JP2008504841A - 微生物atpの抽出及び検出システム - Google Patents
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Abstract
Description
明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特に断りのない限り、全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。参照した全ての特許および公報は、特に断りのない限り、参照によってその全体をここに援用する。
本発明の一態様では、本発明者らは、最適化されていない二価カチオン濃度が、いくつかの微生物細胞からのATPの効果的な放出および検出を妨害できることを見いだした。典型的なルシフェラーゼ媒介ATP検出法は、10〜20mM程度の二価カチオン濃度および約1〜2mMの二価カチオンキレート剤濃度(例えばWoodら、米国特許出願公開第2003/0104507号明細書を参照されたい)を有する試薬組成物を利用する。図1は、B.セレウス(B.cereus)(図1A)および緑膿菌(P.aeruginosa)(図1B)のための二価カチオン濃度の関数としてのATP検出の動態の違いを実証する実験について述べる。二価カチオンはATP検出に必須であるにもかかわらず、この実験からの結果は、予期される二価カチオン量よりも低い量を使用して、実際に微生物細胞中により良いルミネセンスが得られるかもしれないという驚くべき知見を立証する。さらに本発明の発明者らは、試薬組成物または反応混合物中の遊離の二価カチオン(例えばMg2+)濃度をEDTAなどの二価カチオンキレート剤で減少させることにより、特定のATP抽出剤組み合わせの使用から得られるバイオルミネセンスが選択的に増強できることを意外にも見いだした(図2)。この「マグネシウム反転効果」は、その中でCDTAなどのキレート剤化合物の添加がルミネセンス(図3)を活性化することが見いだされた実験によって、さらに支持される。本発明の発明者らは、ATP抽出/検出試薬組成物または反応混合物中に存在する二価カチオンよりも高い濃度で二価キレート剤を使用した(またはキレート剤ありまたはなしで、単により低い二価カチオン量を使用した)場合の、ATP抽出および検出の予想外の利点をさらに立証した。試薬組成物を最適化してこれらの観察を活用することで、同一試薬組成物を使用して、多種多様な微生物源から効率的なATP放出および検出を得ることができた。
1.ATP抽出剤
本発明の一態様は、微生物細胞からのATP放出を促進するための1つ以上のATP抽出剤使用を含む。微生物ATP抽出剤は、ポリミキシンB(例えばポリミキシンB1およびポリミキシンB2)、ポリミキシン−β−ノナペプチド(PMBN)、およびクロロヘキシジン(CHEX)などの抗生物質と、オクチル−β−D−1−チオグルコピラノシドなどのアルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシドと(参照によってその全体をここに援用する米国特許第6,174,704号明細書を参照されたい)、エトキシル化オクチルフェノールトリトンX−100(TX−100)およびその他のエトキシル化アルキルフェノールをはじめとするが、これに限定されるものではない、非イオン性エトキシル化アルキルフェノールなどの非イオン性洗剤と、カルボキシプロピルベタイン(CB−18)などのベタイン洗剤と、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)などの四級アンモニウム塩と、臭化トリメチルオクタデシルアンモニウム(TMA−18)と、プロタミンと、トリエチルアミン(TEA)およびトリエタノールアミン(TeolA)などのアミンと、ポリリジン、ナイシン、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼ(phopholipase)A2、ホスホリパーゼA2活性化ペプチド(PLAP)などのカチオン性、抗細菌、孔形成、膜活性、および/または細胞壁活性ポリマーと、バクテリオファージなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、微生物細胞壁および/または膜を透過処理してATP放出を容易にできる、多様な作用物質を含んでもよい。例えば参照によってその全体をここに援用するMorbeら、Microbiol.Res.(1997年)第152巻、385〜394頁、およびイオン性表面活性化合物を開示する米国特許第4,303,752号明細書を参照されたい。
カブトムシルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、ATPだけでなく二価カチオンにも依存する。したがってルシフェラーゼ活性を容易にするために、(サンプル中に既に存在する場合を除いて)二価カチオンが典型的に提供される。二価カチオンとしては、マグネシウム、カルシウム、およびマンガンが挙げられる。二価カチオンは、スルフェート、スルホネート、グルコネート、カーボネート、塩化物、および臭化物などの塩またはハロゲン化物として供給されてもよい。例えばマグネシウムカチオンは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、炭酸マグネシウムなどとして提供されてもよい。好ましくは二価カチオンは、マグネシウムの塩化物または硫酸塩から選択される。
二価カチオンキレート剤としては、制限なく、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、エチレングリコールテトラ酢酸(EGTA)、および1,2−シクロヘキサンジニトリロテトラ酢酸(CDTA)、ニトリロ酢酸(NTA)、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸、リグノスルホネートの塩、およびそれらの混合物が挙げられる。好ましくはキレート剤は、それらの一般入手可能性および比較的低価格から、EDTA、EGTA、およびCDTAよりなる群から選択される。二価カチオンキレート剤の適切なレベルは、ATP抽出に対する二価カチオンの悪影響を中和するのに十分であるが、カチオン依存性のルシフェラーゼ触媒ATP検出を防止する程度ではないレベルを提供することに基づいて、経験的に判定されてもよい。
それらの最も基礎的レベルでは、ルシフェラーゼはルミネセンスを生じるそれらの能力によって画定される。より具体的には、ルシフェラーゼは基質ルシフェリンの酸化を触媒することで、オキシルシフェリンおよび光子を生成する。その触媒生成物が光を含むルシフェラーゼは、感度、検出可能な生成物、およびATPの容易な測定を提供する。あらゆるATP依存性ルミネセンス生成酵素が、本発明の試薬組成物および方法中で使用するために考察される。
微生物細胞は、経時的に細胞中に存在するATP量を歪められる物質を含んでもよい。これはATP分解酵素、ATP分解酵素阻害物質、および/またはATP生成酵素の阻害物質の存在に起因してもよい。ATP濃度は特定時間に判定されるので、そのままにしておくと、ATP生成または損失と結びついた不適切な活性が、微生物細胞中に存在するATP濃度の過大評価をもたらすかもしれない。
適切な緩衝液の選択は、pH緩衝能力およびルシフェラーゼ−ルシフェリン反応との相互作用に依存する。作用溶液に適切なpHを維持し、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を妨げないあらゆる緩衝液が考察される。好ましいpH範囲は約pH4.5から約pH9.0の間であり、より好ましくは約pH6.0から約pH8.0の間である。MESおよびクエン酸緩衝液に加えて、典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝食塩水(PBS)、トリス、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−エタンスルホン酸)(HEPES)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、ホウ酸塩、および当業者に適切であるかもしれないことが知られているその他のあらゆる緩衝液が挙げられる。典型的な緩衝剤としては、トリシン、HEPPS、HEPES、MOPS、トリス、グリシルグリシン、および適切なpHおよびイオン強度を維持するのに使用されるリン酸塩が挙げられる。好ましい緩衝液濃度は、約50mM〜200mMの範囲である。
気泡に起因するサンプルの損失および/またはサンプルの相互汚染を防止するために、脱泡剤が望ましい。脱泡剤の添加はまた、製造または使用中の生成物の定量供給を容易にするかもしれない。適切な脱泡剤としては、商品名MAZU(登録商標)(PPG Industries、Gurnee,IL)の下に入手できるものが挙げられ、有機またはシリコーンベースであってもよい。脱泡剤の選択は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応への妨害性なしに泡を除去するそれらの能力に左右されてもよい。
試薬組成物はまた、安定剤または揮発性制御剤を含んでもよい。安定剤または揮発性制御剤は、ルシフェラーゼを分解から安定化する、および/またはルシフェラーゼおよび/またはルシフェリンの凍結乾燥を助けるあらゆる化合物であってもよい。適切な酵素安定剤としては、ウシ血清アルブミン(BSA)、Prionex(Pentapharm Ltd.、Basel,Switzerland)などのBSA代用品、ゼラチン、および洗剤(好ましくは非イオン性洗剤、最も好ましくはTHESIT)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の方法、組成物、およびキットは、微生物サンプル中のATP(またはルシフェラーゼ基質として機能できるATP類似体)の単純な定性的または定量的検出を提供する。概してサンプル中のルミネセンスを実証する単純な定性実験は、ATPの存在を示す。
一態様では、本発明は、細菌、酵母またはその他の真菌などの微生物サンプル中、または微生物サンプルを含有することが疑われるサンプル中のATPを抽出し検出する方法を提供する。真正細菌(グラム陽性細菌、グラム陰性細菌の双方)、古細菌、酵母または真菌をはじめとするが、これに限定されるものではない、本発明に従って使用するのに適した多様な微生物源がある。例えば本発明の試薬組成物は、大腸菌(Escherichia coli)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、フラボバクテリウム・オケアノコイテス(Flavobacterium okeanokoites)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびフランシセラ・フィロミラジア(Francisella philomiragia)などのグラム陰性細菌、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureaus)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バシラス・セレウス(Bacilus cereus)、アルスロバクター・ルテウス(Arthrobacter luteus)などのグラム陽性細菌、およびサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)などの真核生物の微生物をはじめとするが、これに限定されるものではない多様な異なる微生物の生物体で機能することが見いだされている。好ましい実施形態では、サンプルは、大腸菌(E.coli)または緑膿菌(P.aeruginosa)を含有する、または含有することが疑われる。本発明の方法は、あらゆる量のATPを含有するサンプルと共に使用してもよいが、非飽和量のATP(すなわちルミネセンスがATP濃度に正比例する範囲)を含有するサンプルを使用することが好ましい。
微生物源からの効率的なATP抽出または放出は、微生物源によって呈される構造的な制約に左右されるかもしれない。これらの状況は、二価キレート剤化合物量のバランスを取って、十分なレベルの二価カチオンがATPのバイオルミネセンスの検出を促進しながら、二価カチオン媒介安定化を逆転させることを必然的に伴うかもしれない。ATPを抽出し検出するための適切なATP抽出剤の選択は、特定微生物源について経験的に判断してもよい。好ましくはこれらの化合物の選択は、本発明に従った一段階抽出およびATP検出のための効率的なATP抽出、およびATP検出活性(例えばルシフェラーゼ活性など)の維持を前提としている。
カブトムシルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、光(「ルミネセンス」)生成をもたらす。カブトムシルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はATP依存性であるため、ルシフェラーゼを使用してATPをアッセイできる。反応は顕著に高感度であり、わずか10-16モル以下のATPを含有するサンプル中のATPを検出できるようにする。本発明の組成物、方法、およびキットは、ルミネセンスの量を定量化することで、使用者がサンプル中のATP量を定量できるようにする。本発明は関心のあるサンプル、および既知量のATP(対照)含有サンプルにも適用される。未知のATP濃度のサンプルから発生した信号と、内部対照から発生した信号(例えばサンプルへの既知量のATP添加と引き続いくルミネセンス測定)とを、またはいくつかの既知ATP濃度サンプルのルミネセンスを測定しグラフにプロットして作成した外部標準曲線とを相関させてもよい。このような方法は当業者に知られている(MoyerおよびHenderson、1983年;Ronnerら、1999年;Stanley、1989年;Woodら、1989年)。
ATPの存在は、生細胞に特徴的な活性代謝プロセスの反映である。したがって本発明の組成物、方法、およびキットを使用して、細胞生存度をアッセイできる(Cree、1998年;Jassimら、1990年;Pettyら、1995年)。細胞生存度の正確な測定は、細胞に対する物質の効果の正確なアセスメントを可能にする。細胞生存度に関するその他の応用は、当業者に知られている。細胞生存度を判定することは、例えば細胞毒性、細胞増殖、壊死、細胞代謝の変化などを評価するのに有用であってもよい。
均質な溶解および検出試薬を作成するための構成要素、および使用説明のセットを含んでもよい、本発明に従って使用されるアッセイキットが考察される。好ましくはキットは、ルシフェリン/ルシフェラーゼの凍結乾燥供給源、均質な溶解および検出試薬を作成するためのATP抽出剤を含有する水戻し緩衝液のバイアルを含んでもよい。水戻し緩衝液は、固定濃度のカチオンおよび/またはキレート剤と共に供給されてもよく、またはこれらの構成要素は別々に供給されて、特定の微生物細胞源材料(例えば個々の細胞、集団など)次第で、使用者が二価カチオンおよび/またはキレート剤を使用に適した濃度で添加できるようにしてもよい。
異なる微生物は、本プロセスに影響する構造的な差違に基づいて、それらが一段階細胞溶解−ATP検出プロセスをサポートをできる程度において違いを示すので、本発明は別の態様では、特定の微生物または微生物群中のATPの効率的な一段階溶解および検出に適した適切な反応条件を同定する方法を提供する。特に本発明は、ATPの抽出および検出に個々にまたは集合的に影響できる、微生物ATP抽出剤、二価カチオン、および二価キレート剤化合物間の最適バランスを評価または判定するためのアッセイを提供する。
1.生微生物細胞または微生物の汚染の存在を判定する
本発明の主要な用途は、上で開示される方法を使用して、微生物細胞サンプルの相対生存度、微生物の細胞個体数、または疑われる微生物汚染源を判定することである。
本発明に従った細胞生存度アッセイの使用は、薬学的活性剤または生物学的活性剤の開発および試験にさらに応用してもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物、方法、およびキットを使用して、抗生物質候補化合物の有効性を評価してもよく、または細菌代謝に対する無機物、小型有機物、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドなどの化合物の効果を試験してもよい(Aigingerら、1980年;Andreottiら、1995年;Bradburyら、2000年;CreeおよびAndreotti、1997年;Crouchら、1993年;Kangasら、1984年)。薬学的活性または生物学的活性剤(例えば抗生物質など)による微生物細胞の処置に続く細胞生存度の測定は、微生物の生育に悪影響を与える新しい薬学的または生物学的活性剤をスクリーニングし、同定する手段を提供するかもしれない。
水戻し試薬(200mM HEPES、pH7.5(Sigma)、MgCl2(0mM、2.5mM、5mM、10mMまたは20mM)、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、2mMナトリウムフッ化物(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma))および基質(4mMクエン酸塩、mMルシフェリン、0.4%Prionex(Pentapharm,Ltd)、約0.08mg/mlの熱安定性ルシフェラーゼ、1mM硫酸マグネシウム、および1.25mM CDTA)を含んでなるルシフェラーゼ試薬組成物を使用して、微生物細胞中のATP検出の動態を評価した。100μlの緑膿菌(P.aeruginosa)培養物または100μlの1×10-9M ATP原液(対照)のいずれかを100μlのルシフェラーゼ試薬組成物に添加して、35分間かけてルミネセンスを周期的に測定した。ウェルあたりおよそ106個の細胞で、緑膿菌(P.aeruginosa)を試験した。この分析結果(図1)は、二価カチオン濃度の関数としてATP検出の違いを明らかにする。
ATP検出に対する異なるATP抽出剤の組み合わせの効果を低い(0.2mM)および高い(20.0mM)二価カチオン濃度で試験した。BacTiter−GloTM試薬組成物(0.358mg/ml UltraGloTMルシフェラーゼ(Promega)、6mMカブトムシルシフェリン(Promega)、200mM HEPES(Sigma)、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma))中において、「高い」(+;20mM)または「低い」(−;0.2mM)濃度のMgCl2の存在下で、緑膿菌(P.aeruginosa)を異なるATP抽出剤で処理した。100μlの緑膿菌(P.aeruginosa)培養物を100μlのBacTiter−GloTM試薬組成物に添加して、ルミネセンスを測定した。緑膿菌(P.aeruginosa)をウェルあたりおよそ106個の細胞で試験した。この分析結果(図2)は、試薬組成物または混合物中のマグネシウムレベルを20mMから0.2mMに減少させたときに、時間枠内の当量点(例えばt=0分)において増大するルミネセンスによって特徴づけられる、「マグネシウム反転」効果を実証する。
キレート剤による二価カチオンの中和が、低い二価カチオン濃度条件下で得られる、より高いルミネセンスを模倣できることを実証するために、水戻し試薬(200mM HEPES(Sigma)、20mM MgCl2、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma))および基質(4mMクエン酸塩、5mMルシフェリン、0.4%Prionex(Pentapharm,Ltd)、約0.08mg/mlの熱安定性ルシフェラーゼ、1mM硫酸マグネシウム、および1.25mM CDTA)を含んでなるルシフェラーゼ試薬組成物で、大腸菌(E.coli)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、緑膿菌(P.aeruginosa)、およびB.セレウス(B.cereus)培養物を処理した。100μlの細菌培養または100μlの1×10-9M ATP原液(対照)のいずれかを100μlの水戻し試薬に添加して、ルミネセンスを35分間にわたり周期的に測定した。ウェルあたりおよそ106個の細胞で、微生物の培養物を試験した。追加的CDTAをt=12分に各サンプルに添加した(最終濃度=20mM CDTA)。この分析結果(図3)は、CDTAが緑膿菌(P.aeruginosa)中の二価カチオンの阻害効果を中和できることを示唆する。
二価カチオンキレート剤の存在下におけるATP検出を実証するために、異なる濃度のEDTA(0mM、22mM、23mM、24mM、および25mM)を含有する水戻し試薬組成物(200mM HEPES(Sigma)、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、20mM MgCl2(Sigma))を調製した。次に水戻し試薬組成物と基質(4mMクエン酸塩、5mMルシフェリン、0.4%Prionex(Pentapharm,Ltd)、約0.08mg/mlの熱安定性ルシフェラーゼ、1mM硫酸マグネシウム、および1.25mM CDTA)とを混合して、ルシフェラーゼ試薬組成物を生じさせた。100μlの大腸菌(E.coli)(図4A)、緑膿菌(P.aeruginosa)(図4B)または1×10-9MのATP原液(図示せず)を100μlのルシフェラーゼ試薬組成物に添加して、ルミネセンスを40分間にわたり周期的に測定した。ウェルあたりおよそ106個の細胞で細菌培養を試験した。この分析結果(図4A、4B)は、ATPの放出と検出の間の適切なバランスを促進するのに最適化された二価キレート剤濃度を使用して、阻害的二価カチオン効果が中和されてもよいことを示唆する。
異なる細菌間でのATP検出に対する二価カチオン濃度の効果を判定するために、水戻し試薬(200mM HEPES(Sigma)、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma))を異なる濃度のMgCl2(0mM、2.5mM、5mM、10mM、および20mM)に添加)を調製して、基質(4mMクエン酸塩、5mMルシフェリン、0.4%Prionex(Pentapharm,Ltd)、約0.08mg/mlの熱安定性ルシフェラーゼ、1mM硫酸マグネシウム、および1.25mM CDTA)に添加した。大腸菌(E.coli)(図5A)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)(図5B)、緑膿菌(P.aeruginosa)(図5C)、およびB.セレウス(B.cereus)(図5D)をウェルあたりおよそ106個の細胞で試験した。対照として、精製ATP溶液もまた試験した(図示せず)。100μlの細菌培養または100μlの1×10-9ATP M原液のいずれかを100μlの試薬に添加し、ルミネセンスを35分間にわたり周期的に測定した。この分析結果(図5A〜5D)は、微生物および二価カチオン濃度に依存するATP検出の差違を明らかにする。
低い(0.2mM)および高い(20.0mM)二価カチオン濃度におけるATP検出の動態を評価するために、低い(0.2mM)または高い(20.0mM)濃度のMgCl2を含有する試薬組成物(200mM HEPES(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/ml UltraGloTMルシフェラーゼ(Promega)、および6mMカブトムシルシフェリン(Promega))に、様々な異なるATP抽出剤の組み合わせを含めて、そこに含有される抽出剤および/または二価カチオン濃度に関してそれぞれ異なる一連の試薬組成物を形成した。100μlの異なる各試薬組成物を小型ウェル内の100μlの大腸菌(E.coli)(図6A、6B)、緑膿菌(P.aeruginosa)(図6C、6D)、または1×10-9M ATP対照溶液(図6E、6F)に添加した。ルミネセンスを50分間にわたり周期的に測定した。この分析結果(図6A〜6F)は、微生物、ATP抽出剤の組み合わせ、および二価カチオン濃度に依存するglo動態の差違を示唆する。
低い(0.2mM)および高い(20mM)二価カチオン濃度におけるATP抽出および検出に対する代案の二価カチオン効果を評価するために、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC27853)をミュラー−ヒントンII(MHII)ブロス中において37℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なMHIIブロス中で50倍に希釈して、次に数時間インキュベートして対数期にした。細胞をウェルあたりおよそ1×106個の細胞に希釈した。ATP対照溶液をおよそ10-9Mに希釈した。100μlのBacTiter−GloTM試薬組成物(0.002、0.02、0.2、2.0または20mMの異なる濃度のMgCl2(図7A)、CaCl2(図7B)、またはMnCl2(図7C)のいずれかを含有する、200mM HEPES(Sigma)、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/ml UltraGloTMルシフェラーゼ(Promega)、および6mMカブトムシルシフェリン(Promega))を調製して、100μlの細菌またはATP対照サンプルに添加した。Turner BiosystemからのVeritasTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。高いCa2+(図7B)およびMn2+(図7C)の使用が、ATP検出を同様に妨害することが見いだされることから、この分析結果(図7A〜7C)は、ATPの抽出および検出に対する二価カチオンの影響がMg2+に限定されないことを示唆する。
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC27853)をミュラー−ヒントンII(MHII)ブロス中において37℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なMHIIブロス中で50倍に希釈して、次に数時間インキュベートして対数期にした。細胞をウェルあたりおよそ1×106個の細胞に希釈した。ATP対照溶液をおよそ10-9Mに希釈した。100μlのBacTiter−GloTM試薬組成物(低い(0.2mM)または高い(20mM)MgCl2濃度のいずれかを含有する、200mM HEPES(Sigma)、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/ml QuantiLum組換えルシフェラーゼ(Promega)、および6mMカブトムシルシフェリン(Promega))を調製して、細菌またはATP対照サンプルのいずれかに添加した。Turner BiosystemからのVeritasTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。この分析結果(図8)は、ATPの一段階抽出および検出に対する二価カチオンの阻害効果が、熱安定性ルシフェラーゼの使用に限定されないことを示唆する。
4種の細菌株を使用して、微生物細胞数とルミネセンス間の関係をを評価した。細菌株大腸菌(Escherichia coli)(ATCC25922)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC25923)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC27853)、およびバシラス・セレアス(Bacillus cereus)(ATCC10987)をミュラー−ヒントンII(MHII)ブロス中において37℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なMHIIブロス中で50倍に希釈して、次に数時間インキュベートして対数期にした。96−ウェルプレート内のMHIIブロスを使用して、培養物のサンプルを連続的に希釈した。水戻ししたBacTiter−GloTM試薬組成物(200mM HEPES(Sigma)、0.08%CTAB(Sigma)、0.16%CHEX(Sigma)、1%トリトン−X100(Sigma)、20mM MgCl2、23mM EDTA、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/ml UltraGloTMルシフェラーゼ(Promega)、および6mMカブトムシルシフェリン(Promega))を感度改善のために室温で1.5時間平衡化して、異なる各培養サンプルに添加した。Turner Biosystem(Sunnyvale,CA)からのVeritasTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。
実施例9で述べられるようにして4種の異なる細菌(大腸菌(E.coli)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、緑膿菌(P.aeruginosa)、およびB.セレウス(B.cereus))を生育させ、アッセイした。各アッセイでおよそ106個の細胞を使用した。ルミネセンス信号の安定性を経時的にモニターした。Turner Biosystem(Sunnyvale,CA)からのVeritasTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。この分析結果(図10)は、本発明の微生物アッセイ系が、一連の微生物細胞において、半減期(T1/2)>30分である安定した「グロータイプ」のルミネセンス信号を生じられることを示唆する。
大腸菌(E.coli)ATCC25922株をMHIIブロス中において37℃で一晩生育させた。一晩培養物を50mlの新鮮なMHIIブロス中で1:106に希釈して、250rpmで振盪しながら37℃でインキュベートした。サンプルを様々な時点で採取し、実施例9で述べられるようにしてルシフェラーゼ検出アッセイを実施した。VeritasTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。Beckman DU650分光光度計を使用して、光学濃度を600nm(O.D.600)で測定した。RLUおよびO.D.の読み取りがそれぞれ108および1を超える場合は、希釈サンプルを使用した。この分析結果(図11)は、ATP検出アッセイが、従来の光学濃度測定よりも高感度の細菌生育の測定を提供することを示唆した(結果を挿入図と比較されたい)。
黄色ブドウ球菌(S.aureus)ATCC25923株をMHIIブロス中において37℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なMHIIブロス中で100倍に希釈して、抗菌剤スクリーンのための接種材料として使用した。LOPAC化合物の作業原液(50×)および標準抗生物質をDMSO中で調製した。96−ウェルマルチウェルプレートの各ウェルは、245μlの接種材料および5μlの50×作業原液を含有した。マルチウェルプレートを37℃で5時間インキュベートした。100μlの培養物を各ウェルから取り出して、実施例9で述べられるようにしてルシフェラーゼ検出アッセイを実施した。Turner Biosystem(Sunnyvale,CA)からのVeritasTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。サンプルおよび濃度は次のとおり。ウェル1〜4および93〜96、2%DMSOの負の対照;ウェル5〜8および89〜92、32μg/mlの標準抗生物質テトラサイクリン、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、オキサシリン、カナマイシン、ピペラシリン、およびエリスロマイシンの正の対照;ウェル9〜88、10μMのLOPAC化合物。この分析結果(図12)は、抗生剤を同定するためのこのスクリーニング方法の使用を確証する(枠で囲んだ正の対照との比較で、円で示した)。
実施例8で述べられるようにして、黄色ブドウ球菌(S.aureus)ATCC25923株およびオキサシリンを調製し、37℃でインキュベートした。NCCLS(6)によってMIC判定で推奨されるように、19時間のインキュベーション後にATP検出アッセイを実施した。オキサシリンなしの対照と比べたRLUの相対百分率を示す。Turner Biosystem(Sunnyvale,CA)からのVeritasTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。この分析結果(図13)は、ATP検出に対する抗生物質の用量依存効果を実証する。
Claims (62)
- (a)反応緩衝液、
(b)1つ以上のATP抽出剤、
(c)第1の濃度の二価カチオン、
(d)第2の濃度の二価カチオンキレート剤、および
(e)ルシフェラーゼ酵素
を含んでなり、
第1の濃度と第2の濃度の間の差が約5mM未満である、微生物を含有することが疑われるサンプル中のATPを検出するための組成物。 - 第1の濃度と第2の濃度との差が約2.5mM未満である、請求項1に記載の組成物。
- 第1の濃度と第2の濃度との差が約1.0mM未満である、請求項1に記載の組成物。
- 第2の濃度が少なくとも第1の濃度の2分の1である、請求項1に記載の組成物。
- 第2の濃度が第1の濃度に少なくともほぼ等しいかまたはそれを超える、請求項1に記載の組成物。
- 第1の濃度が少なくとも10mMである、請求項1に記載の組成物。
- 第1の濃度が少なくとも20mMである、請求項1に記載の組成物。
- 第1の濃度が少なくとも約20mMであり、第2の濃度が少なくとも約20mMである、請求項1に記載の組成物。
- 微生物がグラム陰性細菌である、請求項1に記載の組成物。
- 微生物が大腸菌(E.coli)または緑膿菌(P.aeruginosa)である、請求項1に記載の組成物。
- 1つ以上のATP抽出剤がセチルトリメチル臭化アンモニウムを含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 1つ以上のATP抽出剤がクロロヘキシジンおよび非イオン性洗剤を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 1つ以上のATP抽出剤が、セチルトリメチル臭化アンモニウム、クロロヘキシジン、および非イオン性洗剤を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 二価カチオンがMg2+、Ca2+またはMn2+である、請求項1に記載の組成物。
- 二価カチオンキレート剤がEDTAまたはCDTAである、請求項1に記載の組成物。
- 二価カチオンがMg2+であり、二価カチオンキレート剤がEDTAである、請求項1に記載の組成物。
- (a)反応緩衝液、
(b)1つ以上のATP抽出剤、
(c)約5mM未満である第1の濃度の二価カチオン、
(d)ルシフェラーゼ酵素
を含んでなる、微生物を含有することが疑われるサンプル中のATPを検出するための組成物。 - 第1の濃度が約2.5mM未満である、請求項17に記載の組成物。
- 第1の濃度が約1mM未満である、請求項17に記載の組成物。
- 第1の濃度が約0.5mM未満である、請求項17に記載の組成物。
- 二価カチオンキレート剤をさらに含んでなる、請求項17に記載の組成物。
- 微生物がグラム陰性細菌である、請求項17に記載の組成物。
- 微生物が大腸菌(E.coli)または緑膿菌(P.aeruginosa)である、請求項17に記載の組成物。
- 1つ以上のATP抽出剤がセチルトリメチル臭化アンモニウムを含んでなる、請求項17に記載の組成物。
- 1つ以上のATP抽出剤がクロロヘキシジンおよび非イオン性洗剤を含んでなる、請求項17に記載の組成物。
- 1つ以上のATP抽出剤が、セチルトリメチル臭化アンモニウム、クロロヘキシジン、および非イオン性洗剤を含んでなる、請求項17に記載の組成物。
- 二価カチオンがMg2+、Ca2+またはMn2+である、請求項17に記載の組成物。
- 二価カチオンキレート剤がEDTAまたはCDTAである、請求項17に記載の組成物。
- 二価カチオンがMg2+であり、二価カチオンキレート剤がEDTAである、請求項17に記載の組成物。
- (a)反応緩衝液、
(b)1つ以上のATP抽出剤、
(c)第1の濃度の二価カチオン、
(d)第2の濃度の二価カチオンキレート剤
を含んでなり、
第2の濃度が第1の濃度に少なくともほぼ等しいかまたはそれを超える、グラム陰性微生物からATPを抽出するための組成物。 - 第1の濃度が少なくとも10mMである、請求項30に記載の組成物。
- 第1の濃度が少なくとも20mMである、請求項30に記載の組成物。
- 第1の濃度が少なくとも約20mMであり、第2の濃度が少なくとも約20mMである、請求項30に記載の組成物。
- (a)サンプルと、第1の濃度の二価カチオン、第2の濃度の二価カチオンキレート剤、1つ以上のATP抽出剤、およびルシフェラーゼ酵素を含んでなる組成物とを接触させて、混合物を形成するステップと、
(b)ルミネセンスを検出するステップ
を含んでなり、
第1の濃度と第2の濃度との差が約5mM未満である、微生物を含有するまたは含有することが疑われるサンプル中のATPを検出する方法。 - 組成物中の二価カチオンキレート剤濃度が、組成物中の二価カチオン濃度に少なくともほぼ等しいかまたはそれを超える、請求項34に記載の方法。
- 混合物中の二価カチオンキレート剤濃度が、混合物中の二価カチオン濃度の少なくとも2分の1である、請求項34に記載の方法。
- 微生物がグラム陰性細菌である、請求項34に記載の方法。
- 微生物が大腸菌(E.coli)または緑膿菌(P.aeruginosa)である、請求項34に記載の方法。
- サンプルが微生物細胞の異種性集団を含有するまたは含有することが疑われる、請求項34に記載の方法。
- サンプルが病原菌を含有するまたは含有することが疑われる、請求項34に記載の方法。
- 検出可能なルミネセンス信号が、サンプルと組成物とを接触させた後10分以内に生じる、請求項34に記載の方法。
- 検出可能なルミネセンス信号が、サンプルと組成物とを接触させた後5分以内に生じる、請求項34に記載の方法。
- ルミネセンスが少なくとも30分の半減期があるルミネセンス信号を生じる、請求項34に記載の方法。
- ルミネセンスがサンプル中の少なくとも1×10-14モルのATPを検出するのに十分なルミネセンス信号を生じる、請求項34に記載の方法。
- 組成物が少なくとも1000個の大腸菌(E.coli)細胞を検出するのに十分なルミネセンス信号を生じる、請求項34に記載の方法。
- (a)サンプルと、二価カチオン、1つ以上のATP抽出剤、およびルシフェラーゼ酵素を含んでなる組成物とを接触させて、混合物を形成するステップと、
(b)ルミネセンスを検出するステップ
を含んでなり、
二価カチオンが組成物中に約5mM未満の濃度で存在する、微生物を含有するまたは含有することが疑われるサンプル中のATPを検出する方法。 - 二価カチオンが約2.5mM未満の濃度で組成物中に存在する、請求項46に記載の組成物。
- 二価カチオンが約1mM未満の濃度で組成物中に存在する、請求項46に記載の組成物。
- 二価カチオンが約0.5mM未満の濃度で組成物中に存在する、請求項46に記載の組成物。
- 微生物がグラム陰性細菌である、請求項46に記載の方法。
- 微生物が大腸菌(E.coli)または緑膿菌(P.aeruginosa)である、請求項46に記載の方法。
- サンプルが微生物細胞の異種性集団を含有するまたは含有することが疑われる、請求項46に記載の方法。
- サンプルが病原菌を含有するまたは含有することが疑われる、請求項46に記載の方法。
- 検出可能なルミネセンス信号がサンプルと組成物とを接触させた後10分以内に生じる、請求項46に記載の方法。
- 検出可能なルミネセンス信号がサンプルと組成物とを接触させた後5分以内に生じる、請求項46に記載の方法。
- ルミネセンスが少なくとも30分の半減期があるルミネセンス信号を生じる、請求項46に記載の方法。
- (a)微生物源からの微生物サンプルに、二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも1つのATP抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質を含んでなる組成物を添加して、混合物を形成するステップと、
(b)前記混合物中のルミネセンスの程度を測定して、微生物サンプル中のATPを検出するのに使用するための少なくとも1つのATP抽出剤の適合性を判定するステップ
を含んでなり、
二価カチオンが混合物中に約0.5mM以下の濃度で存在し、
ルミネセンスの程度が検出に十分であれば、前記少なくとも1つのATP抽出剤が微生物源中のATPを検出するのに適する、微生物サンプル中のATPを検出するのに適したATP抽出剤を同定する方法。 - 二価カチオンが約0.1mM以下の濃度で混合物中に存在する、請求項57に記載の方法。
- (a)微生物源からの第1の微生物サンプルに、第1の濃度の二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも1つのATP抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質を添加して、第1の混合物を形成するステップと、
(b)(a)の微生物源からの第2の微生物サンプルに、第2の濃度の二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも1つのATP抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質を添加して、第2の混合物を形成するステップと、
(c)前記第1および第2の混合物中のルミネセンスを別々に検出して、微生物サンプル中のATPを判定するのに使用するための少なくとも1つのATP抽出剤の適合性を判定するステップ
を含んでなり、
第2の混合物中の二価カチオンの第2の濃度が、第1の混合物中の二価カチオンの第1の濃度を超え、
第1の混合物中のルミネセンスが第2の混合物中のルミネセンスを超えれば、前記少なくとも1つのATP抽出剤が微生物源中のATPを検出するのに適する、微生物サンプル中のATPを検出するのに適したATP抽出剤を同定する方法。 - (a)第1の微生物の培養を少なくとも1つの候補抗生剤で処理するステップと、
(b)前記少なくとも1つの候補抗生物質剤で処理された第1の微生物の培養、および前記少なくとも1つの候補抗生物質剤で処理されていない第2の微生物の対照培養を第2の微生物の対照培養中の生育を検出するのに十分な期間生育させるステップと、
(c)第1の微生物の培養および第2の微生物の対照培養を、二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも1つのATP抽出剤、およびルシフェラーゼ含んでなる組成物に別々に接触させて、それぞれ第1および第2の混合物を形成するステップと、
(d)ルミネセンスを検出するステップと、
(e)候補抗生物質が抗生物質活性を有するかどうかを判定するステップ
を含んでなり、
前記第1および第2の混合物それぞれの中の二価カチオンと二価カチオンキレート剤との量の差が約2.5mM未満である、候補抗生剤をスクリーニングする方法。 - 前記第1および第2の混合物それぞれの中の二価カチオンと二価カチオンキレート剤の量の差が約1.25mM未満である、請求項60に記載の方法。
- 前記第1および第2の混合物それぞれの中の二価カチオンと二価カチオンキレート剤の量の差が約0.4mm未満である、請求項60に記載の方法。
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