JPH10500290A - 核酸転移の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 それぞれが核酸種との所定の結合能力を有する一つまたは複数の固体相メンバ（２）を核酸種を含む試料と接触させて該固体相メンバに前記核酸種を結合させる段階と、次いで結合した核酸種を所望の処理手段または分析手段（８）に解放する段階とを含む核酸種を用量配分する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸転移の方法 発明の技術分野 本発明は、核酸断片の用量配分（dosaging of nucleic acidfragments）に関 し、さらに詳細には所定量の核酸種の試料溶液から処理手段または分析手段への 転移に関する。 発明の背景 高等生物中の大多数のＤＮＡは、異なる個体の染色体間で配列が同一である。 しかしながら、ＤＮＡの小さいフラクションは個体間で配列が可変または多型性 である。多型性の正式な定義は、出現頻度が最も高い変異型（または対立遺伝子 ）の個体数頻度が９９％を超えないことである。 本来、ＤＮＡ多型性分析は、使用する特定の酵素の認識部位の内の一つにおけ る配列の変異に起因する、制限酵素の消化によって生成されるＤＮＡ断片の長さ の変異に基づいていた。よって制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の名がある。このＤ ＮＡ断片長は電気泳動ゲル上の泳動速度に基づいて決定され、特定の断片セット の特性がその断片パターンによって記述される。分離された断片バンドの視覚化 は、例えば放射能標識プローブを利 用したブロッティング技術等によって行われる。 また分析の対象となるＤＮＡ断片は、適当なプライマーを用いたＰＣＲ（ポリ メラーゼ連鎖反応）等による多型遺伝子座の増幅によっても生成することができ る。この技術は、特にジ‐、トリ‐またはテトラヌクレオチドの反復などの反復 配列モチーフに代表される多型性マーカーの分析に応用できる。また、このよう な変異は、例えばトリヌクレオチド反復に起因する脆弱Ｘ症候群やハンチントン 病等の人間の疾病にも関係している。増幅断片の場合、断片の検出は延長反応に 使用する一個以上のヌクレオチドまたは単一または複数のプライマーを蛍光体、 例えばフルオレセインで標識することによって容易に提供される。例えば法医学 において断片分析を使用するために、一体となって９９．９％の確実さで個体を 識別する断片分析パターンを提供する例えば四種類位のプライマー対のセット等 を選択しても良い。プライマーは、一体となってこのような高い確実性を提供す る中程度の変異を有する生成物を生成するように設計する。現在、断片分析は蛍 光標識検出を利用した自動ＤＮＡ配列決定装置で行われることが多い。ＤＮＡ配 列決定装置でＰＣＲやＲＦＬＰ（制限断片長多型）などの増幅法によって生成さ れた断 片を分析する際の問題は、電気泳動ゲル上に正確な量の増幅生成物を負荷（load ）することである。通常、ＰＣＲ反応によってピコモル量のＤＮＡ生成物が生成 されるが、断片分析にはアトモルやフェムトモルオーダーの量、即ち千分の一以 下の量しか必要でない。断片生成物の過負荷によってシグナルが「振り切れる（ hit the ceiling）」ことが多い。勿論ＰＣＲ生成物量も増幅の成功度によって かなり変動する。したがって、ゲル上に負荷して試験を行う前に予め試料を希釈 したり、ある希釈に対して正確な試料濃度が得られるように連続的希釈系列を作 製することが通常の慣行である。 発明の概要 本発明の目的は、試料溶液から反応容器や電気泳動ゲルや電気泳動キャピラリ などの処理装置や分析装置に核酸種を正確に用量配分する方法を提供することで ある。特に、本発明は上述の断片分析の問題の克服を追求する。 未だ公開になっていない本発明者らの同時係続の国際出願PCT/SE93/00929号「 核酸試料の処理方法」は核酸種を単一または複数の容器から捕捉し、分析装置に 転移して核酸種を解放するための櫛状構造などの複数の固体相メンバを備えたマ ニホー ルドを開示している。本発明では、その概念を所定量の核酸を試料溶液から処理 装置や分析装置に用量配分することに適用される程度にまで発展させ一般化する ことを提案する。これは、所定量の核酸が各固体相メンバに結合した後に、制御 された量が所望の処理装置や分析装置に解放されるように、核酸種に対する各固 体相メンバの結合能力（binding capacity）を適切に調整することによって達成 される。 したがって、本発明は一般に核酸種を用量配分する方法を提供し、この方法は それぞれが前記核酸種との所定の結合能力を有する単一または複数の固体相メン バを核酸種を含む試料と接触させて該固体相メンバに前記核酸種を結合させる段 階と、次に結合した核酸種を所望の処理手段または分析手段中に解放する段階と を含む。本発明によると、所定量の核酸種を低濃度の溶液並びに高濃度の溶液か ら用量配分することができる。好ましい実施態様においては、試料中の核酸種の 量は固体相メンバの能力を超える量である。また本発明による方法によると、固 体相メンバの結合能力末満の少量の核酸種を含む試料を濃縮することもできる。 この低濃度は増幅不良の結果により生じ得る。この増幅不良試料に固体相メンバ を接触させることによって所 定量がそのメンバに結合する。 このように本発明は核酸種、通常はＤＮＡの正確な用量配分に関するが、本発 明の好ましい態様においては、この核酸種はＰＣＲ等の増幅反応によって生成し た断片であり、その断片は断片分析において電気泳動ゲルもしくはキャピラリに 負荷される。 固体相メンバという用語は広義に理解すべきであり、例えば磁気ビーズなどの ビーズやディップ・スティック（dip-sticks）等を含む。しかし、この固体相メ ンバは以下に示すように本発明者らの前記PCT出願PCT/SE93/00929号に開示した 型式のマニホールドの一部であることが好ましい。 図面の簡単な説明 第１図は、八本のプロング（prongs）を備える櫛状のマニホールドの正面図で ある。 第２図は、八ウェルのウェル・ストリップの概略断面図である。 第３図は、分析装置の試料ウェルと位置合せした第１図のマニホールドを示す 概略正面図である。 第４図は、種々の濃度のビオチン化プライマー存在下で、ス トレプトアビジン（streptavidin）で被覆した第１図のマニホールドへのビオチ ン化ＰＣＲ生成物の結合を示す線図である。 第５図は、断片生成物の過負荷に伴う問題を示す二つのクロマトグラムである 。 発明の詳細な説明 第１図に概略を示し、全般に参照番号１で表した櫛状マニホールドは、本発明 者らの前記国際特許出願PCT/SE93/00929号（その開示を参照により本明細書に組 み込む）に開示されている。このマニホールド１は八本のプロングまたは歯２を 有する。この歯２の形状と間隔は以下により詳細に述べるように電気泳動装置の 試料ウェルに適合させてある。図において、歯２は陰影３で示すように変換され （derivatized）、例えば下記の実施例１に述べるようにアビジン結合粒子で被 覆される。 マニホールド１は第２図に示すような八個のウェル６を有する対応するウェル のセットと協働するように設計され、各ウェル６はマニホールドの単一の歯２を 収容するように適合させてあり、またこの図では試料溶液７で途中まで満たされ ている。 上記のように、マニホールド１は分析装置の試料ウェルと協働するように適合 させてある。これは第３図に概略を示してあ り、同図でマニホールド１は、全般的に参照番号８で表した電気泳動装置の上に 配置されており、歯２は電気泳動装置の各試料ウェル９と位置合せされそれを受 けることができる。 前記核酸種が櫛状の歯２に結合できるように、各歯表面には（i）核酸種それ 自体、または（ii）核酸種に組み込まれた官能基または分子と相互作用可能な分 子もしくは基が固定されている。 第一の場合（i）では、固体相表面はオリゴヌクレオチド、例えば固体相に共 有結合したオリゴヌクレオチドを支持する。該オリゴヌクレオチド核酸種とは相 補的であり、その結果ハイブリッド形成することができる。核酸種がＰＣＲによ って得られるような増幅生成物である場合、オリゴヌクレオチドが反応液中の非 延長プライマー（non-extended primers）とハイブリッド形成するのを防止する ために、そのハイブリッド形成領域が内部になければならない。 第二の場合（ii）では、核酸に組み込まれた官能基は特定の結合対の一方のメ ンバであり、他方のメンバは固体相によって支持される。このような結合対の具 体例は、ビオチン‐アビジン、ビオチン‐ストレプトアビジン、システイン‐チ オール基、 抗原‐抗体、レクチン‐糖である。本発明に関連して特に有用な結合対はビオチ ン‐アビジン（もしくはストレプトアビジン）である。このような特異的な結合 対をＤＮＡの固体相への固定に使用することについては、例えばＷＯ 89/099282 号（その開示を参照により本明細書に組み込む）等により詳細に述べられている 。 増幅生成物に関連して有利な代替結合原理（iii）は、櫛状歯表面でＤＮＡ結 合タンパク質を使用することであり、このタンパク質は増幅プライマーの５’末 端に付加された配列を認識するが、その配列はそれ自体当技術分野で周知のよう に、二重鎖の形でしか結合できない。その様なアプローチは、また、固体相によ るプライマーの捕捉を防ぐ。 本発明の目的において櫛状歯２が、表面を多孔性粒子で被覆することによって 実質的に拡大された表面積を有利に備えることが可能であり、それによって負荷 表面の増加が可能になる。接着剤を使用せずに粒子を表面に付着させることを含 む適当な被覆方法が本発明者らの国際特許出願PCT/SE93/00928号「表面修飾の方 法」（その開示を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。固体相メ ンバのこのような粒子被覆によって 所期の目的に十分な結合能力が容易に達成される。 核酸種を結合できる所定量の基または分子を固体相表面に固定化して適切に規 定された結合能力が得られるようにすることは、上記の方法を手引きとして当技 術分野で周知の方法を用いれば当業者によって容易に行われる。 所望の核酸種を含む溶液に櫛状歯２を導入することによって、調製した歯の結 合能力によって決定される量の核酸種が各歯の表面に結合する。この結合した核 酸物質は、次に所望の処理装置または分析装置に転移され、そこで解放される。 核酸物質の櫛状歯からの解放または脱着に必要な環境と条件は、解放すべき特定 の核酸種と特定の処理装置または分析装置によって異なる。例えば、ゲル電気泳 動を含む分析の場合、マニホールドはその固体相メンバが簡便に電気泳動ゲルプ レートの試料ウェルに導入されるように設計され、そのウェル中で合成核酸鎖の 脱着は例えばホルムアミドなどの変性剤、熱および／または変性ｐＨ（例えばア ルカリ）によって達成することができる。 次に第１図の櫛状構造の断片分析における使用の例について述べる。 まず、ある型の多型性を示す特定の遺伝子座の増幅用に選択 された一群のプライマー対を利用して、染色体ＤＮＡ上でＰＣＲ増幅を行う。各 対の一方のプライマーを検出可能な要素、例えばフルオレセイン等の蛍光体など で標識し、プライマー対の他方のプライマーを特異的結合対の一メンバ、例えば ビオチンなどの分離要素で標識する。ＰＣＲ増幅完了後、反応溶液は特に二重鎖 増幅生成物を含み、その一方の鎖はフルオレセインを担持し、他方の鎖はビオチ ン末端並びに非延長プライマーを有する。図説においては、八種類のＰＣＲ増幅 が第２図の容器の八個のウェル６中で行われる。 ＰＣＲ増幅に先立って、第１図の櫛状物１の歯２に例えば上記の被覆方法によ って所定量のアビジンを供給する。この量は反応溶液中のビオチン標識ＰＣＲ生 成物の期待される水準を適切に下回る、歯２の規定されたビオチン結合能力を提 供するように選択されている。次に、染色体ＤＮＡの多型性遺伝子座に対応する 所望量のビオチン標識二重鎖増幅ＤＮＡ生成物を捕捉するために櫛状歯２を対応 するウェル６に挿入する。 結合ＤＮＡ断片を伴う櫛状歯２を洗浄した後、第３図に示したように櫛状物１ を電気泳動装置８に転移して位置合わせを行い、マニホールド歯２を電気泳動装 置８の試料ウェル９に導入 する。この装置は、例えば自動ＤＮＡ配列決定装置、例えばＡ．Ｌ．Ｆ．Ｓｅｑ ｕｅｎｃｅr^TM（商標）（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジーＡＢ社（スウ ェーデン）から市販）であり、この装置は４０個の電気泳動レーンとレーザ光線 励起と各レーンごとに一台の蛍光検出用フォトダイオード検出器を有する。次に 、各結合ＤＮＡ断片のフルオレセイン標識鎖を、例えば、該鎖を溶出するのに適 当な薬液（例えばホルムアミド）を含む試料ウェル８等によって溶解する。数分 間溶出した後、櫛状物１をウェル９から抜き、電気泳動を開始する。これによっ て所定の適切に規定された量の標識ＤＮＡ断片が電気泳動ゲルに適用され、分析 装置のダイナミック・レンジ内の適当なシグナルが得られることが保証される。 各レーンで得られる泳動パターンから従来の方法によって多型特性が決定される 。 実験によると二重鎖ＰＣＲ生成物の結合は以下の実施例２に示すように大過剰 のビオチン化プライマーによっても、それほど大きな影響は受けない。 下記において、被覆プロングを備える多プロング・マニホールドの調整並びに ビオチン被覆マニホールドによる結合試験について非限定的な二つの例によって 説明する。 実施例１ Ａ．アビジンのセファロース（Sepharose；登録商標） 粒子への結合 沈降物質６．０ｍＬに相当するセファロース（登録商標）（ＨｉＴｒａｐ（登 録商標）、ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）、ファルマシアＬＫＢバイオ テクノロジーＡＢ社、スウェーデン、ウプサラ）を焼結漏斗上で氷冷した１ｍＭ ＨＣｌ（３×１０ｍＬ）でセファロース（登録商標）の表面が常に乾燥しない ように確認しながら注意深く洗浄した。粒子を１．０Ｍ ＮａＣｌと０．４Ｍ ＮａＨＣＯ₃の溶液で迅速に洗浄し、ｐＨ８．３に緩衝し、アビジン１０ｍｇを 含む５ｍＬの上記緩衝液に移した。この懸濁液を両端が上下するように（end-ov er-end）回転させながら１時間インキュベートし、ろ過し、粒子を０．１Ｍエタ ノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）中で１５分間ブロックした。次に、このアビ ジン結合セファロース（登録商標）粒子を、０．１Ｍの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４． ０）で洗浄し、速やかに使用するか、または、０．０２％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナト リウムを含む０．０５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．３）中で保存した。 Ｂ．粒子のポリスチレン固体支持体への付着 上記で調製したアビジン結合粒子をろ過し、蒸留水で洗浄し、メタノール（３ ×５ｍＬ）で脱水した後、トリエチルアミン（Ｅｔ₃Ｎ、３×５ｍＬ）で平衡さ せた。この固体を適当な容器に迅速に移し、Ｅｔ₃Ｎを添加して約７５％（ｖ／ ｖ）粒子のスラリーを得た。対応するマイクロタイタープレートの個々のマイク ロタイターウェル中に突き出す様に適合させた、八列十二本のピンアンドボール 延長部（pin-and-ball extensions）を備えるマイクロタイタープレートのふた （F.A.S.T.システム、ファルコン社、米国カリフォルニア州オックスナード）と して形成されるポリスチレン支持体を超音波槽中でエタノールで20分間洗浄し、 上記スラリーに各２秒間二回沈めることによって上記粒子をポリスチレン支持体 からの突起物上にグラフトさせた後、残存するＥｔ₃Ｎを直ちに空気中に蒸発さ せた。脱イオン水中で洗浄後、剥離した粒子は回収、再利用した。結合の緩い粒 子は水中で振とうしながら１０分間インキュベートすることによって除去した。 このマニホールドを使用するまで０．５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（fat-free dry m ilk）と０．０２％アジ化ナトリウムを添加した緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、１０ ０ｍＭ ト リス塩酸、ｐＨ７．５および０．１％（v/v）トリトンＸ１００）中で保存した 。 ビオチンで５’修飾した³²Ｐ標識化オリゴヌクレオチドによるアビジン被覆支 持体の結合能力試験は、支持体の各プロングが２０ピコモルのオーダのビオチン 化オリゴヌクレオチドと結合できることを示した。 上記の手引きによって、当業者は各々の特定の適用に対して所望の結合能力を 備える任意所望の固体相表面を容易に調製することができる。 実施例２ ＰＣＲ生成物の結合に対する残存プライマー濃度の影響の検討 各々ビオチン化し放射能標識化したプライマーを使用して別々のウェル中でＤ ＱＢ遺伝子（ＤＱＢは移植抗原）について２０μＬのＰＣＲ増幅反応を行った。 増幅終了後、ＰＣＲ生成物からプライマーを除去した。次に種々の量のビオチン 化プライマーを各ウェルに添加した。 後続の実験において、次に、実施例１に述べた方法によってチップをストレプ トアビジン‐セファロース（登録商標）で被覆した第１図に示した型のポリスチ レン櫛状歯を各ウェルに挿 入し、インキュベートして、増幅ＤＱＢ遺伝子生成物を結合させた。次に総放射 能並びにウェルから取り出して洗浄した後の櫛状物の放射能を測定した。結果を 第４図に示したが、結合ＰＣＲ生成物のフラクションをビオチン化プライマー濃 度（ピコモル オリゴ）に対してプロットした。 図から分かるように、高いプライマー濃度までほぼ同じフラクションがビオチ ン化プライマー濃度とは独立に結合する。 実施例３ 次の実験では、実施例１に記載の方法でチップをストレプトアビジン‐セファ ロース（登録商標）で被覆した第１図に示した型のポリスチレンの櫛状歯を各ウ ェルに挿入、インキュベートして、増幅生成物を結合させた。結果を第５図に示 す。第５図のクロマトグラムにおいて、主ピークは試料を示し、小ピークは内部 標準を示す。第１のクロマトグラムでは、元の試料１μＬを機器に直接負荷した 。図から分かるように、主ピークは検出器の飽和のために「振り切れ」ている。 第２のクロマトグラムでは、所定の結合能力を持つ固体相メンバを元の試料に５ 分間接触させた後、この固体相メンバを機器にセットし、それによって試料を溶 出、検出した。得られた試料ピークは機器の 上限以内である。 本発明は以上に特に説明し、図に示した実施態様に限定されないことはもちろ んであり、以下の請求の範囲に定義する一般発明概念の範囲から逸脱せずに多く の変更及び修正が行える。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．それぞれが核酸種との所定の結合能力を有する単一または複数の固体相メン バ（２）を核酸種を含む試料と接触させて該固体相メンバに前記核酸種を結合さ せ、 次に結合した核酸種を所望の処理手段または分析手段（８）中に解放すること、 を含む核酸種を用量配分する方法。 ２．試料中の核酸種の量が単一または複数の固体相メンバの結合能力を超える量 であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．試料中の核酸種の量が単一または複数の固体相メンバの結合能力末満の量で あることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．前記核酸種が増幅反応生成物であることを特徴とする請求の範囲第１項、第 ２項または第３項に記載の方法。 ５．二重鎖ＤＮＡをその一方の鎖を介して単一または複数の固体相メンバに結合 させ、 次にもう一方のＤＮＡ鎖を前記処理手段または分析手段（８） に解放すること、 を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の 方法。 ６．固体相からの核酸種の前記解放が、変性剤、例えばホルムアミド、熱、アル カリなどの変性ｐＨなどによる処理、またはそれらの組合せによって達成される ことを特徴とする請求の範囲第１項から第５項のいずれか一項に記載の方法。 ７．前記固体相メンバが、マニホールドの一部、好ましくは前記固体相メンバを 形成する数個、例えば４本または８本の歯（２）を有する櫛状要素（１）の一部 であることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項のいずれか一項に記載の方 法。 ８．前記分析手段が電気泳動分離ゲルもしくはキャピラリ（８）を備え、前記マ ニホールド歯（２）を受けるように適合させてある試料ウェル（９）を有するこ とを特徴とする請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の方法。 ９．断片分析手順の一部であることを特徴とする請求の範囲第１項から第８項の いずれか一項に記載の方法。