ES2298406T3 - Metodo para la identificacion sistematica de agentes antibacterianos. - Google Patents
Metodo para la identificacion sistematica de agentes antibacterianos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2298406T3 ES2298406T3 ES02783293T ES02783293T ES2298406T3 ES 2298406 T3 ES2298406 T3 ES 2298406T3 ES 02783293 T ES02783293 T ES 02783293T ES 02783293 T ES02783293 T ES 02783293T ES 2298406 T3 ES2298406 T3 ES 2298406T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- transpeptidase
- peptidoglycan
- udp
- reaction mixture
- alanine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Un método de identificación sistemática en busca de agentes antibacterianos potenciales, que comprende: (1) proporcionar una preparación de membrana obtenida a partir de una cepa bacteriana, en el que la preparación de membrana carece de actividad de peptidoglucano transpeptidasa; (2) preparar una mezcla de reacción que comprende la preparación de membrana, un UDP-N-acetilmuramilpentapéptido, una UDP-N-acetilglucosamina marcada radiactivamente, y una fuente de iones metálicos divalentes; (3) incubar la mezcla de reacción durante un periodo definido, en condiciones adecuadas para que se produzca la síntesis del péptidoglucado no reticulado; (4) añadir la mezcla de reacción de la etapa (3), (a) una fuente de peptidoglucano transpeptidasa, para permitir la síntesis del peptidoglucano reticulado, y (b) un compuesto de ensayo; (5) después de un periodo definido, añadir a la mezcla de reacción de la etapa (4) un agente fluorescente soportado por, en o sobre un sustrato capaz de unirse alas paredes de la células bacterianas, y un detergente; y (6) medir la energía luminosa emitida por el agente fluorescente, la cual es indicativa de la presencia de peptidoglucano reticulado marcado radiactivamente.
Description
Método para la identificación sistemática de
agentes antibacterianos.
La presente invención se refiere a un método
para identificar sistemáticamente agentes antibacterianos.
El peptidoglucano es un componente principal de
la pared celular bacteriana, que da a la pared su forma y
resistencia. Es única para las bacterias, y se encuentra en todas
las bacterias, tanto gram positivas como gram negativas. El
peptidoglucano es un polímero de cadenas de glucano que están
reticuladas a través de puentes peptídicos cortos. Consta de restos
enlazados \beta1-4 alternos de
N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido
N-acetilmurámico (MurNAc). Una cadena pentapeptídica
está unida a MurNAc
(MurNAc-pentapéptido), y la reticulación se
produce entre estas cadenas peptídicas.
La biosíntesis de peptidoglucano se puede
dividir en tres etapas: en primer lugar, la síntesis de los
precursores en el citoplasma; en segundo lugar, la transferencia de
los precursores a una molécula portadora lipídica; y, en tercer
lugar, la inserción de los precursores en la pared celular y el
acoplamiento al peptidoglucano existente.
Los precursores sintetizados en el citoplasma
son los nucleótidos de azúcares:
- UDP-N-acetil-glucosamina (UDP-GlcNAc) y UDP-N-acetilmuramilpentapéptido (UDP-MurNAc-pentapéptido).
La segunda etapa, que ocurre en la membrana
citoplásmica, está catalizada por dos enzimas, e implica la síntesis
de una unidad disacárida en un portador lipídico, el fosfato de
undecaprenilo. El portador lipídico también está implicado en la
síntesis de otros componentes de la pared celular bacteriana.
La primera enzima cataliza la transferencia de
fosforil-N-actilmuramilpentapéptido desde
UDP-MurNAc-pentapéptido a
fosfato de undecaprenilo, con la liberación simultánea de UMP. Esta
enzima se denomina
fosfo-N-acetil-muramil-pentapéptido
translocasa (en lo sucesivo denominada como "la translocasa"),
y es el producto del gen mraY en Escherichia coli. El
producto,
undecaprenil-pirofosfato-N-acetilmuramilpentapéptido
(Lípido-P-P-MurNAc-pentapéptido)
o Lípido I o precursor I enlazado a Lípido, es el sustrato para la
segunda enzima.
La N-acetilglucosaminiltransferasa
transfiere N-acetilglucosamina desde
UDP-GlcNAc (con liberación simultánea de UDP) para
formar
undecaprenil-pirofosforil-N-acetilmuramilpentapéptido-N-acetilglucosamina,
o Lípido II o precursor II enlazado a Lípido. Esta enzima también se
denomina
UDP-N-acetilglucosamina:N-acetilmuramil-(pentapéptido)-P-P-undecaprenil-N-acetilglucosamina
transferasa (en lo sucesivo denominado como "la transferasa").
La enzima es el producto del gen murG en Escherichia
coli.
Las enzimas translocasa y transferasa son
esenciales para la viabilidad bacteriana (véanse, respectivamente,
D. S. Boyle y W. D. Donachie, J. Bacteriol., (1998), 180,
6429-6432, y D. Mengin-Lecreulx, L.
Texier, M. Rousseaue e Y. Van Heijernoot, J. Bacteriol., (1991),
173, 4625-4636).
En la tercera etapa, en el exterior de la
membrana citoplásmica, se produce la polimerización del glucano. La
unidad de disacárido-pentapéptido se transfiere
desde el portador lipídico a una unidad o polímero de disacárido
existente, mediante una peptidoglucano transglucosilasa (también
denominada como una peptidoglucano polimerasa) (en lo sucesivo
denominada como "la transglucosilasa"). La unión del puente
peptídico está catalizada por la peptidoglucano transpeptidasa (en
lo sucesivo denominada como "la transpeptidasa"). Ambas
actividades enzimáticas, que son esenciales, residen en la misma
molécula, las proteínas de unión a penicilina (o PBP), como en PBP
1a o 1b en Escherichia coli. Éstas son los productos de los
genes ponA y ponB, respectivamente, en Escherichia coli.
Hay varias PBP en la célula bacteriana, y éstas
se pueden dividir en dos clases, las PBP de baja masa molecular
(LMM) y de alta masa molecular (HMM). Algunas de las PBP de HMM son
enzimas bifuncionales que tienen actividad tanto de transpeptidasa
como de transglucosilasa. De las PBP de HMM, se ha demostrado que
PBP2 y PBP3, y PBP1A o PBP1B de E. coli, son esenciales para
la viabilidad celular. Las PBP de LMM parecen importantes pero no
esenciales para el crecimiento celular (por ejemplo, las PBP 4, 5, 6
de E. coli se pueden suprimir, dando como resultado defectos
de crecimiento, pero la célula sobrevive; véase S.A. Denome, P.K.
Elf, T.A. Henderson, D.E. Nelson y K.D. Young, J. Bacteriol.,
(1999), 181(13), 3981-3993).
En la transferencia de la unidad de
disacárido-pentapéptido desde el precursor lipídico
a una cadena de peptidoglucano existente, el lípido se libera como
una molécula de pirofosfato de undecaprenilo. Ésta se ha de romper
mediante una undecaprenil pirofosforilasa sensible a bacitracina,
también denominada undecaprenil pirofosforilasa o
C55-isoprenil pirofosforilasa (en lo sucesivo
denominada como la "lípido pirofosforilasa"), para generar
fosfato de undecaprenilo, el cual puede entonces volver a entrar en
el ciclo en la segunda etapa.
Tanto la enzima transglucosilasa como la
transpeptidasa (que residen en las proteínas de unión a penicilina
de alto peso molecular, o PBP) representan dianas principales para
el descubrimiento de fármacos que no se han explotado completamente
debido a la falta de ensayos adecuados susceptibles a una
identificación sistemática de alto rendimiento. Dos antibióticos van
dirigidos contra estas proteínas: los glucopéptidos y los
antibióticos beta-lactámicos - penicilinas y
cefalosporinas. Los antibióticos beta-lactámicos,
que inhiben la transpeptidasa, son uno de los más exitosos, y han
producido muchas generaciones de fármacos. La vancomicina, un
glucopéptido, es un inhibidor de la transglucosilasa y, en muchos
casos de resistencia a fármacos, es el último recurso para el
tratamiento de infecciones bacterianas. De este modo, se piensa que
nuevos inhibidores de la transglucosilasa y de la transpeptidasa
tendrán éxito y se podrían convertir en antibióticos clínicamente
útiles.
La enzima transpeptidasa tradicionalmente ha
sido difícil de ensayar. Debido a la actividad de transpeptidasa,
típicamente se forma una reticulación entre el cuarto aminoácido,
D-alanina, de una cadena peptídica y el tercer
aminoácido, por ejemplo ácido diaminopimélico (o
L-lisina en algunas bacterias), de una cadena
peptídico adyacente. El ensayo verdadero para la inhibición de la
transpeptidación es analizar el peptidoglucano formado en busca del
grado de reticulación, lo que es un ensayo muy laborioso; en
presencia de un inhibidor de transpeptidasa, el grado de
reticulación se reduce.
Durante la formación de la reticulación
peptídica, se libera el quinto aminoácido,
D-alanina. Se conoce en la técnica un ensayo
indirecto para la transpeptidasa, que monitoriza la liberación de
D-alanina. Sin embargo, puesto que la misma reacción
también puede ocurrir con una carboxipeptidasa (que escinde la
D-alanina sin formar una reticulación peptídica), la
actividad de transpeptidasa se mide como liberación de
D-alanina que depende de la presencia de
UDP-MurNAc y
UDP-GlcNAc en el ensayo. Esto requiere que la
liberación de la D-alanina se produzca
concomitantemente con la síntesis y reticulación del peptidoglucano;
la actividad de carboxipeptidasa debería de ser independiente de la
síntesis y de la presencia de UDP-GlcNAc en
particular.
Otro método conocido para ensayar la
transpeptidasa se basa en la escisión de una
\beta-lactama coloreada, por ejemplo nitrocefina.
Los antibióticos \beta-lactámicos se unen
covalentemente a un resto de serina de sitio activo en la
transpeptidasa, inactivando de ese modo la actividad de la enzima.
El anillo \beta-lactámico se hidroliza en el
proceso, y, si se usa una \beta-lactama como
nitrocefina, la hidrólisis se puede monitorizar colorimétricamente.
Este método no es muy sensible como medida de la actividad de
transpeptidasa, aunque se usa ampliamente para estudiar la actividad
de \beta-lactamasas.
El método más fácilmente conocido para la
detección de inhibidores de la transpeptidasa es mediante
competición (mediante un compuesto de ensayo) por la unión de una
\beta-lactama marcada (por ejemplo radiactiva o
fluorescente) a una proteína que se une a penicilina. Esto se ha
usado de forma muy frecuente para identificar sistemáticamente
nuevos inhibidores. Debido a la naturaleza del ensayo, la mayoría de
los inhibidores recogidos en esta identificación sistemática son
nuevas \beta-lactamas que actúan mediante el mismo
mecanismo, esto es, uniéndose covalentemente al resto de serina de
sitio activo de la transpeptidasa. Puesto que las bacterias han
desarrollado resistencias a los antibióticos
\beta-lactámicos, lo que es debido a la presencia
de enzimas (\beta-lactamasas) que hidrolizan las
\beta-lactamas, es deseable encontrar inhibidores
de transpeptidasa que no sean \beta-lactamas.
Según la presente invención, se proporciona por
lo tanto un método para identificar sistemáticamente agentes
antibacterianos potenciales, el cual comprende:
- (1)
- proporcionar una preparación de membrana obtenida a partir de una cepa bacteriana, en el que la preparación de membrana carece de actividad de peptidoglucano transpeptidasa;
- (2)
- preparar una mezcla de reacción que comprende la preparación de membrana, un UDP-N-acetilmuramilpentapéptido (UDP-MurNAc-pentapéptido), una UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) marcada radiactivamente, y una fuente de iones metálicos divalentes;
- (3)
- incubar la mezcla de reacción durante un periodo definido, en condiciones adecuadas para que se produzca la síntesis del peptidoglucano no reticulado;
- (4)
- añadir la mezcla de reacción de la etapa (3),
- (a)
- una fuente de peptidoglucano transpeptidasa, para permitir la síntesis del peptidoglucano reticulado, y
- (b)
- un compuesto de ensayo;
- (5)
- después de un periodo definido, añadir a la mezcla de reacción de la etapa (4) un agente fluorescente soportado por, en o sobre un sustrato capaz de unirse a las paredes de la células bacterianas, y un detergente; y
- (6)
- medir la energía luminosa emitida por el agente fluorescente, que es indicativa de la presencia de peptidoglucano reticulado marcado radiactivamente.
En el contexto de la presente memoria
descriptiva, se debería de entender que la abreviatura "UDP" se
refiere a uridin-(5')-difosfato.
El método según la presente invención se lleva a
cabo muy convenientemente usando placas de microtitulación de 96
pocillos, permitiendo de ese modo una forma rápida, simple y
reproducible de medir la actividad enzimática.
Las membranas bacterianas se pueden preparar
como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 99/60155. Las
membranas representan una fuente de translocasa, transferasa,
transglucosilasa, lípido pirofosforilasa y fosfato de undecaprenilo,
que son necesarios para obtener el peptidoglucano no reticulado. Sin
embargo, las membranas carecen de actividad de peptidoglucano
transpeptidasa. Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo en
contacto las membranas bacterianas con un inhibidor de
peptidoglucano transpeptidasa (por ejemplo, ampicilina), o usando
las membranas de una cepa bacteriana mutante en la que la
peptidoglucano transpeptidasa esta inactivada por mutación (por
ejemplo, una mutación de punto o una mutación por supresión).
La cantidad de membranas usadas típicamente
estarán en el intervalo de 1 a 20 \mug, particularmente de 4 a 6
\mug, de proteína por pocillo de la placa de microtitulación.
En una realización de la invención, se usan las
membranas de la bacteria Escherichia coli. Los ejemplos de
cepas de E. coli que se pueden usar incluyen AMA1004.
Adicionalmente, se puede hacer uso de la cepa AMA1004
\DeltaponB::Spc^{r} de E. coli cuando se
transforma con un vector de expresión (por ejemplo, un plásmido) que
comprende un gen homólogo o heterólogo que codifica una proteína de
unión a penicilina que carece de actividad de peptidoglucano
transpeptidasa, pero que tiene actividad de peptidoglucano
transglucosilasa.
El
UDP-MurNAc-pentapéptido usado
puede ser cualquiera de los habitualmente presentes en
peptidoglucanos de origen natural, y se purifica convenientemente a
partir de bacterias, o se obtiene enzimáticamente con precursores a
partir de bacterias, por ejemplo mediante métodos similares a los
descritos por T. den Blaauwen, M. Aarsman y N. Nanninga, J.
Bacteriol, (1990), 172, 63-70).
En una realización de la invención, el
UDP-MurNAc-pentapéptido usado
es
UDP-MurNAc-L-alanina-ácido
\gamma-D-glutámico-ácido
m-diaminopimélico-D-analina-D-alanina
procedente de Bacillus cereus.
La concentración de
UDP-MurNAc-pentapéptido usado
por pocillo de placa de microtitulación estará típicamente en el
intervalo de 5 \muM a 300 \muM, por ejemplo de 5 \muM, 10
\muM, 15 \muM, 20 \muM o 25 \muM, hasta e incluyendo 50
\muM, 75 \muM, 100 \muM, 150 \muM, 200 \muM o 250 \muM
por pocillo de la placa de microtitulación.
Como UDP-N-acetilglucosamina marcada
radiactivamente, es conveniente usar UDP-N-acetilglucosamina
tritiada (UDP-[^{3}H]GlcNAc, comercialmente
disponible de NEN-Dupont) a una concentración en el
intervalo de, por ejemplo, 0,25 \muM, 0,5 \muM, 1,0 \muM, 2,5
\muM, 4,2 \muM o 5 \muM, hasta e incluyendo 10 \muM, 12,5
\muM, 15 \muM, 20 \muM o 25 \muM, por pocillo de la placa de
microtitulación. Se han usado ventajosamente concentraciones de
UDP-N-acetilglucosamina marcada radiactivamente de 4,2 \muM
(con 0,6 a 1,2 \muCi por pocillo).
Los iones metálicos divalentes usados son
preferiblemente iones de magnesio. Una fuente adecuada de iones de
magnesio es cloruro de magnesio, por ejemplo a una concentración en
el intervalo de 5 a 30 mM, particularmente 10 a 25 mM, por pocillo
de la placa de microtitulación.
En la etapa (2) del método, puede ser
conveniente usar un medio acuoso, tal como una disolución tampón,
por ejemplo de HEPES-amoníaco,
HEPES-KOH (siendo HEPES
N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[ácido
2-etanosulfónico]) o hidrocloruro de
Tris[hidroximetil]aminometano
("Tris-HCl"), teniendo la disolución tampón un
pH de alrededor de 7,5. HEPES y Tris-HCl están
comercialmente disponibles de Sigma-Aldrich Company
Limited.
La mezcla de reacción preparada en la etapa (2)
se incuba en la etapa (3) a una temperatura en el intervalo de, por
ejemplo, 20ºC a 37ºC, durante un periodo en el intervalo de, por
ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 ó 50 minutos, hasta e incluyendo
100, 110, 120, 130, 140 ó 150 minutos, en condiciones adecuadas para
que se produzca la síntesis del peptidoglucano no reticulado
catalizada por enzimas.
En la etapa (4) de la invención, se añade una
fuente de peptidoglucano transpetidasa, para permitir la síntesis
del peptidoglucano reticulado. También, en la etapa (4), se añade un
compuesto de ensayo que tiene propiedades antibacterianas
potenciales, típicamente en una disolución acuosa de
dimetilsulfóxido.
La mezcla de reacción de la etapa (4) se incuba
durante un periodo adicional a una temperatura en el intervalo de,
por ejemplo, 20ºC a 37ºC. El periodo de incubación normalmente será
más corto que el periodo de incubación para la mezcla de reacción de
la etapa (3), por ejemplo en un intervalo de 1, 5, 10 ó 15 minutos,
hasta e incluyendo 20, 25 ó 30 minutos.
Una vez que el periodo de incubación haya
finalizado, cualquier reacción posterior se termina con la adición,
en la etapa (5), del agente fluorescente soportado por, en o sobre
un sustrato adecuado, y del detergente, a la mezcla de reacción.
El detergente es cualquier agente que sea capaz
de emulsionar aceite y/o actúe como un agente humectante o como un
tensioactivo. Los ejemplos de detergentes que se puede usar incluyen
Triton X-100^{TM}
(t-octilfenoxipolietoxietanol), Tween 20
(monolaurato de polioxietilensorbitán), Tween 80 (monooleato de
polioxietilensorbitán),
octil-\beta-glucósido, CHAPS
(sulfonato de
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano),
Brij-35 (polioxietilenlauriléter) y Sarkosyl^{TM}
(laurilsarcosinato de sodio).
El agente fluorescente usado puede ser
cualquiera de los empleados habitualmente en ensayos de proximidad
por centelleo. El agente fluorescente está asociado con, o está
soportado por, en o sobre un sustrato, por ejemplo, perlas
revestidas con lectina, perlas que se unen a ARN, perlas de PVT
(poliviniltolueno) revestidas con anticuerpo
anti-ratón, o perlas de PVT revestidas con
aglutinina de germen de trigo, perlas las cuales están
comercialmente disponibles de Amersham Inc. El sustrato (por ejemplo
perlas) escogido debe de ser capaz de unirse a las paredes de las
células bacterianas.
En una realización de la invención, se usan
perlas revestidas con lectina (particularmente perlas revestidas con
aglutinina de germen de trigo), impregnadas con un agente
fluorescente, por ejemplo como se describe en la patente US nº
4.568.649 y en la Patente Europea nº 154.734. Las perlas (conocidas
como perlas de "ensayo de proximidad por centelleo" (o SPA))
están comercialmente disponibles de Amersham Inc.
Las perlas (con el agente fluorescente), que se
añaden convenientemente en forma de una suspensión acuosa, se ponen
en contacto con la mezcla de reacción de la etapa (4) durante un
periodo de al menos 10 minutos, preferiblemente 3 a 10 horas o más
(por ejemplo todo la noche), antes de que la placa se "cuente"
en la etapa (6), por ejemplo en un contador "Microbeta
Tilux".
Sin desear estar ligados a ninguna teoría
particular, se cree que, a través de la unión del sustrato al
material de la pared celular bacteriana (por ejemplo la perlas de
SPA revestidas con aglutinina de germen de trigo son capaces de
unirse a moléculas de azúcar, específicamente
N-acetilglucosamina, presente en el material de la
pared celular bacteriana), el peptidoglucano reticulado, marcado
radiactivamente, formado en la etapa (4), se pone en estrecha
proximidad con el agente fluorescente, el cual se activa por la
energía de radiación, dando como resultado la emisión de energía
luminosa, la cual se mide en la etapa (6). De este modo, se cree que
la luz emitida por el agente fluorescente es indicativa de la
formación de peptidoglucano reticulado.
La presente invención se explicará ahora
adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos
ilustrativos, en los que la abreviatura HEPES se refiere a
N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[ácido
2-etanosulfónico].
Ejemplo
1
Se incubaron 4 mg de membranas celulares de la
cepa AMA1004 de Escherichia coli, preparadas como se describe
en el documento WO 99/60155, con 5 ml de 100 mM de ampicilina en 50
mM de tampón Tris HCl pH 7,5 y 0,1 mM de MgCl_{2} durante 30
minutos a temperatura ambiente. Las membranas se sedimentaron
mediante centrifugación a 150.000 x g durante 15 minutos, y después
se lavaron tres veces. Finalmente se resuspendieron en 1 ml de 50 mM
de tampón Tris HCl y 0,1 mM de MgCl_{2}.
Los pocillos de una placa de microtitulación se
rellenaron individualmente con 15 \mul de una disolución que
contiene 5 \mug de membrana celulares de la cepa AMA1004 de
Escherichia coli, tratadas con ampicilina como se describe
anteriormente (las membranas proporcionaron una fuente de
translocasa, transferasa, transglucosilasa, lípido pirrofosforilasa
y fosfato de undecaprenilo), 15 \muM de
UDP-MurNAc-L-alanina-ácido
\gamma-D-glutámico-ácido
m-diaminopimélico-D-alanina-D-alanina,
4,2 \muM de UDP-N-acetilglucosamina tritiada (0,6 \muCi -
1,2 \muCi por pocillo), 50 mM de tampón de
HEPES-amoniaco pH 7,5, y 10 mM de cloruro de
magnesio (MgCl_{2}). La placa de microtitulación se incubó a 37ºC
durante 120 minutos.
A cada pocillo se añadieron entonces 10 \mul
que contiene 50 mM de tampón HEPES-amoniaco pH 7,5,
10 mM de MgCl_{2}, UDP-N-acetilglucosamina hasta una
concentración final (en 25 \mul) de 250 \muM, un extracto que
contiene PBP1b (una fuente de enzima transpeptidasa) obtenido de las
membranas de \DeltaponA;pBS96 AMA1004 de Escherichia
coli, y 2 \mul de compuesto de ensayo (penicilina G, un
inhibidor de transpeptidasa conocido), en dimetilsulfóxido
(DMSO).
En \DeltaponA;pBS96 AMA1004 de
Escherichia coli, el gen ponA que codifica PBP1a está
inactivado, y el gen ponB que codifica PBP1b está sobreexpresado,
puesto que la cepa contiene un plásmido que comprende una copia
adicional de ponB bajo el control de su promotor natural. Las
membranas de esta cepa de E. coli se prepararon como se
describe en el documento WO 99/60155. Después se trataron con un
detergente, 1% de sulfonato de
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano
(CHAPS), y 1M de NaCl, a una concentración de proteína de 5 mg/ml,
durante una hora a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó
entonces a 150.000 x g durante 15 minutos en una ultracentrifugadora
de mesa Beckman, y se recogió el sobrenadante que contiene PBP1b. La
cantidad de proteína PBP1p usada fue la "fracción soluble"
equivalente a 5 \mug de membrana de partida.
La placa de microtitulación se incubó a 37ºC
durante 15 minutos, y después se añadieron 75 \mul de ácido
etilendiaminotetracético (EDTA) 6 mM.
Tras la adición del EDTA, se añadieron a cada
pocillo 100 \mul de una suspensión acuosa de perlas de ensayo de
proximidad por centelleo revestidas con aglutinina de germen de
trigo, las cuales comprenden 500 \mug de perlas en una disolución
de 50 mM de tampón de HEPES-amoniaco pH 7,5 que
contiene 0,4% de detergente "Sarkosyl" (laurilsarcosinato de
sodio), de forma que la concentración final de detergente
"Sarkosyl" (en 200 \mul) fue 0,2%.
La placa de microtitulación se dejó durante 3 a
10 horas a temperatura ambiente antes de contarla en el contador
"Microbeta Trilux".
Como controles se usaron cuatro pocillos de la
placa de microtitulación: dos pocillos no contenían extracto que
contiene PBP1b (controles de reacción de 0%), y otros dos pocillos
no contenían compuesto de ensayo (controles de reacción de
100%).
La Tabla 1 a continuación enumera los efectos
inhibidores de la penicilina G sobre la enzima transpeptidasa
(después de restar las lecturas de reacción de 0%
correspondientes).
Ejemplo
2
En este Ejemplo, se repitió el método descrito
en el Ejemplo 1, excepto que, en (i), las membranas usadas son
aquellas de \DeltaponB::Spc^{r} AMA1004 de Escherichia
coli, un mutante a partir del cual se ha inactivado el gen ponB
que codifica PBP1b, como se describe por S.Y. Yousif, J.K.
Broome-Smith y B.G. Spratt, J. Gen. Microbiol.,
(1985), 131, 2839-2845. El mutante se transforma con
un plásmido que expresa PBP1b que tiene una mutación Ser510Ala. Ésta
es la serina de sitio activo a la que se unen covalentemente las
\beta-lactamas. De este modo, las membranas
carecen de actividad de transpeptidasa, y por lo tanto no es
necesario tratar las membranas con ampicilina.
Claims (9)
1. Un método de identificación sistemática en
busca de agentes antibacterianos potenciales, que comprende:
- (1)
- proporcionar una preparación de membrana obtenida a partir de una cepa bacteriana, en el que la preparación de membrana carece de actividad de peptidoglucano transpeptidasa;
- (2)
- preparar una mezcla de reacción que comprende la preparación de membrana, un UDP-N-acetilmuramilpentapéptido, una UDP-N-acetilglucosamina marcada radiactivamente, y una fuente de iones metálicos divalentes;
- (3)
- incubar la mezcla de reacción durante un periodo definido, en condiciones adecuadas para que se produzca la síntesis del péptidoglucado no reticulado;
- (4)
- añadir la mezcla de reacción de la etapa (3),
- (a)
- una fuente de peptidoglucano transpeptidasa, para permitir la síntesis del peptidoglucano reticulado, y
- (b)
- un compuesto de ensayo;
- (5)
- después de un periodo definido, añadir a la mezcla de reacción de la etapa (4) un agente fluorescente soportado por, en o sobre un sustrato capaz de unirse a las paredes de la células bacterianas, y un detergente; y
- (6)
- medir la energía luminosa emitida por el agente fluorescente, la cual es indicativa de la presencia de peptidoglucano reticulado marcado radiactivamente.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que el UDP-N-acetilmuramilpentapéptido es
UDP-MurNAc-L-alanina-ácido
\gamma-D-glutámico-ácido
m-diaminopimélico-D-alanina-D-alanina.
3. Un método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la fuente de iones metálicos divalentes
es cloruro de magnesio.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la cepa bacteriana es una cepa de
Escherichia coli.
5. Un método según la reivindicación 4, en el
que la cepa de Escherichia coli es AMA1004, y en el que la
preparación de membrana obtenida a partir de ella se pone en
contacto con un inhibidor de peptidoglucano transpeptidasa.
6. Un método según la reivindicación 4, en el
que la cepa de Escherichia coli es AMA1004
\DeltaponB::Spc^{r} transformada con un vector de
expresión que comprende un gen homólogo o heterólogo que codifica
una proteína de unión a penicilina carente de actividad de
peptidoglucano transpeptidasa.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente fluorescente está
soportado por, en o sobre perlas revestidas con lectina.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el detergente se selecciona de
Triton X-100^{TM} y Sarkosyl^{TM}.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el compuesto de ensayo es un
antagonista de la transpeptidasa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0104101A SE0104101D0 (sv) | 2001-12-05 | 2001-12-05 | New assay |
| SE0104101 | 2001-12-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2298406T3 true ES2298406T3 (es) | 2008-05-16 |
Family
ID=20286221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02783293T Expired - Lifetime ES2298406T3 (es) | 2001-12-05 | 2002-12-03 | Metodo para la identificacion sistematica de agentes antibacterianos. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7419788B2 (es) |
| EP (1) | EP1453971B1 (es) |
| AT (1) | ATE385522T1 (es) |
| AU (1) | AU2002347358A1 (es) |
| DE (1) | DE60224944T2 (es) |
| ES (1) | ES2298406T3 (es) |
| SE (1) | SE0104101D0 (es) |
| WO (1) | WO2003048381A2 (es) |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4568649A (en) | 1983-02-22 | 1986-02-04 | Immunex Corporation | Immediate ligand detection assay |
| DE3483099D1 (de) | 1984-03-15 | 1990-10-04 | Immunex Corp | Test zur sofortigen feststellung von liganden, testsatz und seine herstellung. |
| SE8804657D0 (sv) * | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Gerald Potter Colin | Support structure for use in a proximity assey |
| SE9404072D0 (sv) | 1994-11-24 | 1994-11-24 | Astra Ab | Novel polypeptides |
| JP2002501931A (ja) | 1998-02-02 | 2002-01-22 | プリンストン ユニバーシティ | ＭｕｒＧの基質類似体、その製造方法およびそれを用いたアッセイ |
| CA2332796A1 (en) | 1998-05-15 | 1999-11-25 | Astrazeneca Ab | A scintillation proximity assay for the detection of peptidoglycan synthesis |
| US20010049117A1 (en) | 1998-08-20 | 2001-12-06 | Helena R. Axelrod | Analogs of udp-murnac peptides, assays, kits and related methods of their use |
| AU3615200A (en) | 1999-03-03 | 2000-09-21 | Princeton University | Bacterial transglycosylases: assays for monitoring the activity using lipid ii substrate analogs and methods for discovering new antibiotics |
| US6913895B1 (en) | 1999-08-17 | 2005-07-05 | Advanced Medicine East, Inc. | Methods for assaying transglycosylase reactions, and for identifying inhibitors thereof |
| JP2003535598A (ja) | 2000-06-08 | 2003-12-02 | アストラゼネカ アクチボラグ | 薬剤スクリーニングにおけるトランスロカーゼ酵素活性検出のためのアッセイ |
-
2001
- 2001-12-05 SE SE0104101A patent/SE0104101D0/xx unknown
-
2002
- 2002-12-03 US US10/497,415 patent/US7419788B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-03 EP EP02783293A patent/EP1453971B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-03 WO PCT/GB2002/005534 patent/WO2003048381A2/en active IP Right Grant
- 2002-12-03 DE DE60224944T patent/DE60224944T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-03 AU AU2002347358A patent/AU2002347358A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-03 AT AT02783293T patent/ATE385522T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-12-03 ES ES02783293T patent/ES2298406T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2002347358A8 (en) | 2003-06-17 |
| SE0104101D0 (sv) | 2001-12-05 |
| US7419788B2 (en) | 2008-09-02 |
| DE60224944D1 (de) | 2008-03-20 |
| US20050032137A1 (en) | 2005-02-10 |
| DE60224944T2 (de) | 2009-02-05 |
| EP1453971B1 (en) | 2008-02-06 |
| ATE385522T1 (de) | 2008-02-15 |
| EP1453971A2 (en) | 2004-09-08 |
| AU2002347358A1 (en) | 2003-06-17 |
| WO2003048381A2 (en) | 2003-06-12 |
| WO2003048381A3 (en) | 2003-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maitra et al. | Cell wall peptidoglycan in Mycobacterium tuberculosis: An Achilles’ heel for the TB-causing pathogen | |
| Ali et al. | The growing genetic and functional diversity of extended spectrum beta-lactamases | |
| Aliashkevich et al. | LD‐transpeptidases: the great unknown among the peptidoglycan cross‐linkers | |
| Maddox et al. | Antimicrobial resistance in bacteria from horses: epidemiology of antimicrobial resistance | |
| Höltje | From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherichia coli | |
| Abdullah et al. | Structure of the pneumococcal l, d‐carboxypeptidase DacB and pathophysiological effects of disabled cell wall hydrolases DacA and DacB | |
| US20060228766A1 (en) | Assay for detection of transferase enzyme activity in drug screening | |
| Catherwood et al. | Substrate and stereochemical control of peptidoglycan cross-linking by transpeptidation by Escherichia coli PBP1B | |
| O'Connor et al. | Starvation‐independent sporulation in Myxococcus xanthus involves the pathway for β‐lactamase induction and provides a mechanism for competitive cell survival | |
| ES2298406T3 (es) | Metodo para la identificacion sistematica de agentes antibacterianos. | |
| US7354731B2 (en) | Method of screening for potential anti-bacterial agents | |
| AU739994B2 (en) | A scintillation proximity assay for the detection of peptidoglycan synthesis | |
| Park et al. | β-Lactam resistance development affects binding of penicillin-binding proteins (PBPs) of Clostridium perfringens to the fluorescent penicillin, BOCILLIN FL | |
| Hugonneau-Beaufet et al. | Characterization of Pseudomonas aeruginosa L, D-transpeptidases and evaluation of their role in peptidoglycan adaptation to biofilm growth | |
| Bernal | The Cpx pathway causes changes in peptidoglycan structure, turnover, and recycling | |
| Xu et al. | Novel determinant of antibiotic resistance: a clinically selected Staphylococcus aureus clpP mutant survives daptomycin treatment by reducing binding of the antibiotic and adapting a rod-shaped morphology | |
| Park et al. | Divergent LD-transpeptidase-independent effects of peptidoglycan carboxypeptidases on intrinsic β-lactam and vancomycin resistance | |
| Chun | Investigating the Interaction between lytic transglycosylases and Ivyp1 & Ivyp2 in Pseudomonas aeruginosa | |
| Sarkar | Role of Auxiliary Membrane Components in Beta-Lactam Antibiotic Sensitivity of Escherichia coli | |
| MAWLOOD | The role of penicillin binding protein 4 in β-lactam resistance in Staphylococcus aureus | |
| Dodson | A Genetic and Molecular Analysis of Antimicrobial Agent Resistance in Staphylococci | |
| Suvorov | Regulation of cell wall biosynthesis and resistance to antibiotics |