CN100547388C - 一种抗干扰的食品细菌总数快速检测方法及试剂 - Google Patents

一种抗干扰的食品细菌总数快速检测方法及试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗干扰的食品细菌总数快速检测方法及试剂。首先参照国标法将食品样品分散成合适样品溶液后，加入非细菌ATP消去剂来消除体细胞ATP、游离ATP等对检测的干扰，再依次加入细菌ATP提取剂和生物发光剂后进行ATP发光检测；同时进行ATP标准溶液的发光检测来获得ATP浓度与其发光值的对数关系；最后结合食品样品的发光值来推算出样品的ATP浓度及细菌总数含量。本发明的优点在于，完全使用化学试剂来消除非细菌ATP的干扰，无需增菌或过滤过程，操作简便，检测速度快，灵敏度高，检测范围宽且检测成本低，适合用于食品原料、成品及加工器具表面等的细菌总数快速检测与食品质量控制。

Description

一种抗干扰的食品细菌总数快速检测方法及试剂
技术领域
本发明属于微生物检测领域，涉及食品卫生质量控制，尤其涉及一种用于食品细菌总数的抗干扰快速检测方法及试剂。
背景技术
细菌总数是大多数食品卫生质量中的必检微生物指标，可以用来衡量食品被细菌污染的程度，食用细菌总数超标的食品可能对人体健康造成危害。然而，现有的食品细菌总数检测主要依赖于国家标准GB/T4789-2003中规定的食品卫生微生物检验方法进行，该方法需要对微生物进行培养24小时以上，操作繁琐，检测周期长，需要专业技术人员进行操作，检测结果也明显滞后，远远无法满足食品企业和食品卫生质量监督机构快速获取食品微生物信息的需求。因此，研制开发一种快速、灵敏、简便的细菌总数检测方法及试剂，在食品卫生质量控制中具有重大的需求及现实意义。
三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法是目前认为最为快速的微生物检测方法，该法是基于ATP和荧光素、荧光素酶反应产生荧光的强度与其浓度在一定范围内呈线性关系这一原理，检测过程无需培养，操作简便，重现性好，数分钟内即可得到检测结果。而ATP是生物活动的能量物质，Levin等研究表明各生长时期的细菌均有大致相同且常态下稳定的ATP含量(平均为3×10-16g)，依据ATP生物荧光法检测细菌ATP含量，可以实现细菌总数的快速检测。但大多食品成分较为复杂，其中大量体细胞和游离ATP的存在极大地干扰了细菌中ATP的检测，使得ATP生物荧光法的灵敏度往往达不到食品卫生质量检测的要求。国外从20世纪80年代中期就开始使用ATP生物荧光法对微生物进行检测计数，并在20世纪90年代中期研制出了成套的生物发光检测装置和试剂盒，但检测成本较高，不适合在国内普及推广。近年来，国内许多研究单位也开始了相关研究，如CN1730664公开了一种细菌总数快速检测试剂，使用时需要配合相应的过滤比色杯进行过滤，操作复杂；CN1680804公开了一种微生物抗干扰快速检测方法，需要结合不同培养基对样品进行液体大样法或最近似数法增菌，操作较为复杂且检测时间较长，并不适合用于食品质量的快速检测与现场监督。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗干扰的食品微生物快速检测方法。
本发明的又一目的在于提供一种用于上述检测方法的试剂。
为实现上述目的，本发明提供的检测方法，扩大目前ATP生物荧光法在食品卫生质量控制中的应用，通过消除食品样品中大量非细菌ATP对测定体系的影响，提供适合于食品细菌总数快速检测的方法及试剂，简化抗干扰的操作过程，显著提高检测的灵敏度并缩短检测所需的时间。
具体地说，本发明提供的抗干扰的食品细菌总数快速检测方法，其操作如下：
a)首先参照国标法对食品样品进行取样并制备成合适的样品溶液后，消除该溶液中的非细菌三磷酸腺苷；
b)在步骤a溶液中依次加入提取细菌细胞三磷酸腺苷的提取剂和生物发光剂后进行三磷酸腺苷发光检测；
c)同时进行三磷酸腺苷标准溶液的发光检测以获得三磷酸腺苷浓度与其发光值的对数关系；
d)依据食品样品的发光值来推算出样品的三磷酸腺苷浓度及细菌总数含量。
本发明所提供的抗干扰的食品细菌总数快速检测方法，是通过用非细菌ATP消去剂来消除体细胞ATP、游离ATP等对检测的干扰，并结合ATP生物荧光法来实现食品细菌总数的快速检测。检测过程无需对样品进行增菌或过滤，可大大缩短检测时间，30min内可完成对食品细菌总数的检测。
本发明提供的用于上述检测方法的试剂，包括：
用于消除食品样品溶液中的非细菌三磷酸腺苷的非细菌三磷酸腺苷消去剂、用于提取细菌细胞三磷酸腺苷的细菌三磷酸腺苷提取剂和生物发光剂三种组成；其中：
非细菌三磷酸腺苷消去剂按每毫升计，含有0.005～5mg的非离子表面活性剂、0.01～1mg的三磷酸腺苷降解酶、0.1～10mg的无机盐和20～200mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液；
三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH＝7.6-7.8；
细菌三磷酸腺苷提取剂按每毫升计，含有0.01～15mg的三氯乙酸、氯己定、十二烷基三甲基溴化铵、曲拉通(Triton X-100)、二甲亚砜(DMSO)中至少一种裂解试剂；0.1～5mg的环式糊精、吐温、乙二胺四乙酸、环己烯二胺四乙酸中至少一种中和试剂；以及20～200mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液；
生物发光剂按每毫升计，含有：0.01～5mg的荧光素、0.001～1mg的荧光素酶、2～20mM的可溶性无机镁盐、0.5～100mM的牛血清白蛋白、0.1～10mM的乙二胺四乙酸、0.05～9mM的二硫苏糖醇和20～500mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液；
三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液pH＝7.6-7.8。
所述的试剂，其中，非离子型表面活性剂是从脂肪醇聚氧乙烯(15)醚(AEO-15)、烷基酚聚氧乙烯(15)醚(OP-15)、辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100)、壬基酚聚氧乙烯(10)醚(NP-10)等聚乙二醇型，以及聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween 80)等多元醇型表面活性剂中至少选取一种组成。
所述的试剂，其中，三磷酸腺苷降解酶是从三磷酸腺苷双磷酸酶、焦磷酸酶、磷酸腺苷脱氨酶、己糖激酶、磷酸二酯酶等中至少选取一种组成。
生物发光剂是由荧光素、荧光素酶、可溶性无机镁盐、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇和Tris缓冲液(pH＝7.6-7.8)组成。生物发光剂中按每毫升计，含有：0.01～5mg的荧光素、0.001～1mg的荧光素酶、2～20mM的可溶性无机镁盐、0.5～100mM的牛血清白蛋白、0.1～10mM的乙二胺四乙酸、0.05～9mM的二硫苏糖醇和20～500mM的Tris缓冲液(pH7.8)。
本发明提供的抗干扰的食品细菌总数快速检测方法，与国家标准规定中采用的平板计数法相比，无需对微生物进行培养，具有检测速度快、操作简便、效率高、检测成本低等优点，适合于食品企业从生产原料到成品进行实时而有效的在线监控以及质量监督机构对食品卫生质量的现场监督。
本发明提供的细菌总数快速检测试剂，其应用并不局限于食品检测领域，它同时能应用在水处理、环境检测、纸制品和纸浆制造行业以及医学、法医学等领域的微生物检测上。
附图说明
图1是食品细菌总数的检测流程示意图；
图2是酸奶中细菌总数的检测结果。
具体实施方式
本发明提出了一种基于ATP生物荧光法原理用于食品细菌总数的抗干扰快速检测方法，其检测流程示意图见图1所示。
具体的检测方法为：首先参照国标GB/T4789-2003中规定的食品样品取样及前处理方法，将食品样品均质、分散或稀释成合适浓度的样品溶液。然后取出0.1mL的样品溶液置于试管中，加入0.05mL的非细菌ATP消去剂后稍加振荡后静置3～10min，让样品的体细胞ATP、游离ATP等非细菌ATP充分水解掉；然后加入0.05mL的细菌ATP提取剂来释放出细菌细胞中的ATP使其游离出来，再加入0.2mL生物发光剂后结合荧光探测仪进行ATP发光检测。同时，进行ATP标准溶液的发光检测来获得ATP浓度与其发光值对数关系的校正曲线；最后依据样品的发光值来推算出样品的ATP浓度及细菌总数含量。
非细菌ATP消去剂是由非离子表面活性剂、ATP降解酶、无机盐和Tris缓冲液组成。其中，非离子型表面活性剂，是从脂肪醇聚氧乙烯(15)醚(AEO-15)、烷基酚聚氧乙烯(15)醚(OP-15)、辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100)、壬基酚聚氧乙烯(10)醚(NP-10)等聚乙二醇型，以及聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween)等多元醇型表面活性剂中至少选取一种组成；ATP降解酶，是从三磷酸腺苷双磷酸酶、焦磷酸酶、磷酸腺苷脱氨酶、己糖激酶、磷酸二酯酶等中至少选取一种组成。
其制备过程为：取0.005～5g的非离子表面活性剂、0.01～1g的三磷酸腺苷降解酶和0.1～10g的无机盐溶解于20～200mM的Tris缓冲液(用盐酸或10％氢氧化钠调节pH为7.6-7.8左右)中，使其终体积为1L。这里，所有试剂均采用分析纯，mM是指一种浓度单位(即毫摩尔/升)。此释放剂可在室温条件下快速消除体细胞ATP、游离ATP等非细菌ATP对检测的干扰。其中，非离子表面活性剂的存在可对食品中的体细胞进行裂解，使体细胞中ATP游离出来；ATP降解酶则用来消耗游离的ATP，使ATP转化成对ATP生物荧光反应呈惰性的物质。
细菌ATP提取剂是由裂解试剂、中和试剂和Tris缓冲液(pH7.6)组成。具体而言，是由三氯乙酸、氯己定、十二烷基三甲基溴化铵、曲拉通(Triton X-100)等中至少一种裂解试剂；环式糊精、吐温、乙二胺四乙酸、环己烯二胺四乙酸中至少一种中和试剂；以及Tris缓冲液组成。
其制备过程为：取0.01～15g的裂解试剂和0.1～5g中和试剂溶解于20～200mM的Tris缓冲液(用盐酸或10％氢氧化钠调节pH为7.6左右)中，使其终体积为1L。所有试剂均采用分析纯。此释放剂可在室温条件下快速提取细菌细胞的ATP使其游离出来，从而为生物荧光反应提供可定量检测的ATP，同时使样品中剩余的ATP降解酶失活，从而ATP降解酶对细菌ATP不起作用。
生物发光剂是由荧光素、荧光素酶、可溶性无机镁盐、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇和Tris缓冲液(pH7.8)组成。其制备过程为：先将2～20mM的可溶性无机镁盐、0.5～100mM的牛血清白蛋白、0.1～10mM的乙二胺四乙酸和0.05～9mM的二硫苏糖醇溶解于20～1000mM的Tris缓冲液(用HCl或醋酸调节pH7.8)中，使溶液终体积为10mL；然后再加入0.1～50mg的荧光素和0.01～10mg的荧光素酶使其溶解，并对溶液进行分装、避光保存以备用。所有试剂均为分析纯。此生物发光剂为ATP生物荧光反应提供了必要的反应试剂和一些稳定、提高反应物活性的辅助试剂，可直接用于对样品中的游离ATP进行定量检测。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：
实施例1：酸奶中细菌总数的快速检测
优选了一套检测试剂，其组成及浓度如下所示。
非细菌ATP消去剂的组成：
曲拉通                    0.2mg/ml
三磷酸腺苷双磷酸酶        0.2mg/ml
氯化钠                    6mg/ml
细菌ATP提取剂的组成：
十二烷基三甲基溴化铵    0.08mg/ml
醋酸氯己定          0.16mg/ml
曲拉通              1mg/ml
环式糊精            0.5mg/ml
Tris-HCl(20mM)      pH7.8
生物发光剂的组成：
荧光素              0.8mg/mL
荧光素酶            0.036mg/mL
氯化镁              10mM
牛血清白蛋白        0.11mM
乙二胺四乙酸        2mM
二硫苏糖醇          1mM
Tris-HCl(100mM)     pH7.8
将以上非细菌ATP消去剂、细菌ATP提取剂和生物发光剂按所示浓度分别进行配制，得到一套检测试剂，再结合荧光检测仪来快速酸奶中的细菌总数。检测结果如图1所示，可以看出，荧光仪检测到的光强信号值与ATP浓度及样品中细菌总数之间均呈现出良好的线性关系。此外，该套试剂灵敏度较高，可用来检测细菌总数低于100cfu/mL的样品，因此可广泛用于食品生产过程的质量控制与食品质量的现场卫生监督上。
以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，如选用其它同性相关试剂、改变试剂浓度等方法均在本发明专利要求保护范围之内。

Claims (3)

1、一种抗干扰的食品细菌总数快速检测方法，其操作如下：
a)首先参照国家标准GB/T4789-2003对食品样品进行取样并制备成合适的样品溶液后，消除该溶液中的非细菌三磷酸腺苷；
用于消除非细菌三磷酸腺苷的消去剂按每毫升计，含有0.005～5mg的非离子表面活性剂、0.01～1mg的三磷酸腺苷降解酶、0.1～10mg的无机盐和20～200mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
b)在步骤a溶液中依次加入提取细菌细胞三磷酸腺苷的提取剂和生物发光剂后进行三磷酸腺苷发光检测；
所述细菌三磷酸腺苷的提取剂按每毫升计，含有0.01～15mg的三氯乙酸、氯己定、十二烷基三甲基溴化铵、曲拉通、二甲亚砜中至少一种裂解试剂；0.1～5mg的环式糊精、吐温、乙二胺四乙酸、环己烯二胺四乙酸中至少一种中和试剂；以及20～200mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
所述生物发光剂按每毫升计，含有：0.01～5mg的荧光素、0.001～1mg的荧光素酶、2～20mM的可溶性无机镁盐、0.5～100mM的牛血清白蛋白、0.1～10mM的乙二胺四乙酸、0.05～9mM的二硫苏糖醇和20～500mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
c)同时进行三磷酸腺苷标准溶液的发光检测以获得三磷酸腺苷浓度与其发光值的对数关系；
d)依据食品样品的发光值来推算出样品的三磷酸腺苷浓度及细菌总数含量；
所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH＝7.6-7.8。
2、如权利要求1所述抗干扰的食品细菌总数快速检测方法，其中，非离子型表面活性剂是从脂肪醇聚氧乙烯(15)醚、烷基酚聚氧乙烯(15)醚、辛基苯基聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯(10)醚以及聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中至少选取一种组成。
3、如权利要求1所述抗干扰的食品细菌总数快速检测方法，其中，三磷酸腺苷降解酶是从三磷酸腺苷双磷酸酶、焦磷酸酶、磷酸腺苷脱氨酶、己糖激酶、磷酸二酯酶中至少选取一种组成。
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