JP2005253315A5 - - Google Patents

Description

従来、サンプルＤＮＡ中に目的とする塩基配列が存在するか否か検出する手法として、検出したい目的塩基配列の相補鎖関係にある塩基配列のＤＮＡをプローブＤＮＡとして作成し、ガラスやメンブレンなどに固定させてＤＮＡチップを作り、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップに固定化されているプローブＤＮＡをハイブリダイゼーションさせ、サンプルＤＮＡに目的の塩基配列があったときはサンプルＤＮＡ中の目的塩基配列を持つ部位とＤＮＡチップに固定されているプローブＤＮＡがハイブリッド形成されて結合される。目的とした塩基配列がなかったときはプローブＤＮＡと結合されないため、溶液中で浮遊している状態になる。ハイブリダイゼーションのあと、ＤＮＡチップを洗うと浮遊しているＤＮＡは流され、固定化しているものは流されない。よって、プローブＤＮＡとハイブリッド形成しているサンプルＤＮＡは結合されているため、ＤＮＡチップを洗っても流されないことになる。ハイブリッド形成しているプローブＤＮＡの検出方法は、サンプルＤＮＡに予め蛍光標識を付けておき、ランプやレーザーなどの光源で励起して発光させ、ＤＮＡチップ読取装置で画像を読み取り、どのプローブＤＮＡにサンプルＤＮＡが結合しているか、ハイブリダイゼーションの作用を使って、目的塩基配列の有無をプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡで直接ハイブリダイズしておこなう１ステップ検出で検出している（非特許文献１を参照）。
図２は最近よく利用されているＤＮＡチップを使った目的塩基配列の検出方法の例である。本例は、４種類の異なる目的塩基配列（１）１，目的塩基配列（２）２，目的塩基配列（３）３，目的塩基配列（４）４がサンプルＤＮＡ５に存在するか否かを検出する手法を現したものである。本例では、サンプルＤＮＡ中に目的塩基配列（１）１と目的塩基配列（４）４が存在するものを例として検出している。図２(Ａ)はあらかじめ蛍光標識を付けたサンプルＤＮＡ５で、目的塩基配列(1)１と目的塩基配列(４)４が存在するサンプルＤＮＡ５である。図２（Ｂ）は検出したい目的塩基配列(1)１から目的塩基配列(４)４の対になっているＤＮＡ群１４で、目的塩基配列（１）のＤＮＡ１ａと目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂ，目的塩基配列（２）のＤＮＡ２ａと目的塩基配列（２）の相補鎖ＤＮＡ２ｂ，目的塩基配列（３）のＤＮＡ３ａと目的塩基配列（３）の相補鎖ＤＮＡ３ｂおよび目的塩基配列（４）のＤＮＡ４ａと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂからなる。このとき、目的塩基配列（１）のＤＮＡ１ａと目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂの関係はハイブリダイズすればよいため、相補の関係が完全一致でもよいし、完全一致でなくてもよい。図２（Ｃ）は図２（Ｂ）の中から相補鎖ＤＮＡ１ｂから４ｂをプローブＤＮＡ群８として、ガラスまたはメンブレン１３に固定化し、図２（Ｄ）のＤＮＡチップ９を作成する。図２（Ｅ）はサンプルＤＮＡ５とＤＮＡチップ９に固定されているプローブＤＮＡ群８をハイブリダイゼーション溶液１０に入れ、ハイブリダイズさせる。そのとき、サンプルＤＮＡ５の目的塩基配列(1)１の部位と目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂとが相補鎖関係にあるため、サンプルＤＮＡ５の目的塩基配列(1)１の部位と目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂがハイブリッド形成され結合される。図２（Ｆ）はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップ９の読み取りで、方式はランプ１１で蛍光標識６を励起して発光させ、ＤＮＡチップ読取装置７で読み取る。この例ではサンプルＤＮＡ５の目的塩基配列(1)１の部位とハイブリッド形成して結合されている目的塩基配列（１）１の相補鎖ＤＮＡ１ｂの位置が光ることになる。図２（Ｇ）はＤＮＡチップ読取装置７で読み取った画像１２で、光っている位置からサンプルＤＮＡ５に目的塩基配列(1)１が存在していることがわかる。現在、このようにして、目的の塩基配列がサンプルＤＮＡにあるか否かを検出している。
「サイエンス（Science）」270 巻p467-470

以下、本発明の一実施態様について説明する。図１は本発明の原理を説明する図であり、サンプルＤＮＡに目的塩基配列が存在するか否か、検索手段を現したものである。本実施例は、求めたい目的塩基配列は４種類で、サンプルＤＮＡ５には、目的塩基配列（１）１、目的塩基配列（４）４が存在している例を使用して、検索方法を現している。この方法は、ステップ１として、サンプルＤＮＡと目的塩基配列のプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせ、ステップ２として、ハイブリッド構成したプローブＤＮＡを剥がして、プローブＤＮＡの相補鎖ＤＮＡでハイブリダイズさせて求めるもので、２ステップ工程で検出している。図１（Ａ）は目的塩基配列の検索対象のサンプルＤＮＡ５で、目的塩基配列（１）１、目的塩基配列（４）４が存在し、サンプルＤＮＡ５を制御するための磁気ビーズ１７を結合させている。図１（Ｂ）は、目的塩基配列を検索するための、対になっているＤＮＡ群１４で、目的塩基配列（１）のＤＮＡ１ａと目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂ，目的塩基配列（２）のＤＮＡ２ａと目的塩基配列（２）の相補鎖ＤＮＡ２ｂ，目的塩基配列（３）のＤＮＡ３ａと目的塩基配列（３）の相補鎖ＤＮＡ３ｂおよび目的塩基配列（４）のＤＮＡ４ａと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂからなる。図１（Ｃ）は、サンプルＤＮＡとハイブリダイゼーションさせて、検索するためのプローブＤＮＡ群８で、目的塩基配列（１）１のＤＮＡ１ｂ，目的塩基配列（２）２のＤＮＡ２ｂ，目的塩基配列（３）３のＤＮＡ３ｂおよび目的塩基配列（４）４のＤＮＡ４ｂで構成させる。図１（Ｄ）は、サンプルＤＮＡ５にハイブリダイズしたプローブＤＮＡを検出するための手段で、プローブＤＮＡ群８の相補鎖関係にある目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ａから目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ａのｃ−プローブＤＮＡ群１５をガラスまたはメンブレン１３に固定化し、ｃ−ＤＮＡチップ16化しておく。図１（Ｅ）は、サンプルＤＮＡ５とプローブＤＮＡ群８をハイブリダイゼーション溶液１０に入れ、１つのチューブ１９でハイブリダイゼーションさせる。このとき、サンプルＤＮＡ５にプローブＤＮＡと相同の塩基配列があるときはハイブリッド形成して結合し、未結合のプローブＤＮＡは溶液中で浮遊することになる。本例ではサンプルＤＮＡ５の目的塩基配列（１）１と目的塩基配列（４）４の部位に、目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂが結合することになる。
図１（Ｆ）と図１（Ｇ）は、図１（Ｅ）のハイブリダイゼーション後、サンプルＤＮＡ５に結合したプローブＤＮＡと未結合のプローブＤＮＡを分離するための手段で、サンプルＤＮＡ５を磁石１８で図１（Ｆ）のように固定し、溶液を図１（Ｆ）から図１（Ｅ）に移す。このとき、サンプルＤＮＡ５に結合しているプローブＤＮＡの目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂは移動せず、溶液中で浮遊している未結合のプローブＤＮＡの目的塩基配列（２）の相補鎖ＤＮＡ２ｂと目的塩基配列（３）の相補鎖ＤＮＡ３ｂは図１（Ｇ）のように移動する。こうすることで、結合したプローブＤＮＡと未結合のプローブＤＮＡを分離することができ、サンプルＤＮＡ５に結合したプローブＤＮＡを選択することができる。
図１（Ｈ）は、結合しているプローブＤＮＡ分離するため、目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂをサンプルＤＮＡ５から切り離す。切り離しは溶液をアルカリ性条件にするかまたは熱をかけて行なう。
図１（Ｉ）と図１（Ｊ）は、切り離したサンプルＤＮＡ５とプローブＤＮＡを分離させるもので、サンプルＤＮＡ５を図１（Ｈ）から図１（Ｉ）に移動させる。こうすることで、図１（Ｊ）に結合していたプローブＤＮＡが残り、サンプルＤＮＡ５とプローブＤＮＡの目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂおよび目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂを分離することができる。そのあと、読み取りのため、図１（Ｊ）のように分離抽出したプローブＤＮＡに蛍光物質を標識させるが、蛍光物質を標識するタイミングは図１（Ｃ）の時点でおこなってもよい。一方、図１（Ｉ）のサンプルＤＮＡ５は実際に実験をおこなったサンプルＤＮＡとして、保存することができる。
図１（Ｋ）は、分離抽出したプローブＤＮＡの種類を検出するため、ハイブリダイゼーション溶液１０に、図１（Ｊ）の分離したプローブＤＮＡと図１（Ｄ）のｃ−ＤＮＡチップ１６を入れ、プローブＤＮＡと相補鎖関係にあるｃ−プローブＤＮＡ群１５とハイブリダイズさせる。その結果として、目的塩基配列（１）のＤＮＡ１ａと目的塩基配列（１）の相補鎖ＤＮＡ１ｂおよび目的塩基配列（４）のＤＮＡ４ａと目的塩基配列（４）の相補鎖ＤＮＡ４ｂがハイブリッド形成して結合される。
図１（Ｌ）は、ハイブリッド形成しているプローブＤＮＡの検出で、従来のＤＮＡチップ読取装置７でｃ−ＤＮＡチップを読み取る。
図（Ｍ）は、ｃ−ＤＮＡチップを読み取った画像で、抽出したプローブＤＮＡの結合している位置が光るため、どのプローブＤＮＡが結合したか判別することができる。本実施例では目的塩基配列（１）と目的塩基配列（４）のプローブＤＮＡがサンプルＤＮＡに結合したいたことがわかる。
このように、ｃ−ＤＮＡチップに結合したプローブＤＮＡを求めることで、サンプルＤＮＡにどの目的塩基配列が存在するか検出することができる。なお、ここではサンプルＤＮＡに結合したプローブＤＮＡの分類と検出に、自動化されているＤＮＡチップを利用した塩基配列の検出方法を説明したが、サンプルＤＮＡに結合したプローブＤＮＡの分類と検出の方法は手法であってもよい。また、本発明のプローブＤＮＡの検出を相補鎖プローブＤＮＡで検出する方式は、ＤＮＡチップ以外のものにも適用できることはもちろんである。
以下、上記の手法により、サンプルDNAに選択的に結合したプローブを回収した例を示す。