JPH06504200A - 細胞内成分の抽出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞内成分の抽出法 本発明は、細胞内代謝産物を含めた細胞内成分の抽出法に関するものである。

本発明は、細胞から成分を抽出するために用いられる多くの物質が抽出された成 分につき実施されるアッセイその他の処理工程を妨害するという問題に対処する ものである。本発明は抽出用物質を中和するためにサイクロデキストリンを用い る。本発明による一例においては、細胞内代謝産物がアデノシン三リン酸（ＡＴ Ｐ）であり、これは抽出剤を中和したのちホタルールシフエリンールシフェラー ゼ反応を利用してアッセイすることができる。他の例においては、細胞内成分が 核酸であり、これは抽出剤を中和したのち増幅するか、または他の方法で後処理 することができる。

細胞内成分抽出の一般的観点 生物学的試料中の細胞内成分のアッセイは、しばしば酵素法により行われる。

それらの方法は下記を必要とする・１）成分をアッセイに添加される酵素系に利 用される状態にするために、成分を細胞から放出させること。２）抽出物の調製 、保存またはアッセイに際してそれらの成分に作用する可能性のある細胞由来の 酵素を失活させること。細胞内成分の抽出は、細胞壁および細胞膜を開放し、か つ代謝産物プール全体を周囲の媒質中へ放出させることを伴う。細胞内において は、代謝産物プールはしばしば細胞内酵素の作用のため数秒程度の代謝回転時間 を有する。抽出剤が膜のインテグリテイ−に作用し始めると直ちに、生じた作用 に対して細胞の酵素系が対抗しようとする。従って、時間を要する抽出期間中に かなりの代謝産物水準の変化が起こる可能性がある。このため、最良の酵素アッ セイ法を用いたとしても、細胞内代謝産物水準に関する全く誤ったデータか得ら れることは明らかである。この問題を避ける唯一の方法は、迅速に細胞膜を開放 し、同時に、細胞内成分に作用する酵素をすべて失活させる抽出剤を用いること である。従って酵素の失活は信頼性のあるすべての抽出剤本来の特性である。細 胞壁の存在は細胞を抽出剤から保護し、細菌、菌類および藻類細胞を特に抽出困 難にしている。従ってこれらのＰＩ類の細胞の抽出には、トリクロロ酢酸（ＴＣ Ａ）または過塩素酸（ＰＣＡ）などのカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ） アニオンを含む強酸がしばしば用いられる。これらの物質は強力な酵素失活作用 を有し、アッセイ前に抽出物が著しく希釈されない限り必然的に酵素アッセイを 妨害する。

抽出物の希釈は、低濃度の代謝産物のアッセイを困難にする。

中間代謝産物の代謝回転速度が速いほど、抽出剤添加時に細胞内酵素を直ちに失 活させる必要性はいっそう高くなる。この観点からみて、ＡＴＰは最も抽出困難 な細胞内代謝産物の１つである。すべての細胞において、ＡＴＰはエネルギー産 生反応からエネルギー要求反応へエネルギーを伝達する手段である。従って多種 類のＡＴＰ変換酵素（キナーゼおよびＡＴＰａｓｅ）が存在し、高い活性を有す る。膜のインテグリテイ−がたとえば抽出剤によってわずかに損傷を受けたとし ても、細胞内代謝産物およびイオンが急速に失われる。細胞がこれらの事象を補 償しようとするのに伴って、大量のＡＴＰが消費される。本発明に至る研究の目 的の１つは、ホタルルシフェラーゼアッセイ法と適合する、信頼性のある微生物 ＡＴＰ抽出法を開発することであった。微生物細胞においてはＡＴＰ代謝回転速 度が高Ｘ、かつ厚い細胞壁が存在するため、微生物ＡＴＰの抽出法はすべての種 類の細胞における他の大部分の細胞内代謝産物にも有効なものになると思われる （抽出剤自身が代謝産物を分解しない限り）。さらにＡＴＰのホタルルシフェラ ーゼアッセイ法においては反応通産が測定される。すなわちホタルアッセイ法は 反応速度アッセイ法の一例である。従って抽出中または抽出後に添加される阻害 剤はいずれもアッセイに影響を及ぼすであろう。ホタルルシフェラーゼの活性は 、単純な塩類を含めて多種多様な化合物により阻害される。またホタルルシフェ ラーゼは狭い最適ｐＨをもつ。従ってホタルアッセイ法に有効な抽出法は、他の 大部分の酵素アッセイ法にも有効なものになると思われる。これは特に、単にア ッセイ時間の延長によって阻害を補償しうる終末点アッセイ法のいずれについて も？：Ｒ１段階をなす。抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは後続の酵素反応のため の基質または鋳型として必要であり、従って生物学的に活性でなければならない 。一般に細胞または組織からのＤＮＡは、遺伝子のクローニングまたは同定のた めに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限酵素を用いる開裂による特異 的配列の増幅に用いられる。遺伝子分析実験に後続使用するための細胞または組 織からのゲノムＤＮＡの精製は、一般にすべての細胞成分を放出させるための細 胞溶解、次いで特異的分解酵素による蛋白質およびＲＮＡの選択的消化を伴う。

蛋白性物質その他の汚染物質から分離されたのち、ＤＮＡ試料は比較的純粋であ り、かつ機能的に活性である。分離工程は一般に有機溶剤による抽出、次いでア ルコールによるＤＮＡの沈殿によって行われる（サムプルツク、フリッチュおよ びマニアチス（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｔ、Ｍａｎｉ ａｔｉｓ）。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、　Ｉ！２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、１ ９８９）。汚染蛋白質をたとえば細胞溶解物のアルコール沈殿により特異的に除 去することなく機能的に活性なりＮＡを：ＡＭ：ＪＬうる方法が記載されている （クス、ジエブニカルおよびルピン−ケリー（Ｈ，Ｘｕ、Ａ、Ｍ、Ｊｅｖｎｉｋ ａｒ、Ｅ、Ｒｕｂｉｎ−Ｋｅｌｌｙ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　１旦、４９４３）。従って重大な汚染物質は用いられる抽出剤、通常 はディタージエント、であると思われる。従ってディタージエントを除去すれば そのＤＮＡは後続反応に使用するのに十分なものとなりうる。しかし一般にディ タージエントの除去にはなお分離工程が必要であり、これに伴って調製時間が延 長され、収率低下の可能性が増大する。従って分離工程を伴わない均質な系は、 現在の方法に優る著しい利点をもつであろう。

微生物ＡＴＰの抽出およびアッセイに関する現在の状況迅速な微生物学的方法に おいては、ＡＴＰのホタルルシフェラーゼアッセイ法がしばしばバイオマス推定 のために用いられる。細胞内ＡＴＰ濃度はすべての細胞において類似しており、 細胞当たりのＡＴＰＩＩは細胞内容積にほぼ比例する。

細菌は細胞当たりほぼ［Ｑ−１モルのＡＴＰを含み、藻類は細胞当たりこれより かなり多量のＡＴＰを含む。簡単な光学測定装置およびホタルルシフェラーゼ試 薬を用いて、１ｍｌ容量中に１０−ＨモルのＡＴＰを容易に検出しうる。これは ほぼ１０１個の細菌細胞に相当する。生物検体中の細菌性ＡＴＰは、等容量の２ ゜５％トリクロロ酢酸を添加することにより抽出しうる。しかしルシフェラーゼ 反応に対するトリクロロ酢酸による妨害を避けるために、最終アッセイ容量１ｍ ｌにおいて０．０１ｍ１を越える試料容量を用いることはできない。従って生物 検体中における検出限界は細胞１０″個／ｍｌである。酸を中和することによっ て状況は若干改善されるが、大部分の阻害はこの酸のカオトロピックアニオンに より起こる。

上記の状況により、代替となる抽出法が絶えず追及されてきた。代替抽出剤とし ては第四アンモニウム化合物、たとえば塩化ベンザルコニウムが示唆されている （アンゼーン、ランデイン、エルシンおよびソア（Ｓ、Ａｎｓｅｈｎ、Ａ、Ｌｕ ｎｄｉｎ、Ｌ、Ｎｉ　１ｓｓｏｎ、Ａ、Ｔｈｏｒｅ）、ＡＴＰの簡単なルシフェ ラーゼアッセイ法による細菌尿の検出、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅ獅モ■A　ｐ　ｐ。

４３８−４４５．ステート・プリンティング・アンド・パブリジング社、カリフ ォルニア州ウェストレーク・ビレブジ、１９７９）。しかし、第四アンモニウム 化合物は抽出物をホタル試薬に添加したのちホタルルシフェラーゼを失活させて 、発光を徐々にディケイ（ｄ　ｅ　ｃ　ａ　ｙ）させる。このように測光に際し てルシフェラーゼ活性が徐々にディケイするため、既知量のＡＴＰの添加により アッセイを検量すること（国際的標準法）がほとんど不可能になる。上記の報文 には、ウシ血清アルブミンの添加により失活作用に部分的に対抗しつると述べら れている。

しかし、のちにこの方法を最適なものにするための試みを行った際に、第四アン モニウム化合物によるルシフェラーゼの失活を完全に避けるのに必要な濃度のア ルブミン（２，５−１０％）はルシフェラーゼ反応の強い阻害をもたらすことが 認められた（ランデイン（Ａ、Ｌｕｎｄ　１ｎ）ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰの 抽出および目動ルミツメトリーアッセイ。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｏｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ＣｈｅｍｉＬｕ ■１ｎｅｓｃｅｎｃｅ、クリツカ、スタンレイ、ソルペおよびホワイトヘッド（ Ｌ、Ｋｒ１ｃｋａ、Ｐ、５ｔａｎｌｅｙ、Ｇ、Ｔｈｏｒｐｃ、Ｔ、Ｗｈｉ　ｔｅ ｈｅａｄ）監修、ｌ）ｐ、５４５−５５２．アカデミツク・プレス、ニューヨー ク、１９８４）。しかし重要な知見は、アルブミンはその目的にとって理想的で はなかったか、第四アンモニウム化合物によるルシフェラーゼ失活作用を中和し うろことであった。第四アンモニウム化合物に対する他の中相剤はノニオン界面 活性剤、たとえばツイーン２０、ツイーン６０、ツイーン８０、ポリオキシエチ レンエーテルＷ１およびトライトンＸ−１００であることかのちに見出された（ Ｗ、Ｊ、シンプソンおよびＪ、　Ｒ，Ｍ、ハモント、欧州特許第３０９１８４号 明刑Ｊ）。Ｓ、コレーマイネノおよび■、タルカネンは抽出剤としてノニオン界 面活性剤を使用することを独自に提案した（英国特許第１６００４２４９号明細 り。ノニオン界面活性剤は、ルシフェラーゼが第四アンモニウム化合物により徐 々に失活するのに対抗し、かつそれら自体かルシフェラーゼ反応において強い阻 害性を示すことかない。しかしノニオン界面活性剤の存在下ですら、第四アンモ ニウム化合物の添加に際してルシフェラーゼ反応のかなりの阻害が生じる（実施 例１参照）。従って、第四アンモニウム化合物に関する両方の問題、すなわちル シフェリンでの阻害および失活に対処する系は報告されていない。

ＡＴＰに適用した本発明の基礎となる考察試料を実験室へ輸送することは、迅速 微生物学におけるＡ”ｒＰのホタルアッセイ法の主要な利点、すなわち分析結果 が数分て得られるという事実か排除される。

このようなアッセイ法に対する主な市場は、実際には生化学的分析の訓練かほと んど、または全く無い者による非実験室条件下での現地試験である。このような 条件下では、アッセイ法は普通は少数の試料を伴い、かつ周囲温度で保存された 試薬ならびに低価格の簡単な計測器を用いて実施されなければならないであろう 。

分析操作は、単一アッセイ法に適した形式の試薬を用いて極めて簡単な最小数の 工程を伴うべきであろう１．ディツプスティック手法に基づくこのようなアッセ イ法のための原型の分析−／ステムが報告されている（ランデイン（Ａ、Ｉ、ｕ ｎｄ　ｉｎ）、ルーティン微生物学におけるＡＴＰア７セイ法　１９８０年代の 現実に対する祠祭から、ＡＴＰ　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｒａｐｉｄ　ｌ［ ｅｔｈｃｘｉｓ　ｉｎ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＹ、スタンレイ、マツカーシー およびスミサー（Ｐ、Ｅ、５ｔａｎｌｅｙ、Ｂ、Ｊ、ＭｃＣａｒｔｈｙ、　Ｒ， Ｓｍｉ　ｔｈｅ　ｒ）監修、応用微生物学会テクニカルシリーズ２６．ブラック ウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、ｐｐ、１１−３０゜オッ クスフォード、１９８９）。

ホタルアッセイ法に用いる市販試薬キットの開発に際しての重大な問題は、ホタ ルルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬よりＡＴＰ標準品の方が不安定なことであ ろう。ＡＴＰを周囲温度で長期間保存しうる方法を開発しうるとは思えない。

アッセイに際してＡＴＰＩ！Ｊ準品を再構成および分配することは、さらに問題 を生じる。ＡＴＰＩ準液は、全アッセイ容量の正確にＳ１％容量で添加されなけ ればならないであろう（ランデイン（Ａ、Ｌｕｎｄ　ｉ　ｎ）、ルミツメトリー によるＡＴＰ監視の臨床応用、カロリシス力・インスティテユートからの学位論 文、１９９０）。熟練していない者が現地試験条件下でマイクロリットル容量を 正確にピペット分取することは、極めて実施困難であろう。目動装置の価格は、 この市場では購入し難いものである。以上の問題をすべて解決し得たとしても、 内部基準手法は２回の光学測定、すなわちＡＴＰ基準の添加前および添加後の測 定を必要とする。従って幾つかの観点からみて、ＡＴＰ標準品を用いずにアッセ イを実施し得れば極めて有利であろう。これは、すべての試料においてＡＴＰ濃 度に対し常に同じ関係をもつ本質的な安定な発光を伴う標定されたホタル試薬を 用いることにより達成しうるであろう。活性の損失なしに数年間保存しうる、数 分間本質的に安定な発光を生じる凍結乾燥したホタル試薬が１９７０年代後期以 来、市販されている（ランデイン（Ａ、Ｌｕｎｄｉｎ）、ルミツメトリーによる ＡＴＰ監視の臨床応用、力ロリンス力・インスティテユートからの学位論文、１ ９９０）。

測光機器の光応答の簡単な目動検量システムも十分に確立された技術である。残 された唯一の問題は、測光に際して生物材料抽出物の添加が失活（発光のディケ イを生じる）または阻害（低下するが、安定な発光を生じる）によりルシフェラ ーゼ活性に影響を及ぼすことがないのを保証することであろう。

微生物細胞については、細胞壁を迅速に透過して細胞内酵素を失活させる極めて 有効な抽出剤を用いなければならない。このような抽出剤による酵素分析の妨害 は下記により排除しうる　１）抽出物の希釈（アッセイ感度を低下させる）。

２）抽出物から抽出剤を除去する（時間がかかり、労力を要する操作となる可能 性が最も高い）。３）アッセイ緩衝液に中和剤を含有させることにより抽出剤を 中和する。最後の示唆が明らかに最も関心のある代替法である。極めて有効な抽 出剤に対する必要条件が、同様にその達成を困難にする。中和剤が比較的不活性 であり、ルシフェラーゼ活性に影響を及ぼすべきではないという事実によってこ の状況が簡単になることはない。

この観点における本発明の目的は、ルシフェラーゼの失活またはルシフェラーゼ 反応の阻害をいずれも生じない抽出剤と中和剤の組み合わせの開発であると述べ ることができる。これらの目標を両方とも達成することによって初めて、現地試 験条件下で、すなわちＡＴＰ標準品を用いずに、簡便かつ信頼性のあるＡＴＰア ッセイを実施することができる。

抽出剤の中和は、抽出剤を分解する化学反応の実施により達成しうる。最も簡単 な例は酸性抽出剤を塩基の添加により中和することであろう。しかし正確なｐＨ ＦＩ整が必要であり（強い緩衝剤は阻害を生じる）、多くの状況において実施不 可能であろう。さらに、最良の酸性抽出剤はカオトロピックアニオンを含み、こ れらは中性ｐＨにおいてすら強い阻害を生じる。イオン強度の増大ですらルシフ ェラーゼ活性を低下させる。別法は化学反応によって新たな非阻害性化合物を形 成することにより抽出剤を分解することであろう。しかしこれは酵素を阻害し、 または失活させる可能性のある、反応性の高い反応体を用いなければならない可 能性が最も高い。

最も関心かもたれる方法は、抽出剤分子と中和剤分子の間でコンプレックスを形 成することであろう。第四アンモニウム化合物（１種のカチオン界面活性剤）を 中和するためにノニオン界面活性剤を用いることはこの方法の一例である（Ｗ。

Ｊ、ノンプソンおよびＪ、　Ｒ，Ｍ、ハモンド、欧州特許出願第８８３０８６７ ７゜９号明細Ｊ）。実施例１に示すように、実際にノニオン界面活性剤はあらゆ る種類のイオン性界面活性剤（カチオン、アニオンおよびツビッタ−イオン）か ホタルルシフェラーゼに及ぼす失活作用を中和する。しかしノニオン界面活性剤 の存在下ではすべてのイオン性界面活性剤が、失活を生じるものよりはるかに低 い濃賀において阻害作用を及ぼす。これはノニオン界面活性剤とイオン性界面活 性剤との結合が低いこと、またはそれら２種類の界面活性剤間のコンプレックス による阻害に起因すると思われる。説明に関係なく、この阻害はイオン性界面活 性剤型の抽出剤が結合しつる生物材料の水準に応じて試料毎に異なる可能性があ る。

従ってアッセイ毎にＡＴＰｇ単品を用いる必要があろう。中和剤としてのノニオ ン界面活性剤の他の欠点は、必ずしもすべての酵素がこれらの試薬に対してホタ ルルシフェラーゼと同様に抵抗性ではないということである。

抽出剤を中和するための理想的化合物は、抽出剤に対して高い結合定数をもつも のであろう。理想的にはそれは、酵素を失活させる抽出剤分子部分が保護層によ り囲まれた包接コンプレックス（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成 するであろう。明らかに中和用化合物は酵素に対して可能な限り不活性でなけれ ばならず、かつ分析的に重要な細胞内代謝産物と不可逆的に結合すべきでない。

ある種の界面活性剤、たとえば第四アンモニウム化合物は有用な抽出剤であるこ ＡＭＰの抽出および自動ルミツメトリーアッセイ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅ ＋ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、クリツカ、スタンレイ、ソルペおよびホワイ トヘッド（Ｌ、Ｋｒ１ｃｋａ、Ｐ、５ｔａｎｌｅｙ、Ｇ、Ｔｈｏｒｐｅ。

Ｔ、Ｗｈｉ　ｔｅｈｅａｄ）監修、ｐｐ、５４５−５５２．アカデミツク・プレ ス。

ニューヨーク、１９８４）。すべての界面活性剤分子に共通の特色は、疎水性の テイルである。親水性外表を有するコンプレックス中に疎水性テイルが埋め込ま れた包接コンプレックスの形成が理想的であろう。これはミセルを形成する中和 剤により達成される可能性がある。しかし分析操作に際して添加された酵素がミ セルに取り込まれて、活性の変化を生じる場合がある。さらに、酵素とミセル内 における抽出剤との相互作用を排除することはできない。界面活性剤に対する理 想的な中和剤は、酵素に結合する可能性のない親水性外表、および界面活性剤と 包接コンプレックスを形成するのに適した大きさの疎水性の中空部を有する水溶 性化合物であろう。

サイクロデキストリンの特性 サイクロデキストリンは６．７または８個のグルコース単位（α−１β−および γ−サイクロデキストリン）からなるドーナツ形の分子である。環の内径はそれ ぞれ６人、７．５人および９．５人である。環の内側は界面活性剤などの分子の 疎水性テイルに結合する。生じる包接コンプレックスは一般に界面活性剤とサイ クロデキストリン間で１１の化学量論的量において形成される。α−１β−およ びγ−サイクロデキストリンとの結合定数は、界面活性剤の疎水性テイルの大き さおよび化学的特性に依存する。界面活性剤との結合定数は一般に１０３−１０ ’　ｄｍ”　ｍｏ　ｌ−’であるか、５Ｘ１０’　ｄｒｎ’　ｍｏ　ｌ−’のよ うに高くてもよい（１，サタケ、Ｔ、イケノウエ、Ｔ、タケシタ、Ｋ、ハヤカワ およびＴ、マエダ、α−サイクロデキストリンとイオン性界面活性剤およびそれ らの同族体の結合の電導度分析および電位差測定による研究、Ｂｕｌｌ、Ｃｈｅ ｍ、Ｓａｃ、Ｊｐｎ、５８．２７４６−２７５０．１９８５；パレプおよびリッ カードソン（Ｒ。

Ｐａ１ｅｐｕ、Ｊ、Ｅ、Ｒｉｃｋａｒｄｓｏｎ）、導電率測定によるβ−サイク ロデキストリン／界面活性剤包接化合物の結合定数、Ｌａｎｇｍｕｉｒ　５．２ １８−２２１．１９８９；ｌ　サタケ、Ｓ、ヨシダ、Ｋ、ハヤカワ、Ｔ、マエダ およびＹ、ラスモト。β−サイクロデキストリンと両親媒性イオンの結合定数の 電導度分析による測定、Ｂｕｌｌ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ’、Ｊｐｎ、５９．３９９ １−３９９３．１９８６；Ｔ、オークボ、Ｙ、マエダおよびＨ，キタノ、コンダ クタシス停止フロー法により研究したイオン性界面活性剤とサイクロデキストリ ンの包接プロセス、Ｊ、Ｐｈｙｓ、Ｃｈｅｍ、９３．３７２１−３７２３．１９ ８９、バレブおよびラインスポｏ−（Ｒ，Ｐａ１ｅｐｕ、Ｖ、Ｃ，Ｒｅ１ｎｓｂ 。

ｒｏｕｇｈ）、コンダクタンス測定による界面活性剤−サイクロデキストリン相 互作用、Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、６６．３２５−３２８．１９８８）、サイクロ デキストリンの外表は利水性であり、大部分の酵素と相互作用しないと思われる 。

さらにサイクロデキストリンは水溶性であるが、たとえば重合により、または固 体もしくは粒子の表面に付着させることによりそれらを固定化することができる 。

表面または溶液から界面活性剤を除去するためにサイクロデキストリンを使用す ることにつき報告されている（Ｐ、カナおよびＲ，ドボルシャック。欧州特許出 願第３０’ｌ、８４７号明細書）。この特許出願によれば、界面活性剤を溶液か ら固定化サイクロデキストリンにより除去することができる。除去するのではな く、包接コンプレックスの形成により界面活性剤の作用を中和する可能性は評価 されていない。Ｐ、カナらの欧州特許第２８６３６７号明細書には、アッセイ前 にペプチドフラグメントの安定剤として用いられた界面活性剤を中和するために サイクロデキストリンを使用することが記載されている。ある総説には診断にお けるサイクロデキストリンの種々の用途が記載されている（ゼトリ　（Ｊ、５ｚ ｅｌｔＩＬ１診断におけるサイクロデキストリン、Ｋｏｎｔａｋｔｅ　（ダルム シュタット）１９８８　（１）、３ｌ−３６）。細胞内代謝産物を放出させるた めに抽出剤として添加された界面活性剤を中和するためにサイクロデキストリン を使用することは、これまで記載がない。

発明の記述 本発明によれば、細胞内成分および該成分を抽出するために用いた物質を含有す る溶液を供給することにより細胞内成分の抽出物をＲ製する方法において、該溶 液を、抽出用物質を中和するために適切な種類および適切な量のサイクロデキス トリンまたはサイクロデキストリン誘導体と接触させることを特徴とする方法が 提供される。細胞内成分の性雪は本発明の構成要素ではない。−例は核駿、たと えばＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにＡＴＰを含めた他の前記の細胞内代謝産物で ある。

本明細書で用いる“中和する“という語は、ｐＨを７．０に調整することを意味 するものではない。むしろ抽出剤の中和は、そうしなければ抽出された細胞内成 分の後続処理において抽出剤が引き起こすであろう妨害の減少／排除／克服をも たらすものである。

サイクロデキストリンまたは誘導体の機能は、抽出用物質または抽出剤を中和す ることである。前記のように、これは原理的には抽出剤の分解により行うことが できる。サイクロデキストリンまたは誘導体を不溶性の形で用いる場合、抽出剤 と共に形成されたコンプレックスも不溶性であり、残りの溶液から容易に物理的 に除去される。より一般的には、サイクロデキストリンまたは誘導体は溶液状で 用いられ、抽出剤とのコンプレックスを形成することによりそれを中和する。

次いでそのコンプレックスを溶液から除去することができるが、通常はそれは不 必要であるか、または望ましくはない。界面活性剤を完全に中和することが好ま しいが、本発明は部分中和を生じる条件をも考慮する：これらは後続のアッセイ 、増幅または後続操作のいずれにおいても、抽出剤による妨害を有意に減少させ るものでなければならない。

他の観点においては、本発明はここに記載する方法による生物検体中のＡＴＰの 抽出およびアッセイのためのキットにおいて、下記の構ｆｆｄｉｉＥ分：ａ）抽 出用物質（他の成分と分離して保存する）、ｂ）サイクロデキストリン、 Ｃ）ホタルルシフェラーゼ試薬 ｄ）アッセイ緩衝液 を含むことを特徴とするキットを提供する。

奸ましくけ、抽出用物質は流体検体と接触した際に適切なサイズの試料を捕獲す るキャリヤーの上または中において乾燥されており：サイクロデキストリンはア ッセイ緩衝液に溶解されており：ホタルルシフエラーゼ試薬はアッセイ緩衝液中 へ試薬を放出しうるキャリヤーの上または中において乾燥されている。

抽出剤とサイクロデキストリンの結合が分析操作に用いられる酵素の阻害または 失活を避けるのに十分なほど強固である限り、いかなる種類の抽出剤およびいか なる種類のサイクロデキストリンまたはサイクロデキストリン誘導体も使用しう る。抽出剤は好ましくは界面活性剤であり、これをいずれのサイクロデキストリ ンがその界面活性剤を最も効果的に結合させるかに応じてα−１β−またはγ− サイクロデキストリンと接触させることが好ましい。カチオン、アニオンおよび ツビッタ−イオン界面活性剤をサイクロデキストリンにより中和することができ る（実施例１）。いずれのサイクロデキストリンがその界面活性剤に最適である 可能性があるかという概念は、公表されている結合定数からしばしば得られる（ 前記の文献を参照されたい）。個々の用途につき最適な抽出剤およびサイクロデ キストリンの種類および濃度を定めるこ占は、実施例の記載に従って実施しうる （後記を参照されたい）。サイクロデキストリンは、形成される包接コンプレッ クスの化学量論的量を考慮したモル量に基づいて、抽出剤より過刺に用いること が好ましい。サイクロデキストリンは抽出路Ｔ後の分析操作のいかなる工程にお いても、ただし常に、アッセイに関与する酵素の添加前またはそれと同時に添加 することができる。

ＡＴＰのホタルアッセイ法における抽出剤の中相剤としてのサイクロデキストリ ンの主なｆｉ１点は、発光が抽出剤／中和剤のコンプレックスによる阻害または 失活によって影響されない分析条件を見出しうろことである。これは、高い結合 定数を有する抽出剤、′サイクロデキストリンの組み合わせを用いて達成しうる 。従来用いられている中和剤、たとえば第四アンモニウム化合物を中和するため に用いられるノニオン界面活性剤（Ｗ、Ｊ、　シンプソンおよびＪ、　Ｒ，Ｍ、 ハモンド、欧州特許！３０９１８４号明細書）を用いた場合、失活を避けること はできるが、阻害は避けられない。サイクロデキストリンは酵素を阻害または失 活させる可能性がなく、酵素試薬の安定剤として実際に用いられている（ゼトリ （Ｊ、５ｚｅｌｔｌｉ、診断におけるサイクロデキストリン、Ｋｏｎｊａｋｔｅ 　（ダルムシュタット）１９８８　（１）、３ｌ−３６）。ルシフェラーゼ反応 における発光に対してβ−サイクロデキストリンによる見かけの阻害作用が認め られた（実施例１）。

しかしこの作用はＤ−ルシフェリン／β−サイクロデキストリレのコンプレック ス形成によるものであることが示された。この問題はｐ−ルシフェリンの濃度を 高めることにより排除し得た。他のいずれかのアッセイにおいて見かけの阻害作 用が認められた場合は、使用するサイクロデキストリンの存在下ですべての補助 因子の濃度を最適なものにすることか推奨される。

本発明に基づいて抽出剤、サイクロテキストリンおよびホタル：１ｃＳを種々の タイプの微生物または特殊なタイプの試料中の細胞内ＡＴＰの抽出およびアッセ イのためのキット形式に組み合わせることは簡単なことである。現地用として適 した分析システムは、本発明を前記のディツプスティック手法と組み合わせるこ とにより開発しうる（−７ンデイン（Ａ、Ｌｕｎｄ　ｉｎ）、ルーティン微生物 学におけるＡＴＰア７セイ法・１９８０年代の現実に対する洞察から、　ＡＴＰ 　Ｌｕ履１ｎｅｓｃｅａｃｅ　：　Ｒａｐｉｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｌ［ｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、スタンレイ、マツカーシーおよびスミサーＣＰ、Ｅ、５ ｔａｎｌｅｙ、Ｂ、Ｊ、ＭｃＣａｒｔｈｙ、Ｒ，Ｓｍｉ　１ｅｒ）監修、応用微 生物学会テクニカルシリーズ２６．ブラックウェル・サイエンティフィック・パ ブリケーシランズ、ｐｐ、１１−３０．オツクスフオード、１９８９）。これら のシステムにおいては、予め定められた容量の試料を抽出剤（たとえばマトリッ クス上において乾燥させた第四アンモニウム化合物）と接触させ、次いで抽出さ れた試料、およびホタル試慕（同様にマトリックス上において乾燥させたちの） を、適切なサイクロデキストリンを含有する予め分配された緩衝液に溶解する。

抽出されたＡＴＰ、サイクロデキストリンにより中和された抽出剤、ホタル：ｉ ＣＳおよび緩衝液を含有する牛ユベットからの発光を、携帯用計測器により直接 に測定することができる。標定された試薬および計測器を用いると、各アッセイ を個々にＡＴＰ標準品で検量する必要がないであろう。従ってピペットを使用に ずに１分以内で操作全体が完了するであろう。

以下においてホタルルシフェラーゼ法による微生物中の細胞内ＡＴＰの抽出およ びアッセイの例によって、本発明をさらに説明する。微生物ＡＴＰの抽出に第四 アンモニウム化合物を用いることは十分に確立されている（ランデイン（Ａ。

Ｌｕｎｄ　ｉｎ）、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰの抽出および自動ルミノメトリ ーア７セイ、λｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｏｅｓモ■獅■ ｅ、クリツカ、スタンレイ、ソルベおよびホワイトヘッド（Ｌ、Ｋｒ１ｃｋａ。

Ｐ、５ｔａｎｔｅｙ、Ｇ、Ｔｈｏｒｐｅ、Ｔ、Ｗｈｉ　ｔｅｈｅａｄ）監修、ｐ ｐ。

５４５−５５２．　アカデミブク・プレス、ニューヨーク、１９８４）。第四ア ンモニウム化合物はカチオン界面活性剤である。実施例において、アニオンおよ びツビッタ−イオン界面活性剤も使用しうろことが示されるであろう。サイクロ デキストリンによる界面活性剤の中和を含めたホタルアッセイ法による微生物Ａ ＴＰの抽出法の開発にＩＩして行った工程が実施例に示される。

実施例１ 従来の実験によりホタルルシフェラーゼを急速に失活させることが知られている 各種の界面活性剤から有効な一連の抽出剤を選んだ。これらの抽出剤には下記の ものが含まれていた。臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ；シグマ ・ケミカル社、Ｄ８６３８）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ；シグマ・ケミ カル社：Ｃ９００２）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ；ＡＣＯレーケメーデル ＡＢ＋１０％原液）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣ；アルドリッヒ；　Ｂ４７０ −８）　、Ｎ−ドデシル−Ｎ、　Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン スルホネート（ＤＤＡＰＳ；シグマ・ケミカル社、Ｄ４５１６）、およびドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；シグマ・ケミカル社；Ｌ４５０９）。ＤＴＡＢ％ｃ ｐｃ。

ＢＡＣおよびＢＺＣは第四アンモニウム化合物に属するカチオン界面活性剤であ る。ＤＤＡＰＳはツビッタ−イオン界面活性剤であり、ＳＤＳはアニオン界面活 性剤である。これらの界面活性剤をα−５β−またはγ−サイクロデキストリン （αＣＤ、βＣＤまたはγＣＤ；シグマ・ケミカル社、Ｃ４６４２、Ｃ４７６７ またはＣ４８９２）またはツイーン８０（ケボＡＢ、スウェーデン、ストックホ ルム；ｔ、７２６７）で中和した。

下記の溶液を調製した： １、Ｔ／Ｅ緩衝液；　２ｍｍｏ　ｌ／Ｉ　ＥＤＴＡ　（Ｅ、メルク、Ｆ、　Ｒ， Ｇ、；８３８２）を含有し、酢酸でｐＨ７，７５に調整された０、１ｍｏｌ／１ 　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｅ、メルク、Ｆ、Ｒ，Ｇ、；　８ ３８２）。

２、ＡＭＲ；　５ｍｌの蒸留水中において再構成されたＡＴＰ監視試薬（ノクイ オオービット・オイ、メルク、フィンランド）のバイアル１本。

３、ＡＴＰ；　１０ｍ１の蒸留水中において再構成されたＡＴＰ標準品（バイオ オービット・オイ、メルク、フィンランド）のバイアル１本。

４、　７／Ｅ緩衝液中における抽出剤の原液（ＳＤＳは１％ｗ／ｖ１他のすべて の抽出剤は２％ｗ／ｖ）。

５、Ｔ／Ｅ緩衝液中における中和剤、すなわちαＣＤ、βＣＤ、またはγＣＤ（ ２，５％ｗ／ｖ）またはツイーン８０（１０％ｗ／ｖ）の原液（βＣＤは溶解す るために高温の水道水中で加温する必要がある）。

ホタル試’；Ａ　（ＡＭＲ）は、ルシフェラーゼ、Ｄ−ルシフェリン、ピロホス フェート、ウシ血清アルブミン、およびマグネシウムイオンを含有する。ｌ　Ｑ −１１−１０−’ｍｏｌ／ｌの濃度範囲でＡＴＰ！１度に比例した本質的に安定 な発光（ディケイ速度く２％／分）が得られる（ランデイン（Ａ、Ｌｕｎｄｉｎ ）、ルミツメトリーによるＡＴＰ監視の臨床応用、カロリシス力・インステイテ ユートからの学位論文、１９９０）。測定は、３個のディスペンサー（ＡＭＲＳ ＡＴＰおよび抽出剤につきそれぞれ１個）、電位差記録計およびプリンターを備 えた目動１２５１ルミノメータ−（バイオオービット・オイ、ツルク、フィンラ ンド）を用いて行われた。各実験の前に、０．０．０．１、領　２または０．３ ｍｌの中和剤（２，５％αＣＤ、２．５％βＣＤ、２．５％γＣＤまたは１０％ ツイーン８０）および最高０．９ｍｌのＴ／Ｅ緩衝液を収容した一連のキュベツ ト最高２５個をルミノメータ−に装填した。特別にデザインされたプログラム（ 本発明者から入手しうる）を用いて、ルミノメータ−により下記の工程を実施し た：１、混合下にＯ，ＬｍｌのＡＭＲを添加。

２、　混合下に０．０１ｍ１のＡＴＰ　（キュベツト中の最終濃度１０−’ｍｏ 　ｌ／ｌ）を添加。

３、　最後の添加の５秒、２０秒および３５秒後に発光を測定。

４、０．０１ｍ１の抽出剤を添加。

５、　工程３および４の反復（１０回）。

この滴定実験の結果を図１に示す。最初の８回のＤＴＡＢの添加は、０．５％α ＣＤの存在下で発光に及ぼす影響はごくわずかである。９回目以降の添加はルシ フェラーゼの阻害（発光の不連続的低下）および失活（発光のディケイ速度の増 大）を及ぼすｎＤＴＡＢおよびツイーン８０を用いた場合、明瞭な阻害が１回目 の添加時に既に認められ、失活は３回目または４回目の添加後に認められる。

ＢＺＣのＲ初の７回の添加は、０．５％βＣＤの存在下で阻害も失活も生じない （発光のわずかな増大についてはのちに説明する）。８回目の添加後に発光が低 下する。ツイーン８０の存在下では、１回目のＢＺＣ添加が既に阻害を及ぼすが 、失活は８回目の添加後に初めて有意となる。

上記の操作により１０回の抽出剤添加後に発光に対する影響の測定が可能となっ た。各添加後に、−次反応が推定される２０および３５秒の時点での測定から発 光のディケイ速度を計算した。速度定数および２０秒発光値を用いて、抽出剤添 加時（０秒）の発光を外挿した。これらの外挿した発光値から、抽出剤添加前の 発光値で割ることにより、各抽出剤添加後に残留する発光のフラクシヨンを計算 した（３５秒値）。各抽出剤添加についてのこれらのフィンランドを掛けること により、阻害の影響を受けているけれども経時的な失活の影響を受けていない一 連の相対発光値が得られた。最後に相対発光およびディケイを種々の中和剤の種 類および濃度において抽出剤濃度に対してプロットした（０．２５．０．５０お よび０．７５％のαＣＤ、βＣＤおよびγＣＤ、ならびに１．２および３％のツ イーン８０）。結果を図２−７に示す。中和剤を用いない結果をも示す。ただし ウシ血清アルブミン（０，１％Ｗ／Ｖ、キュベツト中）は部分中和剤であること を考慮すべきである。抽出剤濃度（キュベツト中の％、抽出剤の添加により生じ るわずかな希釈については補正しない）をＸ−軸に示す。ｙ−軸は相対発光（１ ００％から開始）およびディケイ速度（０％／分から開始）を示す。

ＤＴＡＢについての結果をｒｙＪ２に示す。αＣＤおよびβＣＤを用いた場合、 ディケイ速度は一定の抽出剤水準に達するまで本質的にゼロであり、その後急激 にディケイ速度が増大する。γＣＤおよびツイーン８０を用いた場合、ディケイ 速度は低いＤＴＡＢ水準から既に増大する。αＣＤを用いた場合、相対発光は抽 出剤濃度が失活を生じる水準に達するまで１００％付近に留まり、その後低下し 始める。

βＣＤを用いた場合、相対発光は抽出剤濃度が失活を生じる水準に達するまで抽 出剤濃度と共にわずかに増大し、その後低下し始める。γＣＤおよびツイーン８ ０を用いた場合、相対発光は抽出剤濃度と共に低下する。ＣＰＣ，ＢＡＣおよび ＤＤＡＰＳについても同様な結果が得られた（図３．４および６）。

ＢＺＣについての結果を図５に示す（中和は図２の場合と同様であったが、ただ し最高濃度の中和剤を除外した）、αＣＤを用いた場合、得られた中和効果はご くわずかであった。βＣＤおよびγＣＤを用いた場合、一定の抽出剤水準に達す るまでディケイ速度は本質的にセロであり、相対発光は１００％に近く、その後 急激にディケイ速度が増大し、続いて相対発光が急激に低下した。ツイーン８０ を用いた場合、相対発光の連続的低下を伴ってディケイ速度が連続的に増大した 。

ＳＤＳについての結果を図７に示す（γＣＤは除外した）。αＣＤを用いた場合 、ディケイ速度は一定の抽出剤濃度に達するまで本質的にゼロであった。相対発 光はディケイ速度が低下し始める少し前に低下し始めた。βＣＤおよびツイーン ８０を用いた場合、ディケイ速度は抽出剤濃度と共に連続的に増大し、ただしか なり高い濃度まで低い状態に苗まった。相対発光強度は最低の抽出剤濃度からで すら低下した。

０．２５．０．５０および０．７５％のサイクロデキストリンにおいてディケイ 速度を抽出剤濃度の関数として示す曲線は類似していたが、サイクロデキストリ ン濃度か高いほど高い抽出剤濃度の方へ変位した。これは明らかに抽出剤とサイ クロデキストリンのコンプレックスの形成による滴定効果を反映する。曲線間の 変位はディケイ速度１００％／分において、ある程度任意に測定された。変位は 抽出剤のモル数として表され、変位を生じたサイクロデキストリンのモル数で割 られた。ディケイ速度か一定の抽出剤水準までゼロに近く、次いで急激に増大す る場合、これは包接コンプレックスにおける抽出剤とサイクロデキストリンのモ ル比のかなり正確な値を与えるであろう。遊離の形の抽出剤フラクシヨンを生じ る低い結合定数の包接コンプレックス、またはそれ自体がルシフェラーゼを失活 させる抽出剤−サイクロデキストリンコンプレックスは、より不明瞭な滴定効果 を与えるであろう。これはコンプレックスにおけるモル比につきわずかな推定を 与えるにすぎない。αＣＤについてはこのモル比は０．９０　（ＤＴＡＢ）　、 ０゜４８　（ＣＰＣ）、０．７１　（ＢＡＣ）　、０．８９　（ＤＤＡＰＳ）お よび１．０７（ＳＤＳ）であった。βＣＤについてはこのモル比は０．８６　（ ＤＴＡＢ）　、０４５　（ＣＰＣ）、０．７４　（ＢＡＣ）、０．８５　（ＢＺ Ｃ）、０．’９３　（ＤＤＡＰＳ）および１．２５　（ＳＤＳ）であった。γＣ Ｄについてはこのモル比は０８７　（ＢＺＣ）および０．８９　（ＤＤＡＰＳ） であった。ＢＡＣは数種の分子の混合物であり、分子量は最も主要な分子種Ｃｌ 　２　Ｈ２Ｓ　Ｎ　Ｃｅ　Ｈ＋　ｓ　Ｃｌから推定しなければならなかった。従 って結果はＣＰＣ以外のすべてのディタージエントにつき１１の化学量論的量に 匹敵するものであった。０２０分子は芳香環構造および長い脂肪族炭化水素テイ ルを有する。従って２個のサイクロデキストリン分子に結合し、その結果モル比 ０．５０となる可能性かある。この研究に用いた大部分の抽出剤につき１１の化 学量論的量が主張されている（前記の文献を参照されたい）。

中和剤の重要な観点は、それ自身が抽出剤の不在下で発光に及ぼす影響である。

図８は発光がツイーン８０により影響されたとしてもわずかであり、一方サイク ロデキストリンは濃度が増大した場合にわずかな阻害を生じたことを示す。阻害 はβＣＤを用いた場合に最強であった。この阻害はサイクロデキストリンがＤ〜 ルシフェリンと包接コンプレックスを形成することによるものであり、βＣＤに つき結合定数が最高であると思われる。これはβＣＤおよび高い濃度の大部分の 抽出剤（ＤＴＡＢ、ＣＰＣ％ＢＡＣおよびＤＤＡＰＳ）を用いた場合に生じる高 い活性を説明するものであろう。この説明によれば、ある程度高い濃度のＤ−ル シフェリンを用いることによって高い活性を失わせることができるであろう。こ の伝説は図９−１０に示した実験において確認された。０．２５ｍｇ／ｌのルシ フェラーゼ（エンザイマティックス社、英国ケンブリッジ）、種々の濃度のＤ− ルシフェリン（バイオテーマＡＢ、スウェーデン、ダラロ）、５ｍｍｏｌ／ｌの 酢酸マグネシウム、０．　００　Ｌｍｒｎｏ　１／　ｌのビロリン酸四ナトリウ ム（シグマ・ケミカル・カンパニー、米国ミズーリ州；Ｔ６３７９）および０． １％ウシ血血清アルミミノＡ４５０３、シグマ・ケミカル・カンパニー、米国ミ ズーリ州）を含有するホタル試薬を、０．７５％βＣＤを含有する、および含有 しないＴ／Ｅ緩衝液中においてＲ’Ｅ）した。１０−’ｍ　ｏ　ｌ　／　ＩのＡ ＴＰを添加したのち、１２５０ルミノメータ−（バイオオービット・オイ、フィ ンランド、ツルク）により本π的な安定な発光を測定した。予備実験（示されて いなｔりにおいて、βＣＤの不在下での最適Ｄ−ルンフエリン濃度は０．２ｇ／ ｌであることが見出された。

図９はβＣＤの不在下でＤ−ルシフェリンａ麿を増大させると発光が低下したこ とを示す（基′Ｅ陥害）。βＣＤの存在下ではＤ−ルシフェリンが０．２から０ ゜４ｇ／ｌになると発光が著しく増大し、０．４から０．６ｇ／Ｉになるとわず かに増大し、０．６から０．８ｇ／ｌになるとわずかに低下した。最適Ｄ−ルシ フェリン濃崖がβＣＤの不在下での０．２ｇ／ｌから０．７５％βＣＤの存在下 での０．６ｇ／Ｉに移行したことは、βＣＤがＤ−ルシフェリンと包接コンプレ ックスを形成することを強く示すものである。

βＣＤを含有しないホタル試薬に１０μｌ容量の５％ＤＴＡＢを１回添加すると 、ルシフェラーゼの失活のため発光が急激にディケイした（示されていない）。

０７５％（６，６ｍｍｏ　ｌ／ｌ）βＣＤの存在下で、キュベツト中０．２％（ ６゜６ｒｎｍｏｌ／Ｉ）に相当するＤＴＡＢの４回目の添加時に、発光の緩除な ディケイが認められた。ＤＴＡＢ添加後の種々の水準のＤ−ルシフェリンを含有 する試薬からの発光強度を図１０に示す。測定はＤＴＡＢを添加したのち直ちに 行われたので、ＤＴＡＢによるルシフェラーゼの経時的失活により影響されなか った。

最適より著しく低いＤ−ルシフェリン水準（０，２ｇ／ｌまたは０．７ｍｍｏｌ ／ｌ）において、ＤＴＡＢの添加は相対発光を増大させた。最適よりわずかに低 い（０，４ｇ／１）Ｄ−ルシフェリン水準において、ＤＴＡＢの添加が発光に与 えた影響はごくわずかであった。最適（０，６ｇ／Ｉ）およびより高い（０，８ ｇ／１）Ｄ−ルシフェリンにおいては、ＤＴＡＢの添加は発光を低下させた。こ れらの影響についての最も可能性のある説明は、βＣＤに対してＤＴＡＢがＤ− ルシフェリンと比較してより高い親和性を有するというものである。従ってＤＴ ＡＢの添加はＤ−ルシフェリンをβＣＤコンプレックスから解放し、その結果、 最適より著しく低いＤ−ルシフェリン水準においては発光が増大し、最適よりわ ずかに低いＤ−ルシフェリン水準においては発光が本質的に変化せず、最適また はより高いＤ−ルシフェリンにおいては発光が低下した。

図２−７に示した結果を表１にまとめる。この表は６実験すべてにつき〉５％の 阻害または２２％／分のディケイ速度を生じる最低濃度（最終アッセイ混合物中 における％として表す）を示す。これらの実験において抽出剤は、各段階が０゜ ０１％であったＳＤＳ以外は０．０２％ずつ段階的に添加された。Ｍの後の文い てのカットオフ限界は、ある程度任意に定められると思われる。それらが実際に 意味するものは、試料と試薬の混合の間で２．５分の遅延期間に全５％の阻害お よび全２％／分のディケイ速度を与える試料は１０％低すぎるＡＴＰ値を与える であろうということである。この水準における影響は、厳密に制御された分析操 作を用いることにより数学的に補正しうるであろう。

ｎｇＭ　４７１＋ＮｏｏＴＡ＠　ｃｐＣｕＣｕｃ　！ＸｍｅＳ　５Ｏ５ｆｊＬ０ ．０２ｄ０．０２１１−１０．０２ｄ０．０２ｄｏ、ｅｓａＯ，０＋１ａ（ＯＱ 、２５０．ｌＯｄ”Ｏ，ｏ６ｄ＊Ｉ”０ｏ４ｒＯ，ｆｆ２ｄ０．１０−”ｏ、ａ ｚ＋”０．５００．１Ｇｄ４１”０．０１１”Ｏ，ｌＯ＋１”０．０２ｄ１１． １１Ｐ０．０４１”０．７５　０．２１１１１”　０．１２１”　０．１！ｄ” ＋＋、ｔ　ｎＡ、　０．０４１＠ｓＣ口０．２５０．＠ｄＯ，Ｃｒ２ａＯ，０４ １０，１ＯＦＯ，ｌＯｄ１１．０１１０．５０　０．１４ｄ　０．０４１　＋１ ．０１１　１１．１６Ｆ　０．１６１　６．１１１１Ｑ、７ＳＯ，１１＋ｄＯＩ ＭｄＯ，ｌＯ＊ｎＪ、ｎ、４．０．０１１ｙｃｏ　Ｏ，２５０，０４ｄ　Ｉｌ、 ｄＩｌ、ａ、０．０＠＄１０．０４ｄ　＊、ｇ＋１５０　００ｄｍ　＋＋ｄ　ｎ ｄ　Ｏｉｌ　ｏｏ＋＋Ｉ　ｎｄ０．７＄　０．０４ｄ　ｎ、６．　＊、ｄ、　Ｒ ｊ、　＊、４ヅイーン＄Ｏ１，＠　Ｏ，Ｏａｄ　Ｏ，０４１０，１Ｍ　ｌ　ロ０ ４１　０．Ｏｉｌ　Ｏ，０１１２，００００４＋　０．０４１　０．（１４１０ ，０４１０，鏝１　０．０１１３．０００．０４１００４１０．０４１ｎｄ、ｎ 、４．００１１タージエント／サイクロデキストリンのモル比を計算したうちで 最良のディターンエンドとサイクロデキストリンの組み合わせを示す（後記を参 照）。

表１にまとめた実験においては、抽出剤は各段階が０．０１％であったＳＤＳ以 外は００２％ずつの段階的な濃度増大を生じるように添加された。従って表中の 濃度から０．０２％（ＳＤＳについては０．０１％）を差し引いたものが分析上 の妨害を与えない許容しうる濃度を与える。これらの結果は下記のとおり記載し うる １）　中和剤が無い場合、実験に含まれる抽出剤の許容濃度は５０．０２％であ り、これより高い濃度における主要な問題はディケイ速度であった。

２）　βＣＤの方か良好であったＢＺＣ以外は、αＣＤがすべての抽出剤につき 最良の中和剤であった。サイクロデキストリン濃度を０．２５−０．７５％の範 囲で増大させることにより状況が改善された。ＳＤＳ以外は阻害よりむしろディ ケイ速度かサイクロデキストリンを用いる場合の制限因子であった。

３）　αＣＤを用いた場合の許容しうるディターンエンド濃度についての平均モ ル比は下記のとおり計算しうる　ＤＴＡＢについては０．８８、ＣＰＣについて は０．３７、ＢＡＣについては０．４８、ＤＤＡＰＳについては０．９３、ＳＤ Ｓについては０１９゜βＣＤを用いた場合の対応するＢＺＣについての比は０゜ ７３であった。ＳＤＳについてはこのモル比は化学量論的量から予想されるもの よりかなり低い、、５ＤＳａαＣＤの比を＜０．１９に維持しない限り、すべて の抽出剤を包接コンプレックスとして中和した状態に維持するためには結合定数 が低すぎると思われる。

４）　ツイーン８０を用いた場合、許容濃度は一般に０．０２％（ＤＤＡＰＳに ついては０．０４％、ＳＤＳについては＜０．０１）であり、主要な問題は阻害 であった。ツ１′−ン８０濃度を１−３％の範囲で増大させることによって状況 は改善されなかった。

サイクロデキストリンはツイーン８０と比較して、界面活性剤型の抽出剤（カチ オン、アニオン、ツビッタ−イオン）に対するより良好な中和剤であり、より高 ｆＩＡｒｔの抽出剤の使用が可能になると結論される（アッセイ前の抽出物の希 釈はより低いことが必要である）。大部分の抽出剤にっきαＣＤが最良の中和剤 である。しかしＢＺＣのように界面活性剤分子の疎水性テイルが嵩高すぎる場合 はβＣＤ（またはよりいっそう嵩高なテイルについてはγＣＤ）の方が良好であ る。

明瞭な滴定曲線を示すサイクロデキストリン（高い結合定数を有する包接コンプ レックスの形成を示す）については、抽出剤の許容濃度は本質的にサイクロデキ ストリン濃度に比例する。従って最終アブセイ混合物中の抽出剤の予想水準にサ イクロデキストリンの量を調整しうる。βＣＤの存在下である種のディターンエ ンドにつき見られた発光刺激は、抽出剤添加時にβＣＤから放出されるＤ−ルシ フェリンの量を考慮して常に最適Ｄ−ルシフェリン濃度でアッセイを実施するこ とにより排除しうる。αＣＤおよびγＣＤも若干の発光阻害を示すので、それら についても同様な、ただしはるかに低い影響が見られるであろう（図８）。その 場合も改善策はβＣＤと同じ、すなわち若干高い濃度のＤ−ルシフェリンを用い 特定の種類の細胞からのＡＴＰの抽出は、主として抽出剤の種類および濃度、細 胞の種類、ならびに全体的な試料組成により影響される。細胞数、細胞の生理的 条件（増殖の位相など）、ならびに培地組成の相異による副次的な影響を予想す べきである。高い緩衝能は酸による抽出に影響を及ぼし、高い水準の蛋白質また は脂質は界面活性剤による抽出に影響を及ぼすであろう。従って特定の種類の媒 質中における特定の種類の細胞のいずれについても、最適な抽出条件を見出す必 要がある。数種類の抽出剤に関し、各種類につき数種類の濃度を用いて得たＡＴ Ｐ収率を比較することが、実際の細胞内ＡＴＰ濃度を反映する最適抽出条件を見 出す唯一の方法である。これまでの研究（ランデイン（Ａ、Ｌｕｎｄ　ｉｎ）。

ＡＴＰＳＡＤＰおよびＡＭＰの抽出および自動ルミツメトリーアッセイ、　Ａａ ａｌｙｔｉｃａＬ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉ、ｎｅｓ ｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、　クリ塔J、ス タンレイ、トルベおよびホワイトヘッド（Ｌ、Ｋｒ１ｎｋａ、Ｐ、５ｔａｎｌｅ ｙ、Ｇ、Ｔｈｏｒｐｅ、Ｔ、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）監修、ｐｐ、５４５−５５２ ゜アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１９８４）から、大部分の状況におい て最大ＡＴＰ収率は１０．５および２５％トリクロロ酢ｒＩＩ（ＴＣＡ）を用い た収率と比較することにより判定しうろことが知られている。従って各種抽出剤 の比較には常に対照法としてＴＣＡを含めるべきである。最終的な抽出剤の種類 および濃度は、試料のわずかな変化がＡＴＰ収率に影響を及ぼさないように選ぶ べきである。抽出剤が最適濃度においてすら他の抽出剤より有意に低い場合は、 これはその収率が変動性であり、わずかに変更した条件下ですら（たとえば他の 増殖相）かなり低いことを示す。抽出を妨害する試料成分の濃度のわずかな増大 がこれらの試料中のＡＴＰ収率を低下させるのを避けるために、抽出剤濃度は最 適濃度範囲内で可能な限り高く選ぶべきである。

数種類の微生物を含む試料につき、各種抽出剤の最適な種類および濃度を見出す ために実験を行った。抽出剤は第四アンモニウム型のカチオン界面活性剤（ＤＴ ＡＢおよびＢＺＣ）、ツビッタ−イオン型界面活性剤（ＤＤＡＰＳ）、およびア ニオン界面活性剤（ＳＤＳ）であった。ＴＣＡは対照法として含めた。微生物で 一夜、ルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス（５ｇ／Ｉ　ＮａＣ１，１０ｇ／ｌ　トリプ トン、および５ｇ／ｌ酵母エキス）中において増殖させた。酵母は振盪せずに３ ７℃で一夜、シリアブロス中において増殖させた。クロレラは既製培養物として 、藻類および原生動物のタイプカルチャーコレクシラン（フレッシュウォーター ・バイオロジカル・アソシエーション、英国ＬＡ２２　０ＬＰカンブリア、アン ブレサイド、ザ・フェリー・ハウス）から得られた。クロレラ以外の培養物はす べてアナラル水（Ａｎａｌａｒ　ｗａｔｅｒ）中に１０倍希釈された。下記を含 有する抽出剤の２倍希釈液を調製した−１０．５．２．５．１．２５．０．６２ ５．０、３１２５．０．１５６２５、領０７８１２５．０．０３９０６２５．０ ０１９５３１２５および０．００９７６５６２５％の抽出剤、５ｍｍｏｌ／ｌの ＥＤＴＡ中。等容！（０，１ｍ１）の抽出剤および希釈試料を混合した。１およ び３０分後に、２％ツイーン８０を含有するＴ／Ｅ緩衝ＭＯ，８ｍｌを入れた２ 系列の平行したキュへｌトに、得られた抽出物５０μｌアリコートを移した。ツ イーン８０は抽出剤の酵素阻害作用を中和する。しかし抽出されたＡＴＰは、Ａ ＴＰを伴う酵素反応に必要なＥＤＴＡコンプレックス形成性２価金属イオンの存 在下では希釈後に本質的に安定であると予想される。高濃度の抽出剤においては 抽出は数秒以内に完了するが、低濃度では抽出はこれよりかなり長期間を要し、 低い収率を与える。高濃度の抽出剤における第１および第２系列からの結果を比 較すると、抽出物中におけるＡＴＰの安定性が推定される。この実験においては 、サイクロデキストリンではなくツイーン８０を用いた。各アッセイにおいてＡ ＴＰ標準品を添加して自動１２５１ルミノメータ−により、高度に希釈した試料 を用いてアッセイを実施しうるからである。キュベツトをルミノメータ−に装填 し、以下のアッセイ操作を自動的に行った：１）　温度を２５℃に平衡化（１０ 分）。

２）　Ｏ，Ｌｍｌ　ＡＭＲの添加。

３）　２０秒遅れて発光、■１１．、を測定。

４）　Ｏ，０１ｍ１　ＡＴＰの添加。

５）　２０秒遅れて発光、■１．．。８．４、を測定。

これらの遅れは安定な発光を確実に得るために採用された。キュベラ）・中のＡ ”ｒｐｇ度、Ｃ１工、を次式により計算した：Ｃ，，，−Ｃ，、、★Ｉ　、、、 ／　（Ｉ　、、、、、、、−Ｉ　、、、）確実に細胞内ＡＴＰのみを測定するた めに、希釈物およびブランクにつき適宜な補正を行った（細胞内ＡＴＰのみを与 える抽出剤はない）。結果を図１１−１５に示す。

緑膿菌（図１１）および大腸菌（図１２）については、最適濃度のＤＴＡＢ。

ＢＺＣおよびＴＣＡにつき類似のＡＴＰ収率か得られた。ツヒッターイオン界面 活性剤（ＤＤＡＰＳ）もアニオン界面活性剤（ＳＤＳ）も使用できないであろう 。

枯草菌（図１３）、ヒール酵母（図１４）、およびクロレラ・ブルガリス（図１ ５）については、最適濃度の５種類の抽出剤すべてにつき類似の収率か得られた 。

図］、　Ｌ　−１５のデータからは、いずれの微生物についても好ましい抽出剤 についての決定を行うことはできない。そのような決定には、たとえば異なる増 殖位相の細胞についての研究を含めた、よりＩｆｉな実験が要求されるであろう 。さらに、実際の試料において細胞を他の媒質に懸濁した場合、その媒質中にお いて抽出を行う必要がある。実際の試料か数種類の微生物系統を含む場合、それ らすべての系統につき研究を行う必要がある。しかし図１１−１５のデータは、 抽出剤および各抽出剤につき後続実験に使用すべき濃度範囲を選択するために利 用しうる。

このような選択および若干の予備実験を特定の用途につき実施例３に示す。

プロセス水中のバイオマス推定のためにＡＴＰのホタルアッセイ法を採用しつる 。プロセス水中の微生物には、種々の細菌、酵母および藻類の系統が含まれるに １０倍希釈した。ブロスからの有機物質は界面活性剤を用いる抽出をある程度妨 害する可能性かある。プロセス水も若干の有機物質を含有する可能性があるが、 大部分は１０倍希釈ブロスより低い水準であると思われる。従ってモデル実験に おいて有効な抽出法は実際の試料においても有効であると思われる６希釈されて 入手）および実際のプロセス水試料についても同様に実験を行った。

実施例２のデータによれば、すべての種類の微生物細胞（細菌、酵母および藻類 ）に使用しうる３Ｎ類の抽出剤はＤＴＡＢ、ＢＺＣおよび−「ＣＡであった。こ れらの抽出剤それぞれにつき、５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含有するアナラル水 中の１０．５および２．５％溶液を調製した。等容量の抽出剤溶液を入れたキュ ベツトに試料（５０μｍ）を添加し、次いでＴ／Ｅ緩衝液０．８ｍｌを添加した 。

ＤＴＡＢを含有する抽出物については緩衝液は重量基準で５倍多いαＣＤをも含 有し、ＢＺＣを含有する抽出物については緩衝液は４倍多いβＣＤを含有してい た。その結果、モル比０．６３　（ＤＴＡＢ／αｃＤ）および０．６１　（ＢＺ Ｃ／βＣＤ）、すなわち実施例１において計算した最高許容比（それぞれ０．８ ８および０．７３）より十分に低いものとなった。ＡＴＰのアッセイは実施例２ の場合と同様に１２５１ルミノメータ−により自動的に実施された。測定に際し て第四アンモニウム化合物により発光のディケイをもたらすルシフェラーゼ失活 は生゛じなかった。これは、本発明の原理が実際の微生物ＡＴＰアッセイにおい て確かに有効であることの重要な確認であった。

図１６−１８は上記９種類の微生物（尋常変形菌、枯草菌、エーロモナス・ヒド ロフィラ、蛍光菌、緑膿菌、ビール酵母、ミドリムシ、クロレラ・ブルガリスお よびアナベナ・シリンドリカ）を用いたモデル実験で得た代表的結果を示す。

２種類の最低ＴＣＡ１１度（有効濃度１．２５および２，５％）は、少なくとも ４種類の微生物（枯草菌、緑膿菌、ビール酵母およびクロレラ・ブルガリス）に ついては不適当であった。最高ＴＣＡ濃度（有効濃度５％）は、６種類の微生物 （枯草菌、エーロモナス・ヒドロフィラおよびクロレラ・ブルガリス以外のすべ て）において最高または最高に近いＡＴＰ収率を与えた。しかしこの濃度は発光 に著しい阻害を生じ、このためより低い感度を与え、あらゆるアッセイにおいて 内部ＡＴＰ基準を用いることが必要となる。第四アンモニウム化合物ＣＤＴＡＢ およびＢＺＣ）による抽出は、調へた範囲においては抽出剤濃度によりほとんど 影響されなかった。最適濃度より２倍過剰が安全性限界として好ましいであろう 。従って実験的証拠に基づいて、好ましい濃度は２．５％有効濃度とすべきであ るか、これより低い濃度も同様に良好に作動するであろう。ＢＺＣは、４種類の 微生物（エーロモナス・ヒドロフィラ、ｋ１１１１１菌およびビール酵母）にお いて最高または最高に近いＡＴＰ収率を与えた。ＤＴＡＢは、７ａ類の微生物（ 蛍光菌およびアナベナ・シリンドリカ以外のすべて）において最高または最高に 近いＡＴＰ収率を与えた。

抽出法についての最終決定は、各用途の実際の試料を用いた実験に基づいてなさ れ、かつ可能な限り一般的であるように選定しなければならない、３種類のプロ セス水についてのこのような結果を図１９に示す。３種類すべての試料において ＤＴＡＢを用いた場合に最良の結果が得られた。等容量の抽出剤溶液（０，０１ −３，５％ＤＴＡＢ）で抽出した他の３種類のプロセス水試料（０，０５ｍ１） について同様な実験を行った。アッセイ混合物中において０．８７５％の最終濃 實（すなわち最高の最終ＤＴＡ　８８度の５倍）を与えるαＣＤをアッセイ緩衝 液（０，８５ｍ１）に含有させることにより、抽出剤を中和した。アッセイは、 ０゜０５　ｇ／　ｌのルシフェラーゼ（エンザイマティックス社、英国ケンブリ ッジ）、４ｇ／ｌのＤ−ルシフェリン（バイオテーマＡＢ、スウェーデン、ダラ ロ）、１００ｍｍｏ　ｌ／ｌの酢酸マグネシウム、０．０２ｍｍｏ　ｌ／Ｉのビ ロリン酸四ナトリウム（シグマ・ケミカル・カンパニー、米国ミズーリ州、　Ｔ ６３７９）および２％のウシ血清アルブミン（Ａ４５０３、シグマ・ケミカル・ カンパニー、米国ミズーリ州）を含有するホタル試薬０．０５ｍ１を添加するこ とにより実施された。各アッセイは１０−’ｍｏｌ／Ｌ　け７セイ混合物１ｍｌ 中の最終濃度）のＡＴＰ標準品の添加により検量された。ＡＴＰ添加前および添 加後の発光測定を１２５１ルミノメータ−（バイオオービット・オイ、フィンラ ンド、ツルク）により実施した。２重測定で得た結果（図２０）は、抽出物中１ ．２５％のＤＴＡＢ（等容量の試料および２．５％ＤＴＡＢに相当）が安全性限 界において１００％ＡＴＰ収率を与えることを示す。ルーティン用として用いる ためにはこの結論をより多数の試料において確認しなければならない。

この実験においては、細胞溶解後のディターシエントの中和にサイクロデキスト リンを使用することにつき調べた。、０．５ｍＩ　ＰＢＳ　（シグマ）中のＨｅ Ｌａ細胞（１０’）を１ｍｌの細胞溶解緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐ Ｈ８＋１ｍＭ　ＥＤＴＡ；１％　ＳＤＳ；０．４ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａ； ４０Ｕ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ｔｌ）の添加により細胞溶解した。細胞溶解物を５ ５℃で１５分間インキュベートしたのち、０．５ｍｌのプロテイナーゼＫ（ベー リンガ−；６００μｇ／ｍｌ）を添加した。５５℃で４５分間消化を続けた。溶 解物のアリコート（２００μｌ）を新鮮な試験管に装入し、αＣＤ（フル力；　 Ｈ！Ｏ中１０％ｗ／ｖ）を下記の量で溶解物に添加した：　１０μＬ　２０ａｌ 、５０μｌ。

１００μｌおよび２００μ１０緩和な撹拌により試料を混合したのち、ＰＣＨに よりＤＮＡの機能活性を分析した。

ＰＣＲ反応（反応容１１５０μｍ）を下記物質の添加により設定した。１０μｌ の５ｘＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，５；２５０ｍＭ　ＫＣＩ。

７．５ｍＭ　ＭｇＣｈ、１ｍＭ　ｄＡＴＰ、１ｍＭ　ｄＧＴＰｌｌｍＭ　ｄＣＴ Ｐ、１ｍＭ　ｄＴＴＰ）；　２ａＬのＣＦ座プライＴ−５ｉ１（ＣＦ　ｌｏｃｕ ｓｐｒｉｍｅｒ）（各５０μｌ）；ｌμｌのＤＮＡ　（ａｃＤ処理細胞溶解物ま たは対照ＤＮＡ）；３７μｌの無菌Ｈ２０；　２　μｌのＴａｑポリメラーゼ（ エーメルシャム）。

反応プロフィルは下記のとおりであった：９３℃　３分 ５５℃　１分　３０回 ７２℃　２分　〃　〃 ９３℃　３０秒　〃　〃 ５５℃　１分　〃／／ ７２℃　５分 ＰＣＲ反応の終ｒ後に、試料（２０μｌ）をアガロースゲル電気泳動により分析 した（１’ＢＥ緩衝液中１％アガロース、サムプルγり、フリッチュおよびマニ アチスＤ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｔ、Ｍａｎｉａｔ　ｉ ｓ）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａ　１．第２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス 。

１９８９）。５０μｍまたは１００μｍのαＣＤを添加した細胞溶解物において 最大の増幅か達成され、２００μｌを添加した際にも増幅が達成された。対照（ αＣＤ’ｉ−添加しなかった細胞溶解物）または１０μＩもしくは２０μｌのα ＣＤを添加した細胞溶解物においては増幅か生じなかった。

増幅可能な試料か制限酵素による消化も可能であるかを評価するために、下記で 消化した　ＤＮＡ（１８μｍ）、緩衝液（２μｌ、製造業者により供給されたま ま）および酵素（約５Ｕ／μｇ）を混合し、試料を３７℃で１時間消化した。

試料を上記に従ってアガロースゲル電気泳動により分析した。

制限消化後のαＣＤ処理試料のバンディングパターンを調へた。１００μｌのα ＣＤを添加した試料のみか３種類すべての酵素により消化され、これはこれらが これらのＨｅＬａ細胞溶解物におけるＤＮＡのＰＣＲおよび制限分析双方に最適 な中和条件であることを示す。

ＰＣＲおよび制限消化実験は、粗製細胞溶解物中においてＳＤＳを中和するため にαＣＤか有効であり、これらの細胞溶解物中に存在するＤＮＡが機能的に活性 であることを示す。

説明 図】　抽出剤による中和剤の滴定。測定は本文の記載に従って実施された。それ ぞれ曲線上の第３地点の後で、中和剤およびホタル試薬を含有する反応混合物約 １ｍｌに１０μＩの抽出剤を添加した。この図は２％ＤＴＡＢによる０、５％α ＣＤ（◆）および２％ツ・イーン８０（◇）の滴定、ならびに２％ＢＺＣによる ０　５％βＣＤ（■）および２％ツイーン８０（ロ）の滴定を示す。

図２　各種中和剤の存在下でＤＴＡＢがディケイ速度および相対発光に及ぼす影 響。中和剤の種類は図中に示されるウディケイ速度（％／′分）は下記の記号に より示される　◇（中和剤なし）、口（０，２５％サイクロデキストリンまたは １％ツイーン８０）、△（０，５０％サイクロデキストリンまたは２％ツイーン ８０）、および＊（０，７５％サイクロデキストリンまたは３％ツイーン８０） 。

相対発光（１回目の抽出剤添加の前の値に対する％）は下記の記号により示され る　◆（中和剤なし）、■（０，２５％サイクロデキストリンまたは１％ツイー ン８０）、ム（０，５０％サイクロデキストリンまたは２％ツイーン８０）、お よびＸ（０，７５％サイクロデキストリンまたは３％ツイーン８０）。

図３　各種中和剤の存在下で、ＣＰＣがディケイ速度および相対発光に及ぼす影 響。中和剤の濃度および記号は図２の場合と同様（γＣＤは省略〕。

図４　各種中和剤の存在下で、ＢＡＣがディケイ速度および相対発光に及ぼす影 響。中和剤の濃度および記号は図２の場合と同様（γＣＤは省略）。

図５．各種中和剤の存在下で、ＢＺＣがディケイ速度および相対発光に及ぼす影 響。中和剤の濃度および記号は図２の場合と同様（最高濃度の中和剤は省略）。

図６＝各種中和剤の存在下で、ＤＤＡＰＳがディケイ速度および相対発光に及ぼ す影響。中和剤の濃度および記号は図２の場合と同様（最高濃度の中和剤は省略 ）。

図７．各種中和剤の存在下で、ＳＤＳがディケイ速度および相対発光に及ぼす影 響。中和剤の濃度および記号は図２の場合と同様（γＣＤは省略）。

図８＝中和剤が相対発光に及ぼす影響。中和剤の濃度は下記のとおりである＝０ ．２５．０，５０および０．７５％サイクロデキストリン（■、αＣＤ：◆、β ＣＤ、ム、γＣＤ）または１．２および３％ツイーン８０（Ｘ）。

図９：０．７５％βＣＤの存在下（◇）および不在下（◆）でルシフェリン濃度 がホタル試薬からの相対発光に及ぼす影響。βＣＤの不在下で０．２ｇ／ｌのル シフェリンによる発光をＬＯＯ％と設定する。

図１０　：　ＤＴＡＢが、０．７５％βＣＤおよび各ｆ１１１００Ｄ−ルシフェ リン（◆、０．２ｇ／Ｉ：◇、０．　４　ｇ／　ｌ　；■、０．６ｇ／ｌ；口、 ０．８ｇ／ｌ）を含有するホタル試薬の相対発光に及ぼす影響。各Ｎ試薬にＤＴ ＡＢを添加する前の発光を１００％と設定する。

図１１　抽出剤濃度か、水中に１０倍希釈したｈｉｌｌ菌の一夜培養物における ＡＴＰ収率に及ぼす影響。抽出時間　１分（×）および３０分（ロ）。

図１２　抽出剤濃度が、水中に１０倍希釈した大腸菌の一夜培養物におけるＡＴ Ｐ収率に及ぼす影響。抽出時間：１分（×）および３０分（ロ）。

図１３．抽出剤濃度が、水中に１０倍希釈した枯草菌の一夜培養物におけるＡＴ Ｐ収率に及ぼす影響。抽出時間・１分（×）および３０分（ロ）。

図１４　抽出剤濃度が、水中に１０倍希釈したビール酵母の一夜培養物における ＡＴＰ収率に及ぼす影響。抽出時間：１分（×）および３０分（ロ）。

図１５　抽出剤ａｉｒが、水中に１０倍希釈したクロレラ・ブルガリスの一夜培 養物におけるＡＴＰ収率に及ぼす影響。抽出時間。１分（×）および３０分（ロ ）。

図１６　各種抽出剤を用いた尋常変形菌、枯草菌およびエーロモナス・ヒドロフ ィラにおけるＡＴＰの収率。種々の系統の一夜培養物を１０倍希釈し、アリコー トを、５ｍｍｏ１／ｌのＥＤＴＡを含有する等容量の１０．５または２．５％Ｔ ＣＡ　（ロ）　、ＢＺＣ（△）またはＤＴＡＢ　（◇）と混合することにより抽 出した。ＢＺＣを含有する抽出物は４倍（ｗ／ｗ）量のβＣＤにより中和された 。ＤＴＡＢを含有する抽出物は５倍（ｗ／ｗ）量のαＣＤにより中和された。

図１７°各種抽出剤を用いた蛍光画、緑膿菌およびビール酵母におけるＡＴＰの 収率。抽出および記号は図１６の場合と同様。

図１８　各種抽出剤を用いた３種類の１ｉｉＩＩ類培養物におけるＡＴＰの収率 。抽出および記号は図１６の場合と同様。

図１９：各種抽出剤を用いた３種類のプロセス水試料におけるＡＴＰの収率。

抽出および記号は図１６の場合と同様。

図２０１０種まの異なる濃度のＤＴＡＢで抽出したプロセス水試料におけるＡＴ Ｐの収率。３１ｇＩＷＪの試料につき異なる記号を用いて２重実験を示す。

α■　α０２０．０４　α閃α０８　αυ　α２　α１４　０．）６　α追　α ２０ＤＴＡＢ濃度　（％） ０．００　ｏ、０２０．０４　Ｑ、０６α０８０．１００．ｔ２０ｇ　ｏ、ｓ　 ｏ、＋ｓ　ｏ２゜Ｄ丁ＡＳ濃度　（％） ＤＴＡＢ濃度　（％） ＢＡＣ濃度　（％） ＢＡＣ濃度　（％） ＢＺＣ濃度　（％） ＢｚＣ濃度　（％） ＢＺＣ濃度　（％） ＤＤＡＰＳ濃度　（％） ＤＤＡＰＳ濃度　（％） ＤＤＡＰＳ濃度　（％） ０　０．２５　０．５　０．７５ ０　０．２　０．４　０．６　０．８ ルシフ工リン濃度（ｇ／Ｌ） ＤＴＡ８濃度　（％） 抽出剤濃度　（％） 抽出剤濃度　（％） 抽出剤濃度　（％） 、　＋、＋　＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０００５６

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞内成分および該成分を抽出するために用いた物質を含有する溶液を供給 することにより細胞内成分の抽出物を調製する方法において、該溶液を抽出用物 質の中和のために適切な種類および適切な量のサイクロデキストリンまたはサイ クロデキストリン誘導体と接触させることを特徴とする方法。
2. ２．溶液が細胞を抽出用物質と接触させることにより供給される、請求の範囲第 １項に記載の方法。
3. ３．サイクロデキストリンが溶液状で使用される、請求の範囲第１項または第２ 項に記載の方法。
4. ４．サイクロデキストリンが抽出用物質より化学量論的に過剰に使用される、請 求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。
5. ５．サイクロデキストリンがａ−サイクロデキストリン、β−サイクロデキスト リンまたはγ−サイクロデキストリンである、請求の範囲第１項ないし第４項の いずれかに記載の方法。
6. ６．抽出用物質がノニオン、アニオン、カチオンまたはツビッターイオン界面活 性剤、またはそれらの界面活性剤の混合物である、請求の範囲第１項ないし第５ 項のいずれかに記載の方法。
7. ７．細胞内成分がＡＴＰである、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記 載の方法。
8. ８．抽出物中の細胞内成分が酵素アッセイされる、請求の範囲第１項ないし第７ 項のいずれかに記載の方法。
9. ９．酵素アッセイがホタルルシフェラーゼ反応に基づくものである、請求の範囲 第１項ないし第８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．細胞内成分がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求の範囲第１項ないし第６項 のいずれかに記載の方法。
11. １１．抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡが増幅または酵素による修飾もしくは制限 処理により後続処理される、請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．酵素アッセイまたは後続処理がサイクロデキストリンまたは誘導体の存在 下で実施される、請求の範囲第８項、第９項または第１１項に記載の方法。
13. １３．請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかに記載の方法により生物検体中 のＡＴＰを抽出およびアッセイするためのキットにおいて、下記の構成成分：ａ ）抽出用物質（他の成分と分離して保存）ｂ）サイクロデキストリン、 ｃ）ホタルルシフェラーゼ試薬、 ｄ）アッセイ用緩衝液 を含むキット。
14. １４．−抽出用物質が、流体検体と接触した際に適切なサイズの試料を捕獲する キャリヤー上または中において乾燥されており、−サイクロデキストリンがアッ セイ用緩衝液に溶解されており、−ホタルルシフェラーゼ試薬が、該試薬をアッ セイ用緩衝液中へ放出しうるキャリヤー上または中において乾燥されている、請 求の範囲第１３項に記載のキット。