JP2005253315A - 目的塩基配列の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 サンプルＤＮＡ（またはＲＮＡ）量が少なく、サンプルＤＮＡ（またはＲＮＡ）中に検出したい目的配列が複数個存在する場合にすべての目的配列を検出する方法を提供する。
【解決手段】上記課題は、以下の工程：
（１）サンプルＤＮＡ（またはＲＮＡ）とプローブＤＮＡ（またはＲＮＡ）を水溶液中で接触させてハイブリダイゼーション複合体を形成させ；
（２）ハイブリダイゼーション複合体を単離し；
（３）複合体を解離させて、プロ−ブＤＮＡ（またはＲＮＡ）を分離し；
（４）該プローブＤＮＡ（またはＲＮＡ）を同定して、サンプルＤＮＡ中の目的の塩基配列を検出する；
を含む方法により解決される。
【選択図】なし

Description

本発明は、サンプルＤＮＡまたはＲＮＡとプローブＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションによる結合作用を利用して、サンプルＤＮＡまたはＲＮＡに目的とする塩基配列が存在するか否かを検出する方法に関する。取り扱う物質はＤＮＡでもＲＮＡでも同様に考えることができる。以下サンプルがＤＮＡでプローブがＤＮＡの場合について記載する。

従来、サンプルＤＮＡ中に目的とする塩基配列が存在するか否か検出する手法として、検出したい目的塩基配列の相補鎖関係にある塩基配列のＤＮＡをプローブＤＮＡとして作成し、ガラスやメンブレンなどに固定させてＤＮＡチップを作り、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップに固定化されているプローブＤＮＡをハイブリダイゼーションさせ、サンプルＤＮＡに目的の塩基配列があったときはサンプルＤＮＡ中の目的塩基配列を持つ部位とＤＮＡチップに固定されているプローブＤＮＡがハイブリッド形成されて結合される。目的とした塩基配列がなかったときはプローブＤＮＡと結合されないため、溶液中で浮遊している状態になる。ハイブリダイゼーションのあと、ＤＮＡチップを洗うと浮遊しているＤＮＡは流され、固定化しているものは流されない。よって、プローブＤＮＡとハイブリッド形成しているサンプルＤＮＡは結合されているため、ＤＮＡチップを洗っても流されないことになる。ハイブリッド形成しているプローブＤＮＡの検出方法は、サンプルＤＮＡに予め蛍光標識を付けておき、ランプやレーザーなどの光源で励起して発光させ、ＤＮＡチップ読取装置で画像を読み取り、どのプローブＤＮＡにサンプルＤＮＡが結合しているか、ハイブリダイゼーションの作用を使って、目的塩基配列の有無を検出している（非特許文献１を参照）。
図２は最近よく利用されているＤＮＡチップを使った目的塩基配列の検出方法の例である。本例は、４種類の異なる目的塩基配列（１）１，目的塩基配列（２）２，目的塩基配列（３）３，目的塩基配列（４）４がサンプルＤＮＡ５に存在するか否かを検出する手法を現したものである。本例では、サンプルＤＮＡ中に目的塩基配列（１）１と目的塩基配列（４）４が存在するものを例として検出している。図２(Ａ)はあらかじめ蛍光標識を付けたサンプルＤＮＡ５で、目的塩基配列(1)１と目的塩基配列(４)４が存在するサンプルＤＮＡ５である。図２（Ｂ）は検出したい目的塩基配列(1)１から目的塩基配列(４)４の対になっているＤＮＡ群１４で、目的塩基配列（１）のＤＮＡ１ａと目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂ，目的塩基配列（２）のＤＮＡ２ａと目的塩基配列（２）の相補鎖ＤＮＡ２ｂ，目的塩基配列（３）のＤＮＡ３ａと目的塩基配列（３）の相補鎖ＤＮＡ３ｂおよび目的塩基配列（４）のＤＮＡ４ａと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂからなる。図２（Ｃ）は図２（Ｂ）の中から相補鎖ＤＮＡ１ｂから４ｂをプローブＤＮＡ群８として、ガラスまたはメンブレン１３に固定化し、図２（Ｄ）のＤＮＡチップ９を作成する。図２（Ｅ）はサンプルＤＮＡ５とＤＮＡチップ９に固定されているプローブＤＮＡ群８をハイブリダイゼーション溶液１０に入れ、ハイブリダイズさせる。そのとき、サンプルＤＮＡ５の目的塩基配列(1)１の部位と目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂとが相補鎖関係にあるため、サンプルＤＮＡ５の目的塩基配列(1)１の部位と目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂがハイブリッド形成され結合される。図２（Ｆ）はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップ９の読み取りで、方式はランプ１１で蛍光標識６を励起して発光させ、ＤＮＡチップ読取装置７で読み取る。この例ではサンプルＤＮＡ５の目的塩基配列(1)１の部位とハイブリッド形成して結合されている目的塩基配列（１）１の相補鎖ＤＮＡ１ｂの位置が光ることになる。図２（Ｇ）はＤＮＡチップ読取装置７で読み取った画像１２で、光っている位置からサンプルＤＮＡ５に目的塩基配列(1)１が存在していることがわかる。現在、このようにして、目的の塩基配列がサンプルＤＮＡにあるか否かを検出している。
「サイエンス（Science）」270 巻p467-470

従来の方法では、サンプルＤＮＡの量が少ないときは、プローブＤＮＡがガラスやメンブレンなどに固定化されているため、プローブＤＮＡ１個にサンプルＤＮＡ１個のハイブリハイブリダイゼーションしかできない。そのため、サンプルＤＮＡに目的の塩基配列が複数種類存在したときは、１つしか結合できないため、他の目的塩基配列を検出できないという問題があった。そのため、サンプルＤＮＡを増幅して、増やす方式が取られているが、サンプルＤＮＡが未知のＤＮＡで、分子の大きさがバラバラであることなど、増幅する条件が難しいという問題がある。また、ＤＮＡチップを使ってのハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションをおこなう空間が広すぎるため、固定化されているプローブＤＮＡにサンプルＤＮＡが遭遇する確立も低いという問題がある。さらにまた、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡの分子量の大きさが、大きく異なるため、ハイブリダイゼーションの条件である温度などの実験条件設定が難しいという問題がある。

本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みなされたもので、サンプルＤＮＡに複数のプローブＤＮＡをハイブリダイズできるようにし、目的とした塩基配列がサンプルＤＮＡに複数種類存在しても、容易に検出できることを可能とした方法を提供することを目的とする。

本発明は、サンプルＤＮＡまたはＲＮＡ中の目的の塩基配列を検出する方法であって、以下の工程：
（１）サンプルＤＮＡまたはＲＮＡとプローブＤＮＡまたはＲＮＡを液中で接触させてハイブリダイゼーション複合体を形成させ；
（２）ハイブリダイゼーション複合体を単離し；
（３）複合体を解離させて、プロ−ブＤＮＡまたはＲＮＡを分離し；
（４）該プローブＤＮＡまたはＲＮＡを同定して、サンプルＤＮＡまたはＲＮＡ中の目的の塩基配列を検出する；
を含む方法に関する。

本発明では、ｉ）サンプルがＤＮＡでプローブがＤＮＡの場合、ｉｉ）サンプルがＲＮＡでプローブがＲＮＡの場合、ｉｉｉ）サンプルがＤＮＡでプローブがＲＮＡの場合、ｉｖ）サンプルがＲＮＡでプローブがＤＮＡの場合の４つの態様がある。取り扱う物質がＤＮＡでもＲＮＡでも同様に考えることができる。以下サンプルがＤＮＡでプローブがＤＮＡの場合について記載する。
本発明では、従来、ＤＮＡチップと称して、ガラスやメンブレンなどに固定化させていたプローブＤＮＡを固定化させず、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡの水溶液を調製しておき、両水溶液をハイブリダイゼーション条件下で混合してハイブリダイゼーション複合体を形成させる。こうすることで、サンプルＤＮＡが少ない場合でもサンプルＤＮＡに複数種類のプローブＤＮＡをハイブリダイズさせることを可能とする。そのあと、ハイブリダイゼーション複合体を単離し、ハイブリダイゼーション複合体からプローブＤＮＡを分離し、そのプローブを同定することによって、サンプルＤＮＡに存在する目的塩基配列の検出することができる。

すなわち、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡを１つのチューブ中でハイブリダイゼーションさせることで、ハイブリダイゼーションの空間を狭くすることができ、両者が遭遇する確立を高くできる。さらに、１つのチューブ中でハイブリダイゼーションさせることで、サンプルＤＮＡの量が少なくても検出できるようになる。また、複数のプローブＤＮＡを用いることができ、１つのサンプルＤＮＡに複数のプローブＤＮＡがハイブリダイズできるようにしている。

また、単離したプローブＤＮＡの同定は、プローブＤＮＡと相補鎖関係のＤＮＡであるｃ−プローブＤＮＡを用意しておき、ハイブリダイゼーションを用いて同定することができる。すなわち、プローブＤＮＡの相補鎖関係にあるｃ−プローブＤＮＡをガラスやメンブレンなどに固定化し、ｃ−プローブＤＮＡチップとして、あらかじめ作成しておき、分離したプローブＤＮＡとハイブリダイズさせて、同定する。このとき、プローブＤＮＡとｃ−ＤＮＡチップ上のｃ−プローブＤＮＡは分子量がほぼ等しいため、容易な条件で安定的にハイブリッド形成して結合させることができる。プローブＤＮＡを蛍光標識しておき、ｃ−ＤＮＡチップをＤＮＡチップ読取装置で読み取ると、選択抽出したプローブＤＮＡがｃ−プローブＤＮＡに結合している場所が光り、ｃ−ＤＮＡチップ上の位置から、何のプローブＤＮＡであるか特定することができる。すなわち、プローブＤＮＡと結合したｃ−プローブＤＮＡの塩基配列が、サンプルＤＮＡに存在する目的塩基配列であることがわかる。
要するに、従来サンプルＤＮＡ１個にプローブＤＮＡ1個のハイブリダイゼーションであったものが、本発明では、サンプルＤＮＡ1個にプローブＤＮＡを複数個ハイブリダイゼーションできるようにし、サンプルＤＮＡにハイブリッド形成して結合したプローブＤＮＡを相補鎖プローブＤＮＡのｃ−プローブＤＮＡで検出することを特徴としている。なお、ｃ−ＤＮＡチップの読み取りを光でおこなうときは、抽出したプローブＤＮＡとｃ−プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション以前に、プローブＤＮＡに蛍光標識を付けておく必要がある。プローブDNA の蛍光標識化（ヌクレイック アシド リサーチ(Nucleic Acids Research) 13 巻2399-2412 頁、DNAシークエンス（DNA Sequence）4 巻135-141）についてはすでに当業者によく知られており、市販のDNA 合成機を用いて各種蛍光物質を付加したオリゴヌクレオチドを合成することができる。また、企業による蛍光標識化オリゴヌクレオチドの受託合成も実用化されている。

少量のＤＮＡサンプルで複数種類の塩基配列を検出できる。

以下、本発明の一実施態様について説明する。図１は本発明の原理を説明する図であり、サンプルＤＮＡに目的塩基配列が存在するか否か、検索手段を現したものである。本実施例は、求めたい目的塩基配列は４種類で、サンプルＤＮＡ５には、目的塩基配列（１）１、目的塩基配列（４）４が存在している例を使用して、検索方法を現している。図１（Ａ）は目的塩基配列の検索対象のサンプルＤＮＡ５で、目的塩基配列（１）１、目的塩基配列（４）４が存在し、サンプルＤＮＡ５を制御するための磁気ビーズ１７を結合させている。図１（Ｂ）は、目的塩基配列を検索するための、対になっているＤＮＡ群１４で、目的塩基配列（１）のＤＮＡ１ａと目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂ，目的塩基配列（２）のＤＮＡ２ａと目的塩基配列（２）の相補鎖ＤＮＡ２ｂ，目的塩基配列（３）のＤＮＡ３ａと目的塩基配列（３）の相補鎖ＤＮＡ３ｂおよび目的塩基配列（４）のＤＮＡ４ａと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂからなる。図１（Ｃ）は、サンプルＤＮＡとハイブリダイゼーションさせて、検索するためのプローブＤＮＡ群８で、目的塩基配列（１）１のＤＮＡ１ｂ，目的塩基配列（２）２のＤＮＡ２ｂ，目的塩基配列（３）３のＤＮＡ３ｂおよび目的塩基配列（４）４のＤＮＡ４ｂで構成させる。図１（Ｄ）は、サンプルＤＮＡ５にハイブリダイズしたプローブＤＮＡを検出するための手段で、プローブＤＮＡ群８の相補鎖関係にある目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ａから目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ａのｃ−プローブＤＮＡ群１５をガラスまたはメンブレン１３に固定化し、ｃ−ＤＮＡチップ16化しておく。図１（Ｅ）は、サンプルＤＮＡ５とプローブＤＮＡ群８をハイブリダイゼーション溶液１０に入れ、１つのチューブ１９でハイブリダイゼーションさせる。このとき、サンプルＤＮＡ５にプローブＤＮＡと相同の塩基配列があるときはハイブリッド形成して結合し、未結合のプローブＤＮＡは溶液中で浮遊することになる。本例ではサンプルＤＮＡ５の目的塩基配列（１）１と目的塩基配列（４）４の部位に、目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂが結合することになる。
図１（Ｆ）と図１（Ｇ）は、図１（Ｅ）のハイブリダイゼーション後、サンプルＤＮＡ５に結合したプローブＤＮＡと未結合のプローブＤＮＡを分離するための手段で、サンプルＤＮＡ５を磁石１８で図１（Ｆ）のように固定し、溶液を図１（Ｆ）から図１（Ｅ）に移す。このとき、サンプルＤＮＡ５に結合しているプローブＤＮＡの目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂは移動せず、溶液中で浮遊している未結合のプローブＤＮＡの目的塩基配列（２）の相補鎖ＤＮＡ２ｂと目的塩基配列（３）の相補鎖ＤＮＡ３ｂは図１（Ｇ）のように移動する。こうすることで、結合したプローブＤＮＡと未結合のプローブＤＮＡを分離することができ、サンプルＤＮＡ５に結合したプローブＤＮＡを選択することができる。
図１（Ｈ）は、結合しているプローブＤＮＡ分離するため、目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂをサンプルＤＮＡ５から切り離す。切り離しは溶液をアルカリ性条件にするかまたは熱をかけて行なう。
図１（Ｉ）と図１（Ｊ）は、切り離したサンプルＤＮＡ５とプローブＤＮＡを分離させるもので、サンプルＤＮＡ５を図１（Ｈ）から図１（Ｉ）に移動させる。こうすることで、図１（Ｊ）に結合していたプローブＤＮＡが残り、サンプルＤＮＡ５とプローブＤＮＡの目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂおよび目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂを分離することができる。そのあと、読み取りのため、図１（Ｊ）のように分離抽出したプローブＤＮＡに蛍光物質を標識させるが、蛍光物質を標識するタイミングは図１（Ｃ）の時点でおこなってもよい。
図１（Ｋ）は、分離抽出したプローブＤＮＡの種類を検出するため、ハイブリダイゼーション溶液１０に、図１（Ｊ）の分離したプローブＤＮＡと図１（Ｄ）のｃ−ＤＮＡチップ１６を入れ、プローブＤＮＡと相補鎖関係にあるｃ−プローブＤＮＡ群１５とハイブリダイズさせる。その結果として、目的塩基配列（１）のＤＮＡ１ａと目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂおよび目的塩基配列（４）のＤＮＡ４ａと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂがハイブリッド形成して結合される。
図１（Ｌ）は、ハイブリッド形成しているプローブＤＮＡの検出で、従来のＤＮＡチップ読取装置７でｃ−ＤＮＡチップを読み取る。
図（Ｍ）は、ｃ−ＤＮＡチップを読み取った画像で、抽出したプローブＤＮＡの結合している位置が光るため、どのプローブＤＮＡが結合したか判別することができる。本実施例では目的塩基配列（１）と目的塩基配列（４）のプローブＤＮＡがサンプルＤＮＡに結合したいたことがわかる。
このように、ｃ−ＤＮＡチップに結合したプローブＤＮＡを求めることで、サンプルＤＮＡにどの目的塩基配列が存在するか検出することができる。なお、ここではサンプルＤＮＡに結合したプローブＤＮＡの分類と検出に、自動化されているＤＮＡチップを利用した塩基配列の検出方法を説明したが、サンプルＤＮＡに結合したプローブＤＮＡの分類と検出の方法は手法であってもよい。また、本発明のプローブＤＮＡの検出を相補鎖プローブＤＮＡで検出する方式は、ＤＮＡチップ以外のものにも適用できることはもちろんである。
以下、上記の手法により、サンプルDNAに選択的に結合したプローブを回収した例を示す。

サンプルDNAとプローブのハイブリダイゼーション
本発明の方法により目的塩基配列を検出するためのサンプルDNAとして、 配列番号１に示すDNA を用いた。後述するように、ハイブリダイゼーション後の選択のために、その5' 末端にビオチンを共有結合させた。上記サンプルDNAと相補的な配列を有するプローブとして、上記サンプルDNAの塩基配列の 20-35、および41-55 にそれぞれ相補的な配列を有する、配列番号２および３で示したDNA1, DNA2 を化学合成した。またこのサンプルDNAには相補鎖配列が存在しないDNAとして配列番号４から７に示したDNA3, DNA4, DNA5, DNA6 を用いた。サンプルDNAとプローブを含むこれらのDNA をすべて混合し、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションの条件は5 x SSC, 0.5 % SDS, 0.2 mg/ ml 活性化DNA(仔牛胸腺DNAをDNase Iで限定分解したもの)を含む溶液中で上記DNA を混合し,95 ℃で３分熱処理をした後、42 ℃にして10 分間静置した。

サンプルDNAに結合したプローブDNAの選択的回収
本実験の目的のためにサンプルDNAに結合しているビオチンを利用した。DNA のビオチン化については、 テトラヘドロンレターズ(Tetrahedron Letters)32巻1715-1718頁, ヌクレイック アシド リサーチ(Nucleic Acids Research) 20 巻6253-6259頁に記載の方法でおこなうことができる（本実験でのビオチン化したサンプルDNAはシグマジェノシス社の受託DNA合成を利用した）。すなわちビオチンと特異的に結合するストレプトアビジンがマグネチックビーズに固定化されたもの（MACS Separation system, Miltenyi Biotech 社） を用いて、以下の手順でビオチン化DNAを回収した。ハイブリダイゼーション溶液を100 μl のMACS Streptavidin MicroBeads と混合して、それを強力な永久磁石の上にセットしたカラムに供した。カラムは予め平衡化バッファーとしてDNAを含まないハイブリダイゼーション用溶液を流しておいた。試料を供した後のカラムに、同様にハイブリダイゼーション溶液を100 μlずつ５回流し、さらにTE バッファー100 μl を３回流すことで非特異的に結合しているDNAを洗い落とした。その後、カラムを磁石板からはずして、TE バッファーを流すことによってプローブの結合したサンプルDNAをチューブに回収した。

サンプルDNAに対するプローブが選択的に回収されていることの確認
回収したサンプルDNAに結合しているプローブを検出するために、上記方法により最終的にTE バッファーで回収したDNA 溶液を95 ℃処理をして、急冷することにより、ハイブリダイズしているDNA をはずした。その溶液に放射性[γ³²P]ATP とポリヌクレオチドキナーゼを加えることによって、プローブDNAの5' 末端を放射性標識した。反応物を8 M 尿素存在化の20 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、オートラジオグラフィーによってDNA のバンドを検出した。得られたバンドの位置からDNAの鎖長をもとに、目的DNA に結合していたDNA の種類を推定した。すなわち、目的のプローブが選択的にサンプルDNA に結合し、マグネット法によってサンプルDNA と一緒に回収されていたならば、DNA1, DNA2 が15 鎖長と16 鎖長のDNA バンドとして検出され、それ以外の鎖長のバンドが検出されないことになるが、実験結果はその通りになり、サンプルDNAに相補的な配列を有する目的プローブが特異的に結合したことを示す結果となった。 結果を図３に示す。この結果より一種類のサンプルDNAに複数のプローブDNAが同じ効率で結合していることが示され、本発明の原理が有効に働きうることが示された。

本発明の原理を説明する図であり、サンプルＤＮＡに目的塩基配列が存在するか否か、検索手段を現したものである。 図２は最近よく利用されているＤＮＡチップを使った目的塩基配列の検出方法の例を説明する図である。 サンプルDNAに結合したプローブDNAを検出する電気泳動図である。マグネット法でサンプルDNA と一緒に回収されたDNA溶液を放射性標識して、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動でその鎖長を検出した。レーン１、７は回収された溶液を用いて標識したもの。レーン２〜６は本実験で用いたプローブDNA（DNA1〜6）をそれぞれ直接、末端放射性標識して泳動した。レーン2、DNA1; レーン3, DNA2; レーン4, DNA3; レーン5, DNA4; レーン6, DNA5 。

符号の説明

１ 目的塩基配列（１）；
１ａ 目的塩基配列（１）のＤＮＡ；
１ｂ 目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ；
２ 目的塩基配列（２）
２ａ 目的塩基配列（２）のＤＮＡ
２ｂ 目的塩基配列（２）の相補鎖ＤＮＡ；
３ 目的塩基配列（３）；
３ａ 目的塩基配列（３）のＤＮＡ；
３ｂ 目的塩基配列（３）の相補鎖ＤＮＡ；
４ 目的塩基配列（４）；
４ａ 目的塩基配列（４）のＤＮＡ；
４ｂ 目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ；
５ サンプルＤＮＡ；
６ 蛍光標識；
７ ＤＮＡチップ読み取り装置；
８ プローブＤＮＡ群；
９ ＤＮＡチップ；
１０ ハイブリダイゼーション溶液；
１１ ランプ；
１２ 読み取った画像；
１３ ガラス；
１４ ＤＮＡ群；
１５ ｃ−プローブＤＮＡ群；
１６ ｃ−ＤＮＡチップ；
１７ 磁気ビーズ；
１８ 磁石

Claims (7)

1. サンプルＤＮＡまたはＲＮＡ中の目的の塩基配列を検出する方法であって、以下の工程：
   （１）サンプルＤＮＡまたはＲＮＡとプローブＤＮＡまたはＲＮＡを水溶液中で接触させてハイブリダイゼーション複合体を形成させ；
   （２）該ハイブリダイゼーション複合体を単離し；
   （３）該複合体を解離させて、プロ−ブＤＮＡまたはＲＮＡを分離し；
   （４）該プローブＤＮＡまたはＲＮＡを同定して、サンプルＤＮＡまたはＲＮＡ中の目的の塩基配列を検出する；
   を含む方法。
2. ハイブリダイゼーションを、サンプルＤＮＡまたはＲＮＡとプローブＤＮＡまたはＲＮＡのいずれをも固定化させずに行う請求項１に記載の方法。
3. 複数種類のプローブＤＮＡまたはＲＮＡを用いる請求項１または２に記載の方法。
4. プローブＤＮＡまたはＲＮＡが蛍光標識されている請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. プローブＤＮＡまたはＲＮＡの同定をその相補鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 相補鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化されている請求項５に記載の方法。
7. 固定化相補鎖ＤＮＡまたはＲＮＡがＤＮＡまたはＲＮＡチップの形態をとっている請求項６に記載の方法。

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