JPS63502477A - 病気診断のための方法、装置および製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病気診断のための方法、装置および製品発明の分野 この発明は、病気の診断、特に、生きている病原体のサンプルの直接的な存在を 診断するために使用する診断キットおよび診断材料としての非放射性診断方法と 装置に関する。この病原体としては、ＡＩＤＳウィルス、１（ＳＶ、ＣＭＶ、） ＩＢＶ、）ＩＡＶ及びＦＬＩＩウィルスおよび、コレラ、マイコプラズマ、クラ ミジアおよび他の病気を起こしたり通常感染する他の侵入性生物のバクテリアが 挙げられる。

発明の背景 近年、分子ウィルス学は、一般的な分子生物学の我々の知識の拡大による直接の 結果として、および組み替えＤＮＡ技術の新しい精巧な方法の開発の結果として 大台な進歩を遂げている。

この他に、これら分子生物学の技法は個々の遺伝子あるいはゲノムの構造組織を 分析する助けとなった。ウィルス診断方法は医師や臨床研究室や病院によって利 用され、そして、診断協力は一般的に、これらの組織の人員によって開発されて きた。ＤＮＡ関連の技術は研究室以外では広〈実施されていない、ウィルス診断 の分子技術は感度が良く精密で使用が容易であるならば、緊急に必要とされてい る。そのような技術や診断キットの開発は医師の診断室や臨床検査室で容易に用 いられるようになるであろう。

臨床医が使用しているウィルス診断の方法は難しく、時間がかかり、あるいはそ の感度は疑問である（Ｒ１−Ｒ９）［Ｒ１とＲ２は、以下に示される参考文献に おいて、Ｒ，、、とじて参照されているのと同様に、下記の参考文献を示してい る。これらの参考文献は、特に本明細書に含まれるものである。］しかしながら 、多数のウィルス病は患者自身の臨床予後を超えて検出されないままでいる。平 均的な開業医にとって患者が発熱した病気に対する診断は病名がはっきりしない 場合には、“たぶんウィルス感染であろう”とされる。

より適当な予防をする薬の必要性と、病気の管理と、ウィルス治療の研究の最近 の進歩により使用するのが簡便で敏感で安全で簡単であるウィルス診断検査が早 急に必要とされている。

添付書類として引用されているこれらの参考文献は、公知例として特別に選ばれ た一般的な背景の先行技術の参考文献である。しかし、これらからは本願で提起 した発明を導くことはできない０本発明の方法、装置および物品の基礎を提供す ることを示唆する文献あるいは他の文献との組み合わせにより示唆するいかなる 文献もない。本発明における非放射性分子生物学の技術による直接的な生物の診 断は、私の着想以前は知られていなかった。しかし、発明の詳細な説明で言及し た文献は本発明及びその効果の理解に使用できるであろう。

分子診断の分野における進歩は、°核酸ハイブリダイゼーション（交雑）によっ て得ることができる精巧な特異性と感度を利用して研究されていることは公知で ある。それらの手順はオートラジオグラフまたはフルオログラフ検出法をとつな いだ高い特異性放射活性のＤＮＡまたはオリゴデオキシリヌクレオチドプローブ を通常、使用する（Ｒ３−Ｒ９）、それらの分析器具の内、特に放射性プローブ は、日常の臨床薬の使用に関係した制約や、欠点がある。つまり使用されるラジ オアイソトープの短い半減期、個人の安全性そしてアイソトープの処分の問題は 臨床例のウィルス検出において感度が落ちない非放射性の検出方法を要望する。

最近ＨＳＶは、臨床検体において、放射性プローブ（Ｒ２２）を使用するＤＮＡ ハイブリダイゼーションにより検出されることが報告されている。このＤＮＡハ イブリダイゼーションによるウィルスの検出の従来の試みは本発明と多くの重要 な点において異なり、たとえ本発明の説明と他の観点から修正されたとしても多 くの点で異なる。

は不適当であり、かなりの危険性を有しており、個人の安全性を考えると、この 種の検出は不適当とされる。

発明の概要 本発明の好ましい具体例として、ウィルスやバクテリアや他の生物のＤＮＡやｒ ＲＮＡに直接結合する安全な非放射性確認生成物プローブを提供する点について 述べる。

この結合は疑わしい侵入生物体が存在するかしないかを検出するために使用され る。そのプローブや同定するための生成物とはバクテリアのような他の生物体中 でウィルス性ゲノムやｒＲＮＡを相補するＤＮＡ片やオリゴデオキシリボヌクレ オチドのことである。

このフラグメントはリポータ−またはマーカー分子と非放射性確認生成体プロー ブとして作られた、標識されたプローブへ供給される。この分子は発蛍光団であ ろう、従って、このリポータ−またはマーカー確認生成体プローブは紫外線によ って可視化されるであろう。このプローブ発蛍光団結合製品は、臨床検体から取 り出した生物のゲノムやｒＲＮＡが固定化されているマトリックス上で、その存 在を分光測定で確認するのに用いられる。詳細な説明で記載されているように入 念に作られた方法は試料操作のため、自動機にかけられ、非放射性分光測定蛍光 信号の記録が自動化される。ＤＮＡ結合生成物が同定することの出来る代表例は ＡＩＤＳウィルス、Ｈ５Ｖ。

ＣＭＶ、ＨＢＶ、１（ＡＶ及びＦＬｔｌウィルスそしてマイコプラズマ、クラミ ジア、クロレラおよび他の侵入生物体のようなバクテリア生物体である。

同定生成物プローグと同定された微生物操作生成体を得るために使用される方法 およびそのために用いられる装置を、以下、詳細に説明する。更に診断方法は診 断キットおよびその使用方法、即ち疑問の微生物を特定のプローブ、例えばウィ ルスあるいはバクテリア蛋白質と結合させ、それにより同定し、特定の同定を得 るために使用し、そして発光および色彩同定により非放射的に可視化するような 形で供されるものも含む、添付図面を参照して、以下の説明により本発明をさら に解説する。

図面の簡単な説明 第１図は本発明の基本方法を示すブロック図、第２図（ａ）はプローブの生成を 示す模式図、第２図（ｂ）はサンドイッチマトリックスがどのように生成される かを示す模式図、第３図は検体標的生物を示す図、第４図はマークされた標的生 物を示す図、第５Ａ図は固定化方法に使われるスロットマトリックスを示す図、 第５Ｂ図はサンドイツチ法で使用されるサンドイッチフラグメントマトリックス を示す図、 第６Ａ図はサンドイツチ法による目標の標識化された物質を得る方法を図式的に 示す図、第６Ｂ図はサンドイツチ法による目標の標識化された物質を得る別の方 法を示す図、第７図はプローブを放出する器具の概略斜視図である。

発明の詳細な説明 ここで詳述される発明の主要な目的は、医師の診断室、臨床の研究室あるいは病 院で使われるウィルスの診断キットを提供することである。本発明のすべてを理 解した後で当業者が作ることができる代表的なキットのグループは １）ＡＩＤＳ、２）Ｈ３Ｖ、３）ＣＭＶ、４）ＨＢＶおよびＨＡｖｌそして５） ＦＬＵウィルス、並びにバクテリアおよび他の生物のために開発された診断用キ ットを含むものである。

この出願の発明は、診断分野において使用され、人間に対してのウィルスやバク テリアの病気の診断のみならず、動物、植物もしくは工業的な微生物の汚染に対 するものにも適用可能である。バクテリアやその種の発病性の微生物、即ちクロ レラ、マイコプラズマ、クラジミアなどのようなウィルス以外の生物では、目標 分子は、リポソームが含まれているので、リポソームのＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）と なり、従って、目標となるｒＲＮＡの分子は、数千倍に増幅される。ウィルスに 対してはゲノムの検出（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を使用することが好適である０診断キ ット１）非放射線で、２）敏感、３）特異性、４）スピード、５）使用容易、６ ）低コストから成る主な基準に合わせて調整される。

予想されるウィルス性の病気は以下の説明を完全に理解すれば同定できる。

１、ＨＴＬＶ−１１１は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因因子である。

この新たに発見されたウィルスの分子生物学は最近の２年でウィルスゲノムの完 全なヌクレオチド配列を大いにあきらかにした（Ｒ１２−Ｒ１Ｂ）、ウィルスが 増殖している間、それはリンパ球に作用し、それを殺す、それは血液中や他の体 内のリンパ球中で発見され、患者は普通、他のウィルスにより感染する（Ｒ１９ −Ｒ２０）。それは血液中や他の体液の中で発見される。試験法は現在、アボッ ト研究所から入手できるが、この試験は患者によって作られる）（ＴＬＶ−Ｉ　 Ｉ　Ｉウィルスへの抗体の発見に基づいている。従って、この試験は人がウィル スに感染しているかどうかを確認することができる。しかし、抗体の陽性である 人がＡＩＤＳであるかどうか、あるいはこのウィルスの疑いのある人でも、この 病気を他の人に移すことがあるかどうかはこの試験は示すことができない。この 試験は１００％の正確さはないということと、ウィルスが陽性であると診断され た人の約１７％は「誤った陽性である」とＦＤＡ長官であるフランクヤングは最 近、発表している。短大かの専門家においてもウィルスに感染したあらゆる人が 抗体を持つとは限らないと述べている。現在では、ＡＩＤＳの抗体試験は、１つ またはその他の理由のために抗原を作り出さない感染体もしくは不適当な要因の ために混乱した結果が出ると信じられている。この観点において、直接ウィルス 遺伝子の仕組みを検出するまで、試験の好適タイプは「第２世代の試験」と考え られている。それ故、この種の試験は木質的な確認のための試験、もしくは第１ 段階の診断試験として用いられることがある。

米国だけで、約２，３００の血液銀行があると見積られ、それらの銀行で伝染病 スクリーンのために１年間に８０００万〜１億回の試験を行なわなければならな いので、ＡＩＤＳのようなウィルスの直接試験の必要性は高い、そこで、本発明 になるキット及びその試験手順は、臨床研究所や病院ばかりでなく、診療所でも 血液銀行に着く前後にも使用される事を意図したものである。

１１、ヘルペスシンプレックスウィルス（）ＩＳＶ）は、増加傾向にある流行性 性的伝染病になっている性器ヘルペスをおこす（ＣＯＤレポート、１９８２）こ とが知られてる。米国では、年間に２０人に１人の大人が感染していると言われ ている。Ｈ３Ｖ感染の早く正確な診断により適切な助言と、妊娠の管理と更には 新しい有効な化学療法剤の使用が可能になることが望まれている。

Ｈ５Ｖ培養は、標準的な診断テストであるが、高価であり、時間がかかり、そし て多くの診断機関において利用することができない、細胞学的または組織病理学 的診断は、役に立つ場合もあるが、それらの検査の感度は一般的に５０％以下で ある（Ｒ２１）、手軽に使用できる血清試験は、前述の非性器Ｈ３Ｖ感染と性器 ヘルペスとの区別さえできない、最近になって、ＨＳＶは放射性プローブを使う ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検体の中で検出されることが報告された （Ｒ２２）、このＤＮＡハイブリダイゼーションによってウィルスを検出する方 法は、本発明とは多くの重要な点において異なっている。放射性プローブの使用 は、診療所や臨床研究所そして病院においては危険であり、それらの使用は適当 ではない。

ＩＩ　、ウィルス性肝炎は、世界中のいたるところで起こっており、重要な公衆 の健康問題となっている。Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスそして黄熱病ウ ィルスは、急性肝炎や肝壊死の最大の発病原因とされている。肝壊死は、巨大細 胞ウィルス（ＣＭＶ）やニブスティン−バー（ＥＢ）のような他のウィルスにも 関係する。しかしながら、ウィルス性肝炎という言葉は、普通Ａ型ウィルスとＢ 型ウィルスによる肝炎を指す（Ｒ２３）。

Ａ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、本来輸血や親からのルート（妊娠、授乳） で感染する（Ｒ１９）、ＨＢＶ　ＤＮＡは、主細胞ゲノムに同化することが報告 されており、ウィルス性ＤＮＡの同化は肝炎のまれの結果として生ずる肝細胞癌 （Ｒ２２）の出現や進行に関係すると信じられている。ＨＢＶ　ＤＮＡは感染し た人細胞の核と細胞質分屑に表われることが証明されている（Ｒ））、最近ＨＢ ＶＩ！Ａ染にさらされたヒトの肝以外の組ｍ＜胎盤と腎）にもウィルスゲノムが 含まれ、肝細胞癌中の同化のモデルが明らかにされる（Ｒ２６）ことが報告され ている０種々の研究機関から様々なＨＢＶを検出する手段が提供されているが、 それらの感度、特異性については疑問である。

Ｂ、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）は、感染性または流行性肝炎として知られてい る。それは通常、人と人の接触によって広がり、主な感染ルートは食物と水の汚 染に多く起因している。いくつかのＨＡＶのための血清学的試験は、免疫電子顕 微鏡的免疫血液凝集反応、補体結合、放射免疫活性、そして酵素結合免疫吸収技 術などによッテ進歩してきた（Ｒ１１，Ｒ２３）、　ヒトＨＡＶ（７）完全ＲＮ Ａゲノムは、その遺伝子機構を含んだものか発表されている（Ｒ２７）。

■、シトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、一般によく知られている。大人の３０〜 １００％がこのＣＭＶに感染しているという血清学的証拠が報告されている。Ｃ ＭＶは、免疫の低下した患者及び新生児の病気の主な原因とされている（Ｒ８， Ｒ２Ｂ、Ｒ２９）、米国では、先天性のＣＭＶ感染率は全新生児の約１％である 。その結果、子供が耳が聞こえなくなるか、精神発達のおくれが生じたり、又は 両方の障害が生じたりする（Ｒ２９）、最近、患者の母乳にＣＭＶが含まれてい ることが証明された（Ｒ３０）、長い間病院入院して集中治療をうけている小児 は、劇症のＣＭＶを発症する危険性が高いものと信じられている（Ｒ３１）、＄ 植手術に対しての免疫抑制治療をうけている患者の１００％までが尿中にＣＭＶ が認められることが予想されうる（Ｒ８）。そして、ＡＩＤＳ患者でも同様であ る（Ｒ２０）。

近年、現在、ＣＭＶ惑染の診断法は、ＣＭＶ抗原に対する抗体力価の血清学的な 増加の検出、あるいは組織培養でのウィルスの分離に依存している。先天的に感 染された幼児の尿培養では、数日のうちに陽性であると同定できるが、ＣＭＶに 対する多くの培養は陽性であると同定されるまでに６週間かそれ以上を要する。

ＣＭＶ　ＤＮＡは、３２Ｐ＠識のＤＮＡプローブを用いて、尿試料で検出された （Ｒ８、Ｒ２８、Ｒ３２）、このプローブ検出方法は、本発明とは異なる。

他のウィルスの診断と同様の方法で、ＦＬＵ株は、本発明にょる方法を用いて、 そのゲノムによって同定することができる。

これは、特定の株のスクリーニングに有効である。疑いのある試料の直接診断に 用い、そして、検゛出を示す得られた信号を最大にするのに用いたこの方法は、 非放射性直接診断法であって、以下の本発明に記載されている具体例を含むもの である。

■、他の微生物に対するウィルスゲノムあるいはｒＲＮＡのＤＮＡ／ＲＮＡを同 定する非放射性のプローブの作成。

＋＋、試料物質のＤＮＡ、ＲＮＡあるいはｒＲＮＡを固定化するための安定した マトリックスの提供。

ＩＩＩ　、同定されなければならない微生物のゲノムあるいはｒＲＮＡに対して 、各々相補的であるアゾンティファイヤー生成のプローブを用いて、核ハイブリ ダイゼーションにより、マトリックス上にウィルスゲノム（ＤＮＡ／ＲＮＡ）あ るいは他の微生物のｒＲＮＡを効率よく固定化させた後に試料核酸を非放射的に 検出する。

■９次に単一プロドコールの開発を安全面に加えて行うと、非専門家、即ち、医 師の診察室、或は、臨床研究所でも、使用できるキットを作ることができる。

■、微微生物ジブローブ同定生成物同定ために、可視化効果を作成することの好 ましい実施態様では、試料の細かな取扱いの処理を簡素化することである。

Ｖｌ、ＤＮＡ様式化は、本発明の好ましい実施態様に従って説明される種々の方 法で達成で診る。即ちプローブを作成し、次いで標識化する。

ＤＮＡプローブは、基本的にはＤＮＡフラグメントであり、目標（例えばウィル ス）ゲノムに対して相補的なものである。ＤＮＡフラグメントを製造するには２ つの一般的によく知られた方法がある。

Ａ、ＤＮＡオリゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成によるもの。このことは 、近年、見直されてきている（Ｒ３３）。オリゴヌクレオチドの化学合成を自動 的に行なう機械のいくつかが、すでに市場にでまわっている。

Ｂ、所望とするＤＮＡフラグメントの分割によるもの。プラスミド中でクローン 化されたフラグメントが好適である。その際にまず適切に制限した酵素を用い、 次にＤＮＡの残りからのフラグメントを精製することにより得られる。

多くのこれらの技術は本発明者によって開発されたものであり、そして更にＤＮ Ａ形成の分析をすることを含む分子生物学の目的のために用いられていた（Ｒ３ ４−Ｒ４ｓ　）。代用のＤＮＡフラグメントは有用であり、合成されたオリゴヌ クレオチドと結合させるものに使用することができるが、本発明者は所望の生成 物を得る簡便さ、コストのために化学的な方法をとる。他の技術分野では、ＤＮ Ａフラグメントに目印をつけるための診断には用いない他の技術分野で用いられ てきている技術と同一であるとできる公知文献がある。

短ＤＮＡフラグメントまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドのラベリングに一 般的に最も多く用いられている方法は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒ４２ ）を使用するγ−（３２Ｐまたは３５Ｓ）である、長ＤＮＡフラグメントはＤＮ Ａ中にα−（３２Ｐまたは３５Ｓ）デオキシリボヌクレオチドを組み込むことに よって同様にニックトランスレート（翻訳）されることが示唆されている（Ｒ４ ３）。更に最近、ＤＮＡのランダムブライミングは合成オリゴデオキシリボヌク レオチドの使用によるＤＮＡラベリング（オリゴラベリング）に使われた（Ｒ４ ４）。それらの方法は、主に研究器具として使用されており、そして、本発明の 好ましい具体例にあっては能力の比較評価のために有益と考えられる。最近、Ｄ ＮＡの非放射性ラベリングのための研究がいくつか発表されている。例えば、ビ オチン（ビタミンＨ）でラベルされたＤＮＡは、バクテリアＤＮＡの明視化に利 用されている。この方法は、高い親和性複合体（Ｋｄが約１ｏ−Ｉりの構造へ導 くであろうストレプトマイセスアビデイニによって産生されたｎｏｎ　ｇｙｃｏ ｓｙｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｆｒｅｐａｖｉｄｉｎ（分子量６０，００ ０　）　、または卵白糖タンパク（分子量６８，０００）とビオチン　（Ｖｉｆ −）１）が強く結合で包るという事実に基づいている（Ｒ４５）。この複合体は 商業的に入手できる酵素（例えば、バーキオキシダーゼ、アルカリホスファター ゼ）によって簡単に明視化できる。ビオチンを使ったＤＮＡラベリングのμ素的 方法は、ビオチン化ＴＴＰ；Ｊ導体を翻訳反応に用いるという報告がある（Ｒ４ ６）。

また、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント）を用いるプライマ ー伸長反応により、ビオチンでオリゴデオキシリボヌクレオチドの標識化は報告 されている（Ｒ４７）。ＲＮＡは、ビオチン化ＡＤＰ類似体を用いて、３末端の Ｔ４リガーゼ話導修飾によって、ビオチンで標識できたことが示唆された（Ｒ４ ８）、最近、ビオチン化デオキシリボヌクレオチドの合成のための化学的方法が 報告されている（Ｒ４９〜Ｒ５２）。

ビオチン化ＤＮＡ合成のための酵素的方法および化学的方法の両者を用いて、臨 床試料の単一遺伝子あるいはウィルスゲノムを検出した（Ｒ４９，Ｒ５０，Ｒ５ ３）、Ｌ／かしながら、これらの方法は、信号を高めるために変更する必要がま だある。それは少量の臨床試料（少ないウィルスを含む）を用いて行うとき、ま た同時にハイブリダイゼーションおよび可視化のための時間を本発明を利用する ことにより、短縮化でき、かつ、そうすべきである。

Ｂ、ＤＮＡを結合するための直接ＤＮＡ酵素架橋方法この方法（Ｒ５４）は、ａ ）多くの第１７ミノ基をもつ合成ポリアミン　（＋）Ｏｙｔｈｙｌｅｎｅａｍｉ ｎｅ）へ架橋試薬として、ベンゾキノンを用いて、酵素（例：ベロキシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ）を溶解させ、ｂ）こうして修前された酵素を、その 小さくて正に帯電したテイルによってポリアニオン（ＤＮＡ）に静電気的に結合 させ、モしてＣ）共有結合になる架橋反応でマイクロ分子成分間のイオン結合を 成功させることから成る。酵素は、グルチルアルデヒドを用いてＤＮＡに共有結 合できる。次に、酵素は、標準的な酵素反応により可視化される。この方法を本 発明方法の一部として用いることができるが、特定の面の第２次的具体例として 考えられる。すなわち、それは期待されているが（ＨＭＶゲノムが検出された方 法の使用（Ｒ５４））、最も好適な具体例ではなく、ざらにｔｉ密な試薬製　′ 造が必要とされている。

本発明の好ましい実施態様として蛍光性の共役ＤＮＡが用いられる。この方法は 、放射線を照射しないで診断するための方法として、最高に有望で、改良できつ るものである。本実施例は、診断する際に標識化された室光性のＤＮＡブローフ リを利用する。他の人け、ＤＮＡ自動連続分析試験に、この方法を用いていた（ Ｒ５５）。このことは、脂肪族アミノ基を５′末端で含んでいるオリゴヌクレオ チドの合成に基づいている。本発明の最も良い態様に従えば、このアミノ基は、 本発明による、いくつかの蛍光性の訪導体の合成に用いられる。本発明者は、こ の方法を改良して、ウィルス性のＤＮＡを非放射性診断することができるように し、そして、特殊なプローブを可能とした。

この研究は、異なるプローブに対して異なる色を生み出す異なる蛍光を発するグ ループを付着させて、同じ試料の中で異なる病原体を検出することができる複数 のウィルス診断キットを作るために用いられる。

１１、ＤＮＡ試料の固定は、安定なマトリックスの上に一つのＤＮＡの試料を固 定化することによりなされる。

固形の支持体、あるいは膜の上に核酸を固定化するのに用いられているその他の 方法がある（Ｒ５６）。

核酸の固定化で最も一般的に用いられているものは以下の通りである。

Ａ、電気泳動を示すゲルからＤＮＡバンドを吸いとったり、移動させたりするこ とに基づく方法（Ｒ３９）、この方法は、時間を費やすので、概して私たちの目 的のためには、適した方法ではない；試料の核酸は、精製されていなければなら ず、同時に２〜３の試料しか試験できないからである。しかしながら、この方法 の効率と感度は近年改善された（Ｒ５８）。

Ｂ、試料を膜に滴下して吸いとらせる方法ｄｏｔ　ｂｌｏｔは、膜に直接吸いと ることによりあるいは膜を通して試料を濾過することにより膜フィルターに試料 のＤＮＡが残存する試料の核酸を固定化する方法である（Ｒ５９、Ｒ６０）。

この方法は、同時に非常に多くの数の試料を用いることができる点において、い くつかの利点がある。この方法では、試料の核酸を倉入りに純粋にする必要はな いし、前もって電気泳動を行なう必要もない。この方法は研究の際にＤＮＡの試 料を保持するのに使用されるが１つの試料中の病人の診断の方法及び装置の１つ の要素として用いられていることが知られていない。本発明の大きな概念からみ れば別の１つの態様として用いられるものである。

Ｃ，サンドイッチハイブリダイゼーション方法この方法は、信号を発生させるた めにウィルスゲノム（ｖｉｖａｌ　ｇｅｎｏｎｅ）それ自身に加えて、ウィルス ゲノム（ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｎｅ）も補足する重複していないＤＮＡフラグメ ントを２つ必要とする（Ｒ６１、Ｒ６２）。二つのフラグメント（オリゴデオキ シリボヌクレオチド）のうちの一つは、固形の担体の上に固定し、そしてもう一 つは試料と混合する。臨床試料が相当するウィルスゲノムを含んでいるならば、 信号が発生するであろう。ウィルスゲノムは放射性の標識がなされたプローブを 用いる本方法で使用される臨床試料の中で検出される（Ｒ８）、このサンドウィ ッチ法は、近年、膜支持体のかわりにＤＮＡを固定化する樹脂（ｓｅｐｈｉｃｒ ｙｌ　Ｓ−５００）を用いることにより改善された（Ｒ６３）。

本発明の最もよい態様における、サンドイッチハイブリダイゼーション方法は非 放射性のプローブを用いることであり、臨床試料を使うことが最も適している。

好ましくは膜形態において、この方法は固体の支持体を提供することにより、Ｄ ＮＡ分子の結合効率を増加させるために変えられる。ＤＮＡとＲＮＡを結合させ るのにちょうどよい市販の膜がある。ナイロン膜は、高分子結合能を増加するた めに改善されつるであろう（Ｒ６４）。診断過程の自動化の１つのステップとし ての膜は呈色性を与えるために用いられるであろう。５ｅｐｈｌｃｒｏｙｌ　Ｓ −５００のような樹脂がナイロンのかわりに用いられるであろう。

Ｈｌ　、試料の操作 臨床試料は通常、多くのよごれとなる分子（蛋白質、塩等）を有している。しか しながら、どんな病原体のゲノムをも検出する理想的な方法では、入念な操作を 必要としないし、正しい検出信号が得られる。

ウィルスのゲノムは、尿（Ｒ８、Ｒ２８、Ｒ３２）、便（ＲｌＯ，Ｒ６５，Ｒ６ ６）、綿棒からとった試料（Ｒ２２）、含漱剤（Ｒ６７）、血清（Ｒ１１、Ｒ６ ８）、白血球（Ｒ６９）、精液（Ｒ７０）のような臨床試料において、ＤＮＡハ イブリダイゼーションによって検出されてきた。発明者にとって、最近の文献で 、ウィルスゲノムが臨床試料の中に検出されうるということが明らかとなってき た。しかしながら試料の操作をさらに改善することが要求されている。今まで用 いられてきた試料の操作にかわるものの例を以下に示す。

Ａ、試料の核酸を濃縮するための２−ブタノールの使用。

希釈されたＤＮＡ試料をブタノールが濃縮することが観察された（Ｒ７１）。発 明者は同様の目的でこの方法をも用いた０発明者にとって、この方法がＤＭＡに 対して最も優れた態様である。近年、この方法は尿試料からＣＭＶ　ＤＮＡを濃 縮するのに用いられてきている（Ｒ８）。

Ｂ、ウィルス粒子あるいはウィルスゲノムを濃縮するポリエチレングリコールが もう一つの方法である。この方法は同様の目的で、分子生物学において広く用い られるようになっている（Ｒ３４）。

Ｃ３分子ハイブリダイゼーションのために、その２つの糸状体を変性させるため だけでなく、ウィルス粒子を溶解させるためのアルカリ溶液及び化学洗浄剤の使 用をするのは、もう一つの方法である。

０９強脱蛋白物質及びヌクレアーゼ抑制物質としてのグアニジウム硫シアン酸は 、ＲＮＡに対して適している。これは、ｍＲＮＡの分離に広く用いられてきてい る（Ｒ７２）。グアニジウム硫シアン酸はナイロン膜に影響を及ぼさないものと 考えられる。

■、病人を非放射性で直接的に効率良く診断する際に、診断過程は考慮すべき重 要なことである。

医者もしくは臨床医が行なうステップの過程及びステップ数は最小限にとどめる べきである。基本的には、本発明を実施する際の最も好ましい態様では、これら のステップは以下のことを含んでいるＡ二適切に、特に予め活性化されたマトリ ックス上のウィルスゲノムを含んでいる試料の沈漬； Ｂ、試料ゲノムの補足性の糸状体を変性させることと及び特定の固定用プローブ を添加すること； Ｃ９もしそのプローブがねらいとするゲノムに対して補足性があり、結果として 目にみえるような陽性を示す信号となるなら、どんな特定の指定されているプロ ーブの有機体の産物のハイブリダイゼーションを比色的に蛍光的にみえるように すること、（この陽性を示す信号はその試料がプローブがなされているウィルス 他の生体を有していることを息味する。） 本発明の好ましい態様によれば、その診断法は、ウィルスあるいは病人に対して 特別に開発された疑いのあるゲノムに対して補足性のあるＤＮＡのフラグメント あるいはｒＲＮＡプローブを用い、そして改良されたサンドウィッチ法あるいは それにかわるドツト　プロット法（試料を滴下して吸いとらせる法）を用いる診 断キットを使用するものである。

サンドイツチ法はハイブリダイゼーションの臨床試料に対してより適していて、 今日では最も好まれている態様である。サンドイツチ法はウィルスゲノムに対し て補足性のあるＤＮＡのフラグメント（オリゴデオキシリボヌクレオタイド）が 固体支持体に化学的にリンクさせるか、もしくは架橋結合させる様に改良したも のである。

他の目的のためにゲノムは結合されてきている（Ｒ７３）、本発明の好ましい実 施態様ではＤＮＡが紫外線の作用によって膜に架橋結合されることもありうるで あろう。

この方法によれば、支持膜あるいは樹脂がいかなる特定されないバックグラウン ドノイズを最小限にする様に後で処理されるなら、検出効率と感度とを増加させ ることになる。一方、ドツトプロットハイブリダイゼーション法は抽出物中のウ ィルスゲノムを検出するのに用いられる。直接ドツトプロット法は試料に核酸を 作用させ膜を透過させる際に用いられる。この方法では、同時に複数の試料を試 験することができる。

サンドイツチ法は、この目的のために改良がなされている。同一試料中の複数の ウィルスゲノムはサンドイツチ法によって検出される、即ち、異なる穴の中の同 じ膜上に固定化された異なるＤＮＡフラグメントを用いることと、ハイブリダイ ゼーション混合物中の異なるプローブフラグメントを用いることによる検出であ る。多くの伝染病をもっていて、免疫低下をおこしている患者やＡＩＤＳ患者の ような患者は多くの場合、複数の感染をしていることがあり、従って、同一の混 合物中で異なるハイブリダイゼーションのフラグメントを用いることで複数の予 検を行なう必要がある。検出効率と検出感度は支持体（＠あるいは樹脂）にバッ クグランドノイズを最小限にする為の処理を加えることにより、増大させられる 。

この様にして形成された固体支持体は数ケ月間安定であり、また診断キットの一 部として供給されるものである。所定のゲノムに対して補足性のある１つのプロ ーブフラグメント（ｒＲＮＡあるいはＤＮＡ）がキットには入っており、非放射 性の目印をつけられて、診断キットの一部分として別々に梱包される。使用に際 しては、試料ゲノムと固体支持体とをプローブフラグメントに混合させて行なう 。もし、ハイブリダイゼーション反応の結果で化学結合が起こったなら、信号が 現われるが、化学結合が必要とされるので、試料が両方のフラグメントに対して 補足性のあるウィルスゲノムか他の生体ゲノムをもっている場合のみ、この信号 は現われる。

サンドイッチハイブリダイゼーション方法では、ハイブリダイゼーション反応に おいて、試料ゲノムと一体化されたプローブのフラグメントと固体支持体（ウィ ルスゲノムに対して補足性のある付着されたフラグメントであるが、プローブフ ラグメントとは重なりのない）を混合させるに際し、その信号はその試料が両方 のＤＮＡ断片に対し補足性のあるウィルスゲノムをもっている場合のみ現われる であろう。

ドツトプロット法においてはハイブリダイゼーションは、プローブとハイブリダ イゼーション反応によって固定化されたゲノムの方向性とを利用することによっ て行なわれる。プローブフラグメントに対し、補足性のあるウィルスゲノムがあ るなら、その信号が現われることになる。

本発明の最も好ましい実施態様での非放射性プローブとは、望まれる補足的なプ ローブ片もしくは自動的なりＮＡの合成物を持つオリゴヌクレオチドと、標的と なるゲノムに補足的な化学的に合成されたオリゴヌクレオチドに共有的に付着す る蛍光団を準備することによって作られる。

プローブＭＡＧＣＴＡＣＣＧＡＡ　（１つ鎮のような特性をもつ鎖、あるいは目 標とする種あるいは株）のような適切なプローブ片を生み出しつる自動ＤＮＡ合 成装置は、プローブ鎖を生み出す際に用いられうる。

これらの装置はベツクマンインスツルメント社（Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　１０２００゜ Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９４３０４．　Ｕ、Ｓ、Ａ、） あるいはゼネテツクデザイン（１１１５ｃｈｏｏｌ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｗａｔｅ ｒｔｏｗｎ、ＭＡ　０２１７２．　Ｉｌ、Ｓ、Ａ、）のようなメーカーから市販 されている。最適な蛍光団はアルカリ処理・ケミカフ９社（９４Ｑ　Ｗｅｓｔ　 ５ａｉｎｔ　Ｐａｕｌ　Ａｗｅ、　Ｍｉｌｗａｗｋｅｅ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ 　５３２３３［１，５，＾、）、シグマケミカル社（Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　１４５０ ８．　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｏ、　６３１７０、　ｕ、ｓ、Ａ、）から市販 されている。

ＤＮＡ　（デオキシリボ核酸）及びｒＲＮＡ（リボ核酸）の基本組成は、生物体 （種あるいは株）の特徴である。Ｕｖの照射下で蛍光団プローブは蛍光を発する 。ｉｎ　５ｉｔｕｅで組織を診断する場合、こうして、ここで述べた蛍光か紫外 線の顕微鏡のような技術を用いる。

従って、この技術を用いることによって、蛍光形もしくは紫外線形顕微鏡のいず れを用いる場合でも、例えばｉｎ　５ｉｔｕｅ診断を行なうにはここで述べたキ ットを用いさえすれば、紫外線光線下で蛍光色信号として蛍光を検出することが 出来る。

生物体のゲノムは、それぞれ一般に２本鎖をなし、リン酸ジエステル結合により 結合されているデオキシリボヌクレオチド、或いはりボヌクレオチド配列の種特 有の基本的な組成を有する。２本鎖は水素結合により安定化されている。これら の水素結合は壊され易いので、２本鎖は加熱、アルカリ処理、あるいは他の化学 的処理によって分離される。

本発明では、ジゴヌクレオチド（Ｒ３３）の化学的合成法や他の研究者等による （化学的手法を用いてプローブの一部分に認識基を加えることによりプローブ鎖 を化学的に作り出した。ＤＮＡフラグメントとしてオリゴヌクレオチドを用之） た）（Ｒ５０，Ｒ５１，Ｒ５２、Ｒ５５）。酵素的な検出法は比色法や目視によ る、一方詔識分子が蛍光法であるならば、認識されるべき種や系統ごとの特有な りＮＡ、ＲＮＡ鎖の対の一方、あるいは相補的なフラグメントの蛍光性の信号は 視覚化するために紫外線が使用される。そのようなプローブ鎖はＡＧＣＴＴＴＧ Ｃ等である（Ａ：アデニン、Ｇニゲアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）。

この反応を行なう為に、マトリックスが試料に対して露暴され、その結果認識工 程が編成させられることになり、マトリックス上に残ることになる。このマトリ ックスはナイロン膜や改良型のナイロン膜のような核酸との結合の効率を増加す ることができて、しかも損害に強いＤＮＡとＲＮＡを保持することのできるメン ブレン膜が好ましい。これらのフィルタは５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕ ｅｌｌ、　Ｋｅｅｎ、　ＮｅｗＨａｍｐｓｈｉａｒ　０３４３１　Ｌｌ、Ｓ、Ａ 、、或いはＢｉｏ−Ｒａｄ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　２２０ ０　Ｗｒｉｇｈｔ　Ａｖｅｎｕｅ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ ａ　９４８０４　Ｕ、Ｓ、Ａ、　、或いはＮＥＮやＡｍｅｒｉｓｈａｍから市販 されている。

５ｅｐｈｉｃｒｙｌ　Ｓ−５００や類似の樹脂は自動化に好適である。５ｅｐｈ ｉｃｒｙ１樹脂は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、、８００　Ｃｅｎｔｅｎｎｉ ａｌ　Ａｖｅｎｕｅ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　０８８５４　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、より入手可能である。この マトリックスはサンドイツチ法が用いられて、ＤＮＡ片が膜と架橋を起し、最後 にバックグラウンドのノイズが最小になる様に処理する場合においてキットの一 部品として梱包される。

プローブは、水溶液中におかれ、プランジャーのディスペンサーによってカプセ ル中に侵入させられる。

そのようなディスペンサーの例として、第３図に示す針の端のカプセルの侵入点 ３１を有するシリンジの形状がある。シリンジのプランジャーの圧力の作用でカ プセルは、ハイブリダイゼーション媒体中のマトリックスへ針を通って分配され る。

このハイブリダイゼーションの工程は、シールされたプラスチック容器中でなさ れる。サンドウィッチ法においては、あらかじめ準備しであるマトリックスを供 給する事と上述のパイプリタイゼーション媒体とプローブを含むシール容器を提 供することも意図している。

試料はまずバッグに注入され、モしてハイブリダイゼーションを完了するため、 再封される。プローブの残留物を除去する為、用意した溶液で洗浄した後、マト リックスは紫外線照射される。そして、蛍光が起きたなら、標的は、標的とプロ ーブとの結合に由来する同定された生産物であるハイブリダイゼーションの蛍光 により認識される。

この記述は全体の方法のステップが表わされた第１図に添えられた図面を参照す ることにより、より良く理解されるであろう。このように第１図において、ブロ ック１１は蛍光体が総合したプローブの生成を意味するステップを表わしている 。

また、ステップ１２は蛍光体が結合されたプローブの封入のステップを表わす。

ステップ１３は試料、例えば血液１４や尿１５の例を示す。ステップ１６は標的 生体の試料を得るステップを表わす。

ステップ１７はマトリックスの容器へ標的生体を適用し、固定するステップを表 わす。ステップ１８は蛍光団または、ハロゲンでマークされたプローブ（あるい は、着色したり視覚化するものを有するプローブの他の形態）のような標識され 、結合されたプローブをマトリックス上の試料とともに、混合するステップであ り、もし結合反応が起きたならば、プローブと標的とが結合したパイプリタイゼ ーション体の突然変位体を生成する。ステップ１９は目（１０）でも視覚化でき る方法のステップを簡単な顕微鏡（２０）と、紫外線の光源の概略図として表わ した。第２図は、ＤＮＡフラングメントのオリゴヌクレオモト、或はオリゴデオ キシリボヌクレオチドがプローブの基本となるＡＧＡＴＡＣＣＧＡＡ　（２２） 、と、下線を付したＡＧとＡＡを除去した後のフラグメントの生成であるＡＴＡ ｃｃａ　（２３）のようなプローブの生産物の概要を説明したものである。この フラグメントは蛍光団（２４）、例えば蛍光性のイソチアン（Ｆｌｕｒｅｓｃｅ ｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｉ）、ＮＢＤ−Ｆ等の原因物質（Ｓｏｕｒｃ ｅ　ａ＋ａｔｅｒｉａｌ）であるｃｏｌｏｒ　１ｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 、光を放射するレポーター或はマーカー分子と混合し、マークされたプローブの フラグメント、（Ｆ）ＡＴＡＣＣＧが生成される。ゴム栓のついたｔＪｚさなバ イアル瓶のような容器（２６）に収容されることが好ましい。

あるいは、マトリックス、１妾着されたマトリックスフラグメントとともに、同 じプラスチック容器に収容し、ハイブリダイゼーションした混合物は一緒に入れ ても入れなくても良い。

同様に、サンドイツチ法でマトリックス２９を結びつけたとき、第２図（ｂ）で 示されるように結合されたフラグメントの鎖ＡＴＣＣ（２８）は標的となる生体 に対して結合される基本的なマトリックス３０を創り出す、第３図で核酸のサン プル、物質３３をつくり出す核酸の集中プロセス３２によって、たとえば血液の サンプルまたは尿のサンプルから得られるサンプルの標的となる生体を示してい る。標的となる生体は、たとえばＧＣＴＡＣＣＧＡＴＧＴＣＧＧＴＡＴ３３°で あり、例で示されたものはサンプル物質３３で示される。ステップ１７はマトリ ックス上へ目的の微生物を適用させる例を示したものであり、マトリックス上へ 目的の微生物を固定する方法は解析の手法によって異なってくる。第３図におい てサンドイツチ法については垂直点線の左側で示されており、一方、固定法につ いて垂直点線の右側で示されている。

サンドイツチ法によると、マトリックス２９はそのマトリックスに付着した結合 フラグメント３０°を有し、結合マトリックス３０を形成している。そして固定 法のドツト法の実施例では試料ＧＣＴＡＣＣＧＡＴＧＴＣＧＧＴＡＴ３３°がマ トリックス２９と直接的にプロッティング結合している。試料３３゛を標識する ためにハイブリダイゼーション物質とリポータ−あるいはマーカープローブが垂 直な点線された様に、そして標識されたプローブ２５および導入工程３４で供給 される。

プローブ２５を試料マトリックス結合をした病原体３３゛を有する容器に導入し 、そしてこの場合、病原体３３°は目標鎮であり、フラグメント２５と病原体３ ３゛とのハイブリダイゼーション結合が生じ、蛍光団標識されたプローブ−目標 結合３６によって可視化効果のために標識された目標病原体が作られる。第４Ａ および４Ｂ図は第３図の下に示されるように標識されたプローブの試料目的微生 物とマトリックスとへの結合を詳細に示す、これは、目標含有マトリックスを蛍 光団標識されたプローブＧＣＣＡＴＴＡ　（Ｆ）に供給することによって得られ る。ハイブリダイゼーション媒体は標識されたプローブと目標ゲノムとのハイブ リダイゼーションが生じる環境を作るために用いられる０合致があるとハイブリ ッド反応が生じ、結合３６がマトリックス上に目標３３°が標識される。試料の 目標微生物は洗浄され、そして生じたハイブリッド反応がある場合、標識された 目標はマトリックス上に残る。

第５Ａおよび５Ｂ図はマトリックス充填を示す、固定法においてマトリックス２ ９はシート状に充填され、スロット試料アプリケーター４０に適応される。この スロット試料アプリケーションの例として第５Ａ図は上部スロット含有表面板４ １と裏張基板４２の間にマトリックス＠（ナイロンあるいは樹脂）２９を示し、 その２つの板はプラスチックまたはガラスからなる。表面板のスロット４３は試 料をマトリックスに結合するために複数個ある。

第５Ｂ図ではサンドイツチ法を示す。この場合、マトリックスフラグメントＣＧ ＴＡはマトリックス２９に付着している被膜内に存在する。次にマトリックスを 予備処理してバックグラウンドノイズを最小にする。そして乾燥し、個別の試料 操作のために充填する。

それに代えて点線４５に示すハイブリダイゼーション媒体混合物を含むプラスチ ックバッグに充填でき、あるいはハイブリダイゼーション混合物を含有するプラ スチックバッグとは別のプラスチックバッグに充填できる。

第６Ａおよび６Ｂ図はサンドイツチ法を使用する他の方法を示す、第６Ａ図にお いて結合フラグメント被膜を有するマトリックス２９はプラスチックバッグ４５ 中に充填され、あるいはりポータープローブ２５とともに充填される。そのプラ スチックバッグはハイブリダイゼーション媒体およびプローブ類を含むことがで きる。試料３３′をプラスチックバッグ中にシリンジ４７のようなもので注入し 、バッグを再密封する。プラスチックバッグ中のプローブは、ハイブリダイゼー ション媒体をバッグに添加した後に導入できる。

それに代えて、乾燥したフラグメントを有するマトリックスを容器４８に充填で きる。ハイブリダイゼーション媒体４９を容器中に供給し、プローブ物質２５が キットパッケージ５ｏの１つの一部分をなすものである。このパッケージ中に、 あるいはそれによりプローブをハイブリダイゼーション媒体と混合できる。通常 、この変更例ではハイブリダイゼーション媒体を作り、次に用意した試料および プローブおよびハイブリダイゼーション媒体をマトリックスを含むバッグに添加 する。

第６Ａおよび６Ｂ図の両方は、密封した分解できるプローブ含有容器の使用を可 能にするものである。説明の為の断面を示した、第７図に示されるような分配装 置５２に含まれ、あるいはその中に挿入される色彩作成プローブ２５のための分 解できる容器５１が示されている。このプローブは容器５１内に密封され、汚染 防止に役立つものである。分配針５３は、その底５４のシリンジディスペンサー ３０内に凹部５５を有し、それは（プランジャー５６の作用によって）集束され ると、容器５１は、それをこわしてシリンジがプローブを分配できるようにする 。それに代えて、プローブは分配ストッパープランジャーを有するマイクロピペ ットのような種類の容器中に、あるいはゴム栓付き容器内に含有できる。

マトリックスは、標識されたプローブを除去できるカバー２３を有する顕微鏡用 スライド２２上に形成できることが理解されよう。

マトリックス２４は、スライド内に置かれ、目標物質が導入および変質処理によ り、その上に付着される。

当業者にとって、多くの変更例、再配置が上記の装置および方法についてなされ うることがわかる。プローブは、特定のスクリーニング臨界値になるように注文 できる。当業者にとって、上記の説明を理解すると、クレームされた発明の範囲 を越えない限り、多くの特別の例示から適合し、改変し、改善することができよ う。

（以下余白） １、「診断のウィルス字」 Ｈｓｉｕｎｇ　Ｇ、Ｄ、　１９８２　Ｙａｌｅ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒ ｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ３、［核酸スポットパイプリダイゼイション：イ ブスティン−パーウィルスのＤＮＡ６、「敏速なウィルス分析の新しい有効な方 法の研究会の要旨」Ｒｉｃｈｍａｎ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　１９８４Ｊ、Ｉｎ ｒｅｃ、Ｄｉｓ、１５０．９４１−９５１７、「感染した人の肝臓の核と細胞質 断片中のＢ型肝炎ウィルスのＤＮＡの形状ＪＭｉｌｌｅｒ、　Ｒ，ｅｔ　ａｍ　 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３７．３９０−３９９８、「尿中のサイトメガロウイルス ：サンドウィッチハイブリダイゼイシ１ンによるウィルスのＤＮＡの検出」 Ｖｉｒｔａｎｅｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　１９８４．　Ｊ′：　Ｃ１１ｎ−Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、　２０．１０８３−１０８８９、「ハイブリダイゼイシタンに よる含ＷＲ＠中のイブシュティン−バーウィルスのＤ比　ｒｒｌ型肝炎ウィルス 抗原に対する抗体の存在する血ｉｆｆ中のロ■肝炎ウィルス抗原Ｇａ１ｌｏ、　 Ｒ，Ｃ，、５ａｌａｈｕｄｄｉｎ、　Ｓ、Ｚ、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２２４．５００−５０３１３、「ヒト′「１１胞リンフオトロビツクウイルス ３型（ＨＴＬＶ−１ｒｌ）の長い末端の繰り返しの中のシスアクティングの規則 正しい連鎖の位置の選定」Ｒｏｓｅｎ、　Ｃ，Ｃｅｔ　ａｌ、　Ｗ、Ａ、　１９ ８５　ｃａｌｌ　４１．８１３−８２３１４、「レンチウィルスへのＡＩＤＳレ トロウィルスの関連に対するヌクレオナト連鎖１５、ｒＡｒＤｓ、ＨＴＬＶ−ｉ ｌｌの完全なヌクレオチド連鎖」Ｒａｔｎｅｒ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、１９８５ ．　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．２７７−２８４１６、「生物学的活性をもっＨＴＬ Ｖ−Ｈ１＃１分子的複製物」Ｆｉｓｈｅｒ、　Ａ、　ａｔ　ａｌ、　１９８５１ ７．１人のＡＩＤＳとリンパ節症レトロウィルスの核酸の構造と発現」Ｍｕｅｓ ｉｎｇ、　Ｍ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．４５０−４５８１ ８、ｒＡ［ＤＳレトロウィルスの分子構成」Ｒａｂｓｏｎ、　Ａ、Ｂ＋Ｃｅ１ｌ 　４０．４７７−４８０１９、「血液および血液製剤によって伝染するウィルス 性惑染ＪＢａｒｂａｒａ、　Ｊ、Ａ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、　１９８４　Ｃ１１ｎ ｉｃｓ　ｉｎ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ　１３．６９３−７０７２０、ｒＡＩＬ ）Ｓ患者中の感染」 Ｄｒｙｊａｎｋｉ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　１９８４．　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｉｎ 　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ　１３．７０９−７２６２１、「生殖単純庖疹ウィル ス感染の臨床と２９断および局所表面治療の評価ＩＶｏｎｔｖｅｒ、　Ｌ、Ａ、 　ｅｔ　ａｌ、Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、　１３３．５ ４８−Ｄｉｓ、１．　１１７−１２８ ２３、「クルスタック、Ｅ、とクルスタック、Ｃ０により１発行されたウィルス 疾ｒＮｌｉｅ比較診断」 Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ、　Ａ、Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、　１９７７、　Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ２４、ｒＢ型肝炎ウィルスの生態学」 Ｖｙａｓ、　Ｇ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ　１９８１．５ｉ＝ｉｅｎｃｅ　２１３，４ ０６−４１１２５、ｒｎ型肝炎ウィルスゲノムと一致するノンレパティフク組織 からのヒト染色（ｔ−ＤＮＡ中のヌクレオチド連鎖」 Ｎａｕｍｏｖａ、　Ａ、に＋ａｔ　ａｌ　１９８５．　Ｇｅｎｅ　５５．１９− ２５Ｚ６．「肝細胞癌のＤＮＡ中でのＢ型肝炎ウィルスの同化：同化位置での細 胞性板状の重複」 Ｙａｇｉｎｕｍａ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．４４５８−４４６２２７、「ヒトＡ型肝炎ウィルス の遺伝子の構成と一次楕遣」Ｎａｊａｒｉａｎ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　１９８５ 　Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ｏ２／２０２／２６３ １２８、ｒＤＮＡ−ＤＮ＾ハイブリダイゼイションによる臨床ａ本のヒトサイト メガロウィルスの検出」 ５ｐａｃｔｏｒ、　Ｓ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ　１９８４．　Ｊ　Ｉｎｒｅｃｔ、　 Ｄｉｓ、　１５０，１２１−１２５２９、「−次的及び回帰的ｔ’！！感染の相 対的重要性」Ｓｔａｇｎｏ、、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ　１９８２．　Ｎ、　ｅｎｇ ｌ、　Ｊ＋Ｍｅｄ、　３０６．９４５−９４９３０、「スエーデンミルク提供者 のミルク中のサイトメガロウィルス」Ａｌｆｏｒｓ、に、　１９８５．５ｃａｎ ｄ、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１／、　１１−１３３１、「レストリク ションーエンドヌクレアーゼーエイゲスシジン分析による＠告された非医ｍ施設 の幼児間のサイトイガロウィルスの伝染」５ｐｅｃｔｏｒ、　Ｋ、　１９８３． 　Ｌａｎｃｅｔ　３７ｇ−３８１３２、ｒＤＮＡハイブリダイゼイションによる 尿中のヒトサイトメガロウィルスの敏速な検出と定量化」 Ｅｌ−Ｇｅｗｅｌｙ、Ｍ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ　１９８０．Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　、　１０２，４２３−−４２８３７、「ミドリムシ類のグラシリスバチラ リスの葉緑体ゲノム中の特別なサイトとＲＮ人遺伝子の７７７」 Ｅｌ−Ｇｅｖｅｌｙ、　ａｔ　ａｌ　１９８１．　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ ｅｔ、　１８１．２９６−３０５３８°′ｚ賦”ｅＦ”１１９蟹”Ｇｅｎ’？’ ￥Ｆ、Ｑ！１１Ｓ−２８８３９、「ミドリムシ類のグラシリス葉緑体ゲノムの物 理的マツプ上のフェニルアラニンＬＲＮＡ遺伝子の偏在」 Ｅｌ−Ｇｅｗｅｌｙ、　ｅｔ　ａｌ　１９８２．　Ｇｅｎｅ　１７．３３７−３ ３９４０、ｒｆｉ直ロー！−によるグイボヤントＥ度傾配達心法を使った）゛ラ スミドＩＩＮＡの単離の迅速な方法」 Ｅｌ−Ｇｅｗｅｌｙ、　Ｍ、Ｒ，１９８３，Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｍｉｃｈｉｇａ ｎ、　４．１９−２３４１、「ミドリムシ・類のグラシリスバチラリスの葉緑体 ゲノム中のｒ　ｒ　ｒ＋寸ベロンの間の部分の連鎖と進化」 Ｅｌ−Ｇｅｗｅｌｙ、　Ｍ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ　１９８４．　Ｍｏｉ、　Ｇｅｎ、 　Ｇｅｎｅｔ、　１９４．４３２−４４３４３、ｒＤＮＡ−ポリメラーゼを用い たニック転写による高選択的活性に対するデオキシリボ核酸のラベル化」 Ｒｉｇｂｙ、　ａｔ　ａｌ　１！ｊ７７、１．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　 １１１３．２５７−２５１４４、［高選択的活性へのＤＮＡレストリクシ５ンー エンドヌクレアーゼ断片を放射性ラベル化するテクニック」 Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ　１９８４．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　１３７，２６６−２６７４５、「アビジン」 Ｇｒｅｅｎ、　Ｎ、　Ｍ、　１９７５．２９．８５−１３３４６、［ニトロセル ロース上に固定したＤＮＡまたはＲＮＡヘハイブリダイゼイシ５ンをするビオチ ンでラベルされたＤＮＡプローブを見出だす迅速で敏感な分光学的方法」 Ｌｅａｒｙ、　ｅｔ　ａｌ　１９ｇ！、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８０．４０４５ −４０４９４７、「ビオチンでラベルされたオリゴヌクレオチド：ハイブリダイ ゼイション１０−プとして使用される酵素の合成」 Ｍｕｒａｓｕｇｉ、　ｅｔ　ａｌ　１９８４．　ＤＮＡ　３．２１６９−２７７ ４８、ｒＴ４リガーゼを使ったＲＮＡの蛍光ラベル化とビオチン」Ｒｉｃｎａｒ ａｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ　１９８３．　Ｒｅｓ、　１１．６１６７−６１８４キ １　ｒビズ＋ンでラベルを嶋４ミ　スーリコ°丘ンシジリオζ７２し才÷トイ” ｋ”　：　イｅｉＡへ゛　Ａｍぐ’　ハ　イー）°゛ノ９°’イｉイＥ−ａ＞　 ７°ｏ−）”’ｃ５ｏ、「スノートビオチンでラベルされた１０−プを持った特 定のＤＮＡ！鎖の検出」Ｃｎｕ、　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　ＤＮＡ　４．３２ ７−３３１５１、「オリゴデオキシリボヌクレオチドの化学的酵素学的ビオチン のラベル１ヒ」にｅｍｐｅ、　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ ｓ、　Ｒｅｓ、　１３．４５ＰＳ７５２、「新しい試薬によるＤＮＡとＲＮＡの 化学的ラベル化によって調整された非放射性ハイブリダイゼイション１０−ブ」 Ｆｏｒｓｔｅｒ、　ｅｔ　ａｔ　１９８５．　Ｐｎｏｔｏｂｉｏｔｉｎ、　Ｎｕ ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．７４５−７６１５３、ｒビオチンラベル化 ハイブリダイゼイション７０−プを使った培ａｍ胞やパラフィンを埋め込んだ細 胞片中のウィルスゲノムの検出」Ｂｒｉｇａｔｉ、　ｅｔ　ａｌ　１９８３．　 ＶＬｒｏｌｏｇｙ、１２６．３２−５０５４、ｒＤＮＡハイブリダイゼイション への分光学的方法」Ｒｅｎｚ、　Ｍ、、にｕｒｚ、　Ｃ＋１９８４．　Ｎｕｃｌ 、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２．３４３５−３４４３５５、ｒ５箇所に脂肪 性のアミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成：ＤＮＡ連鎖分析に使うための蛍 光性のＤＮＡプリメスの合成」Ｓｍ１ｔｈ、　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｎｕｃ ｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１３．２３９９−２４１２５６、「固体支持体 に固定した核酸のハイブリダイゼイション」Ｍｅｉｎｋｏｔｈ、　Ｊ、、　Ｗａ ｈｌ、　Ｇ、　１９８４．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３８．２６７− ２８４５７、「ゲル電気泳動により分離されたＤＮＡＩｆＴ片の特別な連鎖の検 出」５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、、　Ｍ、　１９７５．　Ｊ、　Ｍｏｉ、　Ｂｉｏ ｌ、　９８．５０３−５１７５８、「アガロースゲルからナイロン膜へのＤＮＡ の迅速な転位」Ｒｅｅｄ、に、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｍａｎｎ、　Ｄ、Ａ、　１９８ ５．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．７２０７−７２２１５９、「 ドットハイブリダイゼイシラン手段による核酸連鎖の同族関係と相対的濃度の決 定Ｊ Ｋａｆａｔｏｓ、　ｅｔ　ａｌ　１９７９．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅ ｓ、　７．２０１−２１０Ｂｒａｎｄｓｍａ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｇ 、１９８０．Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｄｕｎｎ、　Ａ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｈａｓｓｅｌｌ、　Ｊ、Ａ、　１９７７、　ｃ ＝ｔｔ　１２．２３−３６６２６「天然のサンプル中の核酸の検出に対する有益 な方法としてのサンドウィッチハイブリダイゼイシジンＪ Ｒａｎｋｉ、　ｅｔ　ａｌ　１９８３．　Ｇｅｎｅ　２１．７７−８５６３、「 セイハクリルに結合したＤＮＡを用いる遺伝子の検出の迅速な方法」Ｌａｎｇｄ ａｌｅ、　Ｊ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｍａｌｃｏｌｍ、　Ａ、Ｄ、　１９８５．　Ｇ ｅｎｅ　３６’、　２０１−２１０６４、「化学的に修飾した繊維と表面を持つ 細胞の特殊な分離と操作６５、「核酸スポットハイブリダイゼイションによる根 の標本中のアデノウィルスの検出Ｊ Ｓｔａｌｈａｎｄｓｋｅ、　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒ ｏｉ、　１６．２１３−２１８ｅｅ、ｒ４子的に複製されたウィルスプローブを 使うドツト／プロット　ハイプリダイゼイションによる腸のアデノウィルスの検 出」Ｔａｋｉｔｔ、　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｉ、 　１６．１０７−１１８６７、［イブシュティン−バーウィルスのＤＮＡの検出 ：ハイプリダイゼイシランによる含囃剤中のＤＮＡＪ Ａｍｂｉｎｄｅｒ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、　２１．３５３−３５６６８、「丼ＡＴＳ９、非Ｂ型肝炎を持つ チンパンジーの肝臓と血清中の検出されるＢ型肝炎ウィルスの不在」 Ｙａｐ、　５．１１．　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｌｒｏｌ 、　Ｉｓ、　３４３−３５０６９、ｒｒｌ、！ｓす肝炎患者の白血球中のＢ型肝 炎ウィルスのＤＮＡの状ｎＪＧｕ、　Ｊ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ　１９８５．　Ｊ、　 Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ　１７．７３−８１７０、「精子・中のＩＩＢＹ　ＤＮへ の存在：紹菌系枝に対する１１［３Ｖの可能な垂直ｊユ過」Ｈａｄｃｈｏｕｅｌ 、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ　１９８５．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　１６． ６１−６６７１、ｒ２−ブタノールを用いた抽出によるＤＮＡの濃縮１７２、［ リボヌクレアーゼ中に豊富にある源からの生物学的活性なリボ核酸の単離」Ｃｎ ｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　１０．５２９４−５２９９７３、「ゲノムの連鎖」 Ｃｈｕｒｃｈ、　Ｇ、Ｍ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　１９８４．　ＵＳＡ　８ １．１９９１−１９９５国際調査報告 １°“ｖｎａ＋ｌｅ′ａｌ　Ａａ″″″“°０°８°ＰＣＴ／ＬＩＳ８６１０２ ５９４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．目標とする病原体のゲノムまたはｒＲＮＡ配列に対して、相補的な所望のＤ ＮＡ鎖ツラグメントもしくはオリゴデオキシリボヌクレオチドを選択し、該所望 鎖を主要プローブ鎖の部分として供給し、非放射性化学的変化を加えて可視化も しくは比色側効果を効果を生み出すプローブを形成することを特徴とする病原体 の非放射性診断用プローブの製造方法。 ２．該プローブ鎖が、ウイルス性ゲノムに対して相補的なものである請求の範囲 第１項記載の方法。 ３．該プローブ鎖が、ウイルスのゲノムまたはＡＩＤＳ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＢ Ｖ、ＨＡＶ、ＦＬＵウイルスおよびそれらの株を含むウイルスの群に対して相補 的なものである請求の範囲第１項記載の方法。 ４．異なる種またはその株に対して相補的な複数のプローブ鎖が特定の同定剤分 子により標識されているものである請求の範囲第１項記載の方法。 ５．該プローブ鎖が、目標とする病原体もしくは系統のｒＲＮＡ配列に対して相 補的なものである請求の範囲第１項記載の方法。 ６．該非放射性化学的変化が、プローブに対して、発光および／または色同定に より可視化効果を奏する少なくとも一個の分子を付着させることを含むものであ る請求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記分子が、蛍光プローブもしくはハロゲン含有分子である請求の範囲第６ 項記載の方法。 ８．前記主要なプローブ鎖が、リボヌクレオチドの化学的合成によって化学的に 作られたものである請求の範囲第１項記載の方法。 ９．前記主要なプローブ鎖が、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチ ドのらせん構造を断ち切ることによって作られたものである請求の範囲第１項記 載の方法。 １０．前記プローブ鎖のベースのプローブ鎖は、加熱によって切られて、あるい はアルカリまたは他の化学薬品にさらされて切られて主要プローブ鎖を作るもの である請求の範囲第９項記載の方法。 １１．微生物の種または株のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ複合体を供給し、その 複合体の１つ以上を目標として分離し、該目標をリポーター部分および目標病原 体の核酸鎖の特定のフラグメントを持つ標識された非放射性プローブの存在下に さらし、目標物が標識された非放射性プローブと結合する相補的フラグメントを 持つ場合ハイブリツド結合反応を起こさせることを特徴とする微生物の存在の非 放射性直接識別方法。 １２．前記標識された非放射性プローブは、病原体の診断プローブであり、この プローブは、目標の病原体鎖のＤＮＡフラグメントまたはオリゴデオキシリボヌ クレオチドもしくはｒＲＮＡ配列に適合する所望の鎖フラグメントを有し、該所 望の鎖フラグメントは非放射性化学的変化により改変され、可視化効果を奏する プローブを形成した主要なプローブ鎖の部分である請求の範囲第１１項記載の方 法。 １３．前記標識された非放射性プローブは、ＤＮＡフラグメントに対して相補的 フラグメントを有するか、あるいはウイルスゲノムもしくは病原菌のｒＲＮＡ配 列に対し相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドを有するプローブであり、そ して該プローブのリポーター部分は、可視化もしくは比色側定効果を作るに適す るものである請求の範囲第１１項記載の方法。 １４．前記目標とする病原体の核酸鎖は、目標病原体の核酸鎖を保持するに適し 、かっ、それを前記の標識された非放射性プローブとハイブリダイゼーシヨン反 応をする位置に保持するために適するマトリックスに拘束されたものである請求 の範囲第１１項記載の方法。 １５．前記マトリックスは該目標病原体核酸鎖と結合するに適し、かつ、前記標 識された非放射性プローブとハイプリダイゼーション反応する位置に保持するに 適する目標病原体核酸鎖に対して相補的な結合フラグメントを拘束しているもの である請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．前記の標識された非放射性プローブおよび目標病原体核酸鎖は、ハイブリ ダイゼーシヨン媒体中に浸され、そして該媒体中では鎖の相補的適合性ががあり 、それにより該プローブのリポーター部分が該目標鎖と結合する場合には該プロ ーブと核酸鎖との間にハィプリダイデーション反応が生じているものである請求 の範囲第１１項記載の方法。 １７．該プローブと目標鎖との間にハイプリダイゼーション反応が生ヒ、そして リポーター部分が該目標鎖と結合し、リポータープローブ−目標物のハイブリッ ドを作るのに充分な時間経過があった後に、拘束されないプローブおよび他の汚 染物質を該リポータープローブ−目標鎖のハイブリッドから除去し、鎖ハイブリ ッドの存在を立証てきる請求の範囲第１１項記載の方法。 １８．該鎖ハイブリッドを光あるいは酵素反応にさらし、可視化効果あるいは比 色側定信号を生ぜしめ、該リポーター部分の既知の可視化効果あるいは比色側定 信号と合致するものと認識された場合、ハイブリッド鎖は存在するものとして、 かっ目標鎖を有するものとして同定し、それによって診断された試験試料中に目 標病原菌が存在するしのと同定する請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．異種の病原体の鎖と相補的な異種のプローブフラグメントが複数ある請求 の範囲第１１項記載の方法。 ２０．基質物質と目標病原体の核酸鎖のフラグメントを有する病原体の直接診断 のためのマトリックス。 ２１．供給された異種の目標病原体の核酸鎖の異種のフラグメントがある請求の 範囲第２０項記載のマトリックス。 ２２．前記病原体はＡＩＤＳウイルス，ＨＳＶ，ＣＭＶ，ＨＢＶ，ＨＡＶおよび ＦＬＵウイルスおよびバクテリアたとえばコレラ、マイコプラズマ、クラミジア および通常感染すると病気が生じる他の侵入微生物を含む群から選択されるもの である請求の範囲第２０項記載のマトリックス。 ２３．該主要プローブ鎖はＡＩＤＳウイルス，ＨＳＶ，ＣＭＶ，ＨＢＶ，ＨＡＶ およびＦＬＵウイルスお上びバクテリアたとえばコレラ、マイコプラズマ、クラ ミジアおよび通常感染すると病気が生じる他の侵入微生物を含む群から選択され た病原体に対して相補的なものである請求の範囲第１１項記載の方法。 ２１．Ｈ標微生物鎖のフラグメントと合致するプローブフラグメントを有する標 識された非放射性プローブを有し、該プローブフラグメントは、非放射性化学変 化によつて改変され、可視化効果を生ずる付加リポーター部分を有するプローブ を形成することを特徴とする病原体のＤＮＡあるいはＲＮＡ鎖と結合することに よって病原体の直接存在を診断するための非放射性プローブ。 ２５．前記リポーター部分は、可視化効果あるいは比色側定信号を生ずる蛍光団 あるいはハロゲン化合物から得られる分子である請求の範囲第２４項記載の非放 射性プローブ。 ２６．目標微生物鎖のフラグメントと合致するプローブフラグメントを有する標 識された非放射性プローブを有し、該プローブフラグメントは、非放射性化学変 化によって改変され、可視化効果を生ずる付加リポーター部分を有する、病原体 のＤＮＡあるいはＲＮＡ鎖と結合することによって病原体の直接存在を診断する ための非放射性プローブおよび該プローブ用の容器を有することを特徴とする試 料中の病原体の存在の直接診断用のキット。 ２７．固体支持マトリックスを含む請求の範囲第２６項記載のキット。 ２８．前記固体支持マトリックスは隔膜である請求の範囲第２７項記載のキット 。 ２９．前記マトリックスは樹脂である請求の範囲第２７項記載のキット。 ３０．前記マトリックスはナイロン膜である請求の範囲第２７項記載のキット。 ３１．前記マトリックスは目標微生物鎖と結合するに適するものである請求の範 囲第２７項記載のキット。 ３２．前記マトリックスは目標微生物鎖とハイブリッド化する短い鎖フラグメン トと結合したものである請求の範囲第２８項記載のキット。 ３３．前記の短い鎖フラグメントは核酸のフラグメントを含む請求の範囲第３２ 項記載のキット。 ３４．ハイプリダイゼーション媒体を含心請求の範囲第２６項記載のキット。 ３５．前記容器は分解できるものである請求の範囲第２６項記載のキット。 ３６．前記容器は分配要素によって支持されているものである請求の範囲第２６ 項記載のキット。