JP3043063B2 - 微生物のための沈澱テスト - Google Patents
微生物のための沈澱テストInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
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- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/805—Test papers
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/97—Test strip or test slide
Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、特定の酵素の存在により特徴ずけられる特
定の微生物または微生物群用の改良アッセイ法に関する
ものである。このアッセイは、ポリマーマトリックス内
にあるまたは固体担体表面上にある色素形成性基質を使
用する。該色素は該酵素により開裂された際に沈澱す
る。本発明は、更に色素形成性基質、ポリマー系および
固体担体を含む酵素検知デバイスをも包含する。
定の微生物または微生物群用の改良アッセイ法に関する
ものである。このアッセイは、ポリマーマトリックス内
にあるまたは固体担体表面上にある色素形成性基質を使
用する。該色素は該酵素により開裂された際に沈澱す
る。本発明は、更に色素形成性基質、ポリマー系および
固体担体を含む酵素検知デバイスをも包含する。
発明の背景 ヒト胃腸管疾患は様々な微生物に起因して起こる。感
染の共通の媒介物は汚染された食物および水である。こ
のような疾病の発生率を減ずるために、ヒトが消費する
ための食物および水の衛生上の品位が継続的にテストさ
れる。多数の異なる腸内病原体のテストに代わる、指標
生物の存在に対する実験室テスト法がある。大腸菌型の
細菌が、典型的には衛生上の品位の主な指標とし使用さ
れる。というのは、これらが温血動物の胃腸管に通常関
連しているからである。大腸菌型の細菌、特にエシェリ
ヒアコリ（Escherichia coli）の食品中における高率で
の存在は排泄物汚染があることを示唆し、かつヒトが消
費するには不適当であることを示している。
染の共通の媒介物は汚染された食物および水である。こ
のような疾病の発生率を減ずるために、ヒトが消費する
ための食物および水の衛生上の品位が継続的にテストさ
れる。多数の異なる腸内病原体のテストに代わる、指標
生物の存在に対する実験室テスト法がある。大腸菌型の
細菌が、典型的には衛生上の品位の主な指標とし使用さ
れる。というのは、これらが温血動物の胃腸管に通常関
連しているからである。大腸菌型の細菌、特にエシェリ
ヒアコリ（Escherichia coli）の食品中における高率で
の存在は排泄物汚染があることを示唆し、かつヒトが消
費するには不適当であることを示している。
大腸菌型の細菌は、ラクト−スを醗酵して酸性かつガ
ス状の最終生成物（CO2およびH2）にするその能力のた
めに、他の微生物および腸内細菌科のその類縁菌と区別
される。いくつかの非大腸菌型細菌はラクト−スを同一
の最終生成物に醗酵し得るが、大腸菌アッセイにおける
これら微生物の生育は、テストに使用した微生物学的培
地の選択性のために、通常最小化もしくは防止される。
ス状の最終生成物（CO2およびH2）にするその能力のた
めに、他の微生物および腸内細菌科のその類縁菌と区別
される。いくつかの非大腸菌型細菌はラクト−スを同一
の最終生成物に醗酵し得るが、大腸菌アッセイにおける
これら微生物の生育は、テストに使用した微生物学的培
地の選択性のために、通常最小化もしくは防止される。
典型的には、サンプル中の大腸菌型の細菌の存在は液
状の微生物学的育成培地に物質を添加し、得られる混合
物を細菌の生育を助長する温度でインキュベ−トするこ
とにより決定される。サンプルと育成培地との混合物の
インキュベ−トは重要である。というのは、このアッセ
イが該サンプルの低濃度の大腸菌型細菌による汚染を検
出し得る必要があるからである。該混合物のインキュベ
−トの結果、大腸菌型細菌は培養物1ml当たり約106〜10
8細胞なる密度にまで増殖され、ここで該細菌の存在は
多数の方法の何れかにより検出し得る。大腸菌型細菌の
検出に使用されている様々な液体微生物学的生育培地は
２つの共通する性質を有している。即ち、これらは二単
糖ラクト−スを含み、かつ非大腸菌型微生物の生育を選
択的に阻害する化学試薬を含む。選択は重要である。と
いうのは、サンプルが必ず様々な微生物を含んでおり、
また該アッセイの成功は非大腸菌型の細菌により過度の
成長が抑制されていることに依存するからである。
状の微生物学的育成培地に物質を添加し、得られる混合
物を細菌の生育を助長する温度でインキュベ−トするこ
とにより決定される。サンプルと育成培地との混合物の
インキュベ−トは重要である。というのは、このアッセ
イが該サンプルの低濃度の大腸菌型細菌による汚染を検
出し得る必要があるからである。該混合物のインキュベ
−トの結果、大腸菌型細菌は培養物1ml当たり約106〜10
8細胞なる密度にまで増殖され、ここで該細菌の存在は
多数の方法の何れかにより検出し得る。大腸菌型細菌の
検出に使用されている様々な液体微生物学的生育培地は
２つの共通する性質を有している。即ち、これらは二単
糖ラクト−スを含み、かつ非大腸菌型微生物の生育を選
択的に阻害する化学試薬を含む。選択は重要である。と
いうのは、サンプルが必ず様々な微生物を含んでおり、
また該アッセイの成功は非大腸菌型の細菌により過度の
成長が抑制されていることに依存するからである。
大腸菌アッセイは固体または液体培地の何れかを使用
して実施できる。固体培地を使用するアッセイは生菌数
の計数を可能とする。サンプルを固体培地に添加し、大
腸菌の明確なコロニ−を計数する。また、サンプルを液
状培地に添加することもできる。大腸菌群は特徴的な代
謝最終生成物の形成を通して検出される。この液体培地
形式は定性的または定量的の何れであってもよい。該固
体培地形式は、少量（例えば、1ml当たり10微生物未
満）の大腸菌群を含むサンプルまたはコロニ−の可視化
を不明確にする粒状物質（例えば、食物または乳製品）
を含むサンプルに対して好ましい。
して実施できる。固体培地を使用するアッセイは生菌数
の計数を可能とする。サンプルを固体培地に添加し、大
腸菌の明確なコロニ−を計数する。また、サンプルを液
状培地に添加することもできる。大腸菌群は特徴的な代
謝最終生成物の形成を通して検出される。この液体培地
形式は定性的または定量的の何れであってもよい。該固
体培地形式は、少量（例えば、1ml当たり10微生物未
満）の大腸菌群を含むサンプルまたはコロニ−の可視化
を不明確にする粒状物質（例えば、食物または乳製品）
を含むサンプルに対して好ましい。
ブロスまたは寒天中での大腸菌群のアッセイは２つの
別々の段階、即ち推定的（presumptive）および確認的
（confirmed）段階で行われる。まず、推定的アッセイ
は考えられる大腸菌群の存在の指標を与える。該確認段
階では、推定的に正の培養物または典型的なコロニ−を
第二のより選択的な培地で継代培養する。原理的には、
確認的培地は誤った正の結果を排除する。このアッセイ
の該２段階は完了までに48〜96時間を要する。従って、
当分野では時宜にかなった方法で、正確な結果を得るこ
とが要求されている。
別々の段階、即ち推定的（presumptive）および確認的
（confirmed）段階で行われる。まず、推定的アッセイ
は考えられる大腸菌群の存在の指標を与える。該確認段
階では、推定的に正の培養物または典型的なコロニ−を
第二のより選択的な培地で継代培養する。原理的には、
確認的培地は誤った正の結果を排除する。このアッセイ
の該２段階は完了までに48〜96時間を要する。従って、
当分野では時宜にかなった方法で、正確な結果を得るこ
とが要求されている。
一般に、検出は大腸菌型細菌の代謝経路の最終生成物
にもとずいている。例えば、大腸菌型細菌の酸の生成
は、一般に培地中にpH指示薬を配合することにより検出
している。酸の生成は液状培地、例えばクラ−クス（Cl
arke's）培地内のブロモクレゾ−ルパ−プル指示薬の紫
から黄色への色の変化により検出できる。酸産生はコロ
ニ−の形成により検出し得、該コロニ−の中央部は固体
培地、例えばバイオレットレッド胆汁寒天培地（VRBA）
およびマッコンキ−（MacConkey）寒天培地中の指示薬
ニュ−トラルレッドと該酸との反応により暗色となって
いる。
にもとずいている。例えば、大腸菌型細菌の酸の生成
は、一般に培地中にpH指示薬を配合することにより検出
している。酸の生成は液状培地、例えばクラ−クス（Cl
arke's）培地内のブロモクレゾ−ルパ−プル指示薬の紫
から黄色への色の変化により検出できる。酸産生はコロ
ニ−の形成により検出し得、該コロニ−の中央部は固体
培地、例えばバイオレットレッド胆汁寒天培地（VRBA）
およびマッコンキ−（MacConkey）寒天培地中の指示薬
ニュ−トラルレッドと該酸との反応により暗色となって
いる。
更に、ガス状最終生成物は通常液状培地中での気泡の
存在により検出される。この気泡は培養チュ−ブ内の小
さな倒立させた試験管または倒立させたバイアルもしく
は培養装置の特定の部分に捕集することができる。例え
ば、バイオコントロ−ルコリトラック（BioControl Col
iTrakTM）製品は培養装置の頂部に取りつけられたド−
ム内に気泡を捕集する。固体育成培地を含むペトリフィ
ルム（PetrifilmTM;3M）は細菌コロニ−の近接部分の気
泡を捕集する。あるいはまた、ガス状最終生成物は、水
素の電気化学的検出、放射性標識ラクト−スの醗酵によ
り遊離される14CO2の放射能検出、あるいは醗酵を通し
て生成される有機化合物のインピ−ダンス測定（impedi
metric）またはガスクロマトグラフィ−検出などの非可
視的手段により検出することも可能である。
存在により検出される。この気泡は培養チュ−ブ内の小
さな倒立させた試験管または倒立させたバイアルもしく
は培養装置の特定の部分に捕集することができる。例え
ば、バイオコントロ−ルコリトラック（BioControl Col
iTrakTM）製品は培養装置の頂部に取りつけられたド−
ム内に気泡を捕集する。固体育成培地を含むペトリフィ
ルム（PetrifilmTM;3M）は細菌コロニ−の近接部分の気
泡を捕集する。あるいはまた、ガス状最終生成物は、水
素の電気化学的検出、放射性標識ラクト−スの醗酵によ
り遊離される14CO2の放射能検出、あるいは醗酵を通し
て生成される有機化合物のインピ−ダンス測定（impedi
metric）またはガスクロマトグラフィ−検出などの非可
視的手段により検出することも可能である。
大腸菌群のもう一つの検出法は、代謝最終生成物では
なくむしろ大腸菌群関連酵素活性の検出にもとずくもの
である。一般に、酵素アッセイ法は時間のかかる培養テ
スト手法を利用した確認的結果に匹敵する大腸菌型細菌
の定量的評価を与え得る。酵素、β−ガラクトシダ−ゼ
はラクト−スの醗酵に利用される細菌酵素である。β−
ガラクトシダ−ゼはラクト−スを加水分解し、その構成
糖をグルコ−スとガラクト−スに分解する。大腸菌型細
菌は典型的にこの酵素を表現する。例えば、ワ−レン
（Warren）等のAppl.Environ.Microbiol.,1978,35,pp.1
36−41は大腸菌群のテスト法に係わり、該方法は水中に
おける排泄物大腸菌群を定量するために色素産生β−ガ
ラクトシダ−ゼ基質、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（ONPG）を使用している。ワ−レン（Warre
n）等の文献において、黄色の反応生成物ｏ−ニトロフ
ェノ−ル（ONP）の出現はテストサンプル中の大腸菌群
の初期濃度の逆数に関連している。
なくむしろ大腸菌群関連酵素活性の検出にもとずくもの
である。一般に、酵素アッセイ法は時間のかかる培養テ
スト手法を利用した確認的結果に匹敵する大腸菌型細菌
の定量的評価を与え得る。酵素、β−ガラクトシダ−ゼ
はラクト−スの醗酵に利用される細菌酵素である。β−
ガラクトシダ−ゼはラクト−スを加水分解し、その構成
糖をグルコ−スとガラクト−スに分解する。大腸菌型細
菌は典型的にこの酵素を表現する。例えば、ワ−レン
（Warren）等のAppl.Environ.Microbiol.,1978,35,pp.1
36−41は大腸菌群のテスト法に係わり、該方法は水中に
おける排泄物大腸菌群を定量するために色素産生β−ガ
ラクトシダ−ゼ基質、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（ONPG）を使用している。ワ−レン（Warre
n）等の文献において、黄色の反応生成物ｏ−ニトロフ
ェノ−ル（ONP）の出現はテストサンプル中の大腸菌群
の初期濃度の逆数に関連している。
製品、コリラ−ト（Colilert TM）（アクセスメディ
カル（Access Medical））では飲料水中の大腸菌群の検
出にONPG酵素指示薬を使用している。水のサンプルはON
PGを含有する基本生育培地を可溶化するために使用され
る。培地中で生育する細菌起原のβ−ガラクトシダ−ゼ
はONPGを加水分解して、ガラクト−スを生成し、これは
生育用の唯一の炭素源およびエネルギー源として機能す
る。ON生成は酵素活性を示す。24時間のインキュベ−ト
後の、10mlの液体培地全体に渡る黄色の存在は該水サン
プル中に大腸菌型細菌が存在することを示す。
カル（Access Medical））では飲料水中の大腸菌群の検
出にONPG酵素指示薬を使用している。水のサンプルはON
PGを含有する基本生育培地を可溶化するために使用され
る。培地中で生育する細菌起原のβ−ガラクトシダ−ゼ
はONPGを加水分解して、ガラクト−スを生成し、これは
生育用の唯一の炭素源およびエネルギー源として機能す
る。ON生成は酵素活性を示す。24時間のインキュベ−ト
後の、10mlの液体培地全体に渡る黄色の存在は該水サン
プル中に大腸菌型細菌が存在することを示す。
螢光発生β−ガラクトシダ−ゼ基質、フルオレセイン
−β−Ｄ−ガラクトシドはもう一つの活性測定用の指示
薬である。カンデル（Cundell）等はProc.Water Reuse
Symp.,1979,３,pp.1895−99において、該フルオレセイ
ン−β−Ｄ−ガラクトシドを含む培地中で大腸菌型細菌
をインキュベ−トするアッセイを提示している。大腸菌
型細菌はフロ−サイトメトリ−により定量的に測定され
る。該基質のフルオレセイン部分はβ−ガラクトシダ−
ゼによる開裂の後に該細胞内に濃縮され、紫外線の照射
下で該細胞に螢光を発せしめる。米国特許第4,242,447
号は螢光発生基質を使用した大腸菌群の評価用の螢光ア
ッセイを開示している。特に、該米国特許第4,242,447
号は、水サンプルと螢光発生基質とを油と共に乳化し
て、大腸菌型細菌含有油滴を形成する方法を開示してい
る。β−ガラクトシダ−ゼ活性は該螢光発生基質を開裂
し、螢光検出器により計数し得る螢光性油滴を形成す
る。カンデル（Cundell）等はDev.Ind.Microbiol.,197
9,20,pp.571−77において、顕微鏡スライド上に油−包
封細胞を生成する同様な技術を開示している。螢光性液
滴は螢光顕微鏡下で計数される。このカンデルの方法は
下水サンプルに対して利用されている。このカンデル法
の感度は105細胞/mlである。
−β−Ｄ−ガラクトシドはもう一つの活性測定用の指示
薬である。カンデル（Cundell）等はProc.Water Reuse
Symp.,1979,３,pp.1895−99において、該フルオレセイ
ン−β−Ｄ−ガラクトシドを含む培地中で大腸菌型細菌
をインキュベ−トするアッセイを提示している。大腸菌
型細菌はフロ−サイトメトリ−により定量的に測定され
る。該基質のフルオレセイン部分はβ−ガラクトシダ−
ゼによる開裂の後に該細胞内に濃縮され、紫外線の照射
下で該細胞に螢光を発せしめる。米国特許第4,242,447
号は螢光発生基質を使用した大腸菌群の評価用の螢光ア
ッセイを開示している。特に、該米国特許第4,242,447
号は、水サンプルと螢光発生基質とを油と共に乳化し
て、大腸菌型細菌含有油滴を形成する方法を開示してい
る。β−ガラクトシダ−ゼ活性は該螢光発生基質を開裂
し、螢光検出器により計数し得る螢光性油滴を形成す
る。カンデル（Cundell）等はDev.Ind.Microbiol.,197
9,20,pp.571−77において、顕微鏡スライド上に油−包
封細胞を生成する同様な技術を開示している。螢光性液
滴は螢光顕微鏡下で計数される。このカンデルの方法は
下水サンプルに対して利用されている。このカンデル法
の感度は105細胞/mlである。
細菌E.コリは、大腸菌型細菌とは別にアッセイし得る
一種の大腸菌である。存在するE.コリは排泄物汚染のよ
り信頼性の高い指標と考えられる。また、ある種のE.コ
リ菌株はヒトおよび動物の病原体である。標準的なE.コ
リ検出法ではECブロス中で正の推定的培養物を継代培養
し、45.5℃にてインキュベ−トする。ガス発生が正のEC
培養物を、次に識別寒天培地上で画線培養する。単離体
を生化学的特性化により同定する。
一種の大腸菌である。存在するE.コリは排泄物汚染のよ
り信頼性の高い指標と考えられる。また、ある種のE.コ
リ菌株はヒトおよび動物の病原体である。標準的なE.コ
リ検出法ではECブロス中で正の推定的培養物を継代培養
し、45.5℃にてインキュベ−トする。ガス発生が正のEC
培養物を、次に識別寒天培地上で画線培養する。単離体
を生化学的特性化により同定する。
E.コリは酵素β−グルクロニダ−ゼを有することか
ら、比較的特殊な微生物である。結局、螢光発生基質は
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グロクロニド
（MUG）が食品および水サンプル中のE.コリの検出に使
用される。このE.コリ検出法は、培養物を植えつけ、MU
Gの存在下に標準的方法でインキュベ−トすることから
なる。24時間のインキュベ−ト中に発生する螢光はE.コ
リの存在を示す。というのは、E.コリからのβ−グルク
ロニダ−ゼがMUGを螢光性生成物に開裂するからであ
る。かくして、このMUG含有培地の使用はE.コリの検出
時間を短縮することを可能とする。不幸にも、MUGは高
価な試薬であり、また大容量のサンプル、例えば水のサ
ンプルは大量のMUGの使用を必要とし、このテストを著
しく高価なものとする。一般に推奨されるMUGの濃度は
最終培養物1ml当たり50−100μｇである。食品および水
質テストのための典型的な容量はそれぞれ90および100m
lである。かくして、MUGの価格は食品テストおよびPA型
の水質テストのためには魅力のないものとしている。
ら、比較的特殊な微生物である。結局、螢光発生基質は
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グロクロニド
（MUG）が食品および水サンプル中のE.コリの検出に使
用される。このE.コリ検出法は、培養物を植えつけ、MU
Gの存在下に標準的方法でインキュベ−トすることから
なる。24時間のインキュベ−ト中に発生する螢光はE.コ
リの存在を示す。というのは、E.コリからのβ−グルク
ロニダ−ゼがMUGを螢光性生成物に開裂するからであ
る。かくして、このMUG含有培地の使用はE.コリの検出
時間を短縮することを可能とする。不幸にも、MUGは高
価な試薬であり、また大容量のサンプル、例えば水のサ
ンプルは大量のMUGの使用を必要とし、このテストを著
しく高価なものとする。一般に推奨されるMUGの濃度は
最終培養物1ml当たり50−100μｇである。食品および水
質テストのための典型的な容量はそれぞれ90および100m
lである。かくして、MUGの価格は食品テストおよびPA型
の水質テストのためには魅力のないものとしている。
それぞれ大腸菌群およびE.コリの存在を測定するため
の手段として、β−ガラクトシダ−ゼおよびβ−グルク
ロニダ−ゼ活性をアッセイすることができる。酵素検出
アッセイは醗酵最終生成物の検出に勝る利点を有する。
まず、酵素アッセイ法はより感度が高い。１つの酵素が
多くの基質分子を開裂する。１つの酵素により開裂され
る基質の各分子は螢光性または着色されたリポ−タ生成
物を生成する。従って、この信号は酵素により増幅され
る。ある種の基質を使用することにより、104程度の代
謝活性細胞が24時間以内に信号を成形できる。
の手段として、β−ガラクトシダ−ゼおよびβ−グルク
ロニダ−ゼ活性をアッセイすることができる。酵素検出
アッセイは醗酵最終生成物の検出に勝る利点を有する。
まず、酵素アッセイ法はより感度が高い。１つの酵素が
多くの基質分子を開裂する。１つの酵素により開裂され
る基質の各分子は螢光性または着色されたリポ−タ生成
物を生成する。従って、この信号は酵素により増幅され
る。ある種の基質を使用することにより、104程度の代
謝活性細胞が24時間以内に信号を成形できる。
これとは対照的に、24時間以内に可視性の気泡を形成
するには約107〜108個の代謝活性細胞を必要とする。と
いうのは、ラクト−スのβ−ガラクトシダ−ゼ開裂は、
代謝の生理的調節による化学量論的な量の酸およびガス
状最終生成物を生じないからである。該ラクト−ス中の
炭素の大部分は細胞バイオマス中に組み込まれ、醗酵中
の酸化NADの再生には利用されない。酸およびガス産生
の細菌起原の醗酵酵素は該醗酵過程の最終段階にあり、
厳密に調節されている。例えば、ピルベ−ト・フォルメ
−トリア−ゼは好気的条件下では不活性であり、培地が
嫌気性となった時にのみ活性化される。ガス産生におけ
るキ−酵素であるフォルメ−トデヒドロゲナ−ゼは酸素
の存在下では、あるいは培地のpHが６以上である場合に
は合成されない。ヒドロゲナ−ゼ活性および合成は別の
酸化剤、例えば酸素、硝酸塩および亜硝酸塩により受動
的に調節される。従って、嫌気生活、酸性pHおよび外部
酸化剤のない生育条件は、達成されないか、あるいはゆ
っくりと達成されるに過ぎない。更に、培地中の多くの
ラクト−スが、酸−およびガス−産生酵素が活性となる
時点で開裂される。従って、β−ガラクトシダ−ゼ用の
酵素アッセイは醗酵経路の調節の問題を回避し、各基質
開裂の発生毎にリポ−タ基を生成する。
するには約107〜108個の代謝活性細胞を必要とする。と
いうのは、ラクト−スのβ−ガラクトシダ−ゼ開裂は、
代謝の生理的調節による化学量論的な量の酸およびガス
状最終生成物を生じないからである。該ラクト−ス中の
炭素の大部分は細胞バイオマス中に組み込まれ、醗酵中
の酸化NADの再生には利用されない。酸およびガス産生
の細菌起原の醗酵酵素は該醗酵過程の最終段階にあり、
厳密に調節されている。例えば、ピルベ−ト・フォルメ
−トリア−ゼは好気的条件下では不活性であり、培地が
嫌気性となった時にのみ活性化される。ガス産生におけ
るキ−酵素であるフォルメ−トデヒドロゲナ−ゼは酸素
の存在下では、あるいは培地のpHが６以上である場合に
は合成されない。ヒドロゲナ−ゼ活性および合成は別の
酸化剤、例えば酸素、硝酸塩および亜硝酸塩により受動
的に調節される。従って、嫌気生活、酸性pHおよび外部
酸化剤のない生育条件は、達成されないか、あるいはゆ
っくりと達成されるに過ぎない。更に、培地中の多くの
ラクト−スが、酸−およびガス−産生酵素が活性となる
時点で開裂される。従って、β−ガラクトシダ−ゼ用の
酵素アッセイは醗酵経路の調節の問題を回避し、各基質
開裂の発生毎にリポ−タ基を生成する。
大腸菌群に属する属の嫌気性菌株の存在は、ガス検出
アッセイ手順を更に複雑にする。これらの菌株はβ−ガ
ラクトシダ−ゼ活性を有するが、ラクト−スからガスを
生成しない。従って、β−ガラクトシダ−ゼ活性測定ア
ッセイのみがこの大腸菌群の嫌気性菌株を検出し得る。
アッセイ手順を更に複雑にする。これらの菌株はβ−ガ
ラクトシダ−ゼ活性を有するが、ラクト−スからガスを
生成しない。従って、β−ガラクトシダ−ゼ活性測定ア
ッセイのみがこの大腸菌群の嫌気性菌株を検出し得る。
24時間以内のインキュベ−トにより大腸菌−関連酵素
を検出することが可能である。β−ガラクトシダ−ゼお
よびβ−グルクロニダ−ゼアッセイの結果は、大腸菌群
およびE.コリの確認的存在と相関関係をもつ。24時間酵
素アッセイ−正の大腸菌群培養物のアリコ−トを別の培
地、例えばエオシンメチレンブル−寒天およびインキュ
ベ−トした寒天上で画線培養した場合、典型的な大腸菌
およびE.コリのコロニ−は殆ど常に回収される。大腸菌
属の菌はβ−ガラクトシダ−ゼ−正の培養物からの系統
的に同定されたコロニ−である。E.コリはβ−グルクロ
ニダ−ゼ−正の培養物からの系統的に同定された微生物
である。これらの観測は、該標準的な大腸菌アッセイの
第一インキュベ−ト段階（推定的）が48時間から24時間
に短縮されること、および第二のインキュベ−ト段階
（確認的）が不要であることを示している。結局、大腸
菌群およびE.コリ用の酵素アッセイは確認上の結果を得
るに要する時間を72時間程度減少することを可能とし、
同時により一層改良された感度を与えることを可能とす
る。
を検出することが可能である。β−ガラクトシダ−ゼお
よびβ−グルクロニダ−ゼアッセイの結果は、大腸菌群
およびE.コリの確認的存在と相関関係をもつ。24時間酵
素アッセイ−正の大腸菌群培養物のアリコ−トを別の培
地、例えばエオシンメチレンブル−寒天およびインキュ
ベ−トした寒天上で画線培養した場合、典型的な大腸菌
およびE.コリのコロニ−は殆ど常に回収される。大腸菌
属の菌はβ−ガラクトシダ−ゼ−正の培養物からの系統
的に同定されたコロニ−である。E.コリはβ−グルクロ
ニダ−ゼ−正の培養物からの系統的に同定された微生物
である。これらの観測は、該標準的な大腸菌アッセイの
第一インキュベ−ト段階（推定的）が48時間から24時間
に短縮されること、および第二のインキュベ−ト段階
（確認的）が不要であることを示している。結局、大腸
菌群およびE.コリ用の酵素アッセイは確認上の結果を得
るに要する時間を72時間程度減少することを可能とし、
同時により一層改良された感度を与えることを可能とす
る。
食品および乳製品のサンプルには、大腸菌群の検出の
問題が付きまとう。大量の食品が供給されており、その
いくつかの物理／化学的性質は酸性のまたはガス状の最
終生成部の検出あるいはある種の酵素アッセイを困難に
する。例えば、脱脂粉乳などの食品サンプルによる濁度
のために、気泡をブロス内で検出することは困難であ
る。乾燥チ−ズ、チリ粉末または緑色もしくは黄色の野
菜などの食物製品に関連する色は、基質としてONPGを使
用するβ−ガラクトシダ−ゼアッセイにおけるONPなど
の着色されたリポ−タもしくはpH指示薬の色を不明瞭に
する。更に、食品は本来的に酸性であり得、あるいはサ
ンプルの調製中に気泡を内部に取り込む可能性がある。
最後に、食品の化学的特性はアッセイを妨害する可能性
がある。食品は培養ブロスに追加の栄養分を与え、これ
ら栄養分は非大腸菌型細胞により代謝されて、ガス状の
あるいは酸性の最終生成物を形成して、誤った正の結果
に導く可能性がある。例えば、ケ−キミックスまたは他
の甘味を付与した製品はかなりの量の二単糖類および単
糖類を含み、これらは非大腸菌群により酸および／また
はガスに転化される。
問題が付きまとう。大量の食品が供給されており、その
いくつかの物理／化学的性質は酸性のまたはガス状の最
終生成部の検出あるいはある種の酵素アッセイを困難に
する。例えば、脱脂粉乳などの食品サンプルによる濁度
のために、気泡をブロス内で検出することは困難であ
る。乾燥チ−ズ、チリ粉末または緑色もしくは黄色の野
菜などの食物製品に関連する色は、基質としてONPGを使
用するβ−ガラクトシダ−ゼアッセイにおけるONPなど
の着色されたリポ−タもしくはpH指示薬の色を不明瞭に
する。更に、食品は本来的に酸性であり得、あるいはサ
ンプルの調製中に気泡を内部に取り込む可能性がある。
最後に、食品の化学的特性はアッセイを妨害する可能性
がある。食品は培養ブロスに追加の栄養分を与え、これ
ら栄養分は非大腸菌型細胞により代謝されて、ガス状の
あるいは酸性の最終生成物を形成して、誤った正の結果
に導く可能性がある。例えば、ケ−キミックスまたは他
の甘味を付与した製品はかなりの量の二単糖類および単
糖類を含み、これらは非大腸菌群により酸および／また
はガスに転化される。
大腸菌型細菌およびE.コリ用のβ−ガラクトシダ−ゼ
およびβ−グルクロニダ−ゼアッセイ用の基質を適当に
選択することは重要である。例えば、β−ガラクトシダ
−ゼは基質ONPGを開裂して黄色の生成物ONPを生成す
る。しかしながら、食物製品に固有のあるいはこれに添
加されたある種の色は該ONPリポ−タ生成物の黄色を不
明瞭にする。この黄色を不明瞭にする可能性のある食物
製品には、赤身肉のヘモグロビン、葉菜および植物のク
ロロフィル、果実および植物中のβ−カロテンおよび他
の黄色およびオレンジ色の色素、香辛料中の天然色素、
並びに天然および人工着色料などが含まれる。濁った水
および高い有機質含有量を有する水も淡黄色の正のONP
反応を不明瞭にする。更に、標準的な微生物学的育成培
地成分、例えば蛋白またはイ−スト水解物などは該培地
に黄色または金色を付与しONPの存在を不明瞭にする可
能性がある。例えば、標準的な方法の大腸菌用培地、ラ
ウリル硫酸トリプト−ス（LST）ブロスは黄金色の色調
を有する。LSTブロス中および他の補充培地中でONPG−
型の酵素アッセイを実施した結果、夥しい数の誤った負
の結果が得られた。
およびβ−グルクロニダ−ゼアッセイ用の基質を適当に
選択することは重要である。例えば、β−ガラクトシダ
−ゼは基質ONPGを開裂して黄色の生成物ONPを生成す
る。しかしながら、食物製品に固有のあるいはこれに添
加されたある種の色は該ONPリポ−タ生成物の黄色を不
明瞭にする。この黄色を不明瞭にする可能性のある食物
製品には、赤身肉のヘモグロビン、葉菜および植物のク
ロロフィル、果実および植物中のβ−カロテンおよび他
の黄色およびオレンジ色の色素、香辛料中の天然色素、
並びに天然および人工着色料などが含まれる。濁った水
および高い有機質含有量を有する水も淡黄色の正のONP
反応を不明瞭にする。更に、標準的な微生物学的育成培
地成分、例えば蛋白またはイ−スト水解物などは該培地
に黄色または金色を付与しONPの存在を不明瞭にする可
能性がある。例えば、標準的な方法の大腸菌用培地、ラ
ウリル硫酸トリプト−ス（LST）ブロスは黄金色の色調
を有する。LSTブロス中および他の補充培地中でONPG−
型の酵素アッセイを実施した結果、夥しい数の誤った負
の結果が得られた。
ONPGの使用に関連した付随的な問題は該ONP関連生成
物の有害な性質である。ONPは揮発正の化合物であり、
公知の呼吸系、眼および皮膚の刺激物である。ONPの存
在は培養物の取り扱いに関連する能率およびガラス器具
の洗浄を研究者にとって有害なものとする。また、ONP
の使用は、有害な廃物の投棄に係わる問題をも生ずる。
物の有害な性質である。ONPは揮発正の化合物であり、
公知の呼吸系、眼および皮膚の刺激物である。ONPの存
在は培養物の取り扱いに関連する能率およびガラス器具
の洗浄を研究者にとって有害なものとする。また、ONP
の使用は、有害な廃物の投棄に係わる問題をも生ずる。
同様に、β−グルクロニダ−ゼアッセイはMUGを使用
し、これは螢光信号を発生する。食品に関連する色素は
該螢光信号を減衰することが観測されている。例えば、
チリ粉末中の色素はリポ−タ生成物の螢光反応を不明瞭
にする。MUGに係わるさらなる問題は、最大の螢光を与
えるpH範囲がラクト−ス醗酵の際に達成されるpH範囲外
にあることである。MUGはpH10以上で最大の螢光を与え
る。また、ラクト−ス醗酵で生成する酸類は典型的に該
大腸菌培地のpHを５〜６に低下し、これは螢光反応を不
明瞭にする。最後に、既に述べたように、発色性物質を
使用するβ−グルクロニダ−ゼアッセイは、いくつかの
型のサンプルによる妨害を被る。従って、β−グルクロ
ニダ−ゼのための通常の酵素アッセイは食品サンプルに
起因するpHおよび妨害の問題を有し、ある種の食品に対
して使用するには不適当である。
し、これは螢光信号を発生する。食品に関連する色素は
該螢光信号を減衰することが観測されている。例えば、
チリ粉末中の色素はリポ−タ生成物の螢光反応を不明瞭
にする。MUGに係わるさらなる問題は、最大の螢光を与
えるpH範囲がラクト−ス醗酵の際に達成されるpH範囲外
にあることである。MUGはpH10以上で最大の螢光を与え
る。また、ラクト−ス醗酵で生成する酸類は典型的に該
大腸菌培地のpHを５〜６に低下し、これは螢光反応を不
明瞭にする。最後に、既に述べたように、発色性物質を
使用するβ−グルクロニダ−ゼアッセイは、いくつかの
型のサンプルによる妨害を被る。従って、β−グルクロ
ニダ−ゼのための通常の酵素アッセイは食品サンプルに
起因するpHおよび妨害の問題を有し、ある種の食品に対
して使用するには不適当である。
螢光発生物質、例えばMUGは食品サンプル中のE.コリ
の検出用の寒天に使用されてきた。この螢光開裂生成
物、４−メチルウンベリフェロン、は可溶性で、かつE.
コリから寒天（固体培地）中に拡散して、どのコロニ−
が酵素β−グルクロニダ−ゼを含み、どのコロニ−がこ
れを含まないかを決定することを困難にしている。
の検出用の寒天に使用されてきた。この螢光開裂生成
物、４−メチルウンベリフェロン、は可溶性で、かつE.
コリから寒天（固体培地）中に拡散して、どのコロニ−
が酵素β−グルクロニダ−ゼを含み、どのコロニ−がこ
れを含まないかを決定することを困難にしている。
もう一つの煩雑さは、異なる型のサンプル用の培養用
ブロスの最終体積が1ml〜１の範囲で変動することに
ある。各テストに対して、培地中の該発色性または螢光
性基質のモル濃度は一定である必要がある。このため
に、高価なテスト試薬が大量に消費される。食品加工業
者にとっては、全ての大腸菌群のテストが単一のアッセ
イで実施でき、全てのテストサンプルにまたがる結果
を、その大きさとは無関係に容易に読み取ることがで
き、かつテスト試薬を経済的なものとすることが有利で
あろう。
ブロスの最終体積が1ml〜１の範囲で変動することに
ある。各テストに対して、培地中の該発色性または螢光
性基質のモル濃度は一定である必要がある。このため
に、高価なテスト試薬が大量に消費される。食品加工業
者にとっては、全ての大腸菌群のテストが単一のアッセ
イで実施でき、全てのテストサンプルにまたがる結果
を、その大きさとは無関係に容易に読み取ることがで
き、かつテスト試薬を経済的なものとすることが有利で
あろう。
典型的な食品加工業者または水処理施設は搬入される
および搬出される食品、処理水、排水または環境サンプ
ルをテストする。従って、ONPG−またはMUG−にもとず
く合アッセイは、ある型のサンプルのみに対して妥当で
あるにすぎない。かくして、種々のサンプル、例えば食
品、濁ったおよび／または着色した水および環境サンプ
ルに対して有効なかつ関連する種々のテスト法に伴う諸
欠点を解消し得るアッセイに対する需要がある。
および搬出される食品、処理水、排水または環境サンプ
ルをテストする。従って、ONPG−またはMUG−にもとず
く合アッセイは、ある型のサンプルのみに対して妥当で
あるにすぎない。かくして、種々のサンプル、例えば食
品、濁ったおよび／または着色した水および環境サンプ
ルに対して有効なかつ関連する種々のテスト法に伴う諸
欠点を解消し得るアッセイに対する需要がある。
インジゴ形成性（indigogenic）基質、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（Χ−Gal）がβ−ガラクトシダ−ゼ活性を発現するE.
コリコロニ−の検出用の固体培地として使用されてい
る。β−ガラクトシドはΧ−Galをガラクト−スとイン
ドリル誘導体とに開裂する。このインドリル誘導体は二
量体化して、強い青色を呈する置換インジゴを形成す
る。
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（Χ−Gal）がβ−ガラクトシダ−ゼ活性を発現するE.
コリコロニ−の検出用の固体培地として使用されてい
る。β−ガラクトシドはΧ−Galをガラクト−スとイン
ドリル誘導体とに開裂する。このインドリル誘導体は二
量体化して、強い青色を呈する置換インジゴを形成す
る。
フランプトン（Frampton）等はJ.Food Prot.,1988,5
1,pp.402−04において、人為的に菌を植えつけた生の鶏
肉ミンチ中のE.コリを他の細菌コロニ−から識別するた
めに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−グルクロニダ−ゼ（Χ−Gluc）を補充したペプトン
−タ−ジト−ル（tergitol）寒天を開示している。レイ
（Ley）等は、Ann.Meet.Am.Soc.Microbiol.,Abstract Q
35:288,1988において、グリセロ−ル培地および３−イ
ンドリル−β−Ｄ−グルクロニド基質を用いる膜濾過技
術を利用した、水および下水中のE.コリを計数する方法
を開示している。E.コリコロニ−は半固体培地において
青色に見える。ワトキンス（Watkins）等は、Appl.Envi
ron.Microbiol.,1988,54,pp.1874−75において、貝中お
よび排水中のE.コリの検出のためにＸ−Glucを使用した
ポアプレ−ト（pour plate）法を開示している。
1,pp.402−04において、人為的に菌を植えつけた生の鶏
肉ミンチ中のE.コリを他の細菌コロニ−から識別するた
めに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−グルクロニダ−ゼ（Χ−Gluc）を補充したペプトン
−タ−ジト−ル（tergitol）寒天を開示している。レイ
（Ley）等は、Ann.Meet.Am.Soc.Microbiol.,Abstract Q
35:288,1988において、グリセロ−ル培地および３−イ
ンドリル−β−Ｄ−グルクロニド基質を用いる膜濾過技
術を利用した、水および下水中のE.コリを計数する方法
を開示している。E.コリコロニ−は半固体培地において
青色に見える。ワトキンス（Watkins）等は、Appl.Envi
ron.Microbiol.,1988,54,pp.1874−75において、貝中お
よび排水中のE.コリの検出のためにＸ−Glucを使用した
ポアプレ−ト（pour plate）法を開示している。
製品ペトリフィルム（PetrifilmTM）（3M）はE.コリ
の検出のために固体培地とＸ−Glucとを使用している。
E.コリコロニ−は青色になる。
の検出のために固体培地とＸ−Glucとを使用している。
E.コリコロニ−は青色になる。
インド−ル生成化合物、Ｘ−GalおよびＸ−Glucが高
価であるために、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グル
クロニダーゼ活性の検出のために広範には利用されてお
らず、しかも比較的少量の体積で使用されている。従っ
て、当分野では、食品および水質のテストに対して、経
済的に少量のＸ−GalおよびＸ−Glucを使用することを
可能とするβ−ガラクトシダーゼテスト系に対する需要
がある。というのは、強い青色がONPの黄色および他の
着色リポ−タに係わる問題の多くを解決するからであ
る。
価であるために、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グル
クロニダーゼ活性の検出のために広範には利用されてお
らず、しかも比較的少量の体積で使用されている。従っ
て、当分野では、食品および水質のテストに対して、経
済的に少量のＸ−GalおよびＸ−Glucを使用することを
可能とするβ−ガラクトシダーゼテスト系に対する需要
がある。というのは、強い青色がONPの黄色および他の
着色リポ−タに係わる問題の多くを解決するからであ
る。
概して、当分野では、酵素アッセイに関連する感度お
よび速度を改良し、嫌気性大腸菌の検出を可能とし、食
品、水および環境サンプルに首尾よく適用でき、取り扱
いおよび投棄の安全性を与え、かつ高価なテスト試薬の
消費量の点での経済性をもたらす大腸菌検出アッセイに
対する需要がある。
よび速度を改良し、嫌気性大腸菌の検出を可能とし、食
品、水および環境サンプルに首尾よく適用でき、取り扱
いおよび投棄の安全性を与え、かつ高価なテスト試薬の
消費量の点での経済性をもたらす大腸菌検出アッセイに
対する需要がある。
発明の概要 本発明は、特定の微生物および／または微生物群のア
ッセイに有用な、該特定の微生物および／または微生物
群に関連する酵素のアッセイ法並びに酵素指示デバイス
を包含する。一局面においては、本発明の方法は、サン
プルおよび酵素指示デバイスを育成培地に添加し、許容
される温度の下でインキュベ−トし、該酵素指示デバイ
ス上の結果を読み取ることを含む。好ましくは、該生育
培地は液体である。もう一つの方法は、生育培地にサン
プルを添加し、該サンプルおよび生育培地を、微生物の
育成に許容される温度の下で、該育成培地内で微生物の
成長の痕跡がみられるまでインキュベ−トし、酵素指示
デバイスを該育成培地に添加し（ここで、該酵素指示デ
バイスは固定担体上のポリマー系に色素−形成性または
螢光発生基質を含み、あるいは固体担体上で乾燥された
色素−形成性または螢光発生基質を含み、かつ該色素形
成性基質は酵素により開裂されて着色沈澱を形成もしく
は螢光を発生する）、該サンプル、生育培地および酵素
指示デバイスを許容温度にて、酸化性環境で約１〜48時
間インキュベ−トし、該酵素指示デバイス上での色の変
化または螢光反応により、該特定の微生物または微生物
群の存在を視覚的に検出することを含む。好ましくは、
酸化剤を該酵素指示デバイスと共に該育成培地に添加す
る。本発明の酵素指示デバイスは、好ましくはポリマー
系に色素−形成性または螢光発生基質を含むものであ
る。また、該酵素指示デバイスは、固体担体の表面に付
着された色素−形成性または螢光発生基質を含むもので
ある。より詳しくいえば、該酵素指示デバイスは、更に
固体担体成分をも含み、ここで該ポリマー系中の色素−
形成性または螢光発生基質は該固体担体系の表面上に層
状に適用されている。該固体担体は液体の表面に浮遊し
ていて、とりたてて酸化剤を使用しなくとも酸化性環境
として空気を利用し得るようにすることが好ましい。
ッセイに有用な、該特定の微生物および／または微生物
群に関連する酵素のアッセイ法並びに酵素指示デバイス
を包含する。一局面においては、本発明の方法は、サン
プルおよび酵素指示デバイスを育成培地に添加し、許容
される温度の下でインキュベ−トし、該酵素指示デバイ
ス上の結果を読み取ることを含む。好ましくは、該生育
培地は液体である。もう一つの方法は、生育培地にサン
プルを添加し、該サンプルおよび生育培地を、微生物の
育成に許容される温度の下で、該育成培地内で微生物の
成長の痕跡がみられるまでインキュベ−トし、酵素指示
デバイスを該育成培地に添加し（ここで、該酵素指示デ
バイスは固定担体上のポリマー系に色素−形成性または
螢光発生基質を含み、あるいは固体担体上で乾燥された
色素−形成性または螢光発生基質を含み、かつ該色素形
成性基質は酵素により開裂されて着色沈澱を形成もしく
は螢光を発生する）、該サンプル、生育培地および酵素
指示デバイスを許容温度にて、酸化性環境で約１〜48時
間インキュベ−トし、該酵素指示デバイス上での色の変
化または螢光反応により、該特定の微生物または微生物
群の存在を視覚的に検出することを含む。好ましくは、
酸化剤を該酵素指示デバイスと共に該育成培地に添加す
る。本発明の酵素指示デバイスは、好ましくはポリマー
系に色素−形成性または螢光発生基質を含むものであ
る。また、該酵素指示デバイスは、固体担体の表面に付
着された色素−形成性または螢光発生基質を含むもので
ある。より詳しくいえば、該酵素指示デバイスは、更に
固体担体成分をも含み、ここで該ポリマー系中の色素−
形成性または螢光発生基質は該固体担体系の表面上に層
状に適用されている。該固体担体は液体の表面に浮遊し
ていて、とりたてて酸化剤を使用しなくとも酸化性環境
として空気を利用し得るようにすることが好ましい。
本発明のもう一つの局面では、特定の微生物または微
生物群に関連する酵素のアッセイ法が提供され、該方法
はサンプルを育成培地に添加し、ポリマー系内の色素−
形成性基質を添加し（ここで、該色素−形成性基質は該
酵素により開裂された場合に、該ポリマーと結合して沈
澱を形成する）、該ポリマー中の該色素−形成性基質を
該サンプルおよび該育成培地と接触させ、該サンプル、
育成培地および該ポリマー中の該色素−形成性基質を、
特定の微生物または微生物群の生育に許容される温度の
下でインキュベ−トし、該ポリマーと結合し、かつ着色
された沈澱の存在を検出することを含む。
生物群に関連する酵素のアッセイ法が提供され、該方法
はサンプルを育成培地に添加し、ポリマー系内の色素−
形成性基質を添加し（ここで、該色素−形成性基質は該
酵素により開裂された場合に、該ポリマーと結合して沈
澱を形成する）、該ポリマー中の該色素−形成性基質を
該サンプルおよび該育成培地と接触させ、該サンプル、
育成培地および該ポリマー中の該色素−形成性基質を、
特定の微生物または微生物群の生育に許容される温度の
下でインキュベ−トし、該ポリマーと結合し、かつ着色
された沈澱の存在を検出することを含む。
該色素−形成性基質は酵素作用により開裂された場合
に不溶性の沈澱を生成する。好ましくは、該色素−形成
性基質は以下の式で示される置換インジゴ誘導体であ
る。
に不溶性の沈澱を生成する。好ましくは、該色素−形成
性基質は以下の式で示される置換インジゴ誘導体であ
る。
ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である。該ハ
ロゲン原子は、塩素、臭素または沃素である。R1、R2お
よびR3が全てＨである場合、生成される色素沈澱はイン
ジゴである。
ロゲン原子は、塩素、臭素または沃素である。R1、R2お
よびR3が全てＨである場合、生成される色素沈澱はイン
ジゴである。
該色素−形成性基質は水性系に対して不溶であり、生
育培地に暴露された場合に該ポリマーから該色素−形成
性基質が滲出されるのを防止し、もしくは該固体担体の
表面に出て来るのを防止することが好ましい。このよう
にして、各テストに必要とされる色素−形成性基質の量
を減じることにより、経費を維持することが可能であ
る。従って、使用する色素−形成性基質の量はテストの
規模またはサンプルの大きさには無関係である。更に、
特定の微生物または微生物群の酵素アッセイによる分析
は、従来の生育法と比較して、より一層迅速かつ高感度
なアッセイ系および純粋な培養検出法が提供される。
育培地に暴露された場合に該ポリマーから該色素−形成
性基質が滲出されるのを防止し、もしくは該固体担体の
表面に出て来るのを防止することが好ましい。このよう
にして、各テストに必要とされる色素−形成性基質の量
を減じることにより、経費を維持することが可能であ
る。従って、使用する色素−形成性基質の量はテストの
規模またはサンプルの大きさには無関係である。更に、
特定の微生物または微生物群の酵素アッセイによる分析
は、従来の生育法と比較して、より一層迅速かつ高感度
なアッセイ系および純粋な培養検出法が提供される。
本発明の方法および本発明の酵素指示デバイスの使用
の利点は、該色素−形成性基質を、溶液全体に渡り分散
させるというよりも、画成された反応表面上で有効利用
することを可能とする。該反応表面は固体担体部材また
はポリマーマトリックスの表面である。その結果培養物
の容積とは無関係のアッセイが与えられ、かくして試薬
消費の経済性が導かれる。第二に、インジゴ生成基質か
らの該不溶性インジゴ色素−形成性基質の色は青乃至紫
の範囲にあり、この色は食品またはある種の水に関連す
る顔料もしくは濁りにより隠蔽もしくは減衰されること
はない。かくして、該インジゴ生成基質は食品および水
サンプル両者の大腸菌型細菌の検出を可能とする。第三
に、このインジゴ生成性基質は、酵素アッセイに関連す
る速度および感度をもたらす。第四に、β−ガラクトシ
ダ−ゼアッセイはラクト−ス醗酵経路の下方部分での酵
素調節に関連する問題を排除する。第五に、酵素アッセ
イは、該酵素が色素−形成性基質の加水分解を実施した
時点毎に、ガラクトシド部分のみの開裂が終了する該経
路の終端においてではなく、該経路の第一段階において
信号を発生する。
の利点は、該色素−形成性基質を、溶液全体に渡り分散
させるというよりも、画成された反応表面上で有効利用
することを可能とする。該反応表面は固体担体部材また
はポリマーマトリックスの表面である。その結果培養物
の容積とは無関係のアッセイが与えられ、かくして試薬
消費の経済性が導かれる。第二に、インジゴ生成基質か
らの該不溶性インジゴ色素−形成性基質の色は青乃至紫
の範囲にあり、この色は食品またはある種の水に関連す
る顔料もしくは濁りにより隠蔽もしくは減衰されること
はない。かくして、該インジゴ生成基質は食品および水
サンプル両者の大腸菌型細菌の検出を可能とする。第三
に、このインジゴ生成性基質は、酵素アッセイに関連す
る速度および感度をもたらす。第四に、β−ガラクトシ
ダ−ゼアッセイはラクト−ス醗酵経路の下方部分での酵
素調節に関連する問題を排除する。第五に、酵素アッセ
イは、該酵素が色素−形成性基質の加水分解を実施した
時点毎に、ガラクトシド部分のみの開裂が終了する該経
路の終端においてではなく、該経路の第一段階において
信号を発生する。
本発明のもう一つの局面では、特定の微生物および微
生物群に関連した酵素のアッセイは、（ａ）液状生育培
地にサンプルを添加し；（ｂ）画成された反応表面上に
色素−形成性または螢光発生基質を添加し、ここで該基
質は該酵素により開裂された場合に沈澱または螢光性副
生成物を形成し；（ｃ）該サンプル、生育培地および基
質を該特定の微生物および微生物群の生育に許容される
温度にてインキュベ−トし；（ｄ）該画成された反応表
面上または回りの培地中における着色された沈澱の存在
または螢光の存在により、該特定の微生物および微生物
群の存在を検出する各工程を含む。好ましい態様におい
て、該螢光発生基質は４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−グルクロニドである。
生物群に関連した酵素のアッセイは、（ａ）液状生育培
地にサンプルを添加し；（ｂ）画成された反応表面上に
色素−形成性または螢光発生基質を添加し、ここで該基
質は該酵素により開裂された場合に沈澱または螢光性副
生成物を形成し；（ｃ）該サンプル、生育培地および基
質を該特定の微生物および微生物群の生育に許容される
温度にてインキュベ−トし；（ｄ）該画成された反応表
面上または回りの培地中における着色された沈澱の存在
または螢光の存在により、該特定の微生物および微生物
群の存在を検出する各工程を含む。好ましい態様におい
て、該螢光発生基質は４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−グルクロニドである。
図面の簡単な説明 添付図は、ブロモクロロインジゴを生成するための、
ブロモクロロインドリルガラクトシド（Ｘ−Gal）の加
水分解の反応経路を示すものである。ブロモクロロイン
ドリルガラクトシドは、まず該特定の微生物または微生
物群由来のβ−ガラクトシダ−ゼにより開裂されてガラ
クト−ス基が除去され、かつブロモクロロインドキシル
を生成し、これは酸化反応により二量化されて、高度に
着色された青緑色の沈澱、ブロモクロロインジゴとな
る。酸化は、溶液中の酸化剤によりまたはブロモクロロ
インドキシルの空気への暴露により行うことができる。
ブロモクロロインドリルガラクトシド（Ｘ−Gal）の加
水分解の反応経路を示すものである。ブロモクロロイン
ドリルガラクトシドは、まず該特定の微生物または微生
物群由来のβ−ガラクトシダ−ゼにより開裂されてガラ
クト−ス基が除去され、かつブロモクロロインドキシル
を生成し、これは酸化反応により二量化されて、高度に
着色された青緑色の沈澱、ブロモクロロインジゴとな
る。酸化は、溶液中の酸化剤によりまたはブロモクロロ
インドキシルの空気への暴露により行うことができる。
発明の詳細な説明 本発明は、特定の微生物および／または微生物群に関
連する酵素の検定法に関する。好ましくは、該特定の微
生物はE.コリであり、かつ該微生物群は大腸菌型細菌で
ある。該酵素β−ガラクトシダ−ゼは該大腸菌型細菌に
特徴的なものであり、またβ−グルクロニダ−ゼ活性は
E.コリに特徴的なものである。該色素−形成性基質は、
好ましくはポリマー系に混合され、かつ酵素により開裂
された場合には不溶性の沈澱を形成する。また、該色素
−形成性基質は固体担体部材に付着させることも可能で
あり、該担体部材も該不溶性の沈澱を形成するための表
面であり得る。好ましくは、該色素−形成性基質は水性
液体、例えば生育培地に不溶性であって、該生育培地全
体に渡り該色素−形成性基質が分散するのを防止し、代
わりに該ポリマー系または該固体担体部材の表面に該色
素−形成性基質を集中させる。
連する酵素の検定法に関する。好ましくは、該特定の微
生物はE.コリであり、かつ該微生物群は大腸菌型細菌で
ある。該酵素β−ガラクトシダ−ゼは該大腸菌型細菌に
特徴的なものであり、またβ−グルクロニダ−ゼ活性は
E.コリに特徴的なものである。該色素−形成性基質は、
好ましくはポリマー系に混合され、かつ酵素により開裂
された場合には不溶性の沈澱を形成する。また、該色素
−形成性基質は固体担体部材に付着させることも可能で
あり、該担体部材も該不溶性の沈澱を形成するための表
面であり得る。好ましくは、該色素−形成性基質は水性
液体、例えば生育培地に不溶性であって、該生育培地全
体に渡り該色素−形成性基質が分散するのを防止し、代
わりに該ポリマー系または該固体担体部材の表面に該色
素−形成性基質を集中させる。
該色素−形成性基質の、高度に着色された沈澱の生成
反応は、糖基を開裂するための特定の酵素および該開裂
された色素−形成性基質から高度に着色された二量体の
沈澱を形成するための酸化性環境を必要とする。該酸化
性環境は該ポリマー中の色素−形成性基質を空気に暴露
させるか、あるいは該生育培地に酸化剤を添加すること
により生成することができる。酸化剤の例は、過酸化水
素、NO3 -、Fe3+、Ag+、ピロガロ−ル、Cu+などを包含す
る。最も好ましくは、該酸化剤は0.10よりも大きな酸化
還元電位を有し、かつ生育中の微生物に対して有害作用
を回避し得る濃度で使用される。
反応は、糖基を開裂するための特定の酵素および該開裂
された色素−形成性基質から高度に着色された二量体の
沈澱を形成するための酸化性環境を必要とする。該酸化
性環境は該ポリマー中の色素−形成性基質を空気に暴露
させるか、あるいは該生育培地に酸化剤を添加すること
により生成することができる。酸化剤の例は、過酸化水
素、NO3 -、Fe3+、Ag+、ピロガロ−ル、Cu+などを包含す
る。最も好ましくは、該酸化剤は0.10よりも大きな酸化
還元電位を有し、かつ生育中の微生物に対して有害作用
を回避し得る濃度で使用される。
該色素−形成性基質は、好ましくは以下の式で示され
る置換インジゴ誘導体である。
る置換インジゴ誘導体である。
ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である。該糖
基は任意の単糖類、その誘導体、またはアルデヒド酸で
ある。好ましくは、該糖基はガラクトシドまたはグルコ
シドであり、該アルデヒド酸はグルクロン酸である。最
も好ましくは、該糖またはアルデヒド酸はβ−結合によ
り酸素に結合している。該置換インジゴ色素の例は、ガ
ラクト−スおよびグルクロン酸とβ−Ｄ結合している３
−インドリル−、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−、５−ブロモ−３−インドリル−、５−ブロモ−
６−クロロ−３−インドリル−、および５−アイオド−
３−インドリル−誘導体を含む。該基質は無色である
が、適当な酵素により加水分解された場合には、該基質
のインドキシルまたは置換インドキシル部分が酸化され
て、例えば添付図に示したように、強く着色された不溶
性のインジゴ沈澱またはインジゴ誘導体を形成する。該
二量化反応は酸化性の環境を必要とする。更に、酵素に
よる開裂後に有色の不溶性生成物を形成する非インジゴ
生成β−糖基質は本発明の方法および発明の酵素指示デ
バイスに使用することができる。
基は任意の単糖類、その誘導体、またはアルデヒド酸で
ある。好ましくは、該糖基はガラクトシドまたはグルコ
シドであり、該アルデヒド酸はグルクロン酸である。最
も好ましくは、該糖またはアルデヒド酸はβ−結合によ
り酸素に結合している。該置換インジゴ色素の例は、ガ
ラクト−スおよびグルクロン酸とβ−Ｄ結合している３
−インドリル−、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−、５−ブロモ−３−インドリル−、５−ブロモ−
６−クロロ−３−インドリル−、および５−アイオド−
３−インドリル−誘導体を含む。該基質は無色である
が、適当な酵素により加水分解された場合には、該基質
のインドキシルまたは置換インドキシル部分が酸化され
て、例えば添付図に示したように、強く着色された不溶
性のインジゴ沈澱またはインジゴ誘導体を形成する。該
二量化反応は酸化性の環境を必要とする。更に、酵素に
よる開裂後に有色の不溶性生成物を形成する非インジゴ
生成β−糖基質は本発明の方法および発明の酵素指示デ
バイスに使用することができる。
別の態様において、特定の微生物または微生物群の培
養物は育成培地で生育でき、もしくは特定の微生物また
は微生物群に対して推定的に正の結果を与えた。特定の
微生物または微生物群に関連する特定の酵素のアッセイ
のための本発明の酵素指示デバイスは育成培地でサンプ
ルを生育した後、該育成培地中に添加することができ
る。例えば、色素−形成性基質はポリマー系と混合で
き、次いで固体担体の頂部で層に形成し得る。あるい
は、該色素−形成性基質は固体担体部材の表面上に付着
させることもできる。該固体担体は、これを液体育成培
地の表面上に維持すべく浮遊性のプラスチックであるこ
とが好ましい。また、色素−形成性基質はポリマー材
料、例えばラテックスと混合して全体に渡り該色素−形
成性基質を含むマトリックスを形成することも可能であ
る。該色素−形成性基質を含むラテックス製マトリック
スは液体育成培地中に落とし込むか、あるいは該液体育
成培地の表面上に懸垂させることができる。
養物は育成培地で生育でき、もしくは特定の微生物また
は微生物群に対して推定的に正の結果を与えた。特定の
微生物または微生物群に関連する特定の酵素のアッセイ
のための本発明の酵素指示デバイスは育成培地でサンプ
ルを生育した後、該育成培地中に添加することができ
る。例えば、色素−形成性基質はポリマー系と混合で
き、次いで固体担体の頂部で層に形成し得る。あるい
は、該色素−形成性基質は固体担体部材の表面上に付着
させることもできる。該固体担体は、これを液体育成培
地の表面上に維持すべく浮遊性のプラスチックであるこ
とが好ましい。また、色素−形成性基質はポリマー材
料、例えばラテックスと混合して全体に渡り該色素−形
成性基質を含むマトリックスを形成することも可能であ
る。該色素−形成性基質を含むラテックス製マトリック
スは液体育成培地中に落とし込むか、あるいは該液体育
成培地の表面上に懸垂させることができる。
該色素−形成性基質が空気と接していない場合には、
該色素−形成性基質と共にあるいはその添加の直ぐ後
に、該育成培地に発色溶液を添加すべきである。該発色
溶液は酸化剤、例えば過酸化水素、Ag+、Hg++、I3 -、IO
4 -、過硫酸、Pd++、ニトロベンゼン類、アゾベンゼン
類、キノン類、２−クロロ−２−ニトロ−プロパン、K3
Fe（CN）６、インドロン類、およびｐ−ヒドロキシメル
カリベンゾエ−ト（ｐ−hydroxymercaribenzoate）など
を含む。好ましくは、更に該発色溶液は沈澱促進剤およ
び細胞浸透剤をも含む。該細胞浸透剤はインジゴ発生基
質の該細胞内への侵入を容易にして、迅速な該基質の再
編成およびより迅速な該細胞からの該インドキシルまた
はインジゴの分泌をもたらす。細胞浸透剤の例は、トル
エン、アニオン性および非イオン性洗浄剤、およびセチ
ルトリメチルアンモニウムブロミドを包含する。該沈澱
促進剤は生成した沈澱の固体担体および／またはポリマ
ーマトリックスからの移動の防止を助長する。沈澱促進
剤の一例はアルカリ性洗浄剤の混合物、例えば濃度0.1
％〜1.0％でpHが8.0〜10.0のドデシル硫酸ナトリウムで
ある。この沈澱促進剤は濁りまたは強い発色反応の停止
作用を示す育成培地で使用することが好ましい。
該色素−形成性基質と共にあるいはその添加の直ぐ後
に、該育成培地に発色溶液を添加すべきである。該発色
溶液は酸化剤、例えば過酸化水素、Ag+、Hg++、I3 -、IO
4 -、過硫酸、Pd++、ニトロベンゼン類、アゾベンゼン
類、キノン類、２−クロロ−２−ニトロ−プロパン、K3
Fe（CN）６、インドロン類、およびｐ−ヒドロキシメル
カリベンゾエ−ト（ｐ−hydroxymercaribenzoate）など
を含む。好ましくは、更に該発色溶液は沈澱促進剤およ
び細胞浸透剤をも含む。該細胞浸透剤はインジゴ発生基
質の該細胞内への侵入を容易にして、迅速な該基質の再
編成およびより迅速な該細胞からの該インドキシルまた
はインジゴの分泌をもたらす。細胞浸透剤の例は、トル
エン、アニオン性および非イオン性洗浄剤、およびセチ
ルトリメチルアンモニウムブロミドを包含する。該沈澱
促進剤は生成した沈澱の固体担体および／またはポリマ
ーマトリックスからの移動の防止を助長する。沈澱促進
剤の一例はアルカリ性洗浄剤の混合物、例えば濃度0.1
％〜1.0％でpHが8.0〜10.0のドデシル硫酸ナトリウムで
ある。この沈澱促進剤は濁りまたは強い発色反応の停止
作用を示す育成培地で使用することが好ましい。
本発明の酵素指示デバイスは色素−形成性基質、例え
ばＸ−Galを溶媒、例えばジメチルフォルムアミド（DM
F）、メチルセロソルブ（２−メトキシエタノ−ル）、
またはDMSOに溶解し、次いで液状ポリマー系、例えばラ
テックスと混合することにより製造し得る。乾燥して固
体または半固体状態に転化し得る他の接着型ポリマー
は、例えばエチレンビニルアセテ−ト（EVA）、ポリビ
ニルアルコ−ル（PVA）、およびポリビニルピロリドン
（PVP）を包含する。EVAは塩化メチレンに可溶性のポリ
マーである。また、溶媒、例えば塩化メチレン中で液化
し得るポリマー系は該色素−形成性基質と混合すべき該
接着型のポリマーを液化するのに有用である。色素−形
成性基質とポリマーとの混合物は乾燥して固体または柔
軟な固体に成形する。好ましくは、極めて粘稠な状態に
ある該液状の色素−形成性基質とポリマーは固体担体の
表面上に層状に成形し得る。最も好ましくは、固体担体
は液体表面上で浮遊し得る多孔性のプラスチック材料製
のものである。
ばＸ−Galを溶媒、例えばジメチルフォルムアミド（DM
F）、メチルセロソルブ（２−メトキシエタノ−ル）、
またはDMSOに溶解し、次いで液状ポリマー系、例えばラ
テックスと混合することにより製造し得る。乾燥して固
体または半固体状態に転化し得る他の接着型ポリマー
は、例えばエチレンビニルアセテ−ト（EVA）、ポリビ
ニルアルコ−ル（PVA）、およびポリビニルピロリドン
（PVP）を包含する。EVAは塩化メチレンに可溶性のポリ
マーである。また、溶媒、例えば塩化メチレン中で液化
し得るポリマー系は該色素−形成性基質と混合すべき該
接着型のポリマーを液化するのに有用である。色素−形
成性基質とポリマーとの混合物は乾燥して固体または柔
軟な固体に成形する。好ましくは、極めて粘稠な状態に
ある該液状の色素−形成性基質とポリマーは固体担体の
表面上に層状に成形し得る。最も好ましくは、固体担体
は液体表面上で浮遊し得る多孔性のプラスチック材料製
のものである。
更に、溶媒中の該色素−形成性基質は、直接固体担体
部材の表面に添加し、乾燥（溶媒の蒸発）することがで
きる。また、該色素−形成性基質は溶媒、例えばDMFか
ら、試薬例えば塩化メチレンを加えることにより沈澱さ
せることができ、この場合該色素−形成性基質は不溶性
である。次いで、該沈澱は直接固体担体部材上に層状に
形成される。
部材の表面に添加し、乾燥（溶媒の蒸発）することがで
きる。また、該色素−形成性基質は溶媒、例えばDMFか
ら、試薬例えば塩化メチレンを加えることにより沈澱さ
せることができ、この場合該色素−形成性基質は不溶性
である。次いで、該沈澱は直接固体担体部材上に層状に
形成される。
色素−形成性基質の濃度は、与えられた表面積および
該反応容積で可視的応答を与えるのに十分な値である。
例えば、孔径70μで、径1/2インチかつ厚み1/16インチ
のポリエチレン製円形固体担体部材上のＸ−Galの濃度
は約50μｇ〜約1mgの範囲内である。
該反応容積で可視的応答を与えるのに十分な値である。
例えば、孔径70μで、径1/2インチかつ厚み1/16インチ
のポリエチレン製円形固体担体部材上のＸ−Galの濃度
は約50μｇ〜約1mgの範囲内である。
該固体担体は液体の表面上で浮遊でき、該液体表面の
下方に維持されてもよく、あるいは例えば培養物容器ま
たは培養物容器のクロ−ジャ−に物理的に取りつけるこ
とにより、液状育成培地の表面近傍に機械的に配置する
ことも可能である。該固体支持体を該液体−気体界面に
もしくはその近傍に配置することにより、空気中の酸素
の極近傍に位置させてインドキシルのインジゴへの酸化
を容易にし、結果として該アッセイの速度並びに感度を
改善することを可能とする。更に、該固体支持体および
最終的な着色位置が該培地の頂部に局在している場合に
は、該反応は該培養ブロスにより不明瞭化されず、かつ
読み取りが容易となる。該固体支持体が該液体の表面下
に位置する場合には、該色素−形成性基質の酸化を容易
にするために発色溶液を添加することが好ましい。
下方に維持されてもよく、あるいは例えば培養物容器ま
たは培養物容器のクロ−ジャ−に物理的に取りつけるこ
とにより、液状育成培地の表面近傍に機械的に配置する
ことも可能である。該固体支持体を該液体−気体界面に
もしくはその近傍に配置することにより、空気中の酸素
の極近傍に位置させてインドキシルのインジゴへの酸化
を容易にし、結果として該アッセイの速度並びに感度を
改善することを可能とする。更に、該固体支持体および
最終的な着色位置が該培地の頂部に局在している場合に
は、該反応は該培養ブロスにより不明瞭化されず、かつ
読み取りが容易となる。該固体支持体が該液体の表面下
に位置する場合には、該色素−形成性基質の酸化を容易
にするために発色溶液を添加することが好ましい。
大腸菌型細菌をテストする場合、該培地、例えばLST
ブロス中の通常の成分は可溶性基質、例えばONPGの発生
反応を妨害する恐れがある。従って、ONPGは透明な培地
内でのみテストすることができ、結果として弱い反応を
読み取ることを可能とする。ここで、実際上任意の寸法
の固体担体上への該色素−形成性基質の組み込みはサン
プルの寸法とは無関係に、使用する試薬を保存すること
を可能とする。同一の固体担体およびポリマー系と結合
した色素−形成性基質の表面積を任意の体積の培養物に
対して使用することができる。というのは、該基質と細
菌酵素との反応は該培地の全容積に渡ってではなく画成
された表面積内でおこるからである。発生する青色は通
常の微生物学的培地成分により不明瞭化されないので、
ポリマー系内の該色素−形成性基質を使用したアッセイ
は複雑な培地、例えばLSTブロス中で実施することがで
きる。酸化性環境の存在下での該色素−形成性基質の加
水分解により生じた不溶性の青色の沈澱は該固体支持体
の表面に維持され、その結果反応生成物はかなり小さな
より観察の容易な空間に集中される。該沈澱の局在化は
該テストの読み取りを容易にし、その感度を高める。該
酵素アッセイの固体支持体への局在化は試薬利用上の経
済化をもたらす。
ブロス中の通常の成分は可溶性基質、例えばONPGの発生
反応を妨害する恐れがある。従って、ONPGは透明な培地
内でのみテストすることができ、結果として弱い反応を
読み取ることを可能とする。ここで、実際上任意の寸法
の固体担体上への該色素−形成性基質の組み込みはサン
プルの寸法とは無関係に、使用する試薬を保存すること
を可能とする。同一の固体担体およびポリマー系と結合
した色素−形成性基質の表面積を任意の体積の培養物に
対して使用することができる。というのは、該基質と細
菌酵素との反応は該培地の全容積に渡ってではなく画成
された表面積内でおこるからである。発生する青色は通
常の微生物学的培地成分により不明瞭化されないので、
ポリマー系内の該色素−形成性基質を使用したアッセイ
は複雑な培地、例えばLSTブロス中で実施することがで
きる。酸化性環境の存在下での該色素−形成性基質の加
水分解により生じた不溶性の青色の沈澱は該固体支持体
の表面に維持され、その結果反応生成物はかなり小さな
より観察の容易な空間に集中される。該沈澱の局在化は
該テストの読み取りを容易にし、その感度を高める。該
酵素アッセイの固体支持体への局在化は試薬利用上の経
済化をもたらす。
更に別の局面では、本発明の方法並びに酵素指示デバ
イスは、最確数（MPN）法を利用した、食品または水サ
ンプル中の大腸菌型細菌の数を評価する定量的アッセイ
においても利用し得る。MPN大腸菌アッセイは、ポリマ
ー系、例えばラテックス中の色素−形成性基質を標準的
な大腸菌培地、例えばLSTブロスに配合することにより
達成される。該サンプルの調製は標準的な方法で行う。
一夜インキュベ−トした後、試験管内の該ポリマー系に
おける発色を読み取り、正の試験管につき、標準的なMP
N法に従って確定されたMPN/gまたはMPN/mlを計算する。
食品の微生物学的試験法の概説（Compendium of Method
s for the Microbilogical Examination of Foods）
（第２版、米国公衆衛生協会（American Public Health
Association）,1984）；公定分析法（Official Method
s of Analysis）（第14版、アッソシェ−ションオブオ
フィシャルアナリティカルケミスツ（Association of O
fficial Analytical Chemists）,1984）；および水およ
び排水の検査のための標準的方法（Standard Methods f
or the Examination of Water and Wastewater）（第17
版、米国公衆衛生協会（American Public Health Assoc
iation）,1981）を参照のこと。
イスは、最確数（MPN）法を利用した、食品または水サ
ンプル中の大腸菌型細菌の数を評価する定量的アッセイ
においても利用し得る。MPN大腸菌アッセイは、ポリマ
ー系、例えばラテックス中の色素−形成性基質を標準的
な大腸菌培地、例えばLSTブロスに配合することにより
達成される。該サンプルの調製は標準的な方法で行う。
一夜インキュベ−トした後、試験管内の該ポリマー系に
おける発色を読み取り、正の試験管につき、標準的なMP
N法に従って確定されたMPN/gまたはMPN/mlを計算する。
食品の微生物学的試験法の概説（Compendium of Method
s for the Microbilogical Examination of Foods）
（第２版、米国公衆衛生協会（American Public Health
Association）,1984）；公定分析法（Official Method
s of Analysis）（第14版、アッソシェ−ションオブオ
フィシャルアナリティカルケミスツ（Association of O
fficial Analytical Chemists）,1984）；および水およ
び排水の検査のための標準的方法（Standard Methods f
or the Examination of Water and Wastewater）（第17
版、米国公衆衛生協会（American Public Health Assoc
iation）,1981）を参照のこと。
本発明の方法および酵素指示デバイスは、例えば大腸
菌型細菌の定量テストで使用できる。インジゴ生成性ガ
ラクトシド基質は飲料水中の大腸菌のPAテストで使用す
る培地に配合される。この水のサンプルはポリマー系中
に、好ましくは浮遊性のプラスチック固体担体上の層と
しての色素−形成性基質を含む培地に添加する。適当な
インキュベ−ト時間の経過後、培養器内で該固体担体部
材上の沈澱したインジゴは該サンプル中に大腸菌が存在
することを示す。この手順は、環境サンプルを大腸菌の
存在につき定量的にテストするためにも利用される。例
えば、先端に綿布を取りつけたアプリケ−タで拭い、ポ
リマー系に組み込まれた、好ましくは固体担体部材上に
適用されたインジゴ生成性の色素−形成性基質を含む大
腸菌用培地に該アプリケ−タを置くことにより下水設備
の有効性を調べるために表面または排水管をアッセイす
ることができる。適当な時間、例えば１〜24時間、細菌
の育成に許容される温度でのインキュベ−トの後、該培
養器内に、またはより特定的には該固体担体の表面上に
沈澱したインジゴの色は該サンプル中における大腸菌の
存在を示す。
菌型細菌の定量テストで使用できる。インジゴ生成性ガ
ラクトシド基質は飲料水中の大腸菌のPAテストで使用す
る培地に配合される。この水のサンプルはポリマー系中
に、好ましくは浮遊性のプラスチック固体担体上の層と
しての色素−形成性基質を含む培地に添加する。適当な
インキュベ−ト時間の経過後、培養器内で該固体担体部
材上の沈澱したインジゴは該サンプル中に大腸菌が存在
することを示す。この手順は、環境サンプルを大腸菌の
存在につき定量的にテストするためにも利用される。例
えば、先端に綿布を取りつけたアプリケ−タで拭い、ポ
リマー系に組み込まれた、好ましくは固体担体部材上に
適用されたインジゴ生成性の色素−形成性基質を含む大
腸菌用培地に該アプリケ−タを置くことにより下水設備
の有効性を調べるために表面または排水管をアッセイす
ることができる。適当な時間、例えば１〜24時間、細菌
の育成に許容される温度でのインキュベ−トの後、該培
養器内に、またはより特定的には該固体担体の表面上に
沈澱したインジゴの色は該サンプル中における大腸菌の
存在を示す。
上記のような色素−形成性基質の使用の他に、本発明
は、付随的な培養物の移動、試薬の調製もしくは診断法
の使用の必要なしに、E.コリおよび大腸菌型細菌両者の
同時に確認的測定法をも提供する。より詳しくいえば、
上記の如き色素−形成性および螢光発生基質を含む円板
を、E.コリおよび／または大腸菌型細菌の存在につきテ
ストすべき微生物学的培地を含む容器に添加する。培地
と該反応性円板とを含む該容器を、対象とする微生物の
生育に許容される温度にてインキュベ−トする。インキ
ュベ−トの後、該容器を該反応性円板または回りの培地
における識別色の存在につき観察する。次いで、該容器
を長波長の紫外光（360 nm）に暴露して、回りの培地に
おける螢光の存在につき観察する。該円板上に見られる
色は該大腸菌型細菌のための確認反応（confirmed reac
tion）を示す。また、螢光の存在は、特定の微生物、E.
コリの存在に対する確認反応を示す。
は、付随的な培養物の移動、試薬の調製もしくは診断法
の使用の必要なしに、E.コリおよび大腸菌型細菌両者の
同時に確認的測定法をも提供する。より詳しくいえば、
上記の如き色素−形成性および螢光発生基質を含む円板
を、E.コリおよび／または大腸菌型細菌の存在につきテ
ストすべき微生物学的培地を含む容器に添加する。培地
と該反応性円板とを含む該容器を、対象とする微生物の
生育に許容される温度にてインキュベ−トする。インキ
ュベ−トの後、該容器を該反応性円板または回りの培地
における識別色の存在につき観察する。次いで、該容器
を長波長の紫外光（360 nm）に暴露して、回りの培地に
おける螢光の存在につき観察する。該円板上に見られる
色は該大腸菌型細菌のための確認反応（confirmed reac
tion）を示す。また、螢光の存在は、特定の微生物、E.
コリの存在に対する確認反応を示す。
以下の実施例は例示の目的で与えられるものであり、
本発明を限定するものではない。
本発明を限定するものではない。
実施例１ 本例は、水および排水の標準的検査法（Standard Met
hods for the Examination of Water and Wastewater）
（第17版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health
Association）,1981）に記載されたようなPA（存在−
不在）法により飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示
する。簡単に言えば、100 mlの水を容量250 mlのビン中
の３倍濃度のクラ−クス（Clark's）培地50mlに無菌条
件下で加えた。クラ−クス（Clark's）培地にはpH指示
薬を除く改良を施した。インキュベ−トの後、ラテック
スポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質を含
むプラスチック担体を該培養器に加えて、該液体表面に
これを浮かべた。該プラスチック担体上の、ラテックス
ポリマー系中の該インジゴ生成性ガラクトシド基質はす
でに述べたようにして調製した。この混合物を35℃でイ
ンキュベ−トし、24時間後に、該プラスチック担体をイ
ンジゴ形成につき検査した。インジゴ形成−正の反応は
該水サンプル中に大腸菌が確実に存在することを示し
た。
hods for the Examination of Water and Wastewater）
（第17版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health
Association）,1981）に記載されたようなPA（存在−
不在）法により飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示
する。簡単に言えば、100 mlの水を容量250 mlのビン中
の３倍濃度のクラ−クス（Clark's）培地50mlに無菌条
件下で加えた。クラ−クス（Clark's）培地にはpH指示
薬を除く改良を施した。インキュベ−トの後、ラテック
スポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質を含
むプラスチック担体を該培養器に加えて、該液体表面に
これを浮かべた。該プラスチック担体上の、ラテックス
ポリマー系中の該インジゴ生成性ガラクトシド基質はす
でに述べたようにして調製した。この混合物を35℃でイ
ンキュベ−トし、24時間後に、該プラスチック担体をイ
ンジゴ形成につき検査した。インジゴ形成−正の反応は
該水サンプル中に大腸菌が確実に存在することを示し
た。
実施例２ 本例は、本発明の方法を利用して、環境サンプル中の
大腸菌型細菌およびE.コリの検出法を例示する。この環
境サンプルは下水施設の有効性を検査するためにあるい
は日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採
取した。先端に綿を取りつけたアプリケ−タを滅菌した
希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。このスワブを
微生物学的ラウリル硫酸トリプト−スブロス育成培地内
に置いた。浮遊性の円形プラスチック担体の半面にポリ
マー系中のインジゴ形成性ガラクトシド基質を層状に適
用し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を
層状に適用し、インキュベ−ト後にこれを培養物に加え
た。この混合物を35℃にて24時間インキュベ−トした。
該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成−正の反応
により、該環境サンプル中における大腸菌型細菌の存在
が示された。該プラスチック担体の両半面上のインジゴ
形成−正の反応により、該サンプル中におけるE.コリの
存在が示された。
大腸菌型細菌およびE.コリの検出法を例示する。この環
境サンプルは下水施設の有効性を検査するためにあるい
は日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採
取した。先端に綿を取りつけたアプリケ−タを滅菌した
希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。このスワブを
微生物学的ラウリル硫酸トリプト−スブロス育成培地内
に置いた。浮遊性の円形プラスチック担体の半面にポリ
マー系中のインジゴ形成性ガラクトシド基質を層状に適
用し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を
層状に適用し、インキュベ−ト後にこれを培養物に加え
た。この混合物を35℃にて24時間インキュベ−トした。
該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成−正の反応
により、該環境サンプル中における大腸菌型細菌の存在
が示された。該プラスチック担体の両半面上のインジゴ
形成−正の反応により、該サンプル中におけるE.コリの
存在が示された。
実施例３ 本例では、本発明の方法を利用して、最確数（MPN）
分析により食品または水サンプル中の大腸菌およびE.コ
リの濃度を見積もる方法を例示する。このMPN法は食品
の微生物学的検査法の概説（Compendium of Methods fo
r the Microbiological Examination of Foods）（第２
版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health Assoc
iation）,1984）；公定分析法（Official Methods of A
nalysis）（第14版、アッソシェ−ションオブオフィシ
ャルアナリティカルケミスツ（Association of Officia
l Analytical Chemists）,1984）；および水および排水
の標準的検査法（Standard Methods for the Examinati
on of Water and Wastewater）（第17版、米国公衆衛生
協会（Americal Public Health Association）,1981）
に記載されている。
分析により食品または水サンプル中の大腸菌およびE.コ
リの濃度を見積もる方法を例示する。このMPN法は食品
の微生物学的検査法の概説（Compendium of Methods fo
r the Microbiological Examination of Foods）（第２
版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health Assoc
iation）,1984）；公定分析法（Official Methods of A
nalysis）（第14版、アッソシェ−ションオブオフィシ
ャルアナリティカルケミスツ（Association of Officia
l Analytical Chemists）,1984）；および水および排水
の標準的検査法（Standard Methods for the Examinati
on of Water and Wastewater）（第17版、米国公衆衛生
協会（Americal Public Health Association）,1981）
に記載されている。
水サンプル（10ml）を２倍濃度のラウリル硫酸トリプ
ト−ス（LST）ブロス10mlに無菌条件下で添加した。浮
遊性の円形プラスチック固体支持体の半面にポリマー系
中のインジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの
半面にポリマー系中のインジゴ形成性グルクロニド基質
を層状に適用し、インキュベ−ト後にこれを各試験管に
加えた。この混合物を35℃にて24時間インキュベ−トし
た。該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成−正の
反応により、該水サンプル中における大腸菌型細菌の存
在が示される。該プラスチック担体の両半面上のインジ
ゴ形成−正の反応により、該サンプル中のE.コリの存在
が示される。インジゴ生成−正の培養物の数は、標準的
統計確率表（MPN表）を使用して元の水サンプル中に存
在する大腸菌型細菌およびE.コリの数を評価するのに利
用した。
ト−ス（LST）ブロス10mlに無菌条件下で添加した。浮
遊性の円形プラスチック固体支持体の半面にポリマー系
中のインジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの
半面にポリマー系中のインジゴ形成性グルクロニド基質
を層状に適用し、インキュベ−ト後にこれを各試験管に
加えた。この混合物を35℃にて24時間インキュベ−トし
た。該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成−正の
反応により、該水サンプル中における大腸菌型細菌の存
在が示される。該プラスチック担体の両半面上のインジ
ゴ形成−正の反応により、該サンプル中のE.コリの存在
が示される。インジゴ生成−正の培養物の数は、標準的
統計確率表（MPN表）を使用して元の水サンプル中に存
在する大腸菌型細菌およびE.コリの数を評価するのに利
用した。
食品サンプルをMPNアッセイ前に、連続的10倍希釈に
より希釈した。固体食品サンプルの一部（塊）を無菌希
釈剤、バタ−フィ−ルズ（Butterfield's）緩衝燐酸バ
ッファ−９部（容量部）に添加した。この混合物を高速
で２分間ブレンドした。２種の別の10倍希釈物を1:10希
釈食品サンプルから調製した。該10倍希釈物の各1 mlを
10mlの３種のLSTブロスの試験管の各々添加した。浮遊
性の円形プラスチック担体の半面にポリマー系中のイン
ジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの半面にポ
リマー系中のインジゴ形成性グルクロニド基質を適用
し、インキュベ−ト後にこれを各試験管に加えた。この
混合物を35℃にて24時間インキュベ−トした。該プラス
チック担体の半面上のインジゴ生成−正の反応により、
該希釈物サンプル中における大腸菌型細菌の存在が示さ
れる。該プラスチック担体の両半面上のインジゴ形成−
正の反応により、該希釈物サンプル中のE.コリの存在が
示される。インジゴ生成−正の培養物の数は、標準的統
計確率表（MPN表）を使用して元の食品サンプル中に存
在する大腸菌型細菌およびE.コリの数を評価するのに利
用した。
より希釈した。固体食品サンプルの一部（塊）を無菌希
釈剤、バタ−フィ−ルズ（Butterfield's）緩衝燐酸バ
ッファ−９部（容量部）に添加した。この混合物を高速
で２分間ブレンドした。２種の別の10倍希釈物を1:10希
釈食品サンプルから調製した。該10倍希釈物の各1 mlを
10mlの３種のLSTブロスの試験管の各々添加した。浮遊
性の円形プラスチック担体の半面にポリマー系中のイン
ジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの半面にポ
リマー系中のインジゴ形成性グルクロニド基質を適用
し、インキュベ−ト後にこれを各試験管に加えた。この
混合物を35℃にて24時間インキュベ−トした。該プラス
チック担体の半面上のインジゴ生成−正の反応により、
該希釈物サンプル中における大腸菌型細菌の存在が示さ
れる。該プラスチック担体の両半面上のインジゴ形成−
正の反応により、該希釈物サンプル中のE.コリの存在が
示される。インジゴ生成−正の培養物の数は、標準的統
計確率表（MPN表）を使用して元の食品サンプル中に存
在する大腸菌型細菌およびE.コリの数を評価するのに利
用した。
実施例４ 本例は、インジゴ形成性基質混合物を使用して、推定
的に正の大腸菌培養物の全大腸菌およびE.コリについて
の確認法を説明する。大腸菌型細菌に対する推定的ガス
発生性が正の培養物を、以下の手順に従って大腸菌型細
菌およびE.コリの存在につき確認した。浮遊性の円形固
体担体の半面にインジゴ形成性ガラクトシド基質を適用
し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を適
用し、これを該培養物に加えた。酸化剤（過酸化水素、
10％濃度）を該培養物に加えた。大腸菌MPN分析の推定
分析部分は実施例３に記載の手順を利用して、食品また
は水サンプルにつき、LSTブロス中で実施した。24〜48
時間後にガス発生が正の培養物を、上記の浮遊性円形固
体担体を使用し、同時に酸化剤を含む発色剤を添加して
確認した。この培養物を35℃にて約１時間インキュベ−
トし、該プラスチック担体をインジゴの形成に関して検
査した。該円形固体担体の半面上でインジゴ形成−正で
ある培養物には大腸菌型細菌が存在することが確認され
たものと考えた。該円形固体担体の両半面上でインジゴ
形成−正である培養物にはE.コリが存在することが確認
された。インジゴ形成−負の培養物を更に１時間インキ
ュベ−トして、再度検査した。２時間たっても依然とし
てインジゴ形成−負の培養物は大腸菌型細菌またはE.コ
リの存在につき未確認のままであった。
的に正の大腸菌培養物の全大腸菌およびE.コリについて
の確認法を説明する。大腸菌型細菌に対する推定的ガス
発生性が正の培養物を、以下の手順に従って大腸菌型細
菌およびE.コリの存在につき確認した。浮遊性の円形固
体担体の半面にインジゴ形成性ガラクトシド基質を適用
し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を適
用し、これを該培養物に加えた。酸化剤（過酸化水素、
10％濃度）を該培養物に加えた。大腸菌MPN分析の推定
分析部分は実施例３に記載の手順を利用して、食品また
は水サンプルにつき、LSTブロス中で実施した。24〜48
時間後にガス発生が正の培養物を、上記の浮遊性円形固
体担体を使用し、同時に酸化剤を含む発色剤を添加して
確認した。この培養物を35℃にて約１時間インキュベ−
トし、該プラスチック担体をインジゴの形成に関して検
査した。該円形固体担体の半面上でインジゴ形成−正で
ある培養物には大腸菌型細菌が存在することが確認され
たものと考えた。該円形固体担体の両半面上でインジゴ
形成−正である培養物にはE.コリが存在することが確認
された。インジゴ形成−負の培養物を更に１時間インキ
ュベ−トして、再度検査した。２時間たっても依然とし
てインジゴ形成−負の培養物は大腸菌型細菌またはE.コ
リの存在につき未確認のままであった。
実施例５ 本例は、水および排水の標準的検査法（Standard Met
hods for the Examination of Water and Wastewater）
（第17版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health
Association）,1981）に記載されているPA（存在−不
在）法による飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示す
る。簡単に言えば、100 mlの水を容量250 mlのビン中の
３倍濃度のクラ−クス（Clark's）培地50mlに無菌条件
下で加えた。クラ−クス（Clark's）培地にはpH指示薬
を除く改良を施した。インキュベ−トの後、ラテックス
ポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質および
螢光発生基質を含むプラスチック担体を該培養器に加え
て、該液体表面にこれを浮かべた。該プラスチック担体
上の、ラテックスポリマー系中の該インジゴ生成性ガラ
クトシド基質はすでに述べたようにして調製した。この
混合物を35℃でインキュベ−トし、24時間後に、該プラ
スチック担体をインジゴ形成につき検査した。インジゴ
形成−正の反応は該水サンプル中に大腸菌が確実に存在
することを示した。
hods for the Examination of Water and Wastewater）
（第17版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health
Association）,1981）に記載されているPA（存在−不
在）法による飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示す
る。簡単に言えば、100 mlの水を容量250 mlのビン中の
３倍濃度のクラ−クス（Clark's）培地50mlに無菌条件
下で加えた。クラ−クス（Clark's）培地にはpH指示薬
を除く改良を施した。インキュベ−トの後、ラテックス
ポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質および
螢光発生基質を含むプラスチック担体を該培養器に加え
て、該液体表面にこれを浮かべた。該プラスチック担体
上の、ラテックスポリマー系中の該インジゴ生成性ガラ
クトシド基質はすでに述べたようにして調製した。この
混合物を35℃でインキュベ−トし、24時間後に、該プラ
スチック担体をインジゴ形成につき検査した。インジゴ
形成−正の反応は該水サンプル中に大腸菌が確実に存在
することを示した。
実施例６ 本例は、本発明の方法を利用して、環境サンプル中の
大腸菌型細菌およびE.コリの検出法を例示する。この環
境サンプルは下水施設の有効性を検査するためにあるい
は日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採
取した。先端に綿を取りつけたアプリケ−タを滅菌した
希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。このスワブを
微生物学的ラウリル酸トリプト−スブロス育成培地内に
置いた。浮遊性の円形プラスチック担体にポリマー系中
のインジゴ形成性ガラクトシド基質および螢光発生性グ
ルクロニド基質を層状に適用し、インキュベ−ト後にこ
れを培養物に加えた。この混合物を35℃にて24時間イン
キュベ−トした。該プラスチック担体上のインジゴ生成
−正の反応により、該環境サンプル中における大腸菌型
細菌の存在が示された。該プラスチック担体を長波長の
紫外光（366 nm）を照射した際の該容器中の螢光発生−
正の反応により、該サンプル中におけるE.コリの存在が
示された。
大腸菌型細菌およびE.コリの検出法を例示する。この環
境サンプルは下水施設の有効性を検査するためにあるい
は日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採
取した。先端に綿を取りつけたアプリケ−タを滅菌した
希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。このスワブを
微生物学的ラウリル酸トリプト−スブロス育成培地内に
置いた。浮遊性の円形プラスチック担体にポリマー系中
のインジゴ形成性ガラクトシド基質および螢光発生性グ
ルクロニド基質を層状に適用し、インキュベ−ト後にこ
れを培養物に加えた。この混合物を35℃にて24時間イン
キュベ−トした。該プラスチック担体上のインジゴ生成
−正の反応により、該環境サンプル中における大腸菌型
細菌の存在が示された。該プラスチック担体を長波長の
紫外光（366 nm）を照射した際の該容器中の螢光発生−
正の反応により、該サンプル中におけるE.コリの存在が
示された。
以上、本発明を明瞭にしかつ理解を容易にする目的
で、本発明を例示並びに実施例により記載してきたが、
本発明の精神並びに範囲を逸脱することなく、いくつか
の変更並びに改良が可能であることは明らかであろう。
で、本発明を例示並びに実施例により記載してきたが、
本発明の精神並びに範囲を逸脱することなく、いくつか
の変更並びに改良が可能であることは明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デスロシア ジョン ピー アメリカ合衆国 ワシントン州 98103 シアトル バーク アベニュー ノー ス 3520 (72)発明者 マーシャル エリオット ディー ザ サード アメリカ合衆国 ワシントン州 98055 レントン グラント アベニュー サ ウス 1411 アパートメント エム― 305 (72)発明者 フォード ジュディース アメリカ合衆国 ワシントン州 98011 ボーセル ナインティフィフス プレ イス ノースイースト 17939 アパー トメント ６ (72)発明者 マリナク ナンシー ジェイ エス アメリカ合衆国 ワシントン州 98117 シアトル ノースウェスト エイティ ナインス 1900 アパートメント ２ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/04 C12Q 1/34 C12Q 1/04 C12R 1:19 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】サンプル、液状育成培地及び酵素指示デバ
イスを、単一の容器中、特定の微生物又は微生物群の生
育に許容される温度にてインキュベ−トする工程であっ
て、該酵素指示デバイスは、水性系において不溶性であ
り、該酵素に特異的であり、かつ非吸収性固体担体の表
面上に位置している色素−形成性基質を含み、該色素−
形成性色素は該酵素により切断されたとき、不溶性沈殿
物を形成する工程、及び、 非吸収性固体担体の表面上の着色不溶物沈殿物により、
該特定の微生物又は微生物群の存在を検出する工程、 を含む、サンプル中の特定の微生物又は微生物群に関連
する酵素のアッセイ法。 - 【請求項２】色素−形成性基質が以下の式で示される置
換インジゴ誘導体： （ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】特定の微生物がE.コリであり、微生物群が
大腸菌群細菌である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】サンプルが水、飲料水、排水、食品又は環
境サンプルである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】サンプルを液状育成培地に添加する工程、 サンプル育成培地を、特定の微生物又は微生物群の育成
に許容される温度にて、微生物生育の痕跡が認められる
までインキュベ−トする工程、 酵素指示デバイスを添加する工程であって、該酵素指示
デバイスは、水性系において不溶性であり、酵素に特異
的であり、かつ非吸収性固体担体の表面に位置している
色素−形成性基質を含み、該色素−形成性基質は該酵素
により切断されたとき、不溶性着色沈殿物を形成する工
程、 サンプル育成培地及び酵素指示デバイスを、許容された
温度にて約１〜約24時間インキュベ−トする工程、及
び、 特定の微生物又は微生物群の存在を、該酵素指示デバイ
ス上の色に変化により視覚的に検出する工程、 を含むサンプル中の特定の微生物又は微生物群に関連す
る酵素を単一の容器内でアッセイする方法。 - 【請求項６】色素−形成性基質が以下の式で示される置
換インジゴ誘導体： （ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】特定の微生物がE.コリであり、微生物群が
大腸菌群細菌である、請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】サンプルが水、飲料水、排水、食品又は環
境サンプルである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】酵素に関連する特定の微生物又は微生物群
のアッセイ用酵素指示デバイスであって、非吸収性固体
担体表面上に付着された色素−形成性基質を含み、該基
質は該酵素により切断されて該非吸収性固体担体表面上
に不溶性着色沈殿物を形成することを特徴とするデバイ
ス。 - 【請求項１０】色素−形成性基質が以下の式で示される
置換インジゴ誘導体： （ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項９に記載のデバイス。 - 【請求項１１】本質的に非吸収性固体担体表面上に付着
された１以上の色素−形成性基質からなる、E.コリ又は
大腸菌群細菌のアッセイ用酵素指示デバイスであって、
該色素−形成性基質がE.コリ又は大腸菌群細菌由来の酵
素により切断されたとき、不溶性沈殿物を形成するデバ
イス。 - 【請求項１２】少なくとも１つの色素−形成性基質が以
下の式で示される置換インジゴ誘導体： （ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項11に記載のデバイス。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34503389A | 1989-04-27 | 1989-04-27 | |
| US345,033 | 1989-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04504802A JPH04504802A (ja) | 1992-08-27 |
| JP3043063B2 true JP3043063B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=23353176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2507544A Expired - Lifetime JP3043063B2 (ja) | 1989-04-27 | 1990-04-27 | 微生物のための沈澱テスト |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5403721A (ja) |
| EP (1) | EP0470172B1 (ja) |
| JP (1) | JP3043063B2 (ja) |
| AU (1) | AU639237B2 (ja) |
| CA (1) | CA2062753C (ja) |
| DE (1) | DE69020555T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990012888A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2708285B1 (fr) * | 1993-07-28 | 1995-10-20 | Rambach Alain | Procédé d'identification de microorganismes avec un milieu supplémenté en hydrate de carbone. |
| US5750357A (en) * | 1994-05-18 | 1998-05-12 | Microquest Diagnostics, Inc. | Method of rapid analyte detection |
| CZ282401B6 (cs) * | 1994-09-09 | 1997-07-16 | Lachema A.S. | Způsob provedení konformačných testů pomocí fluorchromních substrátů u indikátorů fekálního znečištění či potenciálně patogenních bakterií |
| US5770435A (en) * | 1995-11-02 | 1998-06-23 | University Of Chicago | Mutant E. coli strain with increased succinic acid production |
| US5869301A (en) * | 1995-11-02 | 1999-02-09 | Lockhead Martin Energy Research Corporation | Method for the production of dicarboxylic acids |
| US6459805B1 (en) * | 1996-03-26 | 2002-10-01 | Childrens Hospital Los Angeles | Fluorescence digital imaging microscopy system |
| FR2751663B1 (fr) * | 1996-07-29 | 1998-10-02 | Bio Merieux | Procede de mise en evidence d'une activite enzymatique de microorganismes |
| US5972641A (en) * | 1998-08-28 | 1999-10-26 | Colifast Systems Asa | Rapid coliform detection system |
| CA2286414A1 (en) * | 1999-10-04 | 2001-04-04 | Zhibo Gan | Non-separation heterogenous assay for biological substance |
| US20030138906A1 (en) * | 2001-11-05 | 2003-07-24 | Ingun Tryland | Fluorescence test for measuring heterotrophic bacteria in water |
| US8501433B2 (en) * | 2002-11-01 | 2013-08-06 | Pierce Biotechnology, Inc. | Solvent for chromogenic substrate solution |
| IL154782A0 (en) * | 2003-03-06 | 2003-10-31 | J G Systems Inc | Chemical-mechanical polishing composition containing organic nitro compounds |
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