JP3737988B2 - ポリヌクレオチド組成物および方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
〔発明の概要〕
特異的なポリヌクレオチド組成物およびその生産方法を開示する。生産されたポリヌクレオチドは非相補的なヌクレオチド配列を全く含有しない。この特異的なポリヌクレオチドは、治療剤としてラベルされ診断に応用するプローブを生産するのに使用でき、または薬剤の配送にまたは治療剤として使用できる。
【０００２】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、特異的なポリヌクレオチド組成物およびその生産方法に関する。
【０００３】
〔従来の技術〕
ポリヌクレオチド調製物は、一般に特異的に意図するヌクレオチド配列および意図しない、実際は意図するポリヌクレオチドの使用を妨害し得る他のポリヌクレオチドからなる。これらの調製物は従来次のようにして得られた。所望のポリヌクレオチドのコピーを細菌プラスミドのようなベクタに挿入し、結果的に組換えベクタを得る。その後組換えベクタを細菌のような宿主に導入し、結果的にこれが複製する形質転換宿主を得る。 組換えベクタのプラスミド複製を許容する生育期間の後、多コピーを単離し、必要に応じて所望のポリヌクレオチドを切除する。これらのポリヌクレオチド調製物は、特に治療および診断応用に用途を有する。
【０００４】
この従来の方法では、所望のポリヌクレオチドを含有する調製物は意図しない他のポリヌクレオチドをも一般に含有する。これらのポリヌクレオチドは２つの起源、ｐＢＲ３２２のようなクローン化に使用する従来のベクタおよび宿主染色体から生起する。所望のポリヌクレオチドを含有する単難物がラベルされている場合、これらの他のポリヌクレオチドもラベルされている。これらの他のポリヌクレオチドの多くは、生物サンプルにしばしば認められる共生細菌のポリヌクレオチドに相補的である。よって、これらの他のラベルされたポリヌクレオチドは診断応用で偽陽性を与えるサンプルで共生細菌と反応し得る。これらの欠点は、アール・エフ・アムビンダら「臨床例の診断的核酸ハイブリダイゼーションにおけるベクタ相同問題」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，２４，１６−２０（１９８６）で考察されている。
【０００５】
挿入物がヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）に対して特異的であり、かつｐＵＣ９ベクタにクローン化されているものが一例である。ベクタはイー・コリ細胞に導入されイー・コリは複製を許容される。ＨＰＶ挿入物を含有するベクタポリヌクレオチドは、当業界で公知の幾つかの方法のいずれかによりイー・コリ細菌から単離される。ＨＰＶ挿入物は制限酵素で開裂され、精製され、例えば蛍光分子でニックトランスレーションによりラベルされる。１つはＨＰＶを含有し１つは含有しない２つの異なる膣汚染に対しこのＨＰＶプローブを試験するに際し、イー・コリ細菌はしばしば女性尿管に棲息するため両方の試験が陽性と表れ得る。ＨＰＶ陰性膣汚染で得られる偽陽性は、ＨＰＶ特異的ポリヌクレオチドをラベルする途中にラベルされプラスミドまたはイー・コリの染色体に見出されるポリヌクレオチド配列に相補的なＨＰＶプローブの中にまたは共に存在する非特異的ポリヌクレオチドの結果である。ＨＰＶ陰性サンプルの尿管内におけるイー・コリ細胞の豊富な存在は、プローブに存在する低レベルのラベルされたイー・コリポリヌクレオチドを補償して余りある。イー・コリポリヌクレオチドに相補的でない所望のポリヌクレオチドを生産する１つの方法は、例えば遺伝子合成装置によりポリヌクレオチドを合成的に生産することである。現在利用可能な装置は約５０ヌクレオチド（０．５０ｋｂ） のポリヌクレオチドを生産することができる。しかしながら、この方法で調製したポリヌクレオチドはより長い（１〜２ｋｂ）配列をラベルし得る程にはラベルし得ない。長いプローブは一般に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするに際し短いプローブより大きなシグナルを与える。
【０００６】
さらに、長く伸長したポリヌクレオチドの間で形成されたハイブリッドは、短く伸長したポリヌクレオチドの間で形成されたハイブリッドより顕著に熱力学的に安定である。これによりハイブリッドが高温および高緊縛条件下でインタクトなまま留まるのが許容され、無作為に形成されたハイブリッドの変性が単純化される。
【０００７】
よって、 特にハイブリダイゼーション検定において、均一なヌクレオチド調製物、特に現在遺伝子合成装置から得ることのできるものより長い配列を提供するものを創製する方法の必要性が存する。
【０００８】
〔発明が解決しようとする課題〕
この必要性に応えるべく、本発明は、意図するもの以外の非特異的オリゴまたはポリヌクレオチドを含有しない意図する特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドからなる組成物を提供する。このオリゴまたはポリヌクレオチドは、遺伝子合成装置により達成され得るより何倍も長い配列となり得、他の試験管内または生体内技術から従来利用可能であったものより均一である。この種の均一なオリゴまたはポリヌクレオチドは、特にハイブリダイゼーション検定試薬調製に使用するのに有利である。
【０００９】
〔課題を解決するための手段〕
よって発明によれば、意図する特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドからなり非特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドを含有しない組成物が提供される。この組成物は、（Ｉ）意図するオリゴまたはポリヌクレオチド挿入物を含有するベクタを形成し、（II）前記挿入物を適切な細胞または無細胞系で複製し、（III）挿入物と会合しない全ゆるオリゴまたはポリヌクレオチドをアニールし得なく処理し、かつ（IV）前記挿入物を特異的なオリゴまたはポリヌクレオチド組成物として回収する工程からなる方法により調製する。１つの観点では、この細胞または無細胞系は宿主細菌細胞であり、かつオリゴまたはボリヌクレオチドを選択的不活性化または消化によりアニールし得なく処理する、ベクタは致死的ファージとすることができ、オリゴまたはポリヌクレオチドをこれにより不活性化する。例えばこの致死的ファージは、Ｔ偶数系ファージ、ファージＴ７、またはファージベクタＴ７−Ｔ１０２，Ｔ７−Ｔ１０４，Ｔ７−Ｔ１０５並びにＴ７−Ｔ１０６のような溶菌性ファー ジとすることができる。致死的ファージは、温度依存性または宿主選択性のもののような溶菌性欠損ファージとすることもできる。ベクタが溶菌性欠損ファージである場合は、この方法は、宿主複製系の全ゆる細胞膜を破壊する付加工程を含む。
【００１０】
他の観点では、ベクタは致死的ファージである必要はない。この観点では、この方法は、ベクタが蛋白質コートを有するファージである場合は、ベクタ含有細胞または無細胞系に裸のオリゴまたはポリヌクレオチドを不活性化するが蛋白質を不活性化しない物質を導入する付加工程を含む。例として、この種の不活性化または消化特性を有する物質は、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼまたはこれらの組合せのようなヌクレアーゼである。
【００１１】
本発明は、さらに前記した方法により調製する組成物を提供する。この組成物は、意図する特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドからなり非特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドを含有しない。この組成物は、ハイブリダイゼーションまたは他の特異的な結合系について公知の全ゆるラベル系でラベルを行うのに特に適切であり、かつハイブリダイゼーション検定、薬剤配送並びに遺伝子制御を含む用途について例外的な特異性の試薬を提供する。
【００１２】
前記した態様の他の観点では、本発明は、意図する標的配列に特異的に相補的なオリゴまたはポリヌクレオチド配列を有する致死的ファージからなる組換えベクタを提供する。前記したように、致死的ファージは溶菌性または溶菌性欠損とすることができる。典型的な溶菌性ファージは、ファージＴ７、Ｔ偶数系ファージ、Ｔ７−Ｔ１０２，Ｔ７−Ｔ１０４，Ｔ７−Ｔ１０５並びにＴ７−Ｔ１０６である。典型的な溶菌性欠損ファージは温度依存性または宿主選択性のものである。
【００１３】
全ゆるファージの観点および態様で、組換えベクタはさらに少なくとも１つのラベル系の成分を組込み得る。 このラベル系成分は、オリゴまたはヌクレオチド配列のまたはファージのまたは両方の少なくとも１つのヌクレオチドで組込まれ得る。典型的なラベル系成分はビオチンおよびそのアナログ、酵素、蛍光物質、ラジオラベル並びにその類似物を含む。
【００１４】
前記したように、本発明は組成物および特異的なポリヌクレオチド調製物、すなわち非特異的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含有しない調製物を生産する方法を開示する。
【００１５】
意図するポリヌクレオチドは通常は少なくとも５０のヌクレオチドからなり、この配列は標的配列に対し独特であり、特異的な生物または特異的な群の生物に対し独特または特徴的である。この種の挿入物から得られるポリヌクレオチド断片は、これらが生物の標的配列と独特にハイブリダイズするのに十分な配列のヌクレオチドを含めば特異的なポリヌクレオチドと考えられる。標的は狭くも広くもなり得、属の単一の種から幾つかの属の多数の種にまで及ぶ。この種の特異的なポリヌクレオチドは、よって標的生物または組織の存在を検出するプローブとして使用し得、治療実体としてまたは薬剤配送系の一部として使用し得る。
【００１６】
溶菌性ファージの選択および使用
１つの態様では、 本発明は致死的ファージを使用することを企図するが、これは、感染に際し宿主細菌の生存能力を破壊する溶菌性または溶菌性欠損ファージである。致死的ファージから誘導されたベクタは宿主染色体の全ゆるポリヌクレオチドに対し全く相同性を有しないだろう。ファージは一般に複製して宿主細胞当り約５０〜５００のファージ粒子を生産し、同時に宿主ポリヌクレオチドを崩壊させる。よって、唯一残る無傷のオリゴまたはポリヌクレオチドはベクタおよび意図する挿入物のものである。
【００１７】
本発明によれば、ベクタとして使用すべく選択するファージのポリヌクレオチドを単離し、予備決定した制限エンドヌクレアーゼにより切断して挿入部位を与えた後、意図する特異的なポリヌクレオチドを導入して組換えポリヌクレオチドを生産する。
【００１８】
組換えポリヌクレオチドをパッケージし、適切な宿主細胞を使用する標準的方法でファージのストックを作成する。ファージが複製するのを許容する適切な宿主を選択する。イー・コリは好適な宿主細胞である。
【００１９】
所望のファージの組換えポリヌクレオチドをフェノール処理によりこれらのカプシドから除去する。その後組換えポリヌクレオチドは、従来のベクタを用いるのと異なり直接ラベルして使用し得る。その他、挿入物をシグナル生成系の１つの成分として後に働き得るベクタ配列の一部と共に回収することができる。或いは所望に応じて、 これを酵素的に処理して特異的なポリヌクレオチド挿入物を開裂し得る。この場合、標準的方法を使用して挿入物を単離し、特異的なポリヌクレオチド単独をラベルする。このラベルを達成する方法は当業者にとって公知である。
【００２０】
本発明によって組換えポリヌクレオチドから作成するプローブは、細菌宿主染色体ポリヌクレオチドに相補的な如何なるポリヌクレオチドをも含有しないだろう。致死的ファージは増殖期間の後にその細菌宿主の生存能力を破壊する機構を有するため、宿主染色体はもはや複製し得ない。さらに、ファージは一般に宿主ポリヌクレオチドを崩壊させるため、ファージポリヌクレオチドと宿主染色体との間でどのような組込みが自然に起ったとしても、結果する組込み生成物は破壊される。それにも拘らず、絶対的な純粋性を確実にすべく、塩化セシウムグラジエントにより、および／またはデオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼまたは両方を使用するヌクレアーゼ処理を混合物に施すことにより混合物中の全ゆる宿主ポリヌクチオチド残渣からファージを分離し得る。ヌクレアーゼは裸のポリヌクレオチドを崩壊させるのみでファージを崩壊させない。
【００２１】
プローブは細菌宿主染色体にまたはこの種の宿主が有するプラスミドに見出されるポリヌクレオチドに相補的な如何なるポリヌクレオチドも含有し得ないため、生物サンプル中でプローブが非特異的なポリヌクレオチドとハイブリダイズすることはあり得ない。
【００２２】
この態様の１つの例として、Ｔファージのようなある種の好適な溶菌性ファージの使用を構成する。Ｔファージおよび他の溶菌性ファージのいずれをも使用し得るのであるが、好適例はＴ７ ２本鎖ＤＮＡバクテリオファージであり、これは長きに亘り著述されている。デュンとスツジル、「バクテリオファージＴ７ＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびＴ７遺伝素子の位置」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，４７７〜５３５（１９８３）を参照するとよい。
【００２３】
Ｔ７の全ゲノムの配列および遺伝的機能は公知であるため、これをベクタとして使用すれば有利である。この利点は、 多数の必須でない遺伝子が存在し、これらを除去しても適切な宿主でのファージの生存能力に影響を与えないという事由による。 例えば、宿主の制限酵素活性を除去し、そうでなければＴ７ファージを破壊する蛋白質をコードする遺伝子が存在する。もしこの種の制限酵素を含有しない宿主細菌を使用すれば（制限マイナス）、これらの蛋白質をコードするＴ７ファージの遺伝子領域は必要でない。ファージＤＮＡは感染粒子にパッケージされる所定の大きさでなければならない。一般に、結果的に得られる粒子中のＤＮＡの大きさは約１０％を越えて延長し得ず、２０％を越えて低減し得ない。よってこれにより挿入物の大きさの限界が置かれる。しかしながら、ファージから必須でない遺伝子が欠失されれば、その後より大きい挿入物を組込み得る。
【００２４】
例えば、生成物はもとのＴ７ＤＮＡおよび挿入物として特異的なヌクレオチド配列を含み得る（組換えポリヌクレオチド）。このＤＮＡ分子は蛋白質コートでパッケージされる必要があり、この結果イー・コリ細胞に感染し得る。パッケージ蛋白質を調製する適切な方法はクエムメルレとマスカ、Ｖｉｒｏｌ．２３，５０９（１９７７）により著述されている。この方法は、適切なサプレッション・ネガティブのイー・コリ宿主におけるＴ７の変異株の使用を含み、パッケージ蛋白質を与える。
【００２５】
Ｔ７ＤＮＡと挿入物ＤＮＡとのライゲーション混合物を全ての付加的に必要な成分と共に抽出物と一緒にイ ンキュベートするが、これは当業者には公知である。パッケージングが起るのに十分な時間が経過した後、混合物を宿主細胞の培養物に添加し、溶けた寒天とスラリとをブロス寒天平板に注入する。プラークが形成されるまで平板を３７℃でインキュベートする。特異的なポリヌクレオチドすなわちプローブファージを含有するプラークをその後決定する。いずれかのプラークにおける特異的なポリヌクレオチドの存在を検出する１つの方法は、プラークリフトを作成しそれぞれのプラークからのＴ７ポリヌクレオチドを特異的なポリヌクレオチドからなるプローブを用いてインキュベートすることによる。例えば、マニアテスら、Ｎｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，コールド・スプリング・ハーバ研究所（１０８２）を参照するとよい。特異的なポリヌクレオチドの存在は、（１）多数のプラークからのファージストックを増殖させ、（２）フェノール処理／エタノール沈澱によりプラークからポリヌクレオチドを単離し、（３）適切な制限酵素を使用してファージ中の特異的なポリヌクレオチドの存在を同定することによっても決定し得る。
【００２６】
所望のファージプラークを同定した後は、精製したファージストックを一連の希釈によってこれより得る。ファージを回収して培養し、プラークを単離し、これよりファージストックを調製する。その後これらのファージストックを用いて、この一部を宿主細胞の液体培養に添加して溶菌が起るまでインキュベートすることにより大スケール量のファージを調製する。塩化セシウム遠心分離および／またはヌクレアーゼ処理により残余する可能性のある宿主染色体ポリヌクレオチドからファージを精製する。
【００２７】
非溶菌性ファージの選択および使用
溶菌性欠損ファージは宿主細胞の生存能力を破壊してそれ自身のポリヌクレオチドを複製することができるが、ある種の状況下では宿主細胞を溶菌しない。例えば、これらは温度感受性、または宿主範囲変異株とすることができ、この場合、これらは宿主細胞を特定の温度または宿主を使用したときにのみ溶菌することとなろう。よって、ファージが細胞を溶菌する条件下でこれらは宿主細胞中で複製し得る。しかしながら、一旦所望のファージを得れば、溶菌が起らない条件下でこれらは宿主細胞中で複製し得る。一旦ファージが宿主のポリヌクレオチドを崩壊させそれ自身のゲノムを複製すれば、ファージ粒子をなお担持する宿主細胞は少量の容積で集められる。その後、宿主細胞の膜を例えば界面活性剤溶菌により破裂させ、ヌクレアーゼにより宿主ポリヌクレオチドを崩壊させ、ファージ粒子を集める。その後例えば塩化セシウムのグラジエントにより溶菌中に形成された残渣からファージ粒子を精製する。
【００２８】
宿主細胞のポリヌクレオチドを別個に不活性化して全ての宿主細胞ポリヌクレオチドを精製の過程で意図するポリヌクレオチドから分離しなければならない。よって従来の技術では、これらの宿主ポリヌクレオチドが意図するポリヌクレオチドの調製物に混入する。
【００２９】
宿主細胞ポリヌクレオチドを不活性化する１つの方法は前記したようにヌクレアーゼ処理によるものである。 他の方法はこれらを不可逆的に架橋結合するものである。この方法は宿主細胞のポリヌクレオチドが主として２本鎖形態であることを必要とする。２本鎖ポリヌクレオチドを架橋する多数の試薬が利用可能である。しかしながら、試薬は、ファージ蛋白質コートに浸透してファージのポリヌクレオチドをも不活性化し得るものであってはならない。
【００３０】
この方法の変法は、内位添加剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を付着させるもので、これは２本鎖ポリヌクレオチドをビーズに架橋する能力を有する。ビーズは例えばセファロース、アガロース、またはシリカのようないずれのポリマとすることもできる。内位添加剤は、内位添加剤がビーズと反応しなお内位添加剤上に架橋に必要な機能を無傷のまま残し得るようこれを誘導することによりビーズに付着させる。この種の試薬の例はプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、内位添加かつ架橋剤である。プソラレンは、例えばアガロースと反応し得るイソチオシアナート基を含有するよう誘導し得る。
【００３１】
プソラレンのビーズへの付着に続いて、ビーズをパッケージされたファージ粒子と宿主細胞の裸のポリヌクレオチドとからなる細胞抽出物と混合する。混合物をあらかじめ決定した時間の間撹拌する。プソラレンは、裸の２本鎖ポリヌクレオチドのみに内位添加し得、ファージの封止されたポリヌクレオチドに内位添加し得ない。
【００３２】
その後混合物をプソラレンを活性化し得る波長の光に露呈する。活性化されたプソラレンは内位添加したポリヌクレオチドを架橋結合する。遠心分離を用いて低速でビーズを回転沈降させ、ファージ粒子を上浄に懸濁状態で残す。その後高速でファージ粒子を回転沈降させ、溶かして特異的ポリヌクレオチドからなるものを含むそのポリヌクレオチドを放出させる。
【００３３】
異種起源の宿主細胞系
本発明の他の態様は、特異的なポリペプチドを標的ヌクレオチドの起源に見出される如何なるポリヌクレオチドをも含まないベクタおよび宿主細胞で増殖させる場合に適用できる。よって、たとえベクタまたは宿主細胞のポリヌクレオチドによる特異的なポリヌクレオチドの汚染があったとしても、これらのポリヌクレオチドは生物サンプルに存在しないため全く結果となり得ない。
【００３４】
この種の宿主細胞の例は植物細胞およびそこに見出されるプラスミドであり、ここでは、ヒト細胞または細菌に見出されるものに相補的なポリヌクレオチドは植物中には全く存在しない。標的サンプルはヒトの培養物とし得る。
【００３５】
〔実施例〕
以下の実施例を説明するが、本発明を限定するものではない。
【００３６】
実施例１
この実施例に記載する実験により、ｐＢＲ３２２またはＭ１３のような普通に使用するクローン化ベクタはイー・コリＤＮＡと交叉反応するのに対し、Ｔ７のような致死的ファージはイー・コリＤＮＡと交叉反応しないことを説明する。これにより、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適切な特異的なＤＮＡ配列組成物を調製するベクタの適切な選択を説明する。
【００３７】
Ｔ７、ｐＢＲ３２２並びにＭ１３ＤＮＡのイー・コリのものとの交叉反応性を測定すべく、Ｐ３２ラベルしたＤＮＡプローブをイー・コリの臨床単離物（ｔｅｎ）からの標的ＤＮＡとハイブリダイズさせた。ラベルしたプローブの起源は野生型Ｔ７バクテリオファージおよび２つの普通に使用されるクローン化ベクタ、ｐＢＲ３２２およびＭ１３である。この実験で使用したイー・コリを種々の臨床標品から単離し典型的な臨床単離物の例とした。少なくとも４つの種が抗生物質耐性を与えるプラスミドを含有する。
【００３８】
１２のＤＮＡ（前記した１０のイー・コリ臨床単難物並びに実験室イー・コリ種ＪＭ１０３およびウシ胸線ＤＮＡ）をマニアティスら、前記した文献により記載された方法によって調製する。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）をそれぞれのＤＮＡサンプル（終濃度１２５μｌ当り２０μｇ）に添加することによりポール（Ｐａｌｌ）ナイロン膜（ポール・バイオジン（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ））上にＤＮＡをドットする、１０分の１容量（１２．５μｌ）の２Ｍ ＮａＯＨを変性ＤＮＡ（室温で１０分）に添加する。その後、７Ｍ酢酸アンモニウム （１５０μｌ，ｐＨ８．０）を添加し、続いて１Ｍ酢酸アンモニウム（７１２. ５μｌ）を添加する。それぞれのサンプルからのＤＮＡ（すなわち１μｇ／５０μｌ）を真空（１０インチＨｇ）を用いドットブロット・マニホールドを用いてポールナイロン膜上にドットする。その後２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸Ｎａ，ｐＨ８．０）を用いて膜を短時間リンスし、風乾し、使用する前に８０℃で２時間真空下で加熱する。
【００３９】
試験した３つのＤＮＡプローブ（Ｔ７，ｐＢＲ３２２並びにＭ１３）をＰ３２を用いニックトランスレーション（マニアティスら、前記した文献ｐ１０９を参照するとよい）によりラベルして５×１０７ｃｐｍ／μｇＤＮＡの比活性を有するプローブを作成する。
【００４０】
使用する予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの方法はマニアティスら、前記した文献に記載されたようなものである。６５℃での４８時間のハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて３回、０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて３回、６５℃で膜を洗浄する（それぞれの洗浄について２０分）。フィルタをＸ線フィルム（コダック）に露呈し、現像後、ドットの領域を切除してシンチレーションカウントにより定量化する。この研究の結果を表１にまとめる。
【００４１】
【表１】
＊ それぞれ抗生物質アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性
＊＊ ウシ胸線ＤＮＡのそれぞれのプローブとの交叉反応性から得られる見積られた２００ｃｐｍの平均バックグランドを記載した結果ごとから差引く。
【００４２】
これらのデータから、普通に使用されるプラスミドｐＢＲ３２２はイー・コリＤＮＡと高度に交叉反応性であり、Ｍ１３もイー・コリＤＮＡと高度に交叉反応性であるが、例えばＴ７のような致死的ファージは試験したイー・コリとは交叉反応性でないことが分かる。よって、これは、致死的ファージがクローン化ベクタとして使用して交叉反応性、非特異的配列を含有しないオリゴまたはポリヌクレオチド調製物を生産するのに極めて望ましいことを示唆する。これは特にハイブリダイゼーションプローブに使用するのに極めて望ましい。
【００４３】
実施例２
この実施例に記載する実験は幾種かの組換え致死的ファージベクタの作成に関する。これらのベクタをその後これらの中に種特異的ＤＮＡ配列を挿入し増殖させることにより使用する。広範な種類の意図するＤＮＡ配列がこれらのベクタへの挿入に適切である。
【００４４】
ｐＥＮＺ−４の作成
背景情報は、ヤングら、米国出願番号８２３，９２１、１１８６年１月３０日に出願され即時の承継人に譲渡されたものに与えられているが、これを参考文献としてここに取り入れる。これは、受託番号５３４１１および５３４０９としてアメリカン・タイプ・カルチャ・コレクションに寄託された組換え細菌種を記載する。これらは、それぞれＧＣ１５５およびＧＣ１６５７として言及されるナイセリア・ゴノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来のＤＮＡ配列挿入物を含有するバクテリオファージベクタｍＰ８（バクテリオファージＭ１３から誘導される）を含有する。ここではこれらをｐＥＮＺ−１（ｍｐ８：：ＧＣ１５５）およびｐＥＮＺ−２（ｍｐ８：：ＧＣ１６５７）として後記する。ベクタｍｐ８に関するさらなる背景については、メシング、ジェー、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０〜７８（１９８３）を参照するとよい。
【００４５】
次に図１を参照して、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉ消化によりｐＥＮＺ−１から除去されるＧＣ１５５配列をバクテリオファージベクタｍｐ１９に導入し、同じくＥｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉを用いて消化してプラスミドｐＥＮＺ−３(ｍｐ１９：：ＧＣ１５５）を生産する。ｍｐ１９に関するさらなる背景については、ヤニシューペロンら、Ｇｅｎｅ，３３，１０３〜１１９（１９５８）を参照するとよい。その後ｐＥＮＺ−３プラスミドを使用してイ ー・コリ株ＪＭ１０９細胞を形質転換する。 形質転換したＪＭ１０９細胞を培養して雑種ファージストックを与え、これよりスーパーコイルＤＮＡを単離する。その後制限酵素分析によりファージストックにおいてｐＥＮＺ−３を同定する。ｐＥＮＺ−３プラスミドは、ポリリンカアニーリングにより逆方向に挿入されたＧＣ１５５断片が結果的に与えられる点においてのみもとのｐＥＮＺ−１と異なる。
【００４６】
ｐＥＮＺ−２およびｐＥＮＺ−３プラスミドをＳａｌ ＩおよびＢｇｌ IIを用いて消化し、その後一緒に連結して両方の挿入物 （ＧＣ１５５およびＧＣ１６５７）を含有するプラスミドを生産する。これをここではプラスミドｐＥＮＺ−４と後記し、ＧＣ１５５およびＧＣ１６５７の両方を含有する断片をＧＣ２Ｂ（ハッチ（ｈａｔｃｈｅｄ）蛋白質）として記載する。
【００４７】
ｐＥＮＺ−５の作成
続けて図１を参照して、 ベクタｍｐ１９およびベクタｔｇ１３０（キーニイら、Ｇｅｎｅ，２６，９１（１９８３）を参照するとよい）をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ IIを用いて消化し、その後一緒に連結してプラスミドｐＥＮＺ−５を形成する。このように生産したプラスミドを使用してＪＭ１０９細胞を形質転換し、前記したようにファージストックから制限酵素分析によりｐＥＮＺ−５を同定する。プラスミドｐＥＮＺ−５はＢａｍＨＩ部位に隣接するＥｃｏＲＩ部位を有する。同様に、これらの２つのＢａｍＨＩ部位の間には、さらに制限部位ＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ並びにＨｉｎｄIIIが存在する。図２にこれをさらに詳細に示す。
【００４８】
ｐＥＮＺ−６の作成
調製を前記したｐＥＮＺ−４については、ＧＣ１５５に加えＧＣ１６５７（ＧＣ２Ｂ）挿入物のそれぞれの末端にＢａｍＨＩ部位を有するのが望ましい。
【００４９】
従来これは挿入物の両方の末端に市販のリンカを導入することにより達成されたが、利用可能な付加的な制限部位を有するベクタを創製するのがより好適である。それぞれの意図した挿入物についての他の酵素と和合するリンカを付加するのに従来必要とされた付加操作を回避してこれらの目的を達成するのが最も望ましい。この組合せの利点は、前記したｐＥＮＺ−４およびｐＥＮＺ−５を組合せてプラスミドｐＥＮＺ−６を形成することにより可能となる。
【００５０】
よって、なお図１を参照して、ｐＥＮＺ−４およびｐＥＮＺ−５をＥｃｏＲＩを用いて消化し、その後一緒に連結してプラスミドｐＥＮＺ−６を形成する。このように生産したｐＥＮＺ−６を使用してＪＭ１０９細胞を形質転換し、前記したようにファージストックからの制限酵素分析によって同定する。その結果得られ Ｎ . ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ挿入物ＧＣ２Ｂおよびその制限地図の関連部分を含むｐＥＮＺ−６をより詳細に図３に示す。
【００５１】
Ｔ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂの作成
背景として、この実験で使用するバクテリオファージＴ７−Ｔ１０１は、デュンら、前記した文献に記載されたバクテリオファージＴ７の改変である。 これは最初にダブリュ・スツディル、ブルックハーベン国立研究所により調製された。
【００５２】
主としてこれは、２つの断片が欠失したＴ７ファージである。 デュンら、前記した文献に記載された全Ｔ７ＤＮＡ配列の番号を参照して、欠失した２つの断片は塩基対８３６〜３１４２（△１３０６）および１１，２９３〜１１，５７０（△２８）である。同様に、Ｔ７−Ｔ１０１は△１３０６欠失の端に挿入された小さなリンカ配列を有する。 このリンカ配列は２つのＢａｍＨＩ部位に隣接するＢｇｌ II部位からなる。よって、Ｔ７−Ｔ１０１は、併せてＴ７ＤＮＡ配列の２，５８６ ｂｐを失い、 通常は宿主制限系を克服するのに使用し得る遺伝子を欠損する。このように、このファージは、イー・コリＢの制限マイナス、修飾マイナス（ｒ-、ｍ-）誘導体であるイー・コリ株ＢＬ２１中で生育される。
【００５３】
次に図４を参照して、前記したように調製したｐＥＮＺ−６プラスミドおよびＴ７−Ｔ１０１バクテリオファージをＥｃｏＲＩを用いて消化し、これにより一緒に連結する。連結の結果得られる生成物をクエムメルレら、バクテリオファージＴ７由来のＵＶ 照射損傷ＤＮＡのインビトロパッケージング、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．２３，５０９〜５１６（１９７７）により記載された手順に従ってパッケージする。パッケージ反応の完遂後、 その結果得られる調製物を使用してイー・コリＢＬ２１細胞を形質転換し、細胞を培養してプラークを単離する。個々のプラークからファージストックを作成し、ＤＮＡを単離し、制限酵素分析を行ってｐＥＮＺ−６およびＴ１０１配列のパッケージされた組合せであるＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂを同定する。
【００５４】
なお図４を参照して、ｐＥＮＺ−６由来のＧＣ２Ｂ挿入物をＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩまたはＸｂａＩのいずれかを用いる消化により切除し得る。前記したプロセスによりＥｃｏＲＩ末端を有する挿入物をＢａｍＨＩ部位に置くことが可能となるが、Ｔ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂは、たとえ親Ｔ７−Ｔ１０１ベクタよりも有用な制限部位を有する。
【００５５】
したがって、ＧＣ２Ｂ挿入物を首尾よく使用してこれらの付加的な制限部位をＴ７−Ｔ１０１に導入した。 その結果得られたＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂをその後使用して以下にさらに詳細に説明するようにＧＣ２Ｂにより導入されたポリリンカを有するがＧＣ１５５またはＧＣ１６５７配列を有しない一般的に適用可能なベクタを生産する。
【００５６】
ベクタＴ７−Ｔ１０２の作成
続けて図４を参照して、ＧＣ２Ｂ挿入物をＥｃｏＲＩ消化によりＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂから除去する。 その後ＧＣ２Ｂ挿入物を除去したＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２ＢをＤＮＡリガーゼで処理してなおポリリンカを保持しつつＧＣ２Ｂ挿入物を有しないＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂの左および右部分を一緒に再連結する。連結の結果得られる生成物をパッケージしてイー・コリＢＬ２１細胞を形質転換するのに使用する。これらの形質転換細胞を培養し、プラークを単離し、 個々のプラークからファージストックを作成する。ＤＮＡを単離し、制限酵素分析を行ってＧＣ２Ｂ挿入物を除去したＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂを同定する。以後これをベクタＴ７−Ｔ１０２とするが、 これは、広範囲の標的特異的ＤＮＡ配列を挿入するのに有用である。ベクタＴ１０２の作成によりＴ７ゲノムに新しい制限酵素部位、特にＳａｃＩ，ＳｍａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶ，ＰｓｔＩ，ＳｐｈＩ並びにＨｉｎｄIIIについての部位が導入されることに注意すべきである。
【００５７】
再吟味として、Ｔ７ゲノムの必ずしも全部のコード能力が適切な状況下では生存能力に必要というわけではない。Ｔ７−Ｔ１０１およびＴ７−Ｔ１０２は、双方とも８３６〜３，１４２（△１３０６）および１１，２９３〜１１，５７０（△２８）の領域に及ぶＴ７ゲノムから除去された総計２，５８３ｂｐの欠失を有するＴ７ベクタである。したがって、約２．６Ｋｂの外来ＤＮＡをこれらのベクタに挿入し得るが、なお野生型Ｔ７ゲノムより全然大きなものではない。 同様の技術またはリンカを使用してＴ７または他の致死的ファージ内のＢａｍＨＩ部位または他の都合の良い部位に他の部位を導入する。
【００５８】
Ｔ７誘導ベクタの能力の一層の増強
前記したものに加えて、以下に説明するＴ７−ＬＧ４のようなある種の自然変異株において欠失が見出されたＴ７ゲノムの他の領域が存在する。これらの欠失をＴ１０１またはＴ１０２と組合せて以下のようになお大きな能力を有するベクタを作成する。
【００５９】
最初の手順では、イー・コリＢＬ２１細胞をＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂ、および２，０３４ｂｐの全欠失についてＴ７マップ上で５８４５〜７８７９ｂｐの断片を欠失するＴ７の変異株であるＴ７−ＬＧ４に共感染させて、３つの欠失すべてを有するベクタを結果的に作成する。よってこれは野生型Ｔ７ゲノムから欠失する４， ６１７ｂｐを有する。驚くべきことに、これはその後結果的に得られるベクタを首尾よくパッケージすることができ、これを以後Ｔ７−Ｔ１０４とする。 注記したように、△１３０６およびＴ７−ＬＧ４欠失は共に野生型Ｔ７ゲノムから４．３Ｋｂの欠失を結果的に与える。しかしながら、ＧＣ２Ｂ挿入物（約１．７Ｋｂ）の存在は、結果的に野生型Ｔ７より約２．６Ｋｂだけ小さいＴ７−Ｔ１０４を与える。
【００６０】
次に、ＧＣ２Ｂ挿入物の存在がファージの生存能力に必要かどうかの評価を行う。よって、Ｔ７−Ｔ１０１：： ＧＣ２ＢからのＴ７−Ｔ１０２の作成で前記したものと同様の方法で、Ｔ７−Ｔ１０４ＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて消化し、ポリリンカを維持しつつＧＣ２Ｂ挿入物を除去する。続いて行う連結、パッケージング並びに制限分析により、△１３０６およびＬＧ４の欠失を特徴としＧＣ２Ｂ挿入物をも欠失する１つのベクタを同定する。そこでこれをＴ７−Ｔ１０５と呼ぶ。これにより、挿入配列によって与えられた付加的量のＤＮＡの存在はＴ７−Ｔ１０５の生存能力に要求されないことが示される。
【００６１】
本発明によれば、前記したように調製したベクタを使用して広範囲の配列を挿入し、複製させ、均一な形態で回収することができる。この実施例によりＧＣ２Ｂの使用を示すが、使用することができかつ既に使用されもした他のものには、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来の種特異的配列が含まれる。
【００６２】
実施例３
比較ハイブリダイゼーション検定
この実施例で説明する実験により、種を同定するＤＮＡプローブとして外来ＤＮＡ断片を有する２つの組換えベクタの使用を比較する。両方のベクタは、実施例２で記載した挿入物ＧＣ２Ｂを含む。 第１のベクタはｐＵＣ９である。第２のベクタは、同様に実施例２に記載し同様にＧＣ２Ｂ挿入物を有するＴ７−△１３０６，△２８である。
【００６３】
ｐＵＣ９からＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡを単離精製するのに使用する技術は、マニアティスら、前記した文献に記載されたようなものであり、リゾチーム／フェノール抽出によりプラスミドＤＮＡを単離し、ＣｓＣｌグラジエント浮遊密度遠心によりプラスミドＤＮＡを精製し、２回目のＣｓＣｌ遠心により再精製し、 ＥｃｏＲＩを用いる消化によりＧＣ２Ｂ挿入物を除去し、調製用アガロースゲル電気泳動によりｐＵＣ９ベクタからＧＣ２Ｂ挿入物を分離精製し、続いて電気溶出によりアガロースからＧＣ２Ｂバンドを抽出することからなる。その後この電気泳動精製工程を繰り返してラベルするＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡを与える。
【００６４】
ＧＣ２Ｂ挿入物はそのＴ７−△１３０６，△２８ベクタから精製されず、もとの場所に残留し、 挿入物およびベクタＤＮＡ配列の双方が一緒にラベルされる。
【００６５】
ｐＵＣ９プラミドベクタから誘導した精製ＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡ、Ｔ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２Ｂの両方をビオチンでラベルする。標的配列を伴うフィルタの調製並びに続くハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の詳細は、実施例１に記載されている。ビオチンラベルしたハイブリダイゼーションの検出は、ＤＥＴＥＫ（登録商標）シグナル生成系（エンゾー・バイオケム社、ニューヨーク州、ニューヨーク）を用い添付説明書に記載されているように行った。標的ＤＮＡをフィルタ上に ドットするＤＮＡの量以外は実施例１に記載したのと同様の手順でドットした。この実験の結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
これらのデータから、たとえ徹底的に精製したｐＵＣ９プラスミド誘導ＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡを用いるとしてもイー・コリとの広範な交叉反応性が存在するのに対し、Ｔ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２Ｂベクタはイー・コリＤＮＡと全く反応性を示さないことを理解し得る。同時に、Ｔ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２ＢベクタにおけるＧＣ２Ｂ配列は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ ＤＮＡ（これよりＧＣ２Ｂ配列が誘導された）をＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから区別して認識し得るのになお完全に機能的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドベクタｐＥＮＺ−３，ｐＥＮＺ−４，ｐＥＮＺ−５並びにｐＥＮＺ−６の調製について実施例２で説明する一連の反応全体を示す。
【図２】ベクタｍｐ１９およびｔｇ１３０のポリリンカの融合、その結果得られｐＥＮＺ−５として同定されたプラスミドベクタをさらに詳細に示す。
【図３】ｐＥＮＺ−１からｐＥＮＺ−５へのＧＣ２Ｂ挿入物の転移、その結果得られるプラスミドベクタｐＥＮＺ−６をさらに詳細に示す。
【図４】ｐＥＮＺ−６およびＴ７−△１３０６，△２８からのＴ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２Ｂの作成並びにこれからＧＣ２Ｂ断片を欠失して形成するベクタＴ７−Ｔ１０２を示す。
〔発明の概要〕
特異的なポリヌクレオチド組成物およびその生産方法を開示する。生産されたポリヌクレオチドは非相補的なヌクレオチド配列を全く含有しない。この特異的なポリヌクレオチドは、治療剤としてラベルされ診断に応用するプローブを生産するのに使用でき、または薬剤の配送にまたは治療剤として使用できる。
【０００２】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、特異的なポリヌクレオチド組成物およびその生産方法に関する。
【０００３】
〔従来の技術〕
ポリヌクレオチド調製物は、一般に特異的に意図するヌクレオチド配列および意図しない、実際は意図するポリヌクレオチドの使用を妨害し得る他のポリヌクレオチドからなる。これらの調製物は従来次のようにして得られた。所望のポリヌクレオチドのコピーを細菌プラスミドのようなベクタに挿入し、結果的に組換えベクタを得る。その後組換えベクタを細菌のような宿主に導入し、結果的にこれが複製する形質転換宿主を得る。 組換えベクタのプラスミド複製を許容する生育期間の後、多コピーを単離し、必要に応じて所望のポリヌクレオチドを切除する。これらのポリヌクレオチド調製物は、特に治療および診断応用に用途を有する。
【０００４】
この従来の方法では、所望のポリヌクレオチドを含有する調製物は意図しない他のポリヌクレオチドをも一般に含有する。これらのポリヌクレオチドは２つの起源、ｐＢＲ３２２のようなクローン化に使用する従来のベクタおよび宿主染色体から生起する。所望のポリヌクレオチドを含有する単難物がラベルされている場合、これらの他のポリヌクレオチドもラベルされている。これらの他のポリヌクレオチドの多くは、生物サンプルにしばしば認められる共生細菌のポリヌクレオチドに相補的である。よって、これらの他のラベルされたポリヌクレオチドは診断応用で偽陽性を与えるサンプルで共生細菌と反応し得る。これらの欠点は、アール・エフ・アムビンダら「臨床例の診断的核酸ハイブリダイゼーションにおけるベクタ相同問題」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，２４，１６−２０（１９８６）で考察されている。
【０００５】
挿入物がヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）に対して特異的であり、かつｐＵＣ９ベクタにクローン化されているものが一例である。ベクタはイー・コリ細胞に導入されイー・コリは複製を許容される。ＨＰＶ挿入物を含有するベクタポリヌクレオチドは、当業界で公知の幾つかの方法のいずれかによりイー・コリ細菌から単離される。ＨＰＶ挿入物は制限酵素で開裂され、精製され、例えば蛍光分子でニックトランスレーションによりラベルされる。１つはＨＰＶを含有し１つは含有しない２つの異なる膣汚染に対しこのＨＰＶプローブを試験するに際し、イー・コリ細菌はしばしば女性尿管に棲息するため両方の試験が陽性と表れ得る。ＨＰＶ陰性膣汚染で得られる偽陽性は、ＨＰＶ特異的ポリヌクレオチドをラベルする途中にラベルされプラスミドまたはイー・コリの染色体に見出されるポリヌクレオチド配列に相補的なＨＰＶプローブの中にまたは共に存在する非特異的ポリヌクレオチドの結果である。ＨＰＶ陰性サンプルの尿管内におけるイー・コリ細胞の豊富な存在は、プローブに存在する低レベルのラベルされたイー・コリポリヌクレオチドを補償して余りある。イー・コリポリヌクレオチドに相補的でない所望のポリヌクレオチドを生産する１つの方法は、例えば遺伝子合成装置によりポリヌクレオチドを合成的に生産することである。現在利用可能な装置は約５０ヌクレオチド（０．５０ｋｂ） のポリヌクレオチドを生産することができる。しかしながら、この方法で調製したポリヌクレオチドはより長い（１〜２ｋｂ）配列をラベルし得る程にはラベルし得ない。長いプローブは一般に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするに際し短いプローブより大きなシグナルを与える。
【０００６】
さらに、長く伸長したポリヌクレオチドの間で形成されたハイブリッドは、短く伸長したポリヌクレオチドの間で形成されたハイブリッドより顕著に熱力学的に安定である。これによりハイブリッドが高温および高緊縛条件下でインタクトなまま留まるのが許容され、無作為に形成されたハイブリッドの変性が単純化される。
【０００７】
よって、 特にハイブリダイゼーション検定において、均一なヌクレオチド調製物、特に現在遺伝子合成装置から得ることのできるものより長い配列を提供するものを創製する方法の必要性が存する。
【０００８】
〔発明が解決しようとする課題〕
この必要性に応えるべく、本発明は、意図するもの以外の非特異的オリゴまたはポリヌクレオチドを含有しない意図する特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドからなる組成物を提供する。このオリゴまたはポリヌクレオチドは、遺伝子合成装置により達成され得るより何倍も長い配列となり得、他の試験管内または生体内技術から従来利用可能であったものより均一である。この種の均一なオリゴまたはポリヌクレオチドは、特にハイブリダイゼーション検定試薬調製に使用するのに有利である。
【０００９】
〔課題を解決するための手段〕
よって発明によれば、意図する特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドからなり非特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドを含有しない組成物が提供される。この組成物は、（Ｉ）意図するオリゴまたはポリヌクレオチド挿入物を含有するベクタを形成し、（II）前記挿入物を適切な細胞または無細胞系で複製し、（III）挿入物と会合しない全ゆるオリゴまたはポリヌクレオチドをアニールし得なく処理し、かつ（IV）前記挿入物を特異的なオリゴまたはポリヌクレオチド組成物として回収する工程からなる方法により調製する。１つの観点では、この細胞または無細胞系は宿主細菌細胞であり、かつオリゴまたはボリヌクレオチドを選択的不活性化または消化によりアニールし得なく処理する、ベクタは致死的ファージとすることができ、オリゴまたはポリヌクレオチドをこれにより不活性化する。例えばこの致死的ファージは、Ｔ偶数系ファージ、ファージＴ７、またはファージベクタＴ７−Ｔ１０２，Ｔ７−Ｔ１０４，Ｔ７−Ｔ１０５並びにＴ７−Ｔ１０６のような溶菌性ファー ジとすることができる。致死的ファージは、温度依存性または宿主選択性のもののような溶菌性欠損ファージとすることもできる。ベクタが溶菌性欠損ファージである場合は、この方法は、宿主複製系の全ゆる細胞膜を破壊する付加工程を含む。
【００１０】
他の観点では、ベクタは致死的ファージである必要はない。この観点では、この方法は、ベクタが蛋白質コートを有するファージである場合は、ベクタ含有細胞または無細胞系に裸のオリゴまたはポリヌクレオチドを不活性化するが蛋白質を不活性化しない物質を導入する付加工程を含む。例として、この種の不活性化または消化特性を有する物質は、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼまたはこれらの組合せのようなヌクレアーゼである。
【００１１】
本発明は、さらに前記した方法により調製する組成物を提供する。この組成物は、意図する特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドからなり非特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドを含有しない。この組成物は、ハイブリダイゼーションまたは他の特異的な結合系について公知の全ゆるラベル系でラベルを行うのに特に適切であり、かつハイブリダイゼーション検定、薬剤配送並びに遺伝子制御を含む用途について例外的な特異性の試薬を提供する。
【００１２】
前記した態様の他の観点では、本発明は、意図する標的配列に特異的に相補的なオリゴまたはポリヌクレオチド配列を有する致死的ファージからなる組換えベクタを提供する。前記したように、致死的ファージは溶菌性または溶菌性欠損とすることができる。典型的な溶菌性ファージは、ファージＴ７、Ｔ偶数系ファージ、Ｔ７−Ｔ１０２，Ｔ７−Ｔ１０４，Ｔ７−Ｔ１０５並びにＴ７−Ｔ１０６である。典型的な溶菌性欠損ファージは温度依存性または宿主選択性のものである。
【００１３】
全ゆるファージの観点および態様で、組換えベクタはさらに少なくとも１つのラベル系の成分を組込み得る。 このラベル系成分は、オリゴまたはヌクレオチド配列のまたはファージのまたは両方の少なくとも１つのヌクレオチドで組込まれ得る。典型的なラベル系成分はビオチンおよびそのアナログ、酵素、蛍光物質、ラジオラベル並びにその類似物を含む。
【００１４】
前記したように、本発明は組成物および特異的なポリヌクレオチド調製物、すなわち非特異的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含有しない調製物を生産する方法を開示する。
【００１５】
意図するポリヌクレオチドは通常は少なくとも５０のヌクレオチドからなり、この配列は標的配列に対し独特であり、特異的な生物または特異的な群の生物に対し独特または特徴的である。この種の挿入物から得られるポリヌクレオチド断片は、これらが生物の標的配列と独特にハイブリダイズするのに十分な配列のヌクレオチドを含めば特異的なポリヌクレオチドと考えられる。標的は狭くも広くもなり得、属の単一の種から幾つかの属の多数の種にまで及ぶ。この種の特異的なポリヌクレオチドは、よって標的生物または組織の存在を検出するプローブとして使用し得、治療実体としてまたは薬剤配送系の一部として使用し得る。
【００１６】
溶菌性ファージの選択および使用
１つの態様では、 本発明は致死的ファージを使用することを企図するが、これは、感染に際し宿主細菌の生存能力を破壊する溶菌性または溶菌性欠損ファージである。致死的ファージから誘導されたベクタは宿主染色体の全ゆるポリヌクレオチドに対し全く相同性を有しないだろう。ファージは一般に複製して宿主細胞当り約５０〜５００のファージ粒子を生産し、同時に宿主ポリヌクレオチドを崩壊させる。よって、唯一残る無傷のオリゴまたはポリヌクレオチドはベクタおよび意図する挿入物のものである。
【００１７】
本発明によれば、ベクタとして使用すべく選択するファージのポリヌクレオチドを単離し、予備決定した制限エンドヌクレアーゼにより切断して挿入部位を与えた後、意図する特異的なポリヌクレオチドを導入して組換えポリヌクレオチドを生産する。
【００１８】
組換えポリヌクレオチドをパッケージし、適切な宿主細胞を使用する標準的方法でファージのストックを作成する。ファージが複製するのを許容する適切な宿主を選択する。イー・コリは好適な宿主細胞である。
【００１９】
所望のファージの組換えポリヌクレオチドをフェノール処理によりこれらのカプシドから除去する。その後組換えポリヌクレオチドは、従来のベクタを用いるのと異なり直接ラベルして使用し得る。その他、挿入物をシグナル生成系の１つの成分として後に働き得るベクタ配列の一部と共に回収することができる。或いは所望に応じて、 これを酵素的に処理して特異的なポリヌクレオチド挿入物を開裂し得る。この場合、標準的方法を使用して挿入物を単離し、特異的なポリヌクレオチド単独をラベルする。このラベルを達成する方法は当業者にとって公知である。
【００２０】
本発明によって組換えポリヌクレオチドから作成するプローブは、細菌宿主染色体ポリヌクレオチドに相補的な如何なるポリヌクレオチドをも含有しないだろう。致死的ファージは増殖期間の後にその細菌宿主の生存能力を破壊する機構を有するため、宿主染色体はもはや複製し得ない。さらに、ファージは一般に宿主ポリヌクレオチドを崩壊させるため、ファージポリヌクレオチドと宿主染色体との間でどのような組込みが自然に起ったとしても、結果する組込み生成物は破壊される。それにも拘らず、絶対的な純粋性を確実にすべく、塩化セシウムグラジエントにより、および／またはデオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼまたは両方を使用するヌクレアーゼ処理を混合物に施すことにより混合物中の全ゆる宿主ポリヌクチオチド残渣からファージを分離し得る。ヌクレアーゼは裸のポリヌクレオチドを崩壊させるのみでファージを崩壊させない。
【００２１】
プローブは細菌宿主染色体にまたはこの種の宿主が有するプラスミドに見出されるポリヌクレオチドに相補的な如何なるポリヌクレオチドも含有し得ないため、生物サンプル中でプローブが非特異的なポリヌクレオチドとハイブリダイズすることはあり得ない。
【００２２】
この態様の１つの例として、Ｔファージのようなある種の好適な溶菌性ファージの使用を構成する。Ｔファージおよび他の溶菌性ファージのいずれをも使用し得るのであるが、好適例はＴ７ ２本鎖ＤＮＡバクテリオファージであり、これは長きに亘り著述されている。デュンとスツジル、「バクテリオファージＴ７ＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびＴ７遺伝素子の位置」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，４７７〜５３５（１９８３）を参照するとよい。
【００２３】
Ｔ７の全ゲノムの配列および遺伝的機能は公知であるため、これをベクタとして使用すれば有利である。この利点は、 多数の必須でない遺伝子が存在し、これらを除去しても適切な宿主でのファージの生存能力に影響を与えないという事由による。 例えば、宿主の制限酵素活性を除去し、そうでなければＴ７ファージを破壊する蛋白質をコードする遺伝子が存在する。もしこの種の制限酵素を含有しない宿主細菌を使用すれば（制限マイナス）、これらの蛋白質をコードするＴ７ファージの遺伝子領域は必要でない。ファージＤＮＡは感染粒子にパッケージされる所定の大きさでなければならない。一般に、結果的に得られる粒子中のＤＮＡの大きさは約１０％を越えて延長し得ず、２０％を越えて低減し得ない。よってこれにより挿入物の大きさの限界が置かれる。しかしながら、ファージから必須でない遺伝子が欠失されれば、その後より大きい挿入物を組込み得る。
【００２４】
例えば、生成物はもとのＴ７ＤＮＡおよび挿入物として特異的なヌクレオチド配列を含み得る（組換えポリヌクレオチド）。このＤＮＡ分子は蛋白質コートでパッケージされる必要があり、この結果イー・コリ細胞に感染し得る。パッケージ蛋白質を調製する適切な方法はクエムメルレとマスカ、Ｖｉｒｏｌ．２３，５０９（１９７７）により著述されている。この方法は、適切なサプレッション・ネガティブのイー・コリ宿主におけるＴ７の変異株の使用を含み、パッケージ蛋白質を与える。
【００２５】
Ｔ７ＤＮＡと挿入物ＤＮＡとのライゲーション混合物を全ての付加的に必要な成分と共に抽出物と一緒にイ ンキュベートするが、これは当業者には公知である。パッケージングが起るのに十分な時間が経過した後、混合物を宿主細胞の培養物に添加し、溶けた寒天とスラリとをブロス寒天平板に注入する。プラークが形成されるまで平板を３７℃でインキュベートする。特異的なポリヌクレオチドすなわちプローブファージを含有するプラークをその後決定する。いずれかのプラークにおける特異的なポリヌクレオチドの存在を検出する１つの方法は、プラークリフトを作成しそれぞれのプラークからのＴ７ポリヌクレオチドを特異的なポリヌクレオチドからなるプローブを用いてインキュベートすることによる。例えば、マニアテスら、Ｎｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，コールド・スプリング・ハーバ研究所（１０８２）を参照するとよい。特異的なポリヌクレオチドの存在は、（１）多数のプラークからのファージストックを増殖させ、（２）フェノール処理／エタノール沈澱によりプラークからポリヌクレオチドを単離し、（３）適切な制限酵素を使用してファージ中の特異的なポリヌクレオチドの存在を同定することによっても決定し得る。
【００２６】
所望のファージプラークを同定した後は、精製したファージストックを一連の希釈によってこれより得る。ファージを回収して培養し、プラークを単離し、これよりファージストックを調製する。その後これらのファージストックを用いて、この一部を宿主細胞の液体培養に添加して溶菌が起るまでインキュベートすることにより大スケール量のファージを調製する。塩化セシウム遠心分離および／またはヌクレアーゼ処理により残余する可能性のある宿主染色体ポリヌクレオチドからファージを精製する。
【００２７】
非溶菌性ファージの選択および使用
溶菌性欠損ファージは宿主細胞の生存能力を破壊してそれ自身のポリヌクレオチドを複製することができるが、ある種の状況下では宿主細胞を溶菌しない。例えば、これらは温度感受性、または宿主範囲変異株とすることができ、この場合、これらは宿主細胞を特定の温度または宿主を使用したときにのみ溶菌することとなろう。よって、ファージが細胞を溶菌する条件下でこれらは宿主細胞中で複製し得る。しかしながら、一旦所望のファージを得れば、溶菌が起らない条件下でこれらは宿主細胞中で複製し得る。一旦ファージが宿主のポリヌクレオチドを崩壊させそれ自身のゲノムを複製すれば、ファージ粒子をなお担持する宿主細胞は少量の容積で集められる。その後、宿主細胞の膜を例えば界面活性剤溶菌により破裂させ、ヌクレアーゼにより宿主ポリヌクレオチドを崩壊させ、ファージ粒子を集める。その後例えば塩化セシウムのグラジエントにより溶菌中に形成された残渣からファージ粒子を精製する。
【００２８】
宿主細胞のポリヌクレオチドを別個に不活性化して全ての宿主細胞ポリヌクレオチドを精製の過程で意図するポリヌクレオチドから分離しなければならない。よって従来の技術では、これらの宿主ポリヌクレオチドが意図するポリヌクレオチドの調製物に混入する。
【００２９】
宿主細胞ポリヌクレオチドを不活性化する１つの方法は前記したようにヌクレアーゼ処理によるものである。 他の方法はこれらを不可逆的に架橋結合するものである。この方法は宿主細胞のポリヌクレオチドが主として２本鎖形態であることを必要とする。２本鎖ポリヌクレオチドを架橋する多数の試薬が利用可能である。しかしながら、試薬は、ファージ蛋白質コートに浸透してファージのポリヌクレオチドをも不活性化し得るものであってはならない。
【００３０】
この方法の変法は、内位添加剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を付着させるもので、これは２本鎖ポリヌクレオチドをビーズに架橋する能力を有する。ビーズは例えばセファロース、アガロース、またはシリカのようないずれのポリマとすることもできる。内位添加剤は、内位添加剤がビーズと反応しなお内位添加剤上に架橋に必要な機能を無傷のまま残し得るようこれを誘導することによりビーズに付着させる。この種の試薬の例はプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、内位添加かつ架橋剤である。プソラレンは、例えばアガロースと反応し得るイソチオシアナート基を含有するよう誘導し得る。
【００３１】
プソラレンのビーズへの付着に続いて、ビーズをパッケージされたファージ粒子と宿主細胞の裸のポリヌクレオチドとからなる細胞抽出物と混合する。混合物をあらかじめ決定した時間の間撹拌する。プソラレンは、裸の２本鎖ポリヌクレオチドのみに内位添加し得、ファージの封止されたポリヌクレオチドに内位添加し得ない。
【００３２】
その後混合物をプソラレンを活性化し得る波長の光に露呈する。活性化されたプソラレンは内位添加したポリヌクレオチドを架橋結合する。遠心分離を用いて低速でビーズを回転沈降させ、ファージ粒子を上浄に懸濁状態で残す。その後高速でファージ粒子を回転沈降させ、溶かして特異的ポリヌクレオチドからなるものを含むそのポリヌクレオチドを放出させる。
【００３３】
異種起源の宿主細胞系
本発明の他の態様は、特異的なポリペプチドを標的ヌクレオチドの起源に見出される如何なるポリヌクレオチドをも含まないベクタおよび宿主細胞で増殖させる場合に適用できる。よって、たとえベクタまたは宿主細胞のポリヌクレオチドによる特異的なポリヌクレオチドの汚染があったとしても、これらのポリヌクレオチドは生物サンプルに存在しないため全く結果となり得ない。
【００３４】
この種の宿主細胞の例は植物細胞およびそこに見出されるプラスミドであり、ここでは、ヒト細胞または細菌に見出されるものに相補的なポリヌクレオチドは植物中には全く存在しない。標的サンプルはヒトの培養物とし得る。
【００３５】
〔実施例〕
以下の実施例を説明するが、本発明を限定するものではない。
【００３６】
実施例１
この実施例に記載する実験により、ｐＢＲ３２２またはＭ１３のような普通に使用するクローン化ベクタはイー・コリＤＮＡと交叉反応するのに対し、Ｔ７のような致死的ファージはイー・コリＤＮＡと交叉反応しないことを説明する。これにより、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適切な特異的なＤＮＡ配列組成物を調製するベクタの適切な選択を説明する。
【００３７】
Ｔ７、ｐＢＲ３２２並びにＭ１３ＤＮＡのイー・コリのものとの交叉反応性を測定すべく、Ｐ３２ラベルしたＤＮＡプローブをイー・コリの臨床単離物（ｔｅｎ）からの標的ＤＮＡとハイブリダイズさせた。ラベルしたプローブの起源は野生型Ｔ７バクテリオファージおよび２つの普通に使用されるクローン化ベクタ、ｐＢＲ３２２およびＭ１３である。この実験で使用したイー・コリを種々の臨床標品から単離し典型的な臨床単離物の例とした。少なくとも４つの種が抗生物質耐性を与えるプラスミドを含有する。
【００３８】
１２のＤＮＡ（前記した１０のイー・コリ臨床単難物並びに実験室イー・コリ種ＪＭ１０３およびウシ胸線ＤＮＡ）をマニアティスら、前記した文献により記載された方法によって調製する。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）をそれぞれのＤＮＡサンプル（終濃度１２５μｌ当り２０μｇ）に添加することによりポール（Ｐａｌｌ）ナイロン膜（ポール・バイオジン（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ））上にＤＮＡをドットする、１０分の１容量（１２．５μｌ）の２Ｍ ＮａＯＨを変性ＤＮＡ（室温で１０分）に添加する。その後、７Ｍ酢酸アンモニウム （１５０μｌ，ｐＨ８．０）を添加し、続いて１Ｍ酢酸アンモニウム（７１２. ５μｌ）を添加する。それぞれのサンプルからのＤＮＡ（すなわち１μｇ／５０μｌ）を真空（１０インチＨｇ）を用いドットブロット・マニホールドを用いてポールナイロン膜上にドットする。その後２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸Ｎａ，ｐＨ８．０）を用いて膜を短時間リンスし、風乾し、使用する前に８０℃で２時間真空下で加熱する。
【００３９】
試験した３つのＤＮＡプローブ（Ｔ７，ｐＢＲ３２２並びにＭ１３）をＰ３２を用いニックトランスレーション（マニアティスら、前記した文献ｐ１０９を参照するとよい）によりラベルして５×１０７ｃｐｍ／μｇＤＮＡの比活性を有するプローブを作成する。
【００４０】
使用する予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの方法はマニアティスら、前記した文献に記載されたようなものである。６５℃での４８時間のハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて３回、０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて３回、６５℃で膜を洗浄する（それぞれの洗浄について２０分）。フィルタをＸ線フィルム（コダック）に露呈し、現像後、ドットの領域を切除してシンチレーションカウントにより定量化する。この研究の結果を表１にまとめる。
【００４１】
【表１】
＊＊ ウシ胸線ＤＮＡのそれぞれのプローブとの交叉反応性から得られる見積られた２００ｃｐｍの平均バックグランドを記載した結果ごとから差引く。
【００４２】
これらのデータから、普通に使用されるプラスミドｐＢＲ３２２はイー・コリＤＮＡと高度に交叉反応性であり、Ｍ１３もイー・コリＤＮＡと高度に交叉反応性であるが、例えばＴ７のような致死的ファージは試験したイー・コリとは交叉反応性でないことが分かる。よって、これは、致死的ファージがクローン化ベクタとして使用して交叉反応性、非特異的配列を含有しないオリゴまたはポリヌクレオチド調製物を生産するのに極めて望ましいことを示唆する。これは特にハイブリダイゼーションプローブに使用するのに極めて望ましい。
【００４３】
実施例２
この実施例に記載する実験は幾種かの組換え致死的ファージベクタの作成に関する。これらのベクタをその後これらの中に種特異的ＤＮＡ配列を挿入し増殖させることにより使用する。広範な種類の意図するＤＮＡ配列がこれらのベクタへの挿入に適切である。
【００４４】
ｐＥＮＺ−４の作成
背景情報は、ヤングら、米国出願番号８２３，９２１、１１８６年１月３０日に出願され即時の承継人に譲渡されたものに与えられているが、これを参考文献としてここに取り入れる。これは、受託番号５３４１１および５３４０９としてアメリカン・タイプ・カルチャ・コレクションに寄託された組換え細菌種を記載する。これらは、それぞれＧＣ１５５およびＧＣ１６５７として言及されるナイセリア・ゴノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来のＤＮＡ配列挿入物を含有するバクテリオファージベクタｍＰ８（バクテリオファージＭ１３から誘導される）を含有する。ここではこれらをｐＥＮＺ−１（ｍｐ８：：ＧＣ１５５）およびｐＥＮＺ−２（ｍｐ８：：ＧＣ１６５７）として後記する。ベクタｍｐ８に関するさらなる背景については、メシング、ジェー、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０〜７８（１９８３）を参照するとよい。
【００４５】
次に図１を参照して、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉ消化によりｐＥＮＺ−１から除去されるＧＣ１５５配列をバクテリオファージベクタｍｐ１９に導入し、同じくＥｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉを用いて消化してプラスミドｐＥＮＺ−３(ｍｐ１９：：ＧＣ１５５）を生産する。ｍｐ１９に関するさらなる背景については、ヤニシューペロンら、Ｇｅｎｅ，３３，１０３〜１１９（１９５８）を参照するとよい。その後ｐＥＮＺ−３プラスミドを使用してイ ー・コリ株ＪＭ１０９細胞を形質転換する。 形質転換したＪＭ１０９細胞を培養して雑種ファージストックを与え、これよりスーパーコイルＤＮＡを単離する。その後制限酵素分析によりファージストックにおいてｐＥＮＺ−３を同定する。ｐＥＮＺ−３プラスミドは、ポリリンカアニーリングにより逆方向に挿入されたＧＣ１５５断片が結果的に与えられる点においてのみもとのｐＥＮＺ−１と異なる。
【００４６】
ｐＥＮＺ−２およびｐＥＮＺ−３プラスミドをＳａｌ ＩおよびＢｇｌ IIを用いて消化し、その後一緒に連結して両方の挿入物 （ＧＣ１５５およびＧＣ１６５７）を含有するプラスミドを生産する。これをここではプラスミドｐＥＮＺ−４と後記し、ＧＣ１５５およびＧＣ１６５７の両方を含有する断片をＧＣ２Ｂ（ハッチ（ｈａｔｃｈｅｄ）蛋白質）として記載する。
【００４７】
ｐＥＮＺ−５の作成
続けて図１を参照して、 ベクタｍｐ１９およびベクタｔｇ１３０（キーニイら、Ｇｅｎｅ，２６，９１（１９８３）を参照するとよい）をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ IIを用いて消化し、その後一緒に連結してプラスミドｐＥＮＺ−５を形成する。このように生産したプラスミドを使用してＪＭ１０９細胞を形質転換し、前記したようにファージストックから制限酵素分析によりｐＥＮＺ−５を同定する。プラスミドｐＥＮＺ−５はＢａｍＨＩ部位に隣接するＥｃｏＲＩ部位を有する。同様に、これらの２つのＢａｍＨＩ部位の間には、さらに制限部位ＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ並びにＨｉｎｄIIIが存在する。図２にこれをさらに詳細に示す。
【００４８】
ｐＥＮＺ−６の作成
調製を前記したｐＥＮＺ−４については、ＧＣ１５５に加えＧＣ１６５７（ＧＣ２Ｂ）挿入物のそれぞれの末端にＢａｍＨＩ部位を有するのが望ましい。
【００４９】
従来これは挿入物の両方の末端に市販のリンカを導入することにより達成されたが、利用可能な付加的な制限部位を有するベクタを創製するのがより好適である。それぞれの意図した挿入物についての他の酵素と和合するリンカを付加するのに従来必要とされた付加操作を回避してこれらの目的を達成するのが最も望ましい。この組合せの利点は、前記したｐＥＮＺ−４およびｐＥＮＺ−５を組合せてプラスミドｐＥＮＺ−６を形成することにより可能となる。
【００５０】
よって、なお図１を参照して、ｐＥＮＺ−４およびｐＥＮＺ−５をＥｃｏＲＩを用いて消化し、その後一緒に連結してプラスミドｐＥＮＺ−６を形成する。このように生産したｐＥＮＺ−６を使用してＪＭ１０９細胞を形質転換し、前記したようにファージストックからの制限酵素分析によって同定する。その結果得られ Ｎ . ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ挿入物ＧＣ２Ｂおよびその制限地図の関連部分を含むｐＥＮＺ−６をより詳細に図３に示す。
【００５１】
Ｔ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂの作成
背景として、この実験で使用するバクテリオファージＴ７−Ｔ１０１は、デュンら、前記した文献に記載されたバクテリオファージＴ７の改変である。 これは最初にダブリュ・スツディル、ブルックハーベン国立研究所により調製された。
【００５２】
主としてこれは、２つの断片が欠失したＴ７ファージである。 デュンら、前記した文献に記載された全Ｔ７ＤＮＡ配列の番号を参照して、欠失した２つの断片は塩基対８３６〜３１４２（△１３０６）および１１，２９３〜１１，５７０（△２８）である。同様に、Ｔ７−Ｔ１０１は△１３０６欠失の端に挿入された小さなリンカ配列を有する。 このリンカ配列は２つのＢａｍＨＩ部位に隣接するＢｇｌ II部位からなる。よって、Ｔ７−Ｔ１０１は、併せてＴ７ＤＮＡ配列の２，５８６ ｂｐを失い、 通常は宿主制限系を克服するのに使用し得る遺伝子を欠損する。このように、このファージは、イー・コリＢの制限マイナス、修飾マイナス（ｒ-、ｍ-）誘導体であるイー・コリ株ＢＬ２１中で生育される。
【００５３】
次に図４を参照して、前記したように調製したｐＥＮＺ−６プラスミドおよびＴ７−Ｔ１０１バクテリオファージをＥｃｏＲＩを用いて消化し、これにより一緒に連結する。連結の結果得られる生成物をクエムメルレら、バクテリオファージＴ７由来のＵＶ 照射損傷ＤＮＡのインビトロパッケージング、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．２３，５０９〜５１６（１９７７）により記載された手順に従ってパッケージする。パッケージ反応の完遂後、 その結果得られる調製物を使用してイー・コリＢＬ２１細胞を形質転換し、細胞を培養してプラークを単離する。個々のプラークからファージストックを作成し、ＤＮＡを単離し、制限酵素分析を行ってｐＥＮＺ−６およびＴ１０１配列のパッケージされた組合せであるＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂを同定する。
【００５４】
なお図４を参照して、ｐＥＮＺ−６由来のＧＣ２Ｂ挿入物をＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩまたはＸｂａＩのいずれかを用いる消化により切除し得る。前記したプロセスによりＥｃｏＲＩ末端を有する挿入物をＢａｍＨＩ部位に置くことが可能となるが、Ｔ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂは、たとえ親Ｔ７−Ｔ１０１ベクタよりも有用な制限部位を有する。
【００５５】
したがって、ＧＣ２Ｂ挿入物を首尾よく使用してこれらの付加的な制限部位をＴ７−Ｔ１０１に導入した。 その結果得られたＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂをその後使用して以下にさらに詳細に説明するようにＧＣ２Ｂにより導入されたポリリンカを有するがＧＣ１５５またはＧＣ１６５７配列を有しない一般的に適用可能なベクタを生産する。
【００５６】
ベクタＴ７−Ｔ１０２の作成
続けて図４を参照して、ＧＣ２Ｂ挿入物をＥｃｏＲＩ消化によりＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂから除去する。 その後ＧＣ２Ｂ挿入物を除去したＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２ＢをＤＮＡリガーゼで処理してなおポリリンカを保持しつつＧＣ２Ｂ挿入物を有しないＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂの左および右部分を一緒に再連結する。連結の結果得られる生成物をパッケージしてイー・コリＢＬ２１細胞を形質転換するのに使用する。これらの形質転換細胞を培養し、プラークを単離し、 個々のプラークからファージストックを作成する。ＤＮＡを単離し、制限酵素分析を行ってＧＣ２Ｂ挿入物を除去したＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂを同定する。以後これをベクタＴ７−Ｔ１０２とするが、 これは、広範囲の標的特異的ＤＮＡ配列を挿入するのに有用である。ベクタＴ１０２の作成によりＴ７ゲノムに新しい制限酵素部位、特にＳａｃＩ，ＳｍａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶ，ＰｓｔＩ，ＳｐｈＩ並びにＨｉｎｄIIIについての部位が導入されることに注意すべきである。
【００５７】
再吟味として、Ｔ７ゲノムの必ずしも全部のコード能力が適切な状況下では生存能力に必要というわけではない。Ｔ７−Ｔ１０１およびＴ７−Ｔ１０２は、双方とも８３６〜３，１４２（△１３０６）および１１，２９３〜１１，５７０（△２８）の領域に及ぶＴ７ゲノムから除去された総計２，５８３ｂｐの欠失を有するＴ７ベクタである。したがって、約２．６Ｋｂの外来ＤＮＡをこれらのベクタに挿入し得るが、なお野生型Ｔ７ゲノムより全然大きなものではない。 同様の技術またはリンカを使用してＴ７または他の致死的ファージ内のＢａｍＨＩ部位または他の都合の良い部位に他の部位を導入する。
【００５８】
Ｔ７誘導ベクタの能力の一層の増強
前記したものに加えて、以下に説明するＴ７−ＬＧ４のようなある種の自然変異株において欠失が見出されたＴ７ゲノムの他の領域が存在する。これらの欠失をＴ１０１またはＴ１０２と組合せて以下のようになお大きな能力を有するベクタを作成する。
【００５９】
最初の手順では、イー・コリＢＬ２１細胞をＴ７−Ｔ１０１：：ＧＣ２Ｂ、および２，０３４ｂｐの全欠失についてＴ７マップ上で５８４５〜７８７９ｂｐの断片を欠失するＴ７の変異株であるＴ７−ＬＧ４に共感染させて、３つの欠失すべてを有するベクタを結果的に作成する。よってこれは野生型Ｔ７ゲノムから欠失する４， ６１７ｂｐを有する。驚くべきことに、これはその後結果的に得られるベクタを首尾よくパッケージすることができ、これを以後Ｔ７−Ｔ１０４とする。 注記したように、△１３０６およびＴ７−ＬＧ４欠失は共に野生型Ｔ７ゲノムから４．３Ｋｂの欠失を結果的に与える。しかしながら、ＧＣ２Ｂ挿入物（約１．７Ｋｂ）の存在は、結果的に野生型Ｔ７より約２．６Ｋｂだけ小さいＴ７−Ｔ１０４を与える。
【００６０】
次に、ＧＣ２Ｂ挿入物の存在がファージの生存能力に必要かどうかの評価を行う。よって、Ｔ７−Ｔ１０１：： ＧＣ２ＢからのＴ７−Ｔ１０２の作成で前記したものと同様の方法で、Ｔ７−Ｔ１０４ＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて消化し、ポリリンカを維持しつつＧＣ２Ｂ挿入物を除去する。続いて行う連結、パッケージング並びに制限分析により、△１３０６およびＬＧ４の欠失を特徴としＧＣ２Ｂ挿入物をも欠失する１つのベクタを同定する。そこでこれをＴ７−Ｔ１０５と呼ぶ。これにより、挿入配列によって与えられた付加的量のＤＮＡの存在はＴ７−Ｔ１０５の生存能力に要求されないことが示される。
【００６１】
本発明によれば、前記したように調製したベクタを使用して広範囲の配列を挿入し、複製させ、均一な形態で回収することができる。この実施例によりＧＣ２Ｂの使用を示すが、使用することができかつ既に使用されもした他のものには、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来の種特異的配列が含まれる。
【００６２】
実施例３
比較ハイブリダイゼーション検定
この実施例で説明する実験により、種を同定するＤＮＡプローブとして外来ＤＮＡ断片を有する２つの組換えベクタの使用を比較する。両方のベクタは、実施例２で記載した挿入物ＧＣ２Ｂを含む。 第１のベクタはｐＵＣ９である。第２のベクタは、同様に実施例２に記載し同様にＧＣ２Ｂ挿入物を有するＴ７−△１３０６，△２８である。
【００６３】
ｐＵＣ９からＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡを単離精製するのに使用する技術は、マニアティスら、前記した文献に記載されたようなものであり、リゾチーム／フェノール抽出によりプラスミドＤＮＡを単離し、ＣｓＣｌグラジエント浮遊密度遠心によりプラスミドＤＮＡを精製し、２回目のＣｓＣｌ遠心により再精製し、 ＥｃｏＲＩを用いる消化によりＧＣ２Ｂ挿入物を除去し、調製用アガロースゲル電気泳動によりｐＵＣ９ベクタからＧＣ２Ｂ挿入物を分離精製し、続いて電気溶出によりアガロースからＧＣ２Ｂバンドを抽出することからなる。その後この電気泳動精製工程を繰り返してラベルするＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡを与える。
【００６４】
ＧＣ２Ｂ挿入物はそのＴ７−△１３０６，△２８ベクタから精製されず、もとの場所に残留し、 挿入物およびベクタＤＮＡ配列の双方が一緒にラベルされる。
【００６５】
ｐＵＣ９プラミドベクタから誘導した精製ＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡ、Ｔ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２Ｂの両方をビオチンでラベルする。標的配列を伴うフィルタの調製並びに続くハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の詳細は、実施例１に記載されている。ビオチンラベルしたハイブリダイゼーションの検出は、ＤＥＴＥＫ（登録商標）シグナル生成系（エンゾー・バイオケム社、ニューヨーク州、ニューヨーク）を用い添付説明書に記載されているように行った。標的ＤＮＡをフィルタ上に ドットするＤＮＡの量以外は実施例１に記載したのと同様の手順でドットした。この実験の結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
これらのデータから、たとえ徹底的に精製したｐＵＣ９プラスミド誘導ＧＣ２Ｂ挿入ＤＮＡを用いるとしてもイー・コリとの広範な交叉反応性が存在するのに対し、Ｔ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２Ｂベクタはイー・コリＤＮＡと全く反応性を示さないことを理解し得る。同時に、Ｔ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２ＢベクタにおけるＧＣ２Ｂ配列は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ ＤＮＡ（これよりＧＣ２Ｂ配列が誘導された）をＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから区別して認識し得るのになお完全に機能的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドベクタｐＥＮＺ−３，ｐＥＮＺ−４，ｐＥＮＺ−５並びにｐＥＮＺ−６の調製について実施例２で説明する一連の反応全体を示す。
【図２】ベクタｍｐ１９およびｔｇ１３０のポリリンカの融合、その結果得られｐＥＮＺ−５として同定されたプラスミドベクタをさらに詳細に示す。
【図３】ｐＥＮＺ−１からｐＥＮＺ−５へのＧＣ２Ｂ挿入物の転移、その結果得られるプラスミドベクタｐＥＮＺ−６をさらに詳細に示す。
【図４】ｐＥＮＺ−６およびＴ７−△１３０６，△２８からのＴ７−△１３０６，△２８：：ＧＣ２Ｂの作成並びにこれからＧＣ２Ｂ断片を欠失して形成するベクタＴ７−Ｔ１０２を示す。
Claims (14)
- 試料中における標的核酸の存在を検出する試薬組成物であって、
（ａ）本質的に、
（ｉ）ベクタが増加するベヒクルと十分に相同性であるいずれかの核酸配列を有していない核酸ベクタ、ここにおいて、前記核酸ベクタがＴ偶数系ファージ、Ｔ７−Ｔ１０２，Ｔ７−Ｔ１０４，Ｔ７−Ｔ１０５並びにＴ７−Ｔ１０６ファージ及びそれらから誘導されたものからなる群より選択される溶菌性ファージであり、
（ｉｉ）前記標的の核酸と十分に相同的であり、実質的に標的配列のみとハイブリダイズし、混入物として試料中に存在し得る他の配列とはハイブリダイズしない核酸断片、および
（ｉｉｉ）検出し得るシグナルの産生に必要でありかつ（ｉ）または（ｉｉ）の少なくとも１つと共有結合する少なくとも１つのラベル系
よりなる核酸、および
（ｂ）前記ラベル系成分自身が検出し得ない場合に前記ラベル系の成分（ｉｉｉ）に結合し、前記ラベル成分が検出し得るようにする前記ラベル系の少なくとも１種の付加成分
からなることを特徴とする組成物。 - 前記核酸構築物が、
（ｉｉ）の核酸断片を（ｉ）のベクタ中に導入して前記核酸構築物を形成し、
複製され得る培地中にいて適する宿主中にて形成した構築物を複製させ、
前記（ｉｉ）の核酸断片を導入したベクタの核酸と相補的なハイブリダイズし得るいずれかの核酸配列を除去し、
本質的に（ｉ）および（ｉｉ）よりなる核酸構築物を回収する工程
からなる方法により調製されることを特徴とする請求項１記載の組成物。 - 方法が、ハイブリダイズし得なくなる程度まで核酸を分解するが、蛋白質を分解しない物質を溶菌後、しかしバクテリオファージの核酸をインタクトな状態とするバクテリオファージコートからバクテリオファージの核酸が放出される前に導入する付加工程を更に含み、かつ前記バクテリオファージがインタクトな状態にするようにバクテリオファージの核酸を保護する蛋白質含有コートを有することを特徴とする請求項２記載の組成物。
- 方法が、ハイブリダイズし得なくなる程度まで核酸を分解するが、蛋白質を分解しないヌクレアーゼを溶菌後、しかしバクテリオファージの核酸をインタクトな状態にするバクテリオファージコートからバクテリオファージの核酸が放出される前に導入する付加工程を含み、かつ前記バクテリオファージがインタクトな状態であるようにバクテリオファージの核酸を保護する蛋白質含有コートを有することを特徴とする請求項２記載の組成物。
- 前記保護コートが蛋白質、リポ蛋白質またはムコ蛋白質コートであることを特徴とする請求項４記載の組成物。
- 前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼであることを特徴とする請求項４記載の組成物。
- 前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ双方を含む調製物であることを特徴とする請求項６記載の組成物。
- 試料中における標的核酸の存在につき試料を分析する方法であって、
方法が、
（１）前記試料を
（ａ）本質的に、
（ｉ）ベクタが増加するベヒクルと十分に相同性であるいずれかの核酸配列を有していない核酸ベクタ、ここにおいて、前記核酸ベクタがＴ偶数系ファージ、Ｔ７−Ｔ１０２，Ｔ７−Ｔ１０４，Ｔ７−Ｔ１０５並びにＴ７−Ｔ１０６ファージ及びそれらから誘導されたものからなる群より選択される溶菌性ファージであり、
（ｉｉ）前記標的の核酸と十分に相同的であり、実質的に標的配列のみとハイブリダイズし、混入物として試料中に存在し得る他の配列とはハイブリダイズしない核酸断片、および
（ｉｉｉ）検出し得るシグナルの産生に必要でありかつ（ｉ）または（ｉｉ）の少なくとも１つと共有結合する少なくとも１つのラベル系
よりなる核酸、および
（ｂ）前記ラベル系成分自身が検出し得ない場合に前記ラベル系の成分（ｉｉｉ）に結合し、前記ラベル成分が検出し得るようにする前記ラベル系の少なくとも１種の付加成分
からなる試薬組成物とハイブリダイゼーションする条件下で接触させ、
（２）いずれかの検出し得る反応を観察する
ことからなること特徴とする方法。 - 試薬組成物の核酸構築物が、
（ｉｉ）の核酸断片を（ｉ）のベクタ中に導入して前記核酸構築物を形成し、
複製され得る培地中において適する宿主中にて、形成した構築物を複製させ、
前記（ｉｉ）の核酸断片を導入したベクタの核酸と相補的でハイブリダイズし得るいずれかの核酸配列を除去し、
本質的に（ｉ）および（ｉｉ）よりなる核酸構築物を回収する工程
からなる方法により調製されることを特徴とする請求項８記載の方法。 - 前記構築物が細菌細胞中で複製され、かつ方法が、前記細菌細胞の膜を溶菌後、しかしファージＤＮＡをインタクトな状態にするファージコートからファージＤＮＡが放出される前に破壊する付加工程を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
- ハイブリダイズし得なくなる程度まで核酸を分解するが、蛋白質を分解しないヌクレアーゼを溶菌後、しかしバクテリオファージの核酸をインタクトであるようにするバクテリオファージコートからバクテリオファージの核酸が放出される前に導入する付加工程を含み、かつ前記核酸ベクタがインタクトな状態であるようにバクテリオファージの核酸を保護する蛋白質含有コートを有する病原性バクテリオファージであることを特徴とする請求項９記載の方法。
- 前記保護コートが蛋白質、リポ蛋白質またはムコ蛋白質コートであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ双方を含む調製物であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
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