JP2001508281A

JP2001508281A - 活性表面化学特性に基づく統合核酸ハイブリダイゼーション装置

Info

Publication number: JP2001508281A
Application number: JP51904597A
Authority: JP
Inventors: ホーガン，ミカエル; パウドリル，トーマス; イベルソン，ボニー; アキヤマ，ノブコ; シーアウ，デュ; マリック，アルナブ
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1995-11-14
Filing date: 1996-11-14
Publication date: 2001-06-26
Also published as: CA2235762A1; EP0910570A1; EP0910570A4; WO1997018226A1; AU7612296A

Abstract

(57)【要約】オリゴヌクレオチドと固体基質で構成され、上記固体基質が中性あるいは負の静電界を持った担持面とハイブリダイゼーション面を有しているハイブリダイゼーション装置。図に示すようにハイブリダイゼーション面は上記オリゴヌクレオチドを上記固体基質に結合させるためにアクセスできる。オリゴヌクレオチド・プローブは上記固体基質に１００オングストローム以下の距離で結合される。さらに、このハイブリダイゼーション装置を用いてＤＮＡあるいはＲＮＡ標的配列内に単一塩基変化を起こさせる方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】活性表面化学特性に基づく統合核酸ハイブリダイゼーション装置本発明は政府の援助を受けて行われたものである。政府は本発明に一定の権利を有している。発明の分野本発明はＤＮＡあるいはＲＮＡとオリゴヌクレオチド・プローブとの間の強化された、選択的な結合のための装置及び方法に関するものである。より具体的には、本発明は核酸診断テストで使用するための装置に関連している。発明の背景提案されている発明に最も近いのは標的への結合のイオン特性を変えるためにペプチド核酸（ＰＮＡ）などの修正基質を用いたＤＮＡプローブの利用である。これらは主に遺伝子に基づく治療剤として研究されており、配列検出法で使われる基質表面では使われていない。いずれにせよ、原理はまったく異なっており、大規模な組み合わせ法ですぐ使うことはできない。核酸配列分析に対する現在のニーズはより効率的に情報を集められるようにする新しい方法の急速な開発に拍車をかけている。特に、ほぼ並列な配列に基づくハイブリダイゼーション検出装置（ｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌ，ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｄｅｖｉｃｅｓ）が現在研究されている。この研究では、マイクロエレクトロニクス・エンジニアリング、ナノテクノロジー、光物理、及び情報処理の分野の新しい考え方が組み合わせられて、非常に短い時間内で大量のデータの収集、同化を可能にしてくれる装置の開発がすすめられている。最終的に、そうした装置の開発は、１）ゲノム分析、２）突然変異検出、３）病原検出、４）ＲＮＡ分析及び５）ヌクレオチド配列決定などを含む種々の目的のためのデータの生成のために従来用いられている煩雑な分子生物学的手順にとって代わる可能性がある。新しい方法か、従来の方法かのいずれを問わず、上に述べたいずれかの目的のためにハイブリダイゼーション・アッセイを用いることができる生化学的根拠は、もちろん、１９５０年代初期にＷａｔｓｏｎとＣｒｉｃｋによって最初に解明された核酸の相補的な性質にある。それ以来、相補的核酸ストランドの具体的な水素結合パターンについての研究、情報の整理、そしてさらなる特徴付けが行われ、大量の情報がもたらされると同時に、医学と生物学のパラダイムに大きな影響を及ぼしてきている。十分な感度と選択性を有する核酸をハイブリダイズさせる能力は多数の物理化学的考察に強く依存しており、かなり注目されている。特に重要なのは核酸の静電気的性質と水素結合が二つの負電荷多重電解質間で起きるようにする基質上のホスフェート基の負の電荷をスクリーニングするための大量の溶液陽イオンの必要性である。電解質はイン・ビボでも重要な役割を果しており、複製、遺伝子組換え、転写、クロマチン構造、パッキング及びリガンド結合などの細胞機能における重要な決定因子である。最近まで、大量のハイブリダイゼーション分析がニトロセルロース、ナイロン、あるいはその他の膜タイプ固体基質上で行われてきている。これらのタイプの基質にマクロ分子を取り付ける方法は良くても半固有性のもので、微孔通路への共有結合によらない取り込みが関与している。プローブ分子の他のタイプの固体基質への共有結合によるつながりがハイブリダイゼーション連係結合定数を二桁も強化する可能性のあることが最近実証されている。こうした理由、及び発展しつつあるハイブリダイゼーション検出装置との互換性の問題から、共有結合およびその他の核酸表面不動態化の従来にはない手段がより普及しつつある。固体表面でのポリマーの化学的相互作用についてはかなりのことが知られているが、溶液状態での物理的データと比較してそうした界面での生物学的相互作用に関する情報は不足している。先行技術においては、核酸のハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータは従来溶液状態での実験、あるいは標的分子が非固有的に吸着あるいは封鎖されている膜タイプの基質上で行われた実験に基づいて特徴付けが行われてきている。本発明が行われるまでは、その上でプローブがハイブリダイゼーション反応で固有につなげられる基質物質の積極的な関与については考察が行われていなかった。さらに、本発明は大きな配列に基づく方式を用いた最新の分子技術において有用である。これらの方式で、プローブ分子は装置と併用可能な基質に、多くはミニアチュア化形式で共有結合を用いて取り付けられる。従って、その上でハイブリダイゼーションを行うための『スマートな』表面の開発は新しい検出装置の情報出力を増大させる上で極めて有益である。本発明は固体基質上での核酸ハイブリダイゼーションの固有性を向上させるための装置および方法を提供するものである。このことはＤＮＡ及びＲＮＡに基づくバイオセンサの感度および判別力とそれに関連するハイブリダイゼーション技術の大幅な向上につながる。発明の要約本発明の目的はＤＮＡ内の標的エリアを検出するためのハイブリダイゼーション装置である。本発明のさらなる目的はＲＮＡ内の標的エリアを検出するためのハイブリダイゼーション装置である。本発明のさらに別の目的はＤＮＡあるいはＲＮＡ内の標的エリアを検出するための方法である。従って、上記の課題の達成において、本発明のひとつの側面に従ってオリゴヌクレオチド・プローブと固体基質で構成されるハイブリダイゼーション装置が提供され、該固体基質は中性あるいは負の静電界をもつ基質表面とハイブリダイゼーション表面を有しており、該ハイブリダイゼーション表面は該オリゴヌクレオチドを該固体基質に結合させるためにアクセス可能であり、該オリゴヌクレオチド・プローブは該基質の上記ハイブリダイゼーション面に１００オングストローム以下の距離で結合される。ひとつの具体的な実施の形態で、このオリゴヌクレオチド・プローブは共有結合あるいは速度の遅い可逆的な非共有結合でハイブリダイゼーション面に結合される。ひとつの具体的な実施の形態で、その距離は約５０オングストローム以下である。好ましい実施の形態では、距離は約２０オングストロームである。具体的な実施の形態では、上記担持面は負の静電界を有している。これは負に荷電された蛋白質膜の層、あるいは静電界での電荷をｐｈ５−８の範囲で切り換える組成物を含むことができる。さらに、基質表面あるいはハイブリダイゼーション面はハイブリダイゼーション中は陽イオン性の傾向があり、洗浄中は陰イオン性の傾向が強い組成物で構成することができる。さらに、担持面あるいはハイブリダイゼーション表面は静電界がｐｈ５−６の陽イオン性あるいは中性で、ｐＨ７−８の範囲で負に電荷される組成物で構成することができる。具体的な実施の形態で、ハイブリダイゼーション表面はストレプトアビジン、不動態化誘導物、カルボキシル酸、ヒスチジン誘導物、くえん酸塩、およびＰｋ値が中性に近い他の基から選択される。さらに、ハイブリダイゼーション面はアルギニン誘導物、サルミンＡ１、基質表面に結合されたサルミンＡ１−プローブ・キメラ、アミノ酸、アミノ酸エステル、あるいはアミノ酸及び／又はアミノ酸エステルの混合物であっても差し支えない。ひとつの具体的な実施の形態で、ハイブリダイゼーションは二つ以上の異なった化合物によって構成されている。ひとつの実施の形態で、基質表面はポリスチレンであり、ハイブリダイゼーション面はストレプトアビジンであり、オリゴヌクレオチド・プローブはビオチンを含むように修正されており、そしてオリゴヌクレオチド・プローブはそのビオチンとストレプトアビジンとの非共有結合による相互作用でハイブリダイゼーション面に結合されている。特種な実施の形態で、基質表面はポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、及びポリエステルで構成されるグループから選択され、ハイブリダイゼーション面はその基質表面上に配置されたカルボキシル酸表面であり、オリゴヌクレオチド・プローブはアミノ酸基を含むように修正されており、そして修正されたプローブは共有結合でハイブリダイゼーション面に結合されている。ひとつの特種な実施の形態で、基質表面はガラスであり、オリゴヌクレオチド・プローブとガラスがそのプローブを末端アミン修正へのエポキシシラン結合によって基質表面に結合させることで基質表面−プローブ複合体を形成し、そしてその基質表面−プローブ複合体が効果的なハイブリダイゼーション面を形成する。別の具体的な実施の形態はＤＮＡ又はＲＮＡのストランドの標的エリアのひとつの塩基の相違を検出する方法を含んでおり、その方法はハイブリダイゼーション装置を検出されるべきアリアを含んだＤＮＡ又はＲＮＡと混合させるステップと、その標的エリアがハイブリダイゼーション装置とハイブリダイズするように十分な時間をかけるステップと、ハイブリダイズされないＤＮＡあるいはＲＮＡを取り除くためにハイブリダイゼーション・プローブとＤＮＡあるいはＲＮＡ標的エリアの環境を変えるステップと、そしてハイブリダイゼーション装置にハイブリダイズしたＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するステップを含んでいる。他の、さらなる目的、特徴、及び利点は開示の目的で行われる現段階で好ましい本発明の実施の形態についての以下の説明と添付図面から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は表面物理化学を利用した二重結合形成の調節を示す図である。図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃはプローブ結合法を図式的に示す図である。図３はＫ−ｒａｓ１２ｍｅｒ二重結合の表面状態のイオン強度依存性を示す図である。図４Ａ及び４ＢはＰｈ７．２又はＰｈ５．２でのハイブリダイゼーションの解離動力学で示したプロトタイプ的な『スマートな』表面（ストレプトアビジン）の静電気的性質に対するＰｈの影響を示している。図５Ａ及び５Ｂは解離動力学に対するＰｈ及び陽イオンの影響を示している。図６は二次構造アッセイを図式的に示したものである。図７Ａ及び７Ｂは低イオン強度でのヘアピン形成標的のハイブリダイゼーションを示している。信号強度は光度計からの相対光単位（ＲＬＵ）で示してある。図８はプロタミン・モデルでの二重結合形成を図式的に示している。図９はＮ⁺溶液（図９Ａ）とプロタミン溶液（図９Ｂ）でのサルミンＡ１による選択性向上を比較して示す図である。図１０は１９ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いての表面上でのハイブリダイゼーションの結果を示している。図１１Ａ及び１１Ｂはアミノ酸ハイブリダイゼーション表面を図式的に示す図で、複数のアミノ酸を示している。図１２−１７は固体基質上の種々のハイブリダイゼーション面を図式的に示す図である。これらの図は必ずしも実寸通りではない。本発明の一定の特徴をより明瞭、簡潔に示すために、寸法を誇張したり、図式的に示している場合もある。詳細な説明本発明の範囲および精神を逸脱せずに、ここに開示されている発明に大して種々の置き換えや修正が可能であることは当業者には明らかであろう。ここで用いられている『オリゴヌクレオチド・プローブ』という用語は４つ以上のデオキシリボ核酸あるいはリボヌクレオチドによって構成された分子のことである。正確な長さは温度、そのプローブの供給源およびその方法の利用法などオリゴヌクレオチド・プローブの最終的な機能や利用法につながる多くのファクターに依存する。オリゴヌクレオチド・プローブは精製された制限消化酵素内で自然に発生する場合もあるし、合成的につくることもできる。オリゴヌクレオチド・プロープは標的のＤＮＡあるいはＲＮＡストランドに対する結合を誘発する条件下に置かれるとＤＮＡあるいはＲＮＡに結合することができる。本発明による装置及び方法においては、オリゴヌクレオチド・プローブは通常長さが少なくとも１０ｍｅｒ以上であり、１０−３０ｍｅｒの範囲である。オリゴヌクレオチド・プローブの感度および特殊性は長さ、配列のユニークさ、および局所化された環境によって決められる。例えば１０ｍｅｒ以下などの短すぎるプローブはＤＮＡあるいはＲＮＡにおける非常に多様な配列との非固有結合を示す場合があり、従ってそれほど役に立たない。ＤＮＡあるいはＲＮＡのストランドとほぼ相補的なプローブがそのＤＮＡ及びＲＮＡの固有ストランドと結合することは知られている。従って、プローブが結合するためには、そのプローブ配列はＤＮＡあるいはＲＮＡの正確な相補的配列を反映している必要はないが、それが正確な配列をより正確に反映していればしている程、より良く結合する。この正確な配列を持たなくても結合する能力は、このプローブが『塩基誤対合』があるＤＮＡやＲＮＡと結合することができるという事実を反映している。この『塩基誤対合』という用語は、プローブが公知の配列と向き合った時に、異常なヌクレオチドの異常な結合対が形成されるようなオリゴヌクレオチド内の変化を指している。二重ストランド核酸の形成においては通常グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が結合し、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）とが結合する。従って、塩基誤対合ペアリングでは標準的な塩基対、Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃが見られない。例えば、Ｇ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ａ−Ａ、Ｔ−Ｔ、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｔ−ＧあるいはＴ−Ｃなどの種々の塩基誤対合が起こり得る。この誤対合と局所的な環境の結合の効率に対する影響が本発明においては誤対合検出のために用いられる。プローブとＤＮＡあるいはＲＮＡとの間に塩基誤対合がある場合、プローブは最も厳しい条件下で塩基誤対合が最も少ないストランドと優先的に結合する傾向がある。本発明の方法は塩基誤対合が最も少ない組み合わせがそのプローブと優先的に結合するように条件を変える方法を提供する。本発明で使われる場合、『固体基質』という用語は装置あるいはハイブリダイゼーション反応のための固体基盤を形成する素材を示す。それは基質表面とハイブリダイゼーション面によって構成されている。担持面はポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、その他のプラスチック、ガラス、ＳｉＯ₂、他のシラン類、金あるいは白金などを含む種々の材料から選択することができる。各固体基盤は担持面とハイブリダイゼーション面を有している。ハイブリダイゼーション面は表１（実施例１１）に示すもの、及び有機酸、無機酸、有機塩基及び無機塩基などの他の材料など種々の素材から選択することができる。これにはアミノ酸、ペプチド、及びその他の短いポリマーも含まれる。アミノ酸が用いられる場合、好ましい実施の形態ではメチル・エステルが用いられるが、それは市販されており、形成反応にによって変性されないからである。ハイブリダイゼーション面は同時に『有効ハイブリダイゼーション面』でもあり得る。例えば、プローブはそれが固体基質に結合された場合に、それはその固体基質の表面上に局所化された陽性、中性、あるいは陰性の環境をつくるのに十分な電荷をもつことができる。この局所化された環境はハイブリダイゼーション表面をつくり出す。基質表面は本発明に必要な陽性、中性、あるいは陰性電荷密度を提供する。ハイブリダイゼーション面は単一の化合物でつくることもできるし、複数の異なった化合物の組み合わせでつくることもできる。当業者は上記の組み合わせ方法の教示に基づいて、不必要な実験を行わなくても、任意のプローブがＤＮＡあるいはＲＮＡ標的サイトに結合し、そして／あるいはそれらを見分けるのに最も効率的な化合物、あるいは複数の化合物を判定することは容易に行えるであろう。表面上で行われるハイブリダイゼーションの物理的な結果はその結合反応の一部としてハイブリダイゼーション表面自体を含む場合がある。これは図１に示されている。この図の重要な側面はその表面の遊離反応基が使えることである。これらの遊離反応基はハイブリダイゼーション面へのプローブ結合後に二次的に修正することができる。この二次的修正はそれらプローブを結合させるために用いられる同じ単純な結合化学性を用いて様々な単量体あるいはオリゴマー性分子を用いて行うことができる。そうした分子の実例にはすべての一次及び修正アミノ酸、オリゴペプチド、多糖類、脂質、及び数万の他の小さな有機分子を含んでいる。ハイブリダイゼーション表面はその表面上のこれら分子の唯ひとつ、あるいはこれらの分子の何らかの組み合わせを含む場合がある。従って、少なくともひとつの分子は表面電荷及びハイブリダイゼーション表面の水分子結合（加湿）を変えるために用いることができる。当業者はもちろん、そうしたハイブリダイゼーション速度あるいは固有性の向上に関して有益である可能性のある様々な表面修正を評価する能力は高スループット方法が使えるかどうかに依存していることを理解している。この高スループットのためのひとつの効果的な方法では微量滴定プレート・ウェルの表面上に自動制御的に配置されたプローブ・アレイが用いられる。この技術を用いて、９６ウェル・プレートの各微量滴定ウェルに標的の特殊性に適合したプローブと適合していないプローブの望ましい組み合わせを示すプローブ・アレイが入れられる。さらに、各ウェルは一定の変種あるいは表面修正を含んだり、あるいは異なった大量の溶液成分で処理されたりする場合もある。従って、各ウェルが１６個のプローブを含む９６ウェル微量滴定プレートは１６ｘ９６＝１，５３６の個別ハイブリダイゼーション・データ・ポイントを生み出すことになる。本発明のひとつの実施の形態はＤＮＡあるいはＲＮＡ配列を検出するためのハイブリダイゼーション・アッセイの選択性と感度を向上させるための表面物理化学特性を改良するハイブリダイゼーション装置である。このハイブリダイゼーション装置は固体基質とオリゴヌクレオチド・プローブで構成されており、上記固体基質は中性あるいは陰性電荷密度を有するハイブリダイゼーション表面を含んでおり、該ハイブリダイゼーション面を含んでおり、該ハイブリダイゼーション表面は共有結合あるいは速度の遅い、非共有結合でオリゴヌクレオチド・プローブに結合するためにアクセス可能であり、該オリゴヌクレオチド・プローブは約１００オングストローム以下の距離でそのハイブリダイゼーション面に結合される。当業者であれば、この距離が正確な測定距離でないことはすぐ分かるであろう。この表面効果の強度は表面からの距離が増大するにつれて低下する。その距離が１００オングストローム程度である場合、表面効果はバルク溶液効果に関しては無視できる程度になり始める。この距離は標的ＤＮＡあるいはＲＮＡと基質表面及びハイブリダイゼーション面の間の物理的あるいは静電気的相互作用が行われるように選定される。この距離は結合均衡に影響を及ぼす。物理的あるいは静電気的相互作用とは、例えば二重結合と（１）表面電界、あるいは（ＩＩ）表面近くの局所陽イオン濃度との間の相互作用などを含む。具体的な実施の形態で、プローブはハイブリダイゼーション表面から５０オングストローム以下の距離で結合され、好ましい実施の形態においてはその結合距離は約２０オングストロームである。他の具体的な実施の形態においては、基質表面はその固体基質上に薄い、負に帯電した蛋白質フィルウを重ねることによって負に帯電させることができる。ひとつの具体的な実施の形態において、この固体基質はポリスチレンであり、ハイブリダイゼーション面はストレプトアビジンであり、オリゴヌクレオチド・プローブはビオチンを含むように修正されており、修正プローブはビオチンとストレプトアビジンとの間の非共有結合相互作用によりハイブリダイゼーション面に結合される。他の具体的な実施の形態において、固体基質はポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、あるいはポリエステルであり、ハイブリダイゼーション面はその固体基質上に置かれた薄いカルボキシル酸表面であり、そしてオリゴヌクレオチド・プローブはアミノ酸を含むように修正されており、修正されたプローブは共有結合でハイブリダイゼーション表面に結合される。別の具体的な実施の形態で、オリゴヌクレオチド・プローブは末端アミノ修正部へのエポキシシラン結合によって」ガラス固体基質に結合される。この結合された固体基質／プローブは、そのプローブはそのプローブ／固体基質局所化エリアで負に帯電された環境をつくりだすのに十分な程度に負に帯電されているので、有効なハイブリダイゼーション表面をつくり出す。別の具体的な実施の形態で、ハイブリダイゼーション表面は静電電荷をｐｈ５ −８の範囲で切り換える組成物を有している。ひとつの具体的な実施の形態で、このハイブリダイゼーション装置は電界が負電荷で保持されるハイブリダイゼーション表面を有している。これにより電界によって誘発される誤対合結合の不安定化が可能になる。別の実施の形態において、ハイブリダイゼーション表面はハイブリダイゼーション中、表面静電界がより陽イオン性を持ち、核酸アトラクタとしての役割を果すが、洗浄中は誤対合結合の電界に誘発された不安定さがつくられるように、洗浄中はより陰イオン性が強くなるような組成を有している。本発明のひとつの実施の形態は、切換え可能な静電特性、つまりハイブリダイゼーション中は核酸標的を表面に引きつけられるように表面が陽イオン性か、あるいはＰｈ５−６のけ囲の中性であるが、洗浄中は標的分子と表面との間の選択的な静電相互作用を行わせるようにＰｈ７−８の範囲で負に帯電されるように、薄膜化学特性の利用である。切換え効果のひとつの具体的な実施の形態において、ハイブリダイゼーション面の組成はストレプトアビジン、イミダゾール誘導体、カリボキシル酸、及びその他のＰＫ値がほぼ中性領域の基によって構成されるグループから選択される。これにはヒスチジン誘導体およびくえん酸が含まれる場合もある。なお、個々のカルボキシル酸あるいはイミダゾールは中性に近いＰｋ値を持たない場合もあるが、種々の化合物の組み合わせを用いれば、Ｐｋ値が実質的に中性的になる。別の実施の形態において、ハイブリダイゼーション面はアルギニン誘導体である。さらに、当業者であればハイブリダイゼーション面はアミノ酸、アミノ酸エステル、あるいはそれらの混合物を含む場合もあるであろう。ひとつの具体的な実施の形態は基質表面に結合されたサルミンＡ１−プローブ・キメラで構成されたハイブリダイゼーション面を含む。別の特種な実施の形態はサルミンＡ１及び／又はサルミンＡ１−プローブ・キメラで構成されるハイブリダイゼーション面を含んでいる。このハイブリダイゼーション表面は外因性塩イオンの不在下で表面に対する標的の高選択性結合をつくりだすように選択される。別の実施の形態で、ＤＮＡあるいはＲＮＡのストランドの標的領域におけるひとつの塩基の違いを検出する方法を含んでおり、この方法は本発明によるハイブリダイゼーション装置のいずれかを検出されるべき標的エリアを含むＤＮＡあるいはＲＮＡと混合するステップと、ハイブリダイゼーション面上のプローブが上記ＤＮＡあるいはＲＮＡの標的エリアにハイブリダイズするように十分に時間をかけるステップと、ハイブリダイズされたプローブ／ＤＮＡあるいはＲＮＡの環境を変えるステップと、そして変性後に残っているプローブ／ＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するステップとで構成されている。環境を変えるためには種々の方法を用いることができるが、ひとつの一般的な方法は結合したプローブ／ＤＮＡあるいはＲＮＡを変化を引き起こす特性を有する溶液で洗浄する方法である。例えば、これにはＰｈの変化、イオン性変化、及びその他の条件を含んでいる。別の実施の形態はハイブリダイゼーション及び洗浄中の表面電荷の正確なバランス及び／又は電荷切換えを行うための方法及び装置である。ひとつの特種な実施の形態において、これはハイブリダイゼーション面としてのアミノ酸誘導物の使用を含んでいる。二次元表面に共有結合で結合されたオリゴヌクレオチド・プローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション分析において、ワトソン−クリック・タイプ二重結合形成の速度と特殊性はその表面自体（例えば、局所化された環境）によって起こされる。この効果は種々の、下側にある基質材料の微妙な、単一塩基標的−プローブの誤対合という熱力学的結果を減らすために利用することが可能であろう。本発明は二重結合形成を強化するためのこの表面効果を調節する能力を提供してくれる。分子生物学の技術はデータ獲得の速度とスループットを増大させるための高度のマイクロエレクトロニクス検出方法を用いた高度に平行なアレイに基づくシステムに益々適合化が図られているので、反応を制御できることが益々重要になってきている。いずれのアレイに基づくハイブリダイゼーション方式においても情報出力が有意になるためには、プローブ−標的二重結合の熱力学的安定性に影響を及ぼすすべてのパラメータを詳細に理解することが必要である。これには固体 −液体相間遷移での、あるいはその近くでの相補的核酸の変えられた反応性も含んでいる。上に述べた境界条件を考慮に入れた場合だけ、対合した二重結合を、比較的安定した、しかし誤対合した標的−プローブ対合からの識別を容易に行うことができるであろう。本発明は固体基質物質の合理的な利用、及び表面が予測可能で有益な形でハイブリダイゼーション・プロセスに積極的に関与するようにその物質を化学的に変性させることに関連している。この発明は以下のことを範囲として含んでいる。１．表面での二重結合形成のイオン依存性（つまり、局所化環境）はバルク溶液のそれとはかなり異なっており、低陽イオン濃度で誤対合二重結合に対して選択的に不安定化する。２．全体的な表面物理現象とは無関係に、表面の化学的性質はその静電電荷の性質、疎水性、単位面積あたりのプローブ分子の密度、つなぎ鎖長、及びその他の特性（例えば，Ｐｈ及び大量陽イオン濃度）において異なった表面を提供するように簡単に修正することができる。さらに、その表面はバルク溶液パラメータを変えることで物理的な現れを『調節可能』にするように化学的に修正することができる。３．ハイブリダイゼーション速度の向上及び特殊性に関して、表面を望ましい物理的性質をもつように化学的に修正する能力は組み合わせ方式で実施することができる。当業者は本明細書の説明から、このスクリーニング方法で種々のハイブリダイゼーション表面の検出が最も短い時間内にできることを可能にしてくれることを理解するであろう。ひとつの特殊な実例で、アミノ酸のメチル・エステルを用いて種々のアミノ酸の利用がテストされる。これらのエチル・エステルは市販されているので、これらの化合物の好ましい効果を組み合わせ法で容易に開発することができる。本発明の利点のひとつは、低大量イオン濃度で標的のＤＮＡあるいはＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションのために用いることができる装置及び方法が提供されることである。固体基質上への陽イオンの表面負荷はハイブリダイゼーション面をつくり出して、表面近くに高い局所的陽イオン濃度をもたらすので、この方法は効果的である。この局所的高陽イオン密度は標的フォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）及び副作用を防止するために用いることができる。従って、本発明は基質とハイブリダイゼーション表面が相互作用して、プローブの標的ＤＮＡ配列への結合をより行いやすくするように高局所陽イオン密度を形成する装置を想定している。本発明のひとつの具体的な利点は、固体基質の表面上につくられる静電界を用いて、標的内の誤対合、プローブ、及び表面の静電界間の相互作用による二重結合の選択性を強化することができる。本発明の別の利点は、切換え可能な表面電界がつくられることである。この表面電荷を切り換える能力はハイブリダイゼーション段階中はＤＮＡあるいはＲＮＡを引きつけ、洗浄中には局所静電界が変化するように変えることができるが、誤対合とは選択的に相互作用できず、誤対合標的配列間の優先的結合や解離を行わせるようにする局所イオン静電界を有する表面を可能にしてくれる。この手順では、プローブとの誤対合が最も少ない標的配列がそのプローブと優先的に結合する。本発明の別の利点は単独か、あるいは共有結合プローブ複合体の一部としてのいずれかで用いられるサルミンＡ１及びその誘導体がハイブリダイゼーション・アッセイにおける外因性陽イオンの必要性をなくしてくれることである。本発明の別の重要な側面は、組み合わせ方法を用いることで、本発明の装置あるいは方法を微調整することができることである。表面はハイブリダイゼーション中は陽イオンを引きつける役割を果し、洗浄中は負に帯電した判別素子の役割を果すことができる。本発明のひとつの側面は表面化学特性としてアミノ酸誘導体を用いる組み合わせ表面化学特性を用いる方法である。なお、ハイブリダイゼーション表面のための複数の化合物を発生させる上記表面化学特性はアミノ酸誘導体を用いる場合に特に魅力的である。ひとつの具体的な実施の形態において、アミン化されたポリスチレンが固体基質上のこはく酸の薄い層としてコーティングされる。こはく酸無水物との反応によって、プローブはアミン修正プローブとカルボキシル化表面との間のアミド結合形成によってこの表面に結合される。残りの（未使用の）カルボキシレートはそのプローブを取り付けるのに用いられるのと同じカルボキシル酸結合を用いてアミノ酸のメチル・エステルによって修正される。修正アミノ酸は表面化学構成物（つまり、炭水化物、アミノ酸１、アミノ酸２など）のあらゆる可能なモル比を有する表面をつくりだすために対で付加される。それらは市販されているので、アミノ酸のＯ−メチル・エステルがこの原理を実証する一例として選ばれた。標準的なアミノ酸は望ましい表面物理的化学特性を得るために変えることができる。種々のアミノ酸及びその特性はこの技術分野の当業者によく知られている。これらを用いることで、種々のハイブリダイゼーション装置の方法を開発することができる。さらに別の実施の形態はいろいろなハイブリダイゼーション装置をつくる方法を含んでいる。種々のハイブリダイゼーション装置をつくるためのひとつの方法は有効なハイブリダイゼーション表面を形成する基質表面−プローブ複合体を形成するために、それぞれガラス質の基質表面と末端アミノ修正に対するエポキシシラン結合によって基質表面に結合されたオリゴヌクレオチド・プローブを有するハイブリダイゼーション装置を使用するステップを含んでいる。この方法は、エポキシシラン基をアミノ酸、アミノ酸エステル、及びそれらの混合物で構成されたグループから選択される反応化合物で処理することによって、未反応エポキシシラン基を対応する陽イオン性、中性、あるいは陰イオン性誘導物に転化するステッブを含んでいる。種々のハイブリダイゼーション装置を発生させる別の方法はそれぞれガラス質の基質表面と、有効なハイブリダイゼーション表面を形成する基質表面−プローブ複合体を形成するために末端アミノ修正にエポキシシラン結合によって基質表面に結合されたオリゴヌクレオチド・プローブを有するハイブリダイゼーション装置を利用するステップを含んでいる。この方法では、未反応のエポキシシラン基は、そのエポキシシラン基をアミノ基を含んだ化合物で構成される反応化合物で処理することによって対応する陽イオン、中性、あるいは陰イオン性誘導物に転化される。種々のハイブリダイゼーション装置をつくるさらに別の方法はそれぞれ、ポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、及びポリエステルで構成されるグループから選択される基質表面、その基質表面上に置かれたカルボキシル酸のハイブリダイゼーション面、アミノ酸、アミノ酸エステル及びそれらの混合物によって構成されるグループから選択される化合物を含むように修正されたオリゴヌクレオチド・プローブを有するハイブリダイゼーション装置を用いるステップを含んでいる。この修正されたオリゴヌクレオチド・プローブはそのプローブをハイブリダイゼーション表面に共有結合で結合させるためにカルボキシル酸基と反応させる。複数のハイブリダイゼーション表面を有する種々のハイブリダイゼーション面は各ウェルを反応化合物によって別個に措置することによってガラス底微量滴定プレートによって発生させられる。従って、各ウェルは、異なった反応化合物あるいは反応化合物の混合物で処理された場合に、異なったハイブリダイゼーション表面を提供することができる。別の実施の形態は検出されるべき表面エリアを含んだＤＮＡあるいはＲＮＡを混合するステップと、標的エリアがそのハイブリダイゼーション装置にハイブリダイズするのに十分な時間をかけるステップと、ハイブリダイズされないＤＮＡあるいはＲＮＡを除去するステップと、そしてハイブリダイゼーション表面にハイブリダイズされたＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するステップを含んだ種々のハイブリダイゼーション装置の活性を選別する方法を含んでいる。別の実施の形態は、複数のオリゴヌクレオチド・プローブと、複数の固体基質で構成され、該固体基質が中性あるいは陰性静電界を有する基質表面と、それぞれ上記複数のオリゴヌクレオチド・プローブのひとつを該固体表面に結合させることができ、該オリゴヌクレオチド・プローブが約１００オングストローム以下の距離で固体基質のハイブリダイゼーション表面に結合されるハイブリダイゼーション表面を有している複数の固体基質を含んでいる。ひとつの好ましい実施の形態はプレート内の各ウェルが異なったハイブリダイゼーション装置である微量滴定プレートを含んでいる。以下の実施例は実例として与えられるものであって、いずれの意味でも本発明の発明を限定することは意図していない。実施例１プローブ結合基質の化学的性質図２は表面不動態化モデル化研究のために用いられた共有結合及び非共有結合プローブの不動態化の方法を示している。図２Ａはストレプトアビジンでコーティングした微量滴定プレート・ウェルの使用法を示している。この手順では、ストレプトアビジン単層ハイブリダイゼーション表面は蛋白質を希釈溶液をポリスチレン・ウェルに水性沈殿させることでつくられた。プローブはビオチンをそれらプローブに取り付けることで修正された。修正されたプローブは非共有結合ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によってハイブリダイゼーション面に取り付けられた。図２Ｂはアミン化されたプラスチック面の利用を示している。この手順では、ガス相プラズマ・アミン化の方法でポリスチレンがアミン化された。表面のアミンはこはく酸無水物との反応でカルボキシル酸に転化された。アミノ酸修正プローブはＥＤＣおよびＨＳＳＩを媒介とするアミド形成によってその表面に結合された。図２Ｃはエポキシシラン化されたＳｉＯ₂面の利用を示している。この手順でエポキシシラン単層を蒸気沈殿の方法でＳｉＯ₂に添加させた。このプローブはアミン修正プローブへの二次的アミン形成によってその単層に結合された。実施例２表面近くでの二重結合形成のイオン強度依存性実施例１で述べた修正された表面の近くでのＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＲＮＡ− ＤＮＡハイブリッドのイオン強度依存性は溶液状態での熱力学的特性と比べて大幅に減少する。溶液状態での対イオン縮合理論に基づく実験と溶液状態での実験の両方が行われた。その結果は、公知のデータから予想されるように、溶液における解合定数（Ｋ_a）のログが広範囲にわたるイオン強度のログとともに直線的に変化することを示している。それに対して、表面近くに形成された二重結合については、イオン強度依存性は広い範囲にわたって均一で、また解合定数は低ＭｍＮａ⁺濃度における誤対合の固有な方法においては低下する。このことは図３に示されている。図３はＫ−ｒａｓ発癌遺伝子コドン１２と１３からできたいくつかの可能な対合と誤対合プローブ−標的ペアリングを表わしている。図３から次のことが明らかとなる：１．二重結合形成の陽イオン依存性はＮａ⁺高濃度の範囲（約１Ｍ−１００Ｍｍ）では非常に低く、１００と１０ＭｎＮａ⁺の範囲では誤対合の程度に一致するように結合するＫ_a値を下げ始める。２．塩基誤対合ペアリングのランク順位は公知の熱力学的安定性に一致している（例えば、完全対合＞Ｇ−Ａ型誤対合＞その他の非Ｇ型シングルベース誤対合＞ダブルベース誤対合）。テストされた最も低いイオン強度（約１０Ｍｍ）においては，完全な対合ペアのＫ_a値は顕著には減少せず、また他の二重結合で結合された表面よりも１０−５０倍は高い。一般的に容認された理論ではこの長さでの二重結合はこれら低Ｎａ⁺濃度では不安定でしかも解離するものだと予測されているので、本発明で発見された優れた特殊性の結果は極めて驚嘆すべきものである。図３で見られる効果はその他の多数の表面二重結合ペアリングによって示されている。例えば、エポキシレンでコーティングしたガラスやＳｉＯ₂、アミン化されたポリスチレンのカルボキシアミド誘導体、アミン化されたポリプロピレンのカルボキシアミド誘導体、プラスチックのその他のカルボキシル酸誘導体、アミン化されたプラスチックのハロゲン酢酸誘導物、修正アガロースのようなプラスチックでコーティングされ中性または負に荷電されたポリマー、有機チオールでコーティングした白金、金あるいはその他の金属、有機酸でコーティングした金、白金あるいはその他の金属、あるいは、ストレプトアビジンまたは中性アビジンでコーティングしたプラスチック、ガラスあるいは金属である。正確なメカニズムはわかっていないが、このシステムの次のような特徴が理論的また実験的知見と一致している。１．負に荷電されたプローブ分子同士が結合した後で固有に負に電荷され、あるいはそのようになった表面自体は、表面近くの効果的なモル濃度がバルク溶液のそれよりもずっと高くなるようにＮａ⁺イオンを配位結合する。この現象は核酸表面ハイブリダイゼーションについては今迄知られていなかったものである。２．バルク溶液の陽イオン濃度を低下させる際に、陽イオンのスクリーニングによるロスが公知のＤｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌパラメータに合った距離を拡大する静電力となるので、表面近くに負の電界が現れる。二重結合のペアリングで大きな効果が見られた低イオン強度においては、予測される電界は拡がり、標的− プローブ対を有する領域を含むようになる。したがって、電界自体は誤対合の二重結合を拒絶する補足的な静電力を補充しつづけ、それによって図１で見たようにより強い特殊性へと導かれていくことになる。この現象は核酸表面ハイブリダイゼーションについては今迄知られていなかったものである。３．これらの観察された平衡値は正常及び逆速度定数の両方に依存しているので、表面での結合標的の平均居住時間は溶液中でのその時間よりも長い。物理的現実性の問題として、ひとつの標的が他のプローブと遭遇しないで拡散する可能な次元数は本質的には１つ（それ以上）に限定されることはほぼ間違いない。しかも、表面で不動態化したプローブは検出が可能になるまで拡散することはない。したがって、上記１と２で述べた平衡効果は原則的には、表面結合標的の共鳴時間（例えば、オフ・レート）を通して明らかにされる。実施例３電界効果は『チューン可能』な表面（ストレプトアビジン）近くに現れる表面の境界近くにおける二重結合形成に関する電荷の根底にある効果を示すために、ストレプトアビジン修正ポリスチレンが用いられ、オリゴヌクレオチド・プローブが固体基質のハイブリダイゼーション表面に結合された。ビオチン化されたオリゴヌクレオチド・プローブの結合が非常に強く（Ｋ_d約１０^-16Ｍ）、また、これらの表面のパラクリスタリンの性質により、プローブは５０オングストロームの間隔で正確に位置している（ストレプトアビジン上のビオチン結合サイトの物理的結合間隔）。より重要なことは、ストレプトアビジン蛋白質は約５．５のＰｋ値を持っており、それにより、ハイブリダイゼーション・バッファ溶液のＰｈのわずかな変化によって調整され得るイオン化が可能な表面を生じさせる。したがって、中性Ｐｈで表面は負に電荷され、そのＰｈが下がるにつれて、ストレプトアビジンの電荷はより中性に近づき、そして正になる。なお、溶液のＰｈが５〜９の範囲では二重結合形成には何の影響も与えない。Ｐｈの機能としての平衡値と解離動力学特性が検討された。プローブ−標的二重結合数の解合レートが測定され、拡散制限プロセスについての予測のように、それらのレートが大変似ていることがわかった。図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５ＢはＰｈを中性からストレプトアビジンのＰｋ値へ近づけるように変化させることによって対合あるいは誤対合の二重結合の解離動力学特性への劇的な影響を示している。事実、どのようなイオン強度においても低いＰｈでは測定可能な解離は全く存在しない。それに対し、中性のＰｈでは、解離は誤対合の一定方法において発生し、イオン強度の条件に対する感度を持っている。注目すべきは、特定二重結合形成が、表面が陽イオンに対して中性である蒸留水中のストレプトアビジン上に低いＰｈで起こる可能性があることが見いだされたことにある。この結果が予測に反しているを当業者は容易に認めているが、それは溶液中に少量の塩が含まれるという上記の条件では、通常、二重結合形成は起こることがないからである。実施例４標的の二次的構造の影響を打ち消す手段としての低イオン強度における表面のハイブリダイゼーション極めて低いイオンのバッファ条件において期待以上の高い結合と選択性を達成したことに加えて、大きい標的分子（分子内で起きる塩基ペアリング）自体がイオン強度依存性を示すが、二次的構造の影響は、低バルク陽イオン濃度で修正された表面上でのハイブリダイゼーションによって克服できる。この可能性に取り組むために、各端部（ヘアピンを形成）上で自己補完的である合成標的は、その標的がそれ自体を重ねればプローブ結合サイトが覆い隠されるように設計されていた。これは図６に図式的に示されている。このアッセイから得た結果は図７Ａ、７Ｂに示されている。図７Ａからわかるように、より高いイオン強度でよりも、より低いイオン強度（０−５ＭｍＮ⁺）において標的の結合が２〜３倍増加している。しかも、その結合は通常の解離動力学特性を示しており、この動力学特性はは得られた信号が標的の非固有の吸収によるものではないことを表わしている。図７Ｂもまた誤対合プローブに関して、平衡であるときでさえ極めて特殊性を持っていることを示している。これらのデータは、表面効果が溶液中で人為的構築物（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を小さくするという条件下で標的結合を可能にすることを立証している。実施例５表面のヒスチジン修正その他の修正についてはアミノ酸ヒスチジンによって表わされている。ヒスチジンが興味深いところはそのＰｋ値が約６．７であることである。約８のＰｈ値では、その側鎖の電荷は中性である。しかしながら、Ｐｈ６．０では、その側鎖電荷は陽イオンであり、形式正電荷と想定される。そこで、負に荷電された表面が６．５以下のＰｈでヒスチジンやメチル・エステルによって修正されると、その表面は正に荷電され、核酸標的の全体的なアトラクタとなる。もしも洗浄中にそのＰｈが８に上がったら、その表面はより負に傾き、非固有結合の標的を静電的にはね返す。このようにして、その表面は洗浄中のハイブリダイゼーション・レートや選別を高めるものとして作用する。前述したように、このことはすでに上述した特徴に加えてさらに興味深い特徴を持つ電位を有する表面の一例にすぎない。これは本発明において有用である切り換え可能な静電的表面の優れた例である。実施例６プロタミン結合対合：誤対合の塩基ペアリングの安定性に対するプロタミ結合の影響にアクセスするためにサルミンＡ１を用いた。比較のために、結合を強化するアルミンＡ１の能力を３１ａａペチド・サルミンＡ１またはＮ⁺の濃度を高める状態で、２５℃で１３ｂｐテスト二重結合を形成するための解合定数の測定により測定した。対合と誤対合の二重結合に対する結合親和力が測定された。水溶液中のサルミンＡ１により可能となる塩基ペアリングの選択性が測定された。これは競合方法によって行われた。簡単に言えば、ビオチンが修正された核酸プローブがビオチン−ストレプトアビジンの連結によって微量滴定ウェルの表面にリンクされる。最大９６の異なるプローブをＢｉｏＭｅｋロボットを用いるこの方法で、同時にリンクすることが可能である。この９６ウェル・コンプティション・アッセイは１ナノモルのサルミンＡ１を消費するだけである。したがって、それほど多くの材料を多重アッセイのために必要としない。５０ｕＬの相補的標的は５Ｘ１０^-10Ｍの溶液に加えられ、それによって、表面への結合に際し、化学発光（ＡＰ／Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０）によって検出されるときには正確な表面結合データが生成された。溶液状態での結合平衡は標的溶液（ビオチンなし）にプローブあるいは塩基配列変更によるプローブ同族列を加えることによって得られた。溶液中の二重結合形成は自由標的を消耗し、それによって平衡状態の表面に結合する標的の量を減少させる。溶液状態でのプローブ滴定を行いながら表面結合を観察することによって、正確な結合等温式が得られ、二重結合形成のための解合定数が与えられる。９、１１、１３、１９ｂｐ二重結合対の大きなライブラリが合成され、上記の微小滴定フォーマットで分析された。サルミンＡ１の分析に関しては、１３ｂｐアッセイ・セットが採用された。このセットは以下に述べる３２二重結合対のセットに照準があてられた。このセットによってＡＴあるいはＧＣ塩基対で側面を接するすべての誤対合に対してサルミンＡ１の影響を観察することが可能になった。１３ＢＰテキスト二重結合：５’ＣＴＧＧＣＧＧＡＡＸＡＴＣ−３’ ＡＴ・リッチ・フランク３’ＧＡＣＣＧＣＣＴＴＹＴＡＧ−５’ ５’ＣＴＧＧＸＧＧＡＡＴＡＴＣ−３’ ＧＣ・リッチ・フランク３’ＧＡＣＣＹＣＣＴＴＡＴＡＧ−５’ ここでＸはＡ、Ｔ、Ｇ、そしてＣを表わし、ＹはＡ、Ｔ、Ｇ、あるいはＣを表わす。図９Ａでは、溶液状態での解合定数が１３ｂｐ二重結合形成のためのＮａ⁺イオン濃度の機能として示されている。この完全に対合した（ＰＭ）１３ｍｅｒ二重結合は、１．８から１８０Ｍｍの範囲において１０倍のＮａ⁺イオン濃度につき解合定数が約３０倍増加することを表わしており、これは公知の理論から予測されたとおりである。単一のＣＡあるいはＧＡ誤対合を持つ二重結合は１８Ｍｍ（固体バー）より高いすべてのＮａ⁺濃度において、完全な対合を基準として５０分の１に減少する親和力を表わしている。比較してみると、図９Ｂでは、サルミンＡ１が存在する溶液状態での二重結合形成はＮａ⁺のものより約１０００分の１のイオン濃度で飽和する。添加されたサルミンＡ１は３０ナノモルから１Ｍｍの範囲にわたっている。誤対合二重結合形成のための溶液状態での解合定数は、完全に対合した１３ｂｐ二重結合のものより少なくとも１０００分の１の低さである。この選択性は充分高いので、誤対合二重結合形成が１０ｕＭより低いサルミンＡ１濃度で実験的に検出される可能性はない。この結果は、サルミンＡ１がサブ・ミクロモル濃度の溶液で高親和性を持つダブル・ヘリックス形成を行うことを示唆し、また、この範囲で、二重結合形成の選択性が、Ｎａ⁺が二重結合形成に用いられるときに見られる数値を基準にして２０〜５０倍増加したことを示唆している。実施例７アミノ酸配列変更のプロタミン結合への影響プロタミン族の公知の数字は次のコンセンサス配列で表わされる：サルミンＡ１：Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ− Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ａｒｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨコンセンサス：［ａｒｇ）_n−ｂｅｎｄ］_n−ａｒｇ_n ここで、ｎ＝３−５，ｍ＝３−５，そしてｂｅｎｄは１−３アミノ酸配列で、ポリペプチド配列（ｐｒｏ，ｇｌｙ−ｇｌｙ，ｅｔｃ．）において「よれ（ｋｉｎｋ）」を誘発する可能性がある。この３２ａａ配列のサルミンＡ１はこのコンセンサスに容易に含まれる。当業者はサルミンＡ１の対称的な誘導体の使用は設計上の改良であると容易に容認する。この対称的な誘導体はこの種では唯一の２５−３５ａａアルギニン・リッチ・ペプチドよりもブロック的にずっと低価格で合成することができる。合成ペプチドは少量合成されるが、まず分子の状態で、よれ（ｋｉｎｋ）、あるいは曲がり（ｂｅｎｄ）の性質を変化させ、そしてオリゴ −アルギニン・ドメインの範囲を変化させる。第一世代ペプチド：［（ａｒｇ）₅−ｐｒｏ］₅−ａｒｇ₅ ２３ａａ剛性ベンド［（ａｒｇ）₅−ｐｒｏ］₄−ａｒｇ₅ ２９ａａ剛性ベンド［（ａｒｇ）₅−ｐｒｏ−ｇｌｙ］₃−ａｒｇ₅ ２９ａａ半剛性ベンド［（ａｒｇ）₅−ｐｒｏ−ｇｌｙ］₄−ａｒｇ₅ ３３ａａ半剛性ベンド［（ａｒｇ）₅−ｇｌｙ−ｇｌｙ］₃−ａｒｇ₅ ２６ａａ弾性ベンド［（ａｒｇ）₅−ｇｌｙ−ｇｌｙ］₄−ａｒｇ₅ ３３ａａ弾性ベンド上記の最適ベンドの特定に続き、オリゴ−アルギニン・モチーフの長さを変化させる：［（ａｒｇ）₃−ｂｏｎｄ］₃−ａｒｇ₃ ［（ａｒｇ）₄−ｂｏｎｄ］₃−ａｒｇ₄ ［（ａｒｇ）₅−ｂｏｎｄ］₃−ａｒｇ₅ 実施例８活性表面薄膜の合理的な設計二重結合形成が１００Ａの固体基質内での発生が制限された場合は、固体相核酸ハイブリダイゼーションは表面効果によって影響される。しかし、本発明が行われるまでは、核酸ハイブリダイゼーションにおける表面効果の役割に取り組んだデータ、あるいはそのような表面効果がどのように利用されているかのデータは発表されていない。ポリスチレンがストレプトアビジンでコーティングされ得ることは知られている。ストレプトアビジンは５０オングストローム離れた位置に配置されるビオチン結合サイトでパラクリスタリン単層を形成する。オリゴヌクレオチドは３’末端においてビオチン基で容易に合成される。ストレプトアビジンでコーティングされたポリスチレンは、プローブが定量的核酸ハイブリダイゼーション分析のために空間的に正確に取り付けられる整然とした表面膜の研究用プロトタイプとして用いられた。溶液状態での核酸標的は３’端末でのｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄ）で合成されたので、ストレプトアビジン膜の基質上にプローブ・オリゴマーによって形成される二重結合はアンチ・ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ・ＡＰ化学発光で観察された。９６ウエル微小滴定フォーマットが採用され、ＥＧＧロボット発光計でアッセイされた。１９ＢＰＰＭ５’−−ＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＴ− ３’ＢプローブＤ３’−ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＡＴＡＧＡＣＡ− ５’ 標的ＣＡ５’−−ＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴ− ３’ＢプローブＤ３’−ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＡＴＡＧＡＣＡ− ５’ 標的ＧＡ５’−−ＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴ− ３’ＢプローブＤ３’−ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＡＴＡＧＡＣＡ− ５’ 標的ＧＴ５’−−ＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴ− ３’ＢプローブＤ３’−ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＴＴＡＧＡＣＡ− ５’ 標的Ｂ＝ビオチン、Ｄ＝ＤＩＧＯＸＩＧＥＮＩＮ図１０はハイブリダイゼーションと洗浄中に用いられる結合標的対Ｎａ⁺イオン濃度による化学発光信号を表わしている。サンプルは結合平衡に達するのに充分な２５℃、Ｐｈ７．２で１２時間ハイブリダイズされたものである。標的濃度は５ｘ１０^-10Ｍ（ストランド）で一定に保たれていた。プローブ密度は、有効なビオチン結合サイト（中心で５０オングストロームにつき約１プローブ）の飽和を構成する１ｍｍ²につき４ｘ１０^-10の分子で固定されている。完全に対合した１９ｍｅｒ二重結合（トップ・カーブ）の標的により、２０Ｍｍから２００Ｍｍ以上の範囲ではＮ⁺イオンの依存性はほとんど、あるいは全く見られなかった。この効果は、表面上における有効なプローブ・サイトの飽和によるものではなく（１％以下のプローブはこのアッセイでは標的となっている）、１０−２０ｂｐ範囲でのすべての二重結合に見られるものである。さらに、これらの実験で得られた信号は、ダブルの誤対合による標的は背景上に結合信号を生じさせないので、表面吸収のような僅かな影響に帰することはできない。したがって、このデータは、ストレプトアビジンでコーティングされ整然とした表面上に形成された二重結合のイオン強度依存性が溶液中の二重らせん構造の形成の依存性に比べてかなり相違していることを示唆している。バルクＮａ⁺濃縮液を１０Ｍｍにまで減少させるに際して、標的結合が約３分の１に減少することが検出され（図１０）、１０−２０Ｍｍ範囲における結合過程の物理的な中断を表わしている。ストレプトアビジンはＰｈ７．２で負に荷電されるので、パラクリスタリン・ストレプトアビジン表面膜は負の表面電位を作る必要がある。標準Ｇｏｕｙｅ−Ｄｅｂｙｅ理論では、この表面電位が１０Ｍｍで３０オングストロームに近い１／ｅの長さで指数的関数的に消滅すると予測している。長さは表面膜と結合二重結合との結合間隔に近いので、２０Ｍｍ以下で検出されたＮａ⁺ イオンの非連続性は表面電界と結合ダブル・ヘリックスとの相互作用の直接的な結果である。図１０の下のカーブは１９ｍｅｒ二重結合における単一のＣＡ、ＧＡ、あるいはＧＴの誤対合を生じさせる標的の結合データに相当する。単一の各誤対合は、２５℃でこの大きさの二重結合についてダイゼーション分析をする標準Ｎａ⁺範囲である、１００Ｍｍ以上のＮａ⁺イオンの１９ｍｅｒ二重結合の中で検出されることは不可能である。しかしながら、２０Ｍｍにおいて中断点以下にＮａ⁺イオン濃度を下げるに際して、単塩基の各誤対合は、５倍の信号差へと高める１９ｍｅｒ二重結合においては現在では検出は不可能である。この誤対合識別は、９−１９ｍｅｒの範囲における二重結合に対して、２０ＭｎＮａ⁺以下にまでできるかぎり明確にさせる。実施例９ストレプトアビジン結合低イオン濃度で、表面静電界との相互作用は標的結合選択性の明確な源泉である。これはさらに、ＰＫ値が約５．５のストレプトアビジンを用いて実証された。二重らせん構造の安定性はＰｈ５−８の範囲の溶液ではＰｈに対する依存性をほとんど示さないので、標的結合はストレプトアビジン薄膜がほぼ中性であるＰｈ５．２と、ストレプトアビジンによる表面電位が大きく陰性であるＰｈ７．２で測定される。標的解離の動力学的特性は１２ｂｐのテスト二重結合と高度に定量的な化学蛍光アッセイを用いてモニターされた。この動力学的実験において、標的結合は５０ＭｍＮａ⁺、Ｐｈ７．２での『ハイブリダイゼーション』フェーズ中に均衡状態に達するようにされた。解離に関する動力学的特性を『洗浄』フェーズ中にＰｈ７．２（図４Ａ）か、あるいはＰｈ５．０（図４Ｂ）のいずれかで緩衝液を５ＭｍＮａ⁺に変えて、１８０分間活発に混合させながら観察した。二重に誤対合した二重結合をつくりだす比較対象標的は、この動力学的アッセイにおいては測定可能な信号を生み出さないので、従って、この熱力学的アッセイにおけるすべての信号はオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合によるものである。これらの動力学的特性において、ゼロ時間インターセプトは５０ＭｎＮａ⁺ ，Ｐｈ７．２で得られる結合均衡の結果に対応している。１９ｍｅｒデータ（図１０Ａ及び１０Ｂ）から分かるように、ＧＣ誤対合ではなく、ＣＡがこの『高塩』均衡状態での完全な対合から判別された。中性Ｐｈ（７．２）（図４Ａ）では、その速度が時間ゼロで検出された均衡値（Ｒ_CA＞Ｒ_GA＞Ｒ_PM）にほぼ比例しているかなりの解離動力学的特性が観察された。実際的な観点からすると、このデータは二重結合形成の選択性が時間の経過と共に増大し、１８０分間の『洗浄』後、対合標的ｖｓ誤対合標的の比率は均衡状態の場合より１０倍以上大きい。より基本的には、このデータは、５ＭｍＮａ⁺イオン濃度及びＰｈ７．２で、表面上での二重構造の平均抵抗時間が単一塩基対誤対合への依存性を増大した。原理的に、この動力学的区別は二重らせん構造中の相互作用、あるいはそのらせん構造の表面電界との相互作用によるものであるかもしれない。これら二つの可能性を分離するために、我々はＮａ⁺イオン濃度を５Ｍｍに維持し、洗浄溶液のＰｈを５．２に低下させて。動力学的的実験を繰り返した。ここで、スロレプトアビジン表面はほぼ非帯電状態とし、二重結合の内部的安定性が影響を受けないようにしておくべきである。図４Ｂは表面に中性化が二重構造解離速度に大きな影響を有していることを示している。これらの速度は中性化されたストレプトアビジン表面上での対合及び誤対合二重結合に対して遅くなりすぎて測定できなかった。従って、この動力学的特性データはストレプトアビジンでコーティングしたポリスプチン上でＰｈ７での短い二重結合形成の動力学に支配的影響を及ぼすのはその表面との静電性相互作用であって、内部的二重結合の静電学的特性ではないことを示唆している。このように、固体基質表面近くの静電界はハイブリダイゼーションにおける二重らせん構造形成の親和性および選択性を決める上で積極的な役割を果す。当業者は、この点に関してストレプトアビジンが唯一のモデルではないことは容易に理解することができるであろう。また、当業者はハイブリダイゼーション表面として種々の組成物が有用であることについても理解できるであろう。いくつかの有用な組成物の実例を表１及び図１２−１７に示す。実施例１０活性表面薄膜の合理的な設計ストレプトアビジンに加えて、同様に有益な物理的特徴を示す化学的により単純な表面がつくられた。２０ｍｉｌのポリスチレンは０．５ｘ１０^-9モル／ｃｍ² にアミン化されたプラスマである。これは耐久性のある高品質であり、市場で大量に入手できる。表１に示されているいくつかの表面化学特性についてテストを行った。すべてのデータはアミン修正オリゴヌクレオチド・プローブと高効率取り付けとの一貫性を示している。表１．アミン類の活性化これらの表面化学構成物はオリゴヌクレオチドへのリンカー及びプラスチック表面の表面特性を変えるための手段として用いられる。５ｘ１０^-9Ｍ／ｃｍ²で、プラスチック表面上の一次アミンは約７オングストローム相互に離れて配置される。適切なリンカーに結合すると、表面近くに薄膜がもたらされる。これらの結合のうちの１％だけが消費され、残りの９９％の化学的性質が変えられないようにするためには、プローブ結合を調節する。こうした手順で、陽イオン性、中性ズイッターイオン性、及び陰イオン性の３種類の表面薄膜が得られる。添付表に示す基の公称Ｐｋ値は中性域からはずっと離れている。しかしながら、予備的な結果では、そうした緊密にパックされた表面薄膜の見かけのＰｋは単離されたリンカーのそれとは大きくずれているが、それは７オングストロームの距離では、帯電された基が特に低バルク・イオン強度の場合デバイ（Ｄｅｂｙｅ）長以内に閉じ込められるという事実によるものと思われる。このＰｋのずれはバルクＰｈ変化のＰｈ５−８領域でそれらの表面に結合する標的の親和性及び動力学的特性に及ぼす影響を測定することで調べられる。この効果は基本的なハイブリダイゼーション技術において重要性を持っている。実施例１１アミノ酸組み合わせ方式実施例１０で、表１０は固体基質上でのアミンの活性化を示している。化学構成物２−６のいずれでも、アミノ酸結合表面をつくるために用いることができる。図１１Ａ及び図１１Ｂに示されているように、複数のアミノ酸をその表面に取りつけることができる。この図で、Ｒ_n,mはその表面に取りつけられるいずれかのアミノ酸を示している。従って、表面はいくつかの表面化学特性をもつことができる。プローブとして、第一アミノ酸、第二アミノ酸、未カルボキシル酸（表１のケース、未修正リンカー化学構成物（表１のケース２−６）がある。実施例１２オリゴヌクレオチド−ペプチド・キメラの開発サルミンＡ１はそのＣ末端に一次アミノ酸と単一カルボキシレート基を含んでいない。従って、それは標準水性カルボキシイミド化学特性によって末端基に独特に結合され、オリゴヌクレオチド上に合成されて、Ｐｒｏ−ＳＡＬ−Ａ１−ＣＯＮＨ−ＯＬＩＧＯとなる。この種のキメラ化合物はセファデックスＧ１００クロマトグラフィによって６ＭＧｕＨＣｌ内で精製される。最終的複合体の特性はＥ５ＭＳによって確認される。そうしたキメラがＳＡＬ−Ａ１プローブ標的複合体を形成する能力は競合法を用いて溶液中で、あるいは固体基質上で評価される。固相結合分析のためには、プロタミンに共有結合させるために３’末端にビオチンを、そして５’末端に一次アミンを持ったプローブを用いて、その接合体をビオチン結合によって表面に結合させる。そうした接合体は他の陽イオンがない場合に選択的二重らせん −プロタミン三重らせん構造を形成する。上記の実施例に示されている結果から、修正された『スマートな』表面は二重構造の選択性に関して、そして溶液内での標的二次構造の効果を無効にすることで用いた場合にかなりの効果があることは明らかであろう。これらの結果は、マイクロエレクトロニクスを利用した検出装置の開発に用いることができる（つまり、光学的に純粋で頑丈な）基質物質を用いて得られたものである。これらの基質表面のいくつかの実例には石英、ＳｉＯ₂、ポリスチレン、ポリプロピレン、及びポリエステルなどがある。ストレプトアビジンＰｈ『調節可能』表面は表面化学構成物質の既存のレパートリーを用いて行うことができる多数の化学的修正のただひとつのものであった。本発明は、種々の表面を組み合わせ的な方式で化学的に修正する方法と、スクリーニングのための高スループットを確実にするための手段を提供する。当業者は種々の好適な修正が可能であることはすぐ分かるであろう。当業者は、本発明がハイブリダイゼーションにおける選択性、感度、及び識別力を向上させるために表面を修正するための教示を提供することを含めて、新しい利点を提供することは容易に理解するであろう。表面での、そして特にイオン強度依存性に関連して、二重結合形成において重要な役割を果すことができるように表面物理化学特性を修正することができる。結合反応への表面の関与が積極的な化学的修正によって開発可能である。最後に、本発明の教示を活用することで、組み合わせ的な手段でさらなる修正を短時間で開発することが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者パウドリル，トーマスアメリカ合衆国 77380 テキサス，ザウッドランド，エヌ．ミルベンド，3015 (72)発明者イベルソン，ボニーアメリカ合衆国 77380 テキサス，ザウッドランド，タングルブラッシュドライブ 10，エイピイテイ．702 (72)発明者アキヤマ，ノブコアメリカ合衆国 77030 テキサス，ヒューストン，グリーンブライア 7777，エイピイテイ．1083 (72)発明者シーアウ，デュアメリカ合衆国 77054 テキサス，ヒューストン，ケンブリッジストリート 7900，エイピイテイ．７−２ジィ (72)発明者マリック，アルナブアメリカ合衆国 77380 テキサス，ザウッドランド，バレイウッドドライブ 315，エイピイテイ．702

Claims

【特許請求の範囲】１．オリゴヌクレオチド・プローブと；固体基質；とで構成されたハイブリダイゼーション装置において、該固体基質が中性あるいは負の静電界を有する担持面とハイブリダイゼーション面と有し、該ハイブリダイゼーション面が該オリゴヌクレチド・プローブを該固体基質に結合させるためにアクセス可能であり、該オリゴヌクレチドが該固体基質のハイブリダイゼーション面に約１００オングストローム以下の距離で結合されるハイブリダイゼーション装置。２．上記オリゴヌクレオチドが共有結合か、あるいはゆっくりした速度の可逆、非共有結合でハイブリダイゼーション面に結合される請求項１のハイブリダイゼーション装置。３．上記距離が約５０オングストローム以下である請求項１のハイブリダイゼーション装置。４．上記距離が約２０オングストロームである請求項１のハイブリダイゼーション装置。５．上記担持面が負の静電界を有している請求項１のハイブリダイゼーション装置。６．上記担持面が負に帯電した蛋白質薄膜を有する請求項５のハイブリダイゼーション装置。７．上記担持面がポリスチレンであり；上記ハイブリダイゼーション面がストレプトアビジンであり；上記オリゴヌクレオチド・プローブがビオチンを含むように修正され；そして上記オリゴヌクレオチド・プローブがビオチンのストレプトアビジンとの非共有結合によってハイブリダイゼーション面に結合されている請求項１のハイブリダイゼーション装置。８．上記担持面がポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、及びポリエステルによって構成されるグループから選択され；上記ハイブリダイゼーション面が上記担持面上に置かれたカルボキシル酸面であり、上記オリゴヌクレオチド・プローブがアミノ基を含むように修正され；そして該修正されたプローブが共有結合で上記ハイブリダイゼーション面に結合される請求項１のハイプリダイゼーション装置。９．上記担持面がガラスであり、上記オリゴヌクレオチド・プローブとガラスが、上記プローブを末端アミン修正にエポキシシラン結合させることによる担持面−プローブ複合体を形成し、そして、該担持面−プローブ複合体が有効なハイブリダイゼーション面を形成する請求項１のハイブリダイゼーション装置。１０．上記ハイブリダイゼーション面が上記静電界の電化をＰｈ５−８の範囲で切り換える請求項１の装置。１１．上記静電界が維持されるか、あるいは負の電位である請求項１のハイブリダイゼーション装置。１２．上記静電界がハイブリダイゼーション中はより陽イオン性であり、洗浄中はより陰イオン性である請求項１のハイブリダイゼーション装置。１３．上記静電界がＰｈ５−６の範囲では陽イオン性あるいは中性であり、Ｐｈ７−９の範囲では負に帯電される請求項１のハイブリダイゼーション装置。１４．上記ハイブリダイゼーション面がストレプトアビジン、イミダゾル誘導体、カルボキシル酸、ヒスチジン誘導体、くえん酸塩及びＰｋ値がほぼ中性領域の他の基によって構成されるグループから選択される請求項１のハイブリダイゼーション装置。１５．上記ハイブリダイゼーション面がアルギニン誘導物である請求項１のハイブリダイゼーション装置。１６．上記ハイブリダイゼーション面がサルミンＡ１である請求項１のハイブリダイゼーション装置。１７．上記ハイブリダイゼーション面が上記担持面に結合されたサルミンＡ１−プローブ・キメラである請求項１のハイブリダイゼーション面。１８．上記ハイブリダイゼーション面がアミノ酸、アミノ酸エステル、あるいはそれらの混合物である請求項１のハイブリダイゼーション装置。１９．上記ハイブリダイゼーション面が上記担持面に共有結合で結合された２つ、あるいはそれ以上の異なった化合物によって構成されている請求項１のハイブリダイゼーション装置。２０．ハイブリダイゼーション装置を検出されるべき標的エリアを含んでいるＤＮＡと混合するステップと；上記標的エリアが上記ハイブリダイゼーション装置にハイブリダイズするためにゆっくり時間をかけるステップと；ハイブリダイズされないＤＮＡを取り除くために上記ハイブリダイゼーション・プローブ及びＤＮＡ標的エリアの環境を変えるステップと；そして上記ハイブリダイゼーション装置にハイブリダイズされたＤＮＡを検出するステップ、とで構成されたＤＮＡのストランドの標的エリア内の単一塩基の違いを検出する方法。２１．ハイブリダイゼーション装置を検出されるべき標的エリアを含んでいるＲＮＡと混合するステップと；上記標的エリアが上記ハイブリダイゼーション装置にハイブリダイズするためにゆっくり時間をかけるステップと；ハイブリダイズされないＲＮＡを取り除くために上記ハイブリダイゼーション・プローブ及びＲＮＡ標的エリアの環境を変えるステップと；そして上記ハイブリダイゼーション装置にハイブリダイズされたＤＮＡを検出するステップ、とで構成されたＲＮＡのストランドの標的エリア内の単一塩基の違いを検出する方法。２２．一連のハイブリダイゼーション装置を発生させる方法において、上記一連のハイブリダイゼーション装置のそれぞれがガラス質の担持面と末端アミノ修正に対するエポキシシラン結合で上記担持面に結合されたオリゴヌクレオチド・プローブを有して担持面−プローブ複合体を形成しており、上記複合体が有効なハイブリダイゼーション面を形成しており、未該エポキシシラン基をアミノ酸、アミノ酸エステル、及びそれらの混合物で構成されたグループから選択される反応化合物で処理して未反応エポキシシラン基を対応する陽イオン性、中性、あるいは陰イオン性誘導物に転化するステップを含んでいる方法。２３．複数のハイブリダイゼーション面が各ウェルを反応化合物でそれぞれ別個に処理してガラス底微量滴定プレート内につくられる請求項２２の方法。２４．一連のハイブリダイゼーション装置をつくる方法において、該一連のハイブリダイゼーション装置のそれぞれがガラス質の担持面と末端アミノ修正に対するエポキシシラン結合によって上記担持面に結合されたオリゴヌクレオチド・プローブを有して担持面−プローブ複合体を形成しており、該複合体が有効なハイブリダイゼーション面を形成しており、該エポキシシラン基をアミノ含有化合物で処理して未反応エポキシシラン基を対応する陽イオン性、中性、あるいは陰イオン性誘導物に転化するステップを含む方法。２５．一連のハイブリダイゼーション装置をつくる方法において、該一連のハイブリダイゼーション装置のそれぞれがポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、及びポリエステルで構成されるグループから選択される担持面と、上記担持面上に置かれたカルボキシル酸のハイブリダイゼーション面と、アミノ酸、アミノ酸エステル及びそれらの混合物で構成されるグループから選択される化合物を含むように修正されたオリゴヌクレオチド・プローブを有しており、上記プローブを上記ハイブリダイゼーション面に共有結合で結合させるために上記カルボキシル酸基を上記修正オリゴヌクレオチド・プローブと反応させるステップを含む方法。２６．上記一連のハイブリダイゼーション装置を検出されるべき標的エリアを含むＤＮＡと混合するステップと，上記標的エリアが上記一連のハイブリダイゼーションにハイブリダイズするように十分な時間をかけるステップと、ハイブリダイズされないＤＮＡを除去するステップと、そして上記ハイブリダイゼーション面にハイブリダイズしたＤＮＡを検出するステップとで構成される方法。２７．上記一連のハイブリダイゼーション装置を検出されるべき標的エリアを含むＲＮＡと混合するステップと，上記標的エリアが上記一連のハイブリダイゼーションにハイブリダイズするように十分な時間をかけるステップと、ハイブリダイズされないＲＮＡを除去するステップと、そして上記ハイブリダイゼーション面にハイブリダイズしたＲＮＡを検出するステップとで構成される方法。２８．複数のオリゴヌクレオチド・プローブと；そして複数の固体基質で構成されている一連のハイブリダイゼーション装置において、該固体基質が中性あるいは負の静電界を持つ担持面とハイブリダイゼーション面を有しており、各ハイブリダイゼーション面が上記オリゴヌクレオチド・プローブのひとつを該固体基盤に結合させるためにアクセスでき、該オリゴヌクレオチド・プローブが約１００オングストローム以下の距離で上記固体基質のハイブリダイゼーション面に結合される一連のハイブリダイゼーション装置。