JP2017533718A - 試料中の細菌ａｔｐを検出するためのａｔｐ−ジホスホヒドロラーゼを含むキット - Google Patents

Abstract

試料中の細菌ＡＴＰを検出するキットが提供される。上記キットは、約６．０〜７．２のｐＨを有する水性組成物を含む。上記水性組成物は、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む。細菌ＡＴＰを検出するためのキットを使用する方法も提供される。

Description

本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１１月１３日出願の米国特許仮出願第６２／０７９，１５６号に対する優先権を主張する。

種々の工業製品及び工業プロセスに関与するその他の試料（原料、工程内試料、環境試料等）は、その微生物汚染を試験する必要がある。最終製品は、無菌でなければならない場合もあれば、許容される微生物の総数に限度が設定される場合もある。多くの場合、ある特定の生物の存在に関して試験が実施され、やはりその要件は、特定量の試料中に存在しないことであったり、あるいは許容される数に制限があったりする。

従来、これらの試験は、培養技法の使用を伴う。しかしながら、こうした従来試験方法は、速度が遅い。典型的には、健康で成長の速い細菌又は酵母が、寒天平板上で楽に計数するのに十分な大きさのコロニーを形成するまでに、通常は少なくとも２４時間かかる。しかしながら、多くの試料には、増殖を開始する前に回復期間を必要とするストレスを受けた微生物、又は一般的な種類の培地上での成長が遅い生物（カビなど）が含まれる。したがって、多数の検証済みの培養方法は、２４〜４８時間、場合によっては５日以上のインキュベーション期間を必要とする。

多数の微生物試験が、現在、細胞（例えば、微生物細胞）から放出されるＡＴＰ生物発光を検出するＡＴＰ生物発光反応を使用して、はるかに短時間で実施されている。ＡＴＰは、エネルギー代謝の必須部分であり、したがって、生物又はその他の有機物の存在の指標である。

これらの試験は、ルシフェラーゼ酵素を利用する。生物発光試薬は、ルシフェラーゼを、とりわけ、その基質であるルシフェリン、マグネシウムイオン及び好適な緩衝液と共に含有する。アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）をこの試薬に加えると、ルシフェラーゼは、発光を触媒する。試験の結果は、ＲＬＵ（相対発光単位）の値として記録される。ＲＬＵ値は、一般的に、試験試料中に存在する微生物の量に比例する。

特定の試料（例えば、乳）は、カゼインミセルと関連する比較的高濃度の遊離ＡＴＰ及び体細胞中に存在するＡＴＰを含有し得る。これらの場合、キレート剤を使用してミセルを破壊することができ、マイルドな洗剤を使用して体細胞を溶解することができ、アピラーゼ（ＡＴＰ加水分解酵素）を使用して「非微生物」ＡＴＰを加水分解することができ、それによって、微生物ＡＴＰの検出が可能になる。微生物ＡＴＰを検出するための、単純で簡便な試験に対する必要性がまだ存在する。

本開示は、周囲温度（例えば、約２５℃）で極めて安定なＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの水性組成物を含むキット及び当該組成物の製造方法に関する。ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む実質的に乾燥した組成物は、０℃で安定であることが知られている。更に、≧１ｍｇ／ｍＬのＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼは、凍結保存したときに水性組成物（ｐＨ５〜７）中で安定となり得ることが知られている。更にまた、＜１ｍｇ／ｍＬのＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼは、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍｍのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍｇ／ｍＬのウシアルブミンを含む水性組成物（ｐＨ７．５）中に保管できることが知られている。しかし、凍結解凍サイクルの繰返し及び数時間の室温への暴露は、水溶液中のＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの活性損失を招くことも知られている。上記組成物を、試料中の細菌ＡＴＰを検出するためのキットに使用できる。

本開示の発明の水性組成物は、驚くべきことに、室温（例えば、約２１〜２５℃）で少なくとも２８日の保管後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性の約９０％以上を保持する。有利なことに、この周囲温度における水溶液中のＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの安定化により、ＡＴＰ生物発光を検出するためのキットで当該水性組成物の使用が可能になる。

一態様において、本開示は、約６．０〜７．２のｐＨを有する水性組成物を含むキットを提供する。水性組成物は、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含み得る。任意の実施形態において、ポリオールはソルビトールを含むことができ、緩衝試薬は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、及びスクシネートの混合物を含むことができ、タンパク質は、ウシ血清アルブミンを含むことができる。

別の態様において、本開示は、０℃超で少なくとも７日間保管した水性組成物において初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性の９０％以上を保持する方法を提供する。当該方法は、約６．０〜７．２のｐＨを有する水性組成物を形成する工程（当該組成物は、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む）と、当該水性組成物を１〜２５℃の温度で少なくとも７日の期間保管する工程と、を含み得る。水性組成物は、第１の時点で、初期濃度のＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性を有する。有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせは、組成物を第１の時点から第１の時点の７日後である第２の時点まで２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にする。ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性は、非律速濃度のＡＴＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを用いる、ｐＨ７．７５での生物発光カップルアッセイにおいて測定される。上記方法の任意の実施形態において、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせは、組成物を第１の時点から第１の時点の２８日後である第２の時点まで２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にし得る。当該方法の上記実施形態のいずれかにおいて、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせは、組成物を第１の時点から第２の時点まで２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９５％以上を保持することを可能にし得る。

「含む（comprises）」という用語及びその変形は、これらの用語が本明細書及び特許請求の範囲において現れる場合、限定的な意味を有しない。

本明細書において使用される「ａ（１つの）」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つ」、及び「１つ以上」は、互換的に使用される。したがって、例えば、１つの緩衝試薬は、「１つ以上の」緩衝試薬を意味すると解釈することができる。

「及び／又は」という用語は、列挙された要素のうちの１つ若しくはすべて、又は、列挙された要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。

また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数が含まれる（例えば１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、などを含む）。

上記の発明の概要は、本発明の開示する各実施形態又はすべての実装形態について説明することを意図したものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に示す。本出願全体を通していくつかの箇所で、例の一覧によって指針が提供され、これらの例は、様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合も、記載する一覧は、代表的な群としての役割のみを果たすものであり、排他的な一覧と解釈されるべきではない。

上記その他の実施形態の追加の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載する。他の特徴、目的及び利点は本明細書からも、そして特許請求の範囲からも明らかになるであろう。

本開示のいずれかの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されるか、又は以下の図面に例示される構成の詳細及び構成要素の配置に、その適用が限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な態様で実施又は実行することができる。また、本明細書で使用される専門語句及び専門用語は説明を目的としたものであり、発明を限定するものとして見なされるべきものではない点は理解されるべきである。本明細書における「含む（including）」、「備える、含む（comprising）」、又は「有する（having）」、及びこれらの変形の使用は、以下に挙げる項目及びその均等物並びに追加の項目を包含することが意図される。

今回、本開示の水性組成物は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びＡＴＰ源と組み合わせて、試料中の生きた微生物を検出できることがわかった。試料中に微生物が存在する場合、微生物細胞が破壊され、破壊された細胞に関連するＡＴＰが生物発光酵素的反応で検出される前に、「遊離」ＡＴＰを試料から除去するのに水性組成物を使用することができる。驚くべきことに、組成物は、少なくとも４週間の期間、周囲温度又はそれよりも低温での保管後に、初期アピラーゼ活性の少なくとも９０％を保持することができる。

本開示は、キットを提供する。任意の実施形態において、キットは、生存可能な微生物に関連するＡＴＰを検出するために使用できる。キットは、本明細書に開示する構成要素、及び任意に、当該構成要素の使用説明書を含む。キットは、約６．０〜約７．２のｐＨを有する水性組成物を含み、当該組成物は、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む。

本開示の水性組成物は、試料（例えば、乳）中の微生物ＡＴＰを検出する方法に使用できる。水性組成物は、非微生物ＡＴＰを含み得る試料と混合（例えば、希釈）される。それ故、非細胞（非微生物）ＡＴＰは、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの作用により試料から除去される。その後、微生物は（試料中に存在する場合）、溶解され、当該技術分野において既知の検出方法（例えば、ＡＴＰ依存性生物発光）を使用して、検出できる。

したがって、本開示の水性組成物は、試料と混合したときに、比較的短い期間内（例えば、数時間未満、１時間未満、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、２分以下、１分以下、１分未満）で、試料中のＡＴＰを加水分解するのに有効であるような量（例えば、濃度）のＡＴＰジホスホヒドロラーゼを含む。それ故、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの「有効量」は、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼが使用される方法（例えば、非微生物ＡＴＰを検出する方法）におけるＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの機能に関連する。

水性組成物のポリオール、緩衝試薬、及び／又はタンパク質も、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼが使用される方法において機能を有し得るが、本明細書で使用するとき、ポリオール、緩衝試薬、及びタンパク質の「有効量」は、具体的には、水性組成物の保管中（例えば、触媒反応でＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性を使用する前）にＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性を保存する際のその役割に関連する。水性組成物のポリオール、緩衝液、及び／又はタンパク質構成成分の活性保存効果は、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ含有水性組成物を周囲温度（例えば、約２５℃）、周囲温度を上回る温度、又は周囲温度を下回る温度で保管することを可能にする。

本開示の水性組成物は、有効量の少なくとも１種の緩衝試薬を含む。任意の実施形態において、緩衝試薬は、水性組成物の（室温における）ｐＨを約６．０〜約７．２に維持するために使用される。任意の実施形態において、緩衝試薬は、水性組成物の（室温における）ｐＨを約６．８〜約７．２に維持するために使用される。任意の実施形態において、緩衝試薬は、水性組成物の（室温における）ｐＨを約６．９〜約７．１に維持するために使用される。緩衝試薬は、上記ｐＨで水溶液を緩衝するための約６〜８のｐＫａを有する任意の好適な緩衝化合物又は上記化合物の混合物であることができるが、ただし、緩衝試薬は、当該試薬が有効濃度（すなわち、ｐＨを維持すのに適した濃度）で水性組成物中に存在するとき、実質的にＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性を阻害しない。好ましくは、水性組成物中、操作濃度において、緩衝試薬は、水性組成物がルシフェラーゼ酵素と接触したときに、ルシフェラーゼ酵素活性も実質的に阻害しない。好適な緩衝試薬の例としては、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（「ＨＥＰＥＳ」）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（「Ｔｒｉｓ」）、コハク酸、ホスフェート、トリシン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、上記緩衝試薬のいずれかの塩、及び上記緩衝試薬のうち任意の２つ以上の混合物が挙げられる。任意の実施形態において、水性組成物は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、及びスクシネート緩衝試薬を含む。任意の実施形態において、少なくとも１種の緩衝試薬が、水性組成物中に約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で存在する。

任意の実施形態において、水性組成物の室温（すなわち、約２５℃）におけるｐＨは、約６．０〜約７．２である。任意の実施形態において、水性組成物の室温におけるｐＨは、６．０〜７．２である。任意の実施形態において、水性組成物の室温におけるｐＨは、約６．４〜約７．０である。任意の実施形態において、水性組成物の室温におけるｐＨは、約７．０である。

本開示の水性組成物は、有効量のポリオールを含む。スクロース及びソルビトールのようなポリオールは、凍結保存中の筋原線維タンパク質の機能特性保存に有効であることが知られている。本開示の水性組成物への使用に好適なポリオールとしては、限定するものではないが、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、及びこれらの混合物が挙げられる。タンパク質を安定化するためのポリオールの有効量は、当該技術分野において既知である。任意の実施形態において、ポリオールはソルビトールである。任意の実施形態において、ソルビトールは、水性組成物中に約１モル／リットル〜約１．６モル／リットルの濃度で存在する。

本開示の水性組成物は、ＡＴＰの加水分解を触媒してＡＭＰ及び無機ホスフェートを生成するＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）酵素を含む。任意の実施形態において、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素は、ジャガイモ抽出物に由来する。有利なことに、水性組成物のその他の特徴（例えば、ｐＨ、緩衝試薬、ポリオール、タンパク質）は、協奏的に作用して、０℃を上回る温度においてＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性を長期間（例えば、１週間超、２週間超、３週間超、４週間超）安定化する。「ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性を安定化する」とは、本明細書で使用するとき、一定量のＡＴＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを用いたカップル酵素アッセイを用いて活性を測定したときに、０℃超での保管前に水性組成物中に存在した初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の少なくとも９０％が、保管期間後に水性組成物に残ることを意味する。

ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性成分は、細胞外ＡＴＰからＡＭＰ及び無機ホスフェートへの素早い（例えば、１５分以内の）分解を触媒するために有用な濃度で水性組成物中に存在する。しかしながら、好ましくは、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性成分は、ｐＨ７．７５でのルシフェラーゼ／ルシフェリン反応における細胞外ＡＴＰの測定を実質的に阻害しない濃度で水性組成物中に存在する。任意の実施形態において、本開示の水性組成物中のＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性成分の濃度は、約２５０ユニット／リットル〜約２５００ユニット／リットルである。任意の実施形態において、本開示の水性組成物中のＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性成分の濃度は、約６００ユニット／リットル〜約１２００ユニット／リットルである。

本開示の水性組成物は、有効量のタンパク質を含む。タンパク質は、水性組成物中に存在するＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素とは異なる。タンパク質は、０℃を上回る温度でＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性を安定化する機能がある。本開示の水性組成物への使用に好適なタンパク質の非限定的な例としては、血清アルブミン及び精製コラーゲン（例えば、シグマアルドリッチ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）の商標名で販売されている精製コラーゲン）が挙げられる。任意の実施形態において、水性組成物は血清アルブミンを含む。任意の実施形態において、本開示の水性組成物におけるタンパク質（例えば、血清アルブミン）の有効量は、１００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌである。

任意の実施形態において、本開示のキットは、任意に所定量の体細胞抽出剤を含む。体細胞抽出剤は、体細胞（すなわち、例えば、哺乳類細胞及び植物細胞のような非微生物細胞）の溶解を引き起こすために使用できる。キットの任意の実施形態において、体細胞抽出剤は、水性組成物から分離された（すなわち、異なる一次容器に入った）キットで提供されてもよく、又はキットは、有効量の体細胞抽出剤を水性組成物中に備えてもよい。水性組成物とは別に提供される場合、体細胞抽出剤は、粉末又は液体形態で提供されてもよく、そのいずれかが、部分的又は全体的に、水性組成物と混合されて、有効量の体細胞抽出剤を水性組成物に提供してもよい。

任意の実施形態において、体細胞抽出剤は、非イオン性界面活性剤を含んでもよい。好適な体細胞抽出剤の例としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテル、及びこれらの混合物が挙げられる。

本開示の水性組成物の任意の実施形態において、組成物は、有効量の殺微生物剤（例えば、アジド化合物）を含まない。有効量の殺微生物剤化合物は、溶液中の微生物の増殖を防止するために一般的に水溶液に使用される。しかしながら、有効量の殺微生物剤化合物が本開示の水性組成物中に存在した場合、その水性組成物は、試料中の微生物ＡＴＰを検出する方法の特定の実施形態（例えば、試料を微生物細胞抽出剤で処理して微生物細胞からＡＴＰ放出を引き起こす前に、「遊離」又は「体細胞」ＡＴＰがＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性で処置される方法の実施形態）における使用の効果がなくなる可能性がある。

本開示の水性組成物の任意の実施形態において、組成物は、タンパク質中のジスルフィド結合を低減できるチオール又はメルカプタンを含む化合物の有効量を含まない。チオール含有化合物（例えば、ジチオトレイトール、ジチオエリスリトール）及びメルカプタン（例えば、２−メルカプトエタノール）は、特定の酵素（例えば、プロテアーゼ）の活性を安定化するために水溶液に使用される。それ故、任意の実施形態において、本開示の水性組成物は、有効量のジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、又はβ−メルカプトエタノールを含まない。

任意の実施形態において、本開示のキットは、任意に、ルシフェラーゼ酵素活性成分を含む。任意の実施形態において、ルシフェラーゼ酵素活性成分は、水性組成物から分離されていても（すなわち、別の一次容器内にあっても）よい。ルシフェラーゼ酵素活性成分は、凍結乾燥形態で提供されてもよく、例えば、それが使用前に再水和されてもよい。

任意の実施形態において、本開示のキットは、任意に、微生物（例えば、細菌）細胞抽出剤を含む。細菌細胞抽出剤を、本開示の水性組成物と共に、試料中の微生物ＡＴＰを検出するための方法に使用してもよい。好適な微生物細胞抽出剤の例としては、限定するものではないが、第四級アンモニウム化合物（例えば、セチルトリメチル臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチル臭化アンモニウム（ＤＴＡＢ））又はカチオン性ポリビグアニド化合物（例えば、クロルヘキシジン又はその塩）が挙げられる。任意の実施形態において、微生物細胞抽出剤は、グルコン酸クロルヘキシジンを含む。任意の実施形態において、細菌細胞抽出剤は、非イオン性洗剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｎ−６０）を更に含み、これは、カチオン性細胞抽出剤と組み合わせたときに細胞抽出を促進し得る。

別の態様において、本開示は方法を提供する。この方法を使用して、０℃超で少なくとも７日間保管された水性組成物において初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性の９０％以上を保持することができる。上記方法は、本開示のいずれかの実施形態の水性組成物（上記組成物は、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ（それぞれ本明細書の開示による）を含む）を形成する工程と、上記組成物を１〜２５℃で少なくとも７日間保管する工程と、を含む。ｐＨと有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼとの組み合わせは、組成物を第１の時点から第１の時点の少なくとも７日後である第２の時点まで、約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にし、ここでＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性は、非律速濃度のＡＴＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを用いた、ｐＨ７．７５での生物発光カップルアッセイで測定される。ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性を測定するための代表的な生物発光カップルアッセイ（「ＡＴＰアッセイ」）を本明細書の実施例２に記載する。

方法の任意の実施形態において、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせは、組成物を第１の時点から第１の時点の１４日後である第２の時点まで、約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にする。方法の任意の実施形態において、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせは、組成物を第１の時点から第１の時点の２１日後である第２の時点まで、約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にする。方法の任意の実施形態において、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせは、組成物を第１の時点から第１の時点の２８日後である第２の時点まで、約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にする。方法の任意の実施形態において、ｐＨと有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼとの組み合わせは、組成物を第１の時点から第２の時点まで約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９５％以上を保持することを可能にし、ここで、第２の時点は、第１の時点の７日、１４日、２１日、又は２８日後である。

別の態様において、本開示は方法を提供する。当該方法は、試料中の細菌ＡＴＰを定量するために使用できる。当該方法は、試料を、本明細書に開示するいずれかの実施形態の水性組成物と組み合わせて、第１の混合物を形成する工程（上記水性組成物は、約６．９〜約７．１のｐＨを有する）と、上記第１の混合物を、第１の期間にわたって所定の温度に保持する工程と、第１の混合物を、細菌細胞抽出剤、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及び緩衝試薬と組み合わせて、ｐＨが約７．７５の第２の混合物を形成する工程と、ルシフェラーゼに触媒された生物発光反応を測定する工程と、を含む。

方法の任意の実施形態において、試料は水性試料を含むことができる。好ましい実施形態において、試料は乳（例えば、生乳）を含む。

任意の実施形態において、方法に使用される組成物は、約６．８〜約７．２のｐＨを有する。試料を水性組成物と組み合わせて第１の混合物を形成した後、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼが試料中に存在するいかなるＡＴＰも加水分解できるように、第１の混合物をある期間（例えば、約１分、約２分、約３分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分）にわたって所定の温度（例えば、周囲温度）に保持する。

任意の実施形態において、試料を水性組成物と組み合わせて第１の混合物を形成する工程は、任意に、有効量の体細胞抽出剤を含む第１の混合物を形成することを含む。体細胞抽出剤は、第１の混合物に別途添加されてもよく、又は本明細書に記載のように、試料中に提供されるか若しくは水性組成物中に提供されてもよい。体細胞抽出剤は、本明細書に記載のように、試料を細菌細胞抽出剤と接触させる前に、体細胞（すなわち、例えば、哺乳類細胞及び植物細胞のような非微生物細胞）の溶解を引き起こすために使用できる。

第１の混合物を第１の期間保持した後、第１の混合物を細菌細胞抽出剤、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及び緩衝試薬と組み合わせて、約７．７５のｐＨを有する第２の混合物を形成する。いったん第２の混合物が形成されると、細菌は、試料中に存在する場合、溶解され、そのＡＴＰが放出される。放出された細菌ＡＴＰは、当該技術分野において既知の生物発光反応においてルシフェラーゼ及びルシフェリンと反応し得る。反応は、照度計を用いて観測して、試料中の細菌ＡＴＰの量を判定することができる。

例示的な実施形態
実施形態Ａは、
約６．０〜約７．２のｐＨを有する水性組成物を含み、当該組成物が、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む、キットである。

実施形態Ｂは、体細胞抽出剤を更に含む、実施形態Ａに記載のキットである。

実施形態Ｃは、組成物が有効量の殺微生物化合物を含まない、実施形態Ａ又は実施形態Ｂに記載のキットである。

実施形態Ｄは、殺微生物化合物がアジド部分を含む、実施形態Ｃに記載のキットである。

実施形態Ｅは、組成物が有効量のジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、又はβ−メルカプトエタノールを含まない、実施形態Ａ〜Ｄのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｆは、ルシフェラーゼ酵素活性成分を更に含む、実施形態Ａ〜Ｅのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｇは、ルシフェラーゼ酵素活性成分が水性組成物から分離されている、実施形態Ｆに記載のキットである。

実施形態Ｈは、水性組成物のｐＨが約６．４〜約７．０である、実施形態Ａ〜Ｇのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｉは、ポリオールが、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、及びこれらの混合物からなる群から選択される、実施形態Ａ〜Ｈのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｊは、ポリオールがソルビトールを含む、実施形態Ｉに記載のキットである。

実施形態Ｋは、ソルビトールが、水性組成物中に、約１モル／リットル〜約１．６モル／リットルの濃度で存在する、実施形態Ｊに記載のキットである。

実施形態Ｌは、水性組成物が、有効量の体細胞抽出剤を含む、実施形態Ａ〜Ｋのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｍは、体細胞抽出剤が非イオン性界面活性剤を含む、実施形態Ａ〜Ｌのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｎは、体細胞抽出剤が、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル及びポリエチレングリコールモノアルキルエーテルからなる群から選択される、実施形態Ｍに記載のキットである。

実施形態Ｏは、緩衝試薬がＨＥＰＥＳとＴｒｉｓスクシネートとの混合物を含む、実施形態Ａ〜Ｎのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｐは、緩衝試薬が水性組成物中に約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で存在する、実施形態Ａ〜Ｏのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｑは、タンパク質が血清アルブミン及び精製コラーゲンからなる群から選択される、実施形態Ａ〜Ｐのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｒは、タンパク質が、水性組成物中に、約１００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態Ａ〜Ｑのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｓは、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼがジャガイモの抽出物に由来する、実施形態Ａ〜Ｒのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｔは、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼが水性組成物中に約２５０ユニット／リットル〜約２５００ユニット／リットルの濃度で存在する、実施形態Ａ〜Ｓのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｕは、細菌細胞抽出剤を更に含む、実施形態Ａ〜Ｔのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態Ｖは、細菌細胞抽出剤がグルコン酸クロルヘキシジンを含む、実施形態Ｕに記載のキットである。

実施形態Ｗは、０℃超で少なくとも７日間保管された水性組成物において初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性の９０％以上を保持する方法であって、
約６．０〜７．２のｐＨを有し、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む、水性組成物を形成する工程と、
上記水性組成物を１〜２５℃の温度で少なくとも７日の期間保管する工程と、を含み、
上記水性組成物は、第１の時点で、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性を有し、
上記ｐＨと有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼとの組み合わせは、組成物を第１の時点から第１の時点の少なくとも７日後である第２の時点まで、約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にし、
上記ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性は、非律速濃度のＡＴＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを用いる、ｐＨ７．７５での生物発光カップルアッセイにおいて測定される、方法である。

実施形態Ｘは、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせが、組成物を第１の時点から第１の時点の１４日後である第２の時点まで、約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にする、実施形態Ｗに記載の方法である。

実施形態Ｙは、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせが、組成物を第１の時点から第１の時点の２１日後である第２の時点まで約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にする、実施形態Ｗに記載の方法である。

実施形態Ｚは、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの組み合わせが、組成物を第１の時点から第１の時点の２８日後である第２の時点まで約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にする、実施形態Ｗに記載の方法である。

実施形態ＡＡは、ｐＨと有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼとの組み合わせが、組成物を第１の時点から第２の時点まで約２５℃で保持した後に、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９５％以上を保持することを可能にする、実施形態Ｗ〜Ｚのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態ＡＢは、
約６．０〜７．２のｐＨを有する水性組成物を含むキットであって、当該組成物は、有効量のソルビトール、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓスクシネート、血清アルブミン、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性成分を含む、キットである。

実施形態ＡＣは、水性組成物中のソルビトールの有効量が約１．３Ｍであり、ＨＥＰＥＳ緩衝液の有効量が約１ｍＭであり、Ｔｒｉｓスクシネートの有効量が約１ｍＭであり、血清アルブミンの有効量が約２３０ｍｇ／Ｌであり、ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性成分の有効量が約６００〜１２００ユニット／リットルである、実施形態ＡＢに記載のキットである。

実施形態ＡＤは、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテルを更に含む、実施形態ＡＢ又は実施形態ＡＣに記載のキットである。

実施形態ＡＥは、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテルの有効量が約０．０９重量％である、実施形態ＡＤに記載のキットである。

実施形態ＡＦは、試料中の細菌ＡＴＰを定量する方法であって、
試料及び水性組成物を含む第１の混合物を形成する工程であって、上記水性組成物が約６．８〜約７．２のｐＨを有し、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む、工程と、
上記第１の混合物を、第１の期間にわたって所定の温度に保持する工程と、
第１の混合物を、細菌細胞抽出剤、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及び緩衝試薬と組み合わせて、ｐＨが約７．７５の第２の混合物を形成する工程と、ルシフェラーゼに触媒された生物発光反応を測定する工程と、を含む方法である。

実施形態ＡＧは、第１の混合物を形成する工程が、有効量の体細胞抽出物を含む第１の混合物を形成する工程を更に含む、実施形態ＡＦに記載の方法である。

実施形態ＡＨは、上記水性混合物が、有効量の体細胞抽出剤を含む、実施形態ＡＧに記載の方法である。

本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に、本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。特に指示がない限り、すべての部及び割合は重量に基づき、すべての水は蒸留水であり、すべての分子量は重量平均分子量である。

材料

参照実施例１
２５℃で様々な期間保管した後の凍結乾燥ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性の安定性

アピラーゼの長期保管の最新技術は、酵素を凍結乾燥することである。可能な場合、凍結乾燥酵素は４℃以下で保管されるが、場合によっては参照実施例に示すように、周囲温度（２５℃）で保管される可能性がある。凍結乾燥ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ；品番６２０５８３５４；３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）のバイアルを、表２に示す期間、室温で保管した。それぞれの時点（周囲温度での保管の初日に起こる時点「１」、周囲温度での保管の６〜７日後に起こる時点「２」、周囲温度での保管の１４〜１５日後に起こる時点「３」、周囲温度での保管の２１〜２２日後に起こる時点「４」、周囲温度での保管の２８〜２９日後に起こる時点「５」）において、バイアルの１つを製造業者の指示に従って再構成した。再構成した酵素を、下記のＡＴＰアッセイに使用した。ＲＬＵ／秒は、本明細書に記載のように測定した。「残存率（％）」は、凍結乾燥酵素を周囲温度でそれぞれの期間保管した後に残存する初期（時点「１」）アピラーゼ酵素活性に対するパーセンテージを指す。

結果は、凍結乾燥アピラーゼ酵素が、周囲温度で少なくとも約４週間安定であることを示す。

実施例１．ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む水性組成物（ｐＨ７．０）

アピラーゼ（ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ）を含む水性組成物を、表３に示す成分を室温で混合することによって作製した。得られた溶液のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨを用いて７．０に調節した。得られた水性組成物を密封ステリリン容器に入れ、周囲温度（２５℃）で保管した。

比較例１．
ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む水性組成物（ｐＨ７．７５）

アピラーゼ（ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ）を含む水性組成物を、表３に示す成分を室温で混合することによって作製した。得られた溶液のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨを用いて７．７５に調節した。得られた水性組成物を密封ステリリン容器に入れ、周囲温度（２５℃）で保管した。

２５℃で保管した水性組成物中のＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼの安定性

周囲温度で表４に示す期間保管した後、各容器（すなわち、実施例１及び比較例１、並びに参照実施例１）からアリコートを取り出し、下記のＡＴＰアッセイに使用した。

ＡＴＰアッセイ：

ＬＬ１のバイアルを、製造業者の指示に従って再構成した。６００マイクロリットルの再構成ＬＬ１を、５０マイクロリットルの水性アピラーゼ組成物（すなわち、実施例１又は比較例１の組成物）及び５０マイクロリットルの１０^−７Ｍ ＡＴＰと、キュベット内（２５℃）で混合することによって、アピラーゼ活性を判定するための別の試験試料を調製した。試料調製直後、アピラーゼ活性を、キュベット内で、ＡＴＰ崩壊速度を照度計で８分間追跡することによって測定した。結果を、１秒当たりの相対発光単位（ＲＬＵ／秒）として記録した。各逐次的な時点において、ＲＬＵ／秒が、開始時点（「時点１」）と比較して相対的に高い数値であることは、保管中に初期アピラーゼ酵素活性がより多く残存することを示す。時点「１」において、個々の水性組成物（実施例１及び比較例１）を作製した日と同じ日に、アピラーゼ活性を試験するための個別試料を（上記のように）調製及び試験した。時点「２」において、６〜７日間エージングした水性組成物中のアピラーゼ活性を（上記のように）試験するため、アピラーゼ活性試験用の各５０マイクロリットルの試料をステリリン容器から取り出した。時点「３」において、１４〜１５日間エージングした水性組成物中のアピラーゼ活性を（上記のように）試験するため、アピラーゼ活性試験用の各５０マイクロリットルの試料をステリリン容器から取り出した。時点「４」において、２１〜２２日間エージングした水性組成物中のアピラーゼ活性を（上記のように）試験するため、アピラーゼ活性試験用の各５０マイクロリットルの試料をステリリン容器から取り出した。時点「５」において、２８〜２９日間エージングした水性組成物中のアピラーゼ活性を（上記のように）試験するため、アピラーゼ活性試験用の各５０マイクロリットルの試料をステリリン容器から取り出した。結果を表４に示す。

データは、７．０のｐＨを有する水性組成物が、周囲温度での保管中に、７．７５のｐＨを有する類似組成物よりも有意に大きいＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性を保持したことを示す。

本明細書に引用したすべての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能な資料の完全な開示は、参照により組み込まれる。本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれている文献の開示との間に何らかの不整合が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。上記の発明を実施するための形態及び実施例は、理解を簡単にするためにのみ示した。そこから不必要な限定がないことを理解されたい。当業者には明らかな変形形態が、特許請求の範囲によって定義される本発明内に包含されるため、本発明は、図示及び記載する正確な詳細に限定されるものではない。

すべての項目名は、読み手の便宜のためのものであり、そのように指示がない限り、項目名に続く本文の意味を限定するために使用されるべきでない。

本明細書に例示的に記載する本発明は、本明細書に具体的に開示しない何らかの要素がなくても好適に実行することができる。したがって、例えば、本明細書ではいずれの場合も、「備える、含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting of）」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。用いた用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用したものであり、そのような用語及び表現を使用する際、図示及び記載する特徴又はその一部分の何らかの均等物を除外する意図はなく、クレームされる本発明の範囲内で様々な変形形態が可能であることが理解される。したがって、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって、本発明について具体的に開示したが、本明細書に開示する概念の修正形態及び変形形態を、当業者であれば用いることができ、そのような修正形態及び変形形態は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると見なされることを理解されたい。

Claims (20)

1. 約６．０〜約７．２のｐＨを有する水性組成物を含み、前記組成物が、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む、キット。
2. 体細胞抽出剤を更に含む、請求項１に記載のキット。
3. 前記組成物が、有効量の殺微生物化合物を含まない、請求項１又は２に記載のキット。
4. 前記組成物が、有効量のジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、又はβ−メルカプトエタノールを含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
5. ルシフェラーゼ酵素活性成分を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
6. 前記ルシフェラーゼ酵素活性成分が、前記水性組成物から分離されている、請求項５に記載のキット。
7. 前記水性組成物のｐＨが約６．４〜約７．０である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット。
8. 前記ポリオールが、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキット。
9. 前記ポリオールがソルビトールを含み、前記ソルビトールが、前記水性組成物中に約１モル／リットル〜約１．６モル／リットルの濃度で存在する、請求項８に記載のキット。
10. 前記水性組成物が、有効量の前記体細胞抽出剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキット。
11. 前記体細胞抽出剤が、非イオン性界面活性剤を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
12. 前記体細胞抽出剤が、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル及びポリエチレングリコールモノアルキルエーテルからなる群から選択される、請求項１１に記載のキット。
13. 前記緩衝試薬が、ＨＥＰＥＳとＴｒｉｓスクシネートとの混合物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキット。
14. 前記緩衝試薬が、前記水性組成物中に約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキット。
15. 前記タンパク質が、血清アルブミン及び精製コラーゲンからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
16. 前記ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼが、前記水性組成物中に約２５０ユニット／リットル〜約２５００ユニット／リットルの濃度で存在する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキット。
17. 細菌細胞抽出剤を更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
18. ０℃超で少なくとも７日間保管された水性組成物において初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ酵素活性の９０％以上を保持する方法であって、
    約６．０〜７．２のｐＨを有し、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む、水性組成物を形成する工程と、
    前記水性組成物を１〜２５℃の温度で少なくとも７日の期間保管する工程と、を含み、
    前記水性組成物は、第１の時点で、初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性を有し、
    前記ｐＨと前記有効量の前記ポリオール、前記緩衝試薬、前記タンパク質、及び前記ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼとの組み合わせは、前記組成物を前記第１の時点から前記第１の時点の少なくとも７日後である第２の時点まで約２５℃で保持した後に、前記初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９０％以上を保持することを可能にし、
    前記ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性は、非律速濃度のＡＴＰ、ルシフェリン、及びルシフェラーゼを用いる、ｐＨ７．７５での生物発光カップルアッセイにおいて約２５℃で測定される、方法。
19. 前記ｐＨと前記有効量の前記ポリオール、前記緩衝試薬、前記タンパク質、及び前記ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼとの前記組み合わせが、前記組成物を前記第１の時点から前記第２の時点まで約２５℃で保持した後に、前記初期ＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼ活性の９５％以上を保持することを可能にする、請求項１８に記載の方法。
20. 試料中の細菌ＡＴＰを定量する方法であって、
    試料及び水性組成物を含む第１の混合物を形成する工程であって、前記水性組成物が、約６．８〜約７．２のｐＨを有し、有効量のポリオール、緩衝試薬、タンパク質、及びＡＴＰ−ジホスホヒドロラーゼを含む、工程と、
    前記第１の混合物を、第１の期間にわたって所定の温度に保持する工程と、
    前記第１の混合物を、細菌細胞抽出剤、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及び緩衝試薬と組み合わせて、ｐＨが約７．７５の第２の混合物を形成する工程と、
    ルシフェラーゼに触媒された生物発光反応を測定する工程と、を含む方法。