JPH03117498A - ペスト菌に対するプローブの研究方法および製造方法と、それによって得られたオリゴヌクレオチドおよびプローブと、ペスト菌の検出方法 - Google Patents

ペスト菌に対するプローブの研究方法および製造方法と、それによって得られたオリゴヌクレオチドおよびプローブと、ペスト菌の検出方法

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JPH03117498A
JPH03117498A JP2157395A JP15739590A JPH03117498A JP H03117498 A JPH03117498 A JP H03117498A JP 2157395 A JP2157395 A JP 2157395A JP 15739590 A JP15739590 A JP 15739590A JP H03117498 A JPH03117498 A JP H03117498A
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Didier Georges J M Allaer
ディディエ　ジョルジュ　ジャン―マリー　アラエ
Michel Thierry Jean-F Rossius
ミシェル　ティエリ　ジャン―フランソワ　ロシウス
Dolores Vaira
ドロール　ヴェラ
Andre J J Renard
アンドレ　ジャン　ジョセフ　ルナール
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Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
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EUROP DE BIOTECHNOL SOC
Rhone Merieux SA
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、種々のペスト菌の共通プローブおよび／また
は特定プローブの研究方法および製造方法と、インビト
ロでＤＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡＤＮＡの分子ハイブリ
ッドによってペスト菌族のウィルスの検出用プローブ組
成中に導入される新規なオリゴヌクレオチドと、上記方
法で得られたプローブと、本発明によるプローブを用い
た検出方法とに関するものである。
従来の技術 現在の分類ではペスト菌属は基本的に３つの種類に分類
されている。すなわち、牛の下痢のウィルス（ＢＶＤ）
、豚コレラ閑、ボルダ（Ｂｏｒｄｅｒ）病のウィルスで
ある。これらの種は、各々多数の変種または亜種に分か
れており、正確に知られているものは僅かである。
これら各ウィルスによって引き起こされるウィルス性疾
患は、動物のウィルスによる他の疾患に伴うものと識別
するのが困難であり、従って、診断が難しい。
また、血清感染の危険性があるため、動物用製剤、ワク
チン等の調製に用いる血清中のペスト菌の検出検査を行
うことは必要不可欠のことである。
しかし、エリザ（ＥＬＩＳＡ）等の従来の診断法や検出
状不十分であることが多いことが分かっている。
標識を付けた小さなりＮＡまたはＲＮＡ　（プローブ）
配列を用いて、相同的（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）配列また
は相補的（ｃ　ｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｙ）配列を検出す
る分子ハイブリッド化技術はかなり前から知られている
。
しかし、ペスト菌の場合には変種や亜種が種々存在する
ため困難であるとともに、ペスト菌の大部分、可能であ
れば全てを検出し、場合によって同定する手段を開発す
る必要がある。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、種々のペスト菌の共通プロブおよび／
または特定プローブの研究方法と、その製造方法を提供
することにある。
本発明の他の目的は、ペスト菌ウィルスの検出および同
定用の分子ハイブリッド化プローブまたはプローブ混合
物として利用可能な、全ペスト閑に共通な配列および各
種および各亜種の特定配列の相補的配列のオリゴヌクレ
オチドを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、単純かつ容易に実施でき、
しかも、迅速で且つ信頼性が良く、少なくとも一部を自
動化することが可能な、サンプル中でペスト閑を検出お
よび／または同定する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段 本出願人は、コード化されていない領域でゲノムすなわ
ち端部５”　上の同じ領域に位置するペスト菌の変種の
ゲノムの一部分、より詳細には、ＢＶＤオスｏ　ｘ　（
Ｏｓ１ｏｓｓ）の塩基２００〜塩基３１０の間に位置す
る部分を配列化することが特に重要であることを発見し
た。
本出願人は、ＢＶＤウィルスの２つの変種の相補的配列
は既に公知（ＢＶＤ変種オスＴＩ′１ス（［１ｓｌｏｓ
ｓ）Ｃはヨー（１０バ特許出願第２０８．６７２号とＢ
　Ｖ　ＤＮａｄｌコレット（Ｃｏ１１ｅｔ）達の［細菌
学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　Ｊ　１６５号、１９８８年、
１９１〜１９９頁を参照）であるので、特にペスト菌の
下記１９の変種（その起源とその生物型は添付文献参照
）のゲノム中のこの部分（１１０個の塩基）を配列化し
た： ＢＶＤウィルスの１２変種、 ボルダ（Ｂｏｒｄｅｒ）病ウィルスの３変種、豚コレラ
ウィルスの４変種。
これら配列を比較研究することによって、全てのペスト
閑にほぼ共通な２０の塩基（第１図の９３〜７２の塩基
）の配列と、各種に特定な配列と、亜種の特定な配列を
決定することができた。
従って、本発明の対象は、ペスト閑に共通なプローブお
よび／またはその変種に特有なプローブの研究方法およ
び調製方法であって、ＢＶＤオスロス（Ｏｓ１ｏｓｓ）
ウィルスのゲノムの塩基２００〜３１０の間に位置する
領域に対応する符号化されていない領域に、これら符号
化されていない領域の両端部の所にハイブリッド化する
開始片を用いて、ペスト菌のゲノムの末端５′に向かっ
て位置した約１１０〜１１５個の塩基の領域を増殖し、
この増殖領域を配列化し、既に配列化されたペスト菌の
他の変種と類似領域と比較することによって、オリゴヌ
クレオチドの相同配列および／または特殊配列を調べ、
プローブを製造するためにこの配列を作ることを特徴と
する方法にある。
増殖は各々が下記の２つの開始片（ａｍｏｒｃｅ）また
はアンプリヌール（ａｍｐ　１１ｎｅｒ）を用いて実施
するのが好ましい： ５’　ＡＣＧ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＴＧ
ＣＣＣ３’５′ＴＧＴ　ＧＣＣＡＴＧ　ＴＡＣＡＧＣＡ
ＧＡ　ＧＡ　３・約１１０〜１１５塩基のこの区域は、
第２の開始片のハイブリッド化区域がペスト菌のゲノム
の読み取りの第１段階の開始ＡＵＧコドンの直前に位置
するという事実によって定義することもできる。
増殖区域の塩基７２〜９３の間に延びたる部分の外で特
定の配列を調べるのが好ましい。
第１図の参照番号Ａ−８の複数のまたは全部のつ、イル
スの配列に共通な配列および／または特定な配列を探す
のが好ましい。
本発明はさらに、上記の方法によって得られるオリゴヌ
クレオチドを対象とする。
本発明はさらに、共通配列と相補的な配列を有するオリ
ゴヌクレオチドと、上記の１９個の変種のペスト菌の各
ゲノムの特定配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを対象とする。
本発明によるオリゴヌクレオチドは下記の配列を有して
いる： 変種■、ＲおよびＳを除く第１図のペスト菌全邪の塩基
９３〜７２の相補的オリゴヌクレオチド１：５・ＧＴＧ
　ＧＧＩＩ：　ＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＡ　ＴＣ
Ａ　ＧＣ３’変種■の塩基９３〜７２の相補的オリゴヌ
クレオチド２： ５・ＧＴＧ　ＧＧＣＣＴＣＴＧ（：　ＡＧＣＧＣＣＣＴ
Ａ　ＴＣＡ　ＧＧ　３・変種ＲとＳの塩基９３−６８の
相補的オリゴヌクレオチド３； ５−　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＣＴＣＴＧＣＴＡＣＡＣＣＣＴ
Ａ　ＴＣＡ　ＧＧＣＴＧＴ豚コレラウィルスの変種の塩
基６８〜４４の相補的３′ オリゴヌクレオチド４　： ５・ＡＣＴ　ＣＣＣＡＴＣＡＣＧ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　Ｇ
Ａ　３“ボルダ（Ｂｏｒｄｅｒ）　Ｅの変種の塩基６８
〜４４の相補的オリゴヌクレオチド５　： ５・ＡＡ（：　ＣＣＣ＾＾ＣＡ（：Ａ　ＧＴＧ　ＡＧＧ
　ＴＧＴ　３’ボルデ（Ｂｏｒｄｅｒ）　ＦとＧの変種
の塩基６８〜４．４の＋ｉｌ補的オリゴヌクレオヂド６
　： ５・ＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴ　ＡＧＧ　ＴＧＴ
　３’ＢＶＤの変種Ｉ（とＫの塩基６９−５１の相補的
オリゴヌクレオチド７　： ５・　ＴＡＴ　　ＴＣＧ　　ＴＡＡ　　ＣＡＧ　　ＴＣ
Ｇ　　ＧＴＴ　　Ａ　　３’ＢＶＤの変種ＬＳＭ、Ｎお
よびＰの塩基６９〜５１の相補的オリゴヌクレオチド８
　： ５・ＴＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＧＧ　ＴＴＧ　ＧＴＴ
　Ａ　３゜ＢＶＤの変種０の塩基６９〜５１の相補的オ
リゴヌクレオチド９　： ５・ＴＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＧＧ　ＴＴＧ　ＧＴＣ
Ａ　３’ＢＶＤの変種Ｉの塩基６９〜５１の相補的オリ
ゴヌクレオチド１０： ５−　ＴＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＧＧ　Ｔｌ’：Ｇ　
ＧＴＴ　Ａ　３’ＢＶＤの変種Ｊの塩基６９−＝５１の
相補的オリゴヌクレオチド１１： 、’５’　ＴＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　
ＡＴＣＡ　３’ＢＶＤの変種Ｑの塩基６９へ・５１の補
足のオリゴヌクレオチド１２： ５＝　ＴＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＧＧ　ＴＣＴ　ＧＴ
ＣＴ　３’もちろん、いくつかのヌクレオチドは均等な
塩基、例えばイノシンを用いた要素と代えることができ
、これら準線な均等物は本発明の範囲に含まれる。
オリゴヌクレオチドは、１０個以十、特に１５＝１７個
の対応する配列の連続した塩基を含むのが好ましい。
本発明はさらに、本発明によるプローブの研究方法光調
製方法によって製造されたプｒ−１−ブを対象とする。
本発明はさらに、各々が上記の共通配列および特定配列
の全部または一部を有する一般的および特定な核プロー
ブを対象とする。
ハイプリント化の選択性の問題から、上記の核プローブ
は、少なくとも１５＝＝１７個の対応するオリゴヌクレ
オチド配列が連続した塩基を備えているのが好ましく、
さらには」１記の配列全部を備えいるのが好ま（７い。
しかし、それ以下の数の塩基、例えば１Ｏ＝１２個の塩
基を有する場合でも使用できるプローブもある。
検出する場合には、本発明による核プローブを公知の任
意の方法で標識化する。例えば、核プローブに放射性同
位体を結合させる。
非放躬什的検出方法の場合には、核プローブにアミン基
、Ｓ　Ｉ−４基または非放射性標識、物古結合可能なそ
の他の任意の分子のような付加基を付けることができる
。
また、それ自体公知の方法で、全てのプローブに共通な
検出用核フラグメント、例えば放射性同位体に結合され
た核フラグメントを有する公知の同一配列のヌク１／オ
チドにグラフト化することもできる。
本発明によるプローブは、例えば″ホスホラミシトく円
＋ｏｓｐｔ＋ｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）法”　　［ポーカ
ージ、　（Ｓ、　ｌ、。
Ｂ　ｅ　１１１．、Ｉ　ｃ　ａ　ｇｅ　）　　とカルデ
ル（［？ａｒｕｔｈｅｒｓ　Ｍ、　Ｈ，）、１９８１年
、テトラヘドロン　レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
ｓ　１．、ｅｔｔ、）第２２す、１８５９頁１または、
その他の適当な化学合成法１、二上って製造するのが好
ましい。
１−記ブローブを用いてペスト閑を検出する場合には、
オリゴヌクレオチド１に対応するプローブとオリゴヌク
レオチド２および３の１つ１こ文１応するプローブとを
含む混合物、または、好ましくは−れらの３つのプロー
ブの混合物を用いるのが好ましい。
豚−１し・うのウィルスを検出する場合には、オリゴヌ
クレオチド４に対応するプローブを用い、ボルデ（Ｂｏ
ｒｄｅｒ）病のウィルスを検出する場合には、オリゴヌ
クレオチド５および６に対応するプローブの混合物を用
い、ＢＶＤを検出する場合には、オリゴヌクレオチド７
〜１２に対応するプローブの混合物を用いて行うことが
できる。もちろん、これらを任意に組み合わせて用いる
ことができる。
本発明によるプローブを用いた本発明の分子ハイブリッ
ド化は、例えばウルデア（Ｍｉｃｋｅｙ　　Ｓ。
Ｕｒｄｅａ）の方法［［ジェヌ（ＧＥＮＥ）　Ｊ第６１
号、２５３〜２６４頁、１９８７年］を用いて、液体、
例えば動物の血液または血清サンプルまたは動物細胞の
全ＲＮＡを含むサンプルについて行うことができる。
本発明では、予めＲＮＡを増殖させて検出感度を増大さ
せることができるしサイキ（ＳＡＩにＩ）達の［サイエ
ンス（５ｃｉｅｎｃｅ）　」第２３０号、１５３０〜１
５３４頁、１９８５年１゜ 本発明はさらに、プローブの研究方法および製造方法と
、ペスト菌検出方法の増殖段階で用いられる、各々が下
記の配列を有する開始片を対象とする： ５′ＡＣＧ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＴＧＣ
ＣＣ３・５−　ＴＧＴ　ＧＣＣＡＴＧ　ＴＡＣＡＧＣＡ
ＧＡ　ＧＡ　３・本発明の上記以外の特徴と利点は、本
発明によるペスト菌のゲノム配列の転写を示す第１図を
参照して説明する以下の実施例によって明らかになろう
。但し、これらの実施例は、本発明を何ら限定するもの
で（まない。
実施例 ■、動物血清中での検出 ウルデア（Ｍｉｅｋｅｙ　Ｓ、　Ｕｒｄｅａ）達が記載
の方法（「ジェヌ（ＧＥＮＥ）　Ｊ第６１号、２５３〜
２６４頁、１９８７年）を用いることができる。
また、下記の方法を適用することもできる＝（１）　　
ラルザル（Ｄ、Ｌａｒｚｕｌ）達が「ジャーナル　オブ
　ヘパトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏ
ｌｏｇｙ）　Ｊ１９８７年、５／１９９〜２０４に記載
した、血清から核酸を抽出する方法。
（２）血清を７０℃で１時間、下記溶液中で培養する：
ｐ！（，６，５の酢酸ナトリウム２５　　ｍＭＥ　Ｄ　
Ｔ　Ａ　　　　　　　　　２．５ｍＭ０．５　％ＳＤＳ
　　［ノニデット（〜ｏｎ　１ｄｅｔ）　Ｐ４０シグマ
（３ｉｇｍａ）　　と交換可能１鮭精液のＤＮＡ　　　
　　１２．５μｇ／ｍ１゜（後記の調製を参照） ブロテイナーゼＫ［ボーリンガ−（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ）、マンヘイム（Ｍａｎｎｂｅｉｍ）　］２．５ｍｇ
／ｒｎＩ！ １容量のフェノール（調製については１１１項を参照）
を添加し、渦状に撹拌し、８０００　ｇで３分間遠心分
離し、上部相を回収する。
（４）エーテルジエチル１容量を添加し、渦状に撹拌し
、上部相を除去し、６８℃で３０分間培養し、エーテル
ジエチルの痕跡を除去する。
（５）酢酸ナトリウム（最終濃度０．２５Ｍ）と２．５
容量のエタノールを添加し、少なくとも２０分間７０℃
で数百する。
（６）　　８０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄み液
を除去し、残滓を乾燥させ、最小の容量の水に再懸濁す
る。
（７）下記のＩＩＩ項によって、増殖させる。
（８）　　ラルザル（Ｄ、　Ｌａｒｚｕｌ）達に記載さ
れた検出方法によって検出をする。
（３） ＲＮＡ細胞の調製は、チョムツィンスキー（Ｐ。
Ｃｈｏｍｃｚ　１ｎｓｋ　ｉ）とサツキ（Ｎ、　５ａｃ
ｃｈｉ）が［「アナリティ力ル　バイオケミカル（＾ｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　Ｊ、１６２号、１５６
〜１５９頁（１９８７年）１に記載の方法から誘いだ。
（ａ）ｍｌ： （１）変性溶液：４Ｍのチオシアン酸グアニジン、２５
ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５％のサルコシル、０
．１Ｍの２−メルカプトエタノール。
この溶液は１力月間保存でき、２−メルカプトエタノー
ルを含まない溶液は３カ月間同じ条件で保存できる。
（２）２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４ 〔３）　　フェノール：使用直前に５　Ｑ　ｍ　！、４
のトリス（Ｔｒｉｓ）Ｆ（ＣＩ溶液（ｐＨ＝７．５）、
５ｍｉ、ｌのＥＤＴＡ（ｐＨ＝７．５）を用いて平衡さ
せた蒸留フェノール（−２０℃に維持）（デカンクー付
きアンプルを使用。複数回平衡化させる必要がある）最
終溶液を４℃で２〜３週間保持される。
（４）　　クロロホルム／イソ−アミルアルコール（容
積で４９：１） （５）イソプロパツール （６）絶対エタノール （７）　　１０％サルコシル （８）　　ＰＢＳ　：　　ＫＣＩ　　２７ｍＭ、　　Ｋ
）１２Ｐ０４１５ｍＭ、、Ｎａ２ＨＰ０゜３２ｍＭ５Ｎ
ａＣ！　１３７ｍＭ （ｂ）手順 ■、この手順に記載の容積は、８０ｃｉの細胞液からＲ
ＮＡを製造するように計算されたものである。この容積
を、他の細胞液の面積に比例するように調節する（１０
段階の前まで）。
２、培地を吸込し、細胞液をＰＢ３５ｍｌで濯ぎ、上澄
み液を吸込する。
３、変性溶液３ｒｄ！を用いて細胞を溶解させ、その混
合物を容量１５−の殺菌管に移す（溶解溶液で培養箱の
底をよく洗浄する。溶液は、この段階で極めて粘性が高
いことが多い。）４、各反応物、２Ｍ酢酸ナトリウム０
．５ｄ、フェノール５ｍ！及びクロロホルム／イソアミ
ルアルコール１ｒｎｌを添加した後、この溶液を添加し
、管を逆さにしてゆっくりと撹拌する。
５．１５分間、氷上で冷却する。
６．２０分間、４℃で１００００　ｇで遠心分離する。
７、ＤＮＡやタンパクが存在する上部相と中間相を取ら
ないように注意しながら、水相（上部相）を回収する。
８．１容量のイソプロパツールを添加し、少なくとも１
時間−２０℃に放置する。
９．４℃で２０分間、１００００　ｇで遠心分離する。
１０、　　上澄み液を除去し、変性溶液０．７ｍｆ！中
にＲＮＡの残滓を再懸濁させ、全体を容量１．５ｍｌの
無閑管に移す。
１１．１容量のイソプロパツールを用いて、ＲＮＡを沈
澱させる。少なくとも１時間の、−２０℃に放置する。
１２、テーブル遠心機中で、８０００　ｇで１０分間、
４℃で遠心分離する。
１３、上澄み液を除去し、残滓を真空乾Ｌ’ｚ　（Ｓｐ
ｅｅｄｖａｃ）させ、それを殺菌水２００μβ中に再懸
濁させる。そこに、サルコシル（０，５％）を添加し、
残滓を懸濁させる。残滓がなかなか再懸１４゜ １５゜ １６゜ １７゜ １８゜ 濁しない時は、１０分間６５ｔに加熱し、１５秒間ずつ
数回ポルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）で撹拌する。
必要ならば、この処理をもう１回繰り返す。
フェノール２００μβを添加し、管を逆さにして撹拌し
、次に、クロロホルム／イソアミルアルコール２００μ
！を添加し、同様に撹拌する。
テーブル遠心機（８０００ｇ、４℃）で３分間遠心分離
し、水相（有機相）を回収する。クロロホルム／イソア
ミルアルコール２００μβを添加し、管を逆さにして撹
拌し、上記と同様に遠心分離する。
新規に水相を回収し、酢酸ナトリウム（最紋２濃度０．
２５Ｍ）とエタノール２．５容量を添加する。少なくと
も２０分間−７０℃で放置する。
８０００　ｇでテーブル遠心機で１５分間遠心分離し、
」二澄み液を除去する。残滓を真空乾燥（Ｓｐｅｅｄｖ
ａｃ）　Ｌ、、最小容量の殺菌水中に再懸濁させる。
２６０ｎｍでの光学密度から得られたＲＮＡの量９ を測定する。
ＲＮＡの濃度（μｇ／ｍ１．）− ＤＯ２６０（１ｃｍ＋）　１０．０２４通常、８０ｃｆ
ｆｌの融合細胞液からＲＮＡ２００μｇが得られる。
ｔｔＬｋでＲＮＡ（７１）ａ度を３．３μｇ／μｆｆｌ
；：調節する。
（ａ）溶液 （１）　　ＳＳＣ２０ｘ　　：　　ＮａＣ１１７５，３
ｇとクエン酸ナトリウム８８．２　ｇを８２０　８００
　ｍｌ中に溶解させる。
数滴のｌ０Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを７．０に調節する。
その容積をｌｌに調節する。
（２）　　ホルムアルデヒド溶液（３７％）（ｂ）手順 １、細胞の全ＲＮＡ３μβ　（１０μｇ）に、３７％ホ
ルムアルデヒド０．３μβを添加し、２０分間６０２゜ ３゜ ４゜ ５゜ ℃に加熱し、氷上で０℃に保つ。
ＳＳＣ２Ｏｘ　中１．：　５　分１’ｔＪｆｆニトロセ
ルロースシートを入れ、その後、吸い取り紙上で１０分
間室温でニトロセルロースを乾燥させる。
このように処理したニトロセルロース上ニＲＮＡ溶液３
．３μβを置く　（スポットは約１ｃ＋＋ｆ以下）。
ＳＳＣ６ｘの溶液中で２分間ニトロセルロースを濯ぎ、
１５分間室温で乾燥させる。
８０℃、真空下で２時間二トロセルロースヲ乾燥させる
。ニトロセルロース上に置かれたＲＮＡは、室温のデシ
ケータ内［ホヮットマン（ｗｈａｔｍａｎ）　３ＭＭ　
　濾紙２枚）で数遇間安定である。
Ｂ　ハイブリッド化 （ａ）溶液 （１）　　プレハイブリッド化溶液； ＳＳＣ４ｘ　（上記を参照） デンハルト（Ｄｅｎａｈｒｔ　５　ｘ　［７イコツル（
Ｆｉｃｏｌｌ） （２） （３） ４００．０．１２％（ｐ／ｖ）、ＰＶＰ　（ポリビニル
ピロリドン）０．１２％（ｐハ１）、牛の血清−アルブ
ミンのＶ分画０．１２％　　　１ 硫酸ナトリウノ・ドデシル０．１％（ρ／ν）変性され
た鮭の精子のＤＮＡ３ＱＱμｇ／ｍｆ！（下記１〕項を
参照） ハイブリッド化溶液： ＳＳＣ４ｘ　（上記を参照） ヂンハルト（Ｄｅｎａｈ百）２ｘ１フイコツル（Ｆｉｃ
ｏｌｌ）４００．０．０４％（ｐ／ｖ）　、牛の血清−
アルブミンのＶ分画０．０４％（ｐ／ｖ）］ 硫酸ナトリウｌ、ドデシル　３％（ｐ／ν）硫酸デクス
トラン１０％（ｐ／ｖ）　　（予め調製し、５０％溶液
で希釈） 変性された鮭の精子のＤＮＡ２００μｇ／ｍｌ（下記す
項を参照） １０分間、１００℃に加熱した標識化されたプローブ５
０　ｎｇ／ｒｎ！ 溶液Ｉ： ＳＳＣ２Ｘ　、　ドデシル硫酸ナトリウム０．１％ｐ／
ｖ（４） （５） 溶液、Ｊ・ ＳＳＣＯ，２５Ｘ、　ドデシル硫酸すトリウム０．１％
ｐ／ｖＴＥ　：　　１０ｍＭ−トリス（Ｔｒｉｓ）−Ｈ
ＣＬ　　ｐＨ＝７．５１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．５ （ｂ）鮭の精子のＤＮＡの調製 １、０．４　Ｍ　　ＮａＯＨ１００−中に夜間室温で鮭
の精子のＤＮＡ　１　ｇを溶解させる。
２．４５分間沸騰させる。
３、氷上で冷却し、氷酢酸でｐＨ＝７にする。
４．４０００ｇで１０分間、室温で遠心分離し、」−澄
み液を回収する。
５６絶対エタノール２容量を添加し、少なくとも６０分
間−２０℃に放置する。
６．８０００ｇで１５分間、室温で遠心分離（２、上澄
み液を除去する。
７、真空下で残滓を乾燥させる。
８、ＴＥ５０ｍｆ中にこの残滓を溶解させる。
９、２６０　ｎｍで光学密度を測定してＤＮＡＩを測定
する。
１０゜ ＤＮＡの濃度（μｇ／ｒｎ１．）− Ｄ　０２６０　　（１ｃｍ）　　１０．０２濃度を１０
ｍｇ／ｍｆ！に調節する。
このようにして調製した鮭の精子のＤＮＡは２０℃で数
カ月間保存できる。
（Ｃ）手順 １、プレハイブリッド化溶液１　ｍｌ　／　ｃｉ中で、
少なくとも４時間、５５℃でニトロセルロースヲ加熱す
る（Ｂ−ｄの項／以下を参照）。
プラスチックの袋中にフィルターを別け、容袋を熱シー
ルする前に気泡を除く。
２、袋を真空にし、ハイブリッド化溶液０．５ｍＪ！、
／ｅｉを添加する。少なくとも１２時間、５５℃に加熱
する（Ｂ−ｄの項を参照）。
３、袋を真空にし、開いて、５分間ずつ、４回室温で溶
液■でフィルターを洗浄する。
４．５分間ずつ、４回室温で溶液Ｊでフィルターを洗浄
する。
５．１５分間ずつ３回、４５℃で溶液Ｊでフィルターを
洗浄する（Ｂ−ｄの項を参照）。
６、プローブの標識型に従って表示する。
（ｄ）温度 上記の手順（Ｂ−ｃの項）で示した温度はプローブのＴ
Ｍによって決まる（ＴＭ−プローブの５０％がハイブリ
ッド化されていない形からハイブリッド化された形にな
る温度）。
ＴＭに対する塩基組成の効果は、プローブが５０未満の
塩基を有する時より大きい［メインコト（Ｊ、　ＭＥＩ
ＮＫＯＴＨ）　、ウオール（Ｇ、　ＷＨ八へ「アナリテ
ィカル　パ°イオケミストリイ　（八ＮＡＬ、　ＢＩＯ
ＣＩＩ巳１）」第１３８号、２６７〜２８４頁、１９８
４年）。２０個以下の塩基を有するオリゴヌクレオヂド
のプローブの場合には、標準条件（約０．９ＭのＮａＣ
１）　でハイブリッ化を行った時に、下記の式を用いて
ＴＭの近似値を決定することができる［ウォレス（Ｒ，
Ｂ。
ＷＡＩ、ＬＡＣＥ）達の「ヌクレイックアシズレスポン
ス（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）」第６号、３
５４３〜３６５６頁、１９７９年１： ＴＭ　　（ｔ）”４　　（Ｇ＋Ｃ）＋２　　（Ａ＋Ｔ）
（ここで、Ｇ、Ｃ，Ａ及びＴは、オリゴヌクレオチド中
の対応する塩基（グアニジン、サイトシン、アデニン、
チミン）の数に対応する）オリゴヌクレオチドのプロー
ブを用いてフィルター上でハイブッＩＪ　）化する（す
なわぢ、膜上に不動化した核酸サンプルを用いたハイブ
リッド化）では、配列を完全にハイブリッド化するため
に５℃未満の温度を使用する。ハイブリッド化していな
い各塩基対に対してこれらの短いプローブを用いる時に
は、温度をさらにに５℃下げてハイブリッド化の安定性
を維持する必要がある。
３、培養したＲＮＡの検出 下記の第１ＩＩ項に記載の方法によって動物細胞の全Ｒ
ＮＡを増殖させる。
この増殖中にＲＮ　Ａ　−ｂ（Ｄ　Ｎ　Ａ転写する。こ
こでは、ＤＮＡ、−ＤＮＡハイブッリド化に付いて説明
する。その方法はＩＩのＡ−ｂの項と下記の点のみが異
なる： ５分間、９５℃で増殖液１０μβを加熱する。
氷上に置く。
ニトロセルロースシートを５ＳＣ２Ｏｘ中に５分間入れ
、次いで室温で１０分間、吸い取り紙上でニトロセルロ
ースを乾大桑させる。
この処理をしたニトロセルロース上で通常に市販されて
いる［ドツト　ブロッティング（ＤｏｔＢｌｏｔｔ、ｉ
ｎｇ）　Ｊ装置を用いて１０μβの試料を付ける。
このニトロセルロースを真空下、８０℃で工時間乾燥す
る。
ＩＩＩ　　　ＲＮＡの増殖 増殖によって核酸の配列を増殖させる。すなわち、開始
片（ａｍｏｒｃｅ）をハイブリッド化し且つ三燐酸ヌク
レオチドとＤＮＡポリメラーゼまたはその他の重合酵素
の存在下で開始片から配列の相補的鎖を合成して、開始
片を延ばした生成物を下記配列の合成用母体として使用
する。
この増殖は２つの開始片で行われ、各開始片は下記の相
補的ＤＮＡ列上の特定のサイｈ、＝ハイブリッド化され
る： （１）開始片Ａ：５゛＾（：Ｇ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＡＧ
Ｇ　ＧＣＡ　ＴＧＣＣＣ（ＢＶＤ、ｔスｏス（Ｏｓｌｏ
ｓｓ）ケ／　ム（７）塩基２３４〜塩基２５４の相補的
配列） （２）開始片Ｂ　：　　５’　ＴＧＴ　ＧＣＣＡＴＧ　
ＴＡＣＡＧＣＡＧＡ　ＧＡ（塩基３８５〜塩基３６５の
相補的配列）３“ ３′ １、転写酵素用の開始片のハイブリッド化（開始片Ｂ） （１）ＲＮＡ溶液を１〜８μ１（１０〜２０μｇ）を採
取する。
（２）開始片の役目をするオリゴヌクレオチド２０ｎｇ
を添加する。
（３）最終容積１０μｐ中での最終濃度を下記のように
する： ＫＣＩ　　２５０ｍＭ　。
トリス（Ｔｒｉｓ）　−ＨＣＩ　２．５ｍＭ５ｐＨ＝　
７、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　Ｏ，２５ｍＭ （４）　　１５分間、６５℃に加熱する。
６０分間、室温（またはそれ以上の温度）で放置する。
この温度は、オリゴヌクレオチドの配列と培地の塩濃度
、この場合は０．２５Ｍ、によって決まる。この温度は
下記の各種の方法で決めることができる。
（ａ）　　メインコト　（Ｊ、　ＭＥＩＮＫＯＴＨ）と
ウオール（Ｇ、　ＷＨＡＬ）の「アナリティカル　ハイ
オケミストリイ　（ＡＮＡＬ、　ＢＩＤＣＨＥＭ）　」
第１３８号、２６７〜２８４頁、１９８４年（ｂ）　　
ウォレス（Ｒ２Ｈ，ｌ１ＩＡＬＬＡｃＥ）達の「ヌクレ
イックアシズレスポンス（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
、）　Ｊ　６号、３５４３〜３６５６頁、１９７９年（
Ｃ）　　ボッデル（Ｄ、　Ｖ、　ＧＯＥＤＤＥＬ）達の
［ネーチャア（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ第２８７号、４１１
〜４１６頁、１９８０年 （ｄ）サッグス（Ｓ、　Ｖ、　５ＬＩＧＧＳ）達（７）
”ナチｓラル　アカデミツクサイエンス予稿集 （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　　Ｊア
メリカ合衆国、第７８号、６６１３〜６６１７頁、１９
８０年（ｅ） （ｆ） スツォスタック（Ｊ、　Ｗ、　５ＺＯ５ＴＡＫ）達の「
メトノズ　エンジモロジイ（Ｍｅｔｈ、ｏｄｓＥｎｚｙ
ｍｏｌ、）　Ｊ第６８号、４１９〜４２８頁、１９８０
年 サッグス（Ｓ、　Ｖ、５ＬＩＧＧＳ）達の［アイシーエ
ヌーユーシーエルエー　シンポジウ ム　デップロッピング　バイオロジー （Ｉ（：Ｎ−ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐ、Ｄｅｖ、　　Ｂｉｏ
ｌ、）　　Ｊ第２３号、６８３〜６９３頁、１９８１年 ２、転写酵素によるＤＭＡ鎖の合成 （１）ベスダ研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＭ−ＭＬＶの転写
酵素：Ｍ−ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌ
ｅｕｋｅｍｉａν１ｒｕｓ）　　のクローンを２０単位
添加する。
（２）最終容積３３μβ中で最終濃度が以下のようにな
るように調節するニ ドリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ　　ｐＨ＝８．６　　７ｍ
ＭＭｇＣＬ　　　　　　　　　　　　　　　７ｍＭＤＴ
Ｔ　（ジチオトレイトル）　　　　　３．５ｍＭ（３） 開始片Ｂ　　　　　　　　　　　５　ｎｇ／μ１ＫＣＩ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５ｍＭ２２
℃で１５分間培養し、次に、３５℃で４５分間培養する
。
３、増殖 （１）最終容積１００μβ中での最終濃度を下記のよう
に調節する： ＫＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍＭトリス
（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ　　ｐＨ＝８．６　　１０ｍＭＭ
ｇＣ１ｚ　　　　　　　　　　　　　２．５ｍＭゼラチ
ン　　　　　　　　　　２００ｎ　ｇ　／μｌＤ　Ｎ　
Ｔ　Ｐ　　　　　　　　　　　　２００　μＭ開始片−
Ａ　　　　　　　　　　Ｌｏｎｇ／μｌ開始片−Ｂ　　
　　　　　　　　Ｌｏｎｇ／μβ（２）ＴＡＱ［ニュー
イングランドバイオ研究所（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）のＴｈｅｒｍｕｓ　Ａｑｕａｔ＋ｃｕｓ
ＤＮＡポリメラーゼ：　カレディン（＾、Ｓ。
ＫＡＬＥＤＩＮ）達の［パイオキミア（Ｂｉｏｋｈｉｍ
ｉａ）　Ｊ第４５　（４）号、６４４〜６５１頁、１９
８０年参照］を４単位添加する。
（３）　　３６０秒間、９３℃に加熱する。
Ａ）６０秒間、９３℃に加熱する。
Ｂ）　１２０秒間、２２℃またはそれ以上の温度（場合
によってさらに長い時間）加熱する。
Ｃ）７２℃で９０秒間、培養する。
（４）Ａ−Ｃの段階を４回繰り返す。
（５）次に、下記の温度のザイクルを２５〜３０回繰り
返す： Ｄ）９３℃で、６０秒間 Ｅ）５５℃で、９０秒間 Ｆ）７２℃で、９０秒間 この増殖段階はヨーロッパ特許出願第２３６．０６９号
に記載のような装置で実施するのが好ましい。
文献 １．　　　Ａｙｎａｕｄ、　Ｊ、　Ｍ、、　１９６８．
　　Ｅｔｕｄｅ　ｄｅ　Ｉａ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｅｎｃｙｃｌｅ　ｕｎｉｑｕｅ　ｄ’ｕｎ　ｃ
ｌｏｎｅ　ｄｕ　ｖｉｒｕｓ　ｄｅ　Ｉａ　ｐｅｓｔｅ
　ｐｏ「Ｃ１ｎｅ　ｅｌａｓｓｉｑｕｅａｕ　　ｍｏｙ
ｅｎ　　ｄｅ　　ｌ’ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｅｅ、　　　Ａｎｎ、　　　Ｒｅｃｈ、　　Ｖｅｔｅ
ｒ。
１：２５−３６ ２、　　　　　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、Ｊ、Ｉ土、Ｂａｋ
ｅｒ、Ｊ、Ａ、ａｎｄ　　ＭｃＥｎｔｅｅ、に、、１９
６０゜Ａ　ｅｙｔｏｐａ市ｉｅ　ｓ汀ａｉｎ　ｏｆ　ｖ
ｉｒｕｓ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ、　　Ｃｏｒ
ｎｅｌｌ　Ｖｅｔ。
５０ニア３−７９ ３、　　　Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔ、　Ｄ、　Ｅ、　ａｎｄ
　Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ、　Ｗ、　Ａ、、　１９６３゜５
ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　５ｏｌｕｂｌｅ　ａｎ
ｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓ　ｏｆＢｏｖｉｎｅ　　Ｖｉｒｕｓ　　Ｄｉ
ａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅ
ｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　ＨｏｇＣｈｏｌｅｒａ、
　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｍｅｄ、　ａｎｄ　Ｖ
ｅｔ、　Ｓｃ、　２７：ｎ’　５４、　　　Ｌａｕｎａ
ｉｓ、　Ｍ、、　Ａｙｎａｕｄ、　Ｊ、　Ｍ、　ａｎｄ
　Ｃｏｒｔｈｉｅｒ、　Ｇ、、　＋９７２゜５ｗ１ｎｅ
　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ　：　ｐｒｏｐｅｎｉｅｓ　
ｏｆ　ａ　ｃｌｏｎｅ　（Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ　５ｔｒ
ａｉｎ）ｉｓｏｌａｔｅｄ　　ｉｎ　　ｃｅｌｌ　　ｃ
ｕｌｔｕｒｅ　　ａｔ　　ｌｏｗ　　ｔｅｍｐｅｒａｔ
ｕｒｅ、　　　Ｕｓｅ　　１ｎｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ
、Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、　Ｖｅｔｅｒ、　　＋２３：１５
３７−１５５４゜５、　　　ＭｃＣＩｕｒｋｉｎ、　Ａ
、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｃｏｒｉａ、　Ｍ、　Ｆ、、　＋９
７８．　５ｅｌｅｃｔｅｄｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｂ
ｏｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｄｉａｒｒｈｅａ　（ＢＶＤ
）　ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ　ｏｎｂｏｖｉ
ｎｅ　＋ｕｒｂｉｎａ＋ｅ　ｃｅｌｌｓ　：　ｖｉｒｕ
ｓ　ｔｉｔｒｅ　ａｎｄ　５ｏｌｕｂｌｅ　ａｎｔｉｇ
ｅｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｓ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉ
ｎ　ｉｒｎｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｋｉｌｌ
ｅｄ　ｎＶＤ　ｖｉｒｕｓ。
Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　５８：１Ｉ９−１２８４、
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明によるペスト菌のゲノムの転写ＤＮＡ配
列を示す。 ロース メリュ 代 理 人

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）ペスト菌に共通なプローブおよび／またはその変
    種に特有なプローブの研究方法および調製方法であって
    、ＢＶＤオスロス（Ｏｓｌｏｓｓ）ウィルスのゲノムの
    塩基２００〜３１０の間に位置する領域に対応する符号
    化されていない領域に、これら符号化されていない領域
    の両端部の所にハイブリッド化する開始片を用いて、ペ
    スト菌のゲノムの末端５′に向かって位置した約１１０
    〜１１５個の塩基の領域を増殖し、この増殖領域を配列
    化し、既に配列化されたペスト菌の他の変種と類似領域
    と比較することによって、オリゴヌクレオチドの相同配
    列および／または特殊配列を調べ、プローブを製造する
    ためにこの配列を作ることを特徴とする方法。 （２）下記の配列を有する２つの開始片を用いることを
    特徴とする請求項１に記載の方法： 【遺伝子配列があります。】 （３）増殖領域のほぼ塩基７２〜９３の間に延びた部分
    の外で特定配列を探すことを特徴とする請求項１または
    ２に記載の方法。 （４）増殖領域のほぼ塩基７２〜９３の間に延びた部分
    で共通配列を探すことを特徴とする請求項１または２に
    記載の方法。 （５）第１図に参照番号Ａ〜Ｓで示したウィルスの複数
    または全部の配列中で共通配列および／または特定配列
    を探すことを特徴とする請求項３または４に記載の方法
    。 （６）請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によっ
    て得られるオリゴヌクレオチド。（７）下記の配列を有
    するオリゴヌクレオチド：【遺伝子配列があります。】 （８）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺伝
    子配列があります。】 （９）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺伝
    子配列があります。】 （１０）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１１）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１２）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１３）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１４）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１５）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１６）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１７）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１８）下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：【遺
    伝子配列があります。】 （１９）対応する配列の連続した１０個以上、特に１５
    〜１７個の塩基を有することを特徴とする請求項７〜１
    ８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレチオド。 （２０）請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によ
    って調製されたプローブ。 （２１）請求項７〜８のいずれか一項に記載の配列を全
    部または部分的に有することを特徴とする分子ハイブリ
    ッド化によるペスト菌検出用ＤＮＡプローブ。 （２２）請求項１０に記載の配列を全部または部分的に
    有することを特徴とする分子ハイブリッド化による豚コ
    レラウィルス検出用ＤＮＡプローブ。 （２３）請求項１１または１２に記載の配列を全部また
    は部分的に有することを特徴とする分子ハイブリッド化
    によるボルデ（ＢＯＲＤＥＲ）病検出用ＤＮＡプローブ
    。 （２４）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の配列
    を全部または部分的に有することを特徴とする分子ハイ
    ブリッド化によるＢＶＤウィルス検出用ＤＮＡプローブ
    。 （２５）請求項２１に記載のＤＮＡプローブの少なくと
    も２つの型を含む混合物。 （２６）請求項２３に記載の２つのＤＮＡプローブを含
    む混合物。 （２７）請求項２４に記載のＤＮＡプローブの少なくと
    も２つの型を含む混合物。 （２８）対応する配列の連続した１０個以上、特に１５
    〜１６個の塩基を有することを特徴とする請求項２１〜
    ２７のいずれか一項に記載のＤＮＡプローブ。 （２９）化学合成によって得られることを特徴とする請
    求項２１〜２８のいずれか一項に記載のＤＮＡプローブ
    。 （３０）液体、例えばテストする動物の血液または血清
    のサンプルに請求項１〜５または２１〜２９のいずれか
    一項に記載のプローブまたは混合物を使用することを特
    徴とする分子ハイブリッド化によるペスト菌種のウィル
    スの検出方法。 （３１）テストする動物の細胞の全ＲＮＡを含むサンプ
    ルに請求項１〜５または２１〜２９のいずれか一項に記
    載のプローブまたは混合物を使用することを特徴とする
    分子ハイブリッド形成によるペスト菌種のウィルスの検
    出方法。 （３２）ハイブリット形成前に適当な１組の開始片を用
    いて、ウィルス性ＲＮＡを増殖させることを特徴とする
    請求項３０または３１に記載の方法。 （３３）各々が下記の配列を有することを特徴とする請
    求項１〜５または３２のいずれか一項に記載の方法を実
    施するための開始片： 【遺伝子配列があります。】
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