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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening auf potentielle
antibakterielle Mittel.
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Peptidoglycan
ist ein Hauptbestandteil der bakteriellen Zellwand, der der Wand
ihre Form und Stärke gibt.
Es kommt ausschließlich
in Bakterien vor, wobei es sich in allen Bakterien, sowohl gram-positiven
als auch gram-negativen,
findet. Bei Peptidoglycan handelt es sich um ein Polymer aus Glycansträngen, die über kurze
Peptidbrücken
quervernetzt sind. Es besteht aus einander abwechselnden β1-4-verknüpften Resten
von N-Acetylglucosamin
(GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure
(MurNAc). An MurNAc ist eine Pentapeptidkette gebunden (MurNAc-Pentapeptid),
wobei zwischen diesen Peptidketten eine Quervernetzung stattfindet.
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Die
Biosynthese von Peptidoglycan läßt sich
in drei Stufen einteilen: erstens die Synthese der Vorstufe im Cytoplasma,
zweitens die Übertragung
der Vorstufe auf ein Lipidträgermolekül und drittens
die Insertion der Vorstufe in die Zellwand sowie die Kupplung an
bereits bestehendes Peptidoglycan.
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Bei
den im Cytoplasma synthetisierten Vorstufen handelt es sich um die
Zuckernukleotide:
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UDP-N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc) und
UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid
(UDP-MurNAc-Pentapeptid).
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Die
zweite Stufe, die in der cytoplasmatischen Membran stattfindet,
wird von zwei Enzymen katalysiert und beinhaltet die Synthese einer
Disaccharideinheit an einem Lipidträger, Undecaprenyiphosphat.
Der Lipidträger
ist auch an der Synthese anderer Bestandteile der Bakterienzellwand
beteiligt.
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Das
erste Enzym katalysiert die Übertragung
von Phosphoryl-N-acetylmuramylpentapeptid von UDP-MurNAc-Pentapeptid auf Undecaprenylphosphat
bei gleichzeitiger Freisetzung von UMP. Dieses Enzym wird Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translokase
(nachfolgend als "die
Translokase" bezeichnet)
genannt und ist das Produkt des Gens mraY in Escherichia coli. Das
Produkt, Undecaprenylpyrophosphat-N-acetylmuramylpentapeptid (Lipid-P-P-MurNAc-pentapeptid)
bzw. Lipid I bzw. lipidverknüpfte
Vorstufe I, stellt das Substrat für das zweite Enzym dar.
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N-Acetylglucosaminyl-Transferase überträgt N-Acetylglucosamin
von UDP-GlcNAc (bei gleichzeitiger Freisetzung von UDP) unter Bildung
von Undecaprenylpyrophosphoryl-N-acetylmuramylpentapeptid-N-acetylglucosamin
bzw. Lipid II bzw. lipidverknüpfte
Vorstufe II. Dieses Enzym wird auch UDP-N-acetylglucosamin:N-Acetylmuramyl(pentapeptid)-P-P-undecaprenyl-N-acetylglucosamin-Transferase
(nachfolgend als "die Transferase" bezeichnet) genannt.
Das Enzym ist das Produkt des Gens murG in Escherichia coli.
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Die
Translokase- und Transferase-Enzyme sind für die Lebensfähigkeit
der Bakterien essentiell (siehe D. S. Boyle und W. D. Donachie,
J. Bacteriol., (1998), 180, 6429–6432 bzw. D. Mengin-Lecreulx,
L. Texier, M. Rousseaue und Y. Van Heijernoot, J. Bacteriol., (1991),
173, 4625–4636).
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In
der dritten Stufe findet an der Außenseite der cytoplasmatischen
Membran die Polymerisation des Glycans statt. Dabei wird die Disaccharid-Pentapeptideinheit
vom Lipidträger
auf eine bereits bestehende Disaccharideinheit oder ein bereits
bestehendes Polymer durch eine Peptidoglycan-Transglycosylase (auch als Peptidoglycan-Polymerase
bezeichnet) (nachfolgend als "die
Transglycosylase" bezeichnet) übertragen.
Die Verbindung der Peptidbrücke
wird durch Peptidoglycan-Transpeptidase (nachfolgend als "die Transpeptidase" bezeichnet) katalysiert.
Beide Enzymaktivitäten,
die jeweils essentiell sind, befinden sich im gleichen Molekül, nämlich den
Penicillin-Bindungsproteinen
(oder PBPs), wie beispielsweise in PBP 1a bzw. 1b in Escherichia coli.
Hierbei handelt es sich um die Produkte der Gene ponA bzw. ponB
in Escherichia coli.
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In
der Bakterienzelle gibt es mehrere PBPs, die sich in zwei Klassen,
und zwar PBPs mit geringem Molekulargewicht (LMM) und hohem Molekulargewicht
(HMM), einteilen lassen. Bei den HMM-PBPs handelt es sich teilweise
um bifunktionelle Enzyme, die sowohl Transpeptidase- als auch Transglycosylase-Aktivität aufweisen.
Es konnte gezeigt werden, daß von
den HMM-PBPs PBP2
und PBP3 sowie entweder PBP1A oder PBP1B von E. coli für die Lebensfähigkeit
der Zelle essentiell sind. Die LMM-PBPs scheinen für das Zellwachstum
wichtig, jedoch nicht essentiell zu sein (z. B. die PBPs 4, 5, 6
von E. coli lassen sich deletieren, was zu Wachstumsdefekten führt, wobei
die Zelle jedoch überlebt,
siehe S. A. Denome, P. K. Elf, T. A. Henderson, D. E. Nelson und
K. D. Young, J. Bacteriol., (1999), 181(13), 3981–3993).
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Bei
der Übertragung
der Disaccharid-Pentapeptideinheit von der Lipidvorstufe auf eine
bereits bestehende Peptidoglycankette wird das Lipid in Form eines
Moleküls
Undecaprenylpyrophosphat freigesetzt. Letzteres muß von einer
Bacitracin-sensitiven Undecaprenyl-Pyrophosphorylase, auch Undecaprenyl-Pyrophosphorylase
bzw. C55-Isoprenyl-pyrophophorylase (nachfolgend als die "Lipid-Pyrophosphorylase" bezeichnet) genannt,
gespalten werden, um Undecaprenyiphosphat zu erzeugen, das dann
in der zweiten Stufe in den Kreislauf zurückkehren kann.
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Sowohl
das Transglycosylase- als auch das Transpeptidase-Enzym (die innerhalb
der hochmolekularen Penicillin-Bindungsproteine oder PBPs liegen)
stellen Hauptziele für
die Entdeckung von Arzneistoffen dar, die aufgrund des Fehlens geeigneter
Tests, die einem Screening mit hohem Durchsatz zugänglich sind,
noch nicht voll ausgenutzt wurden. Zwei Antibiotika zielen auf diese
Proteine ab: die Glycopeptide sowie die beta-Lactam-Antibiotika-Penicilline und Cephalosporine.
Die beta-Lactam-Antibiotika, die die Transpeptidase hemmen, sind
eines der erfolgreichsten Antibiotika und führten zu vielen Generationen
von Arzneistoffen. Vancomycin, ein Glycopeptid, ist ein Inhibitor
der Transglycosylase und stellt in vielen Fällen von Arzneistoffresistenz
den letzten Ausweg für
die Behandlung bakterieller Infektionen dar. Es wird somit angenommen,
daß neue Inhibitoren
der Transglycosylase und Transpeptidase genauso erfolgreich sind
und zu klinisch geeigneten Antibiotika werden könnten.
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Das
Transpeptidase-Enzym ist traditionell schwer zu testen. Aufgrund
von Transpeptidase-Aktivität wird
typischerweise eine Quervernetzung zwischen der vierten Aminosäure, D-Alanin,
einer Peptidkette und der dritten Aminosäure, z. B. Diaminopimelinsäure (oder
L-Lysin in einigen Bakterien) einer benachbarten Peptidkette gebildet.
Der wahre Test für
die Hemmung der Transpeptidierung besteht in der Analyse des gebildeten Peptidoglycans
auf den Grad der Quervernetzung, wobei es sich hier um einen sehr
arbeitsaufwendigen Test handelt; in Gegenwart eines Transpeptidase-Inhibitors
ist der Grad der Quervernetzung reduziert.
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Während der
Ausbildung der Peptidquervernetzung wird die fünfte Aminosäure, D-Alanin, freigesetzt. Im
Stand der Technik ist ein indirekter Test für die Transpeptidase bekannt,
bei dem die Freisetzung von D-Alanin
verfolgt wird. Allerdings wird, da die gleiche Reaktion auch bei
einer Carboxypeptidase (die das D- Alanin ohne Bildung einer Peptidquervernetzung
abspaltet) erfolgen kann, die Transpeptidase-Aktivität als D-Alanin-Freisetzung
gemessen, die vom Vorhandensein von UDP-MurNAc und UDP-GlcNAc im
Test abhängt.
Dafür ist
es notwendig, daß die
Freisetzung des D-Alanins gleichzeitig mit der Synthese und Quervernetzung
des Peptidoglycans erfolgt; die Carboxypeptidase-Aktivität sollte
von der Synthese und dem Vorhandensein insbesondere von UDP-GlcNAc
unabhängig
sein.
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Ein
weiteres bekanntes Verfahren zum Testen der Transpeptidase beruht
auf der Spaltung eines gefärbten β-Lactams,
z. B. Nitrocefin. Die β-Lactam-Antibiotika
binden kovalent an einen Serinrest des aktiven Zentrums in der Transpeptidase,
wodurch die Enzymaktivität
inaktiviert wird. Der β-Lactamring
wird dabei hydrolysiert, und die Hydrolyse läßt sich bei Verwendung eines β-Lactam-ähnlichen
Nitrocefins kolorimetrisch verfolgen. Dieses Verfahren ist als Messung
der Transpeptidase-Aktivität
nicht besonders empfindlich, doch findet es breite Anwendung zur
Untersuchung der Aktivität
von β-Lactamasen.
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Das
einfachste bekannte Verfahren zum Nachweis von Inhibitoren der Transpeptidase
besteht im Konkurrieren (einer Testverbindung) um die Bindung eines
markierten (z. B. radioaktiven oder fluoreszierenden) β-Lactams
an ein Penicillin-Bindungsprotein. Dieses Verfahren wurde am häufigsten
zum Screening auf neue Inhibitoren eingesetzt. Aufgrund der Beschaffenheit
des Tests, handelt es sich bei den meisten bei diesem Screening
gefundenen Inhibitoren um neue β-Lactame,
die über
den gleichen Mechanismus wirken, das heißt, durch kovalente Bindung
an den Serinrest des aktiven Zentrums der Transpeptidase. Da Bakterien
gegenüber den β-Lactam-Antibiotika eine
Resistenz entwickelt haben, die auf das Vorhandensein von Enzymen
(β-Lactamasen),
die die β-Lactame
hydrolysieren, zurückzuführen ist,
ist es wünschenswert,
Transpeptidase-Inhibitoren zu finden, bei denen es sich nicht um β-Lactame
handelt.
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Im
Sinne der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zum Screening
auf potentielle antibakterielle Mittel bereitgestellt, das die folgenden
Schritte umfaßt:
- (1) Bereitstellen einer aus einem Bakterienstamm
gewonnenen Membranpräparation,
wobei der Membranpräparation
Peptidoglycan-Transpeptidase-Aktivität fehlt;
- (2) Herstellen eines Reaktionsansatzes, der die Membranpräparation,
ein UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid (UDP-MurNAC-Pentapeptid), radioaktiv
markiertes UDP-N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc) sowie eine Quelle
für zweiwertige
Metallionen umfaßt;
- (3) Inkubieren des Reaktionsansatzes über einen festgelegten Zeitraum
unter zum Stattfinden der Synthese von nicht quervernetztem Peptidoglycan
geeigneten Bedingungen;
- (4) Versetzen des Reaktionsansatzes aus Schritt (3) mit
(a)
einer Quelle für
Peptidoglycan-Transpeptidase, um die Synthese von quervernetztem
Peptidoglycan zu gestatten, und
(b) einer Testverbindung;
- (5) nach einem festgelegten Zeitraum Versetzen des Reaktionsansatzes
aus Schritt (4) mit einem von einem zur Bindung an Bakterienzellwände fähigen Substrat
geträgerten,
darin oder darauf befindlichen Fluoreszenzmolekül sowie einem Detergens; und
- (6) Messen der von dem Fluoreszenzmolekül emittierten Lichtenergie,
wodurch das Vorhandensein von radioaktiv markiertem quervernetztem
Peptidoglycan angezeigt wird.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung ist zu verstehen,
daß sich
die Abkürzung "UDP" auf Uridin-(5'-)diphosphat bezieht.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung wird am zweckmäßigsten
unter Verwendung von 96-Loch-Mikrotiterplatten durchgeführt, was
einen schnellen, einfachen und reproduzierbaren Weg zur Messung
von Enzymaktivität
ermöglicht.
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Die
Bakterienmembranen können
wie in Beispiel 1 der
WO 99/60
155 beschrieben präpariert
werden. Die Membranen stellen eine Quelle für Translokase, Transferase,
Transglycosylase, Lipid-Pyrophosphorylase und Undecaprenylphosphat
dar, die zur Herstellung von nicht quervernetztem Peptidoglycan
notwendig sind. Allerdings fehlt den Membranen Peptidoglycan-Transpeptidase-Aktivität. Dies
läßt sich
beispielsweise dadurch erreichen, daß man die Bakterienmembranen
mit einem Inhibitor der Peptidoglycan-Transpeptidase (z. B. Ampicillin)
in Kontakt bringt oder die Membranen eines mutanten Bakterienstamms
verwendet, in dem die Peptidoglycan-Transpeptidase durch Mutation
(z. B. eine Punktmutation oder Deletionsmutation) inaktiviert ist.
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Die
verwendete Menge an Membranen liegt typischerweise im Bereich von
1 bis 20 μg,
insbesondere 4 bis 6 μg,
Protein pro Loch der Mikrotiterplatte.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden die Membranen von Escherichia coli-Bakterien verwendet. Zu
den E. coli-Stämmen,
die verwendet werden können,
gehört
beispielsweise AMA1004. Darüber hinaus
kann der E. coli-Stamm AMA1004 ΔponB::Spcr verwendet werden, wenn dieser mit einem
Expressionsvektor (z. B. einem Plasmid) transformiert ist, der ein
homologes oder heterologes Gen enthält, das für ein Penicillin-Bindungsprotein
codiert, dem die Peptidoglycan-Transpeptidase-Aktivität fehlt,
das jedoch Peptidoglycan-Transglycosylase-Aktivität besitzt.
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Bei
dem verwendeten UDP-MurNAc-Pentapeptid kann es sich um eines der üblicherweise
in natürlich vorkommenden
Peptidoglycanen vorhandenen UDP-MurNAc-Pentapeptide handeln, wobei
dieses zweckmäßigerweise
aus Bakterien aufgereinigt oder enzymatisch mit Vorstufen aus Bakterien
hergestellt wird, beispielsweise mit ähnlichen Verfahren wie denen
von T. den Blaauwen, M. Aarsman und N. Nanninga, J. Bacteriol.,
(1990), 172, 63–70).
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
handelt es sich bei dem verwendeten UDP-MurNAc-Pentapeptid um UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin aus
Bacillus cereus.
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Die
Konzentration des verwendeten UDP-MurNAc-Pentapeptids liegt typischerweise im
Bereich von 5 μM
bis 300 μM,
beispielsweise von 5 μM,
10 μM, 15 μM, 20 μM oder 25 μM bis zu
und einschließlich
50 μM, 75 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM oder 250 μM pro Loch
der Mikrotiterplatte.
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Als
radioaktiv markiertes UDP-N-Acetylglucosamin wird zweckmäßigerweise
tritiertes UDP-N-Acetylglucosamin (UDP-[3H]GlcNAc,
im Handel erhältlich
von NEN-Dupont), beispielsweise in einer Konzentration im Bereich
von 0,25 μM,
0,5 μM,
1,0 μM,
2,5 μM,
4,2 μM oder
5 μM bis
zu und einschließlich
10 μM, 12,5 μM, 15 μM, 20 μM oder 25 μM pro Loch
der Mikrotiterplatte, verwendet. Die Konzentrationen des radioaktiv
markierten UDP-N-Acetylglucosamins
von 4,2 μM
(mit 0,6 bis 1,2 μCi
pro Loch) wurden vorteilhafterweise verwendet.
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Bei
den verwendeten zweiwertigen Metallionen handelt es sich vorzugsweise
um Magnesiumionen. Eine geeignete Quelle für Magnesiumionen ist Magnesiumchlorid, beispielsweise
in einer Konzentration im Bereich von 5 bis 30 mM, insbesondere
von 10 bis 25 mM, pro Loch der Mikrotiterplatte.
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In
Schritt (2) des Verfahrens kann die Verwendung eines wäßrigen Mediums,
wie beispielsweise einer Pufferlösung,
z. B. von HEPES-Ammoniak, HEPES-KOH (HEPES ist N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) oder
Tris[hydroxymethyl]aminomethan-Hydrochlorid
("Tris-HCl"), zweckmäßig sein,
wobei die Pufferlösung
einen pH-Wert von etwa 7,5 aufweist. HEPES und Tris-HCl sind im
Handel von der Firma Sigma-Aldrich
Co. Ltd. erhältlich.
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Der
in Schritt (2) hergestellte Reaktionsansatz wird in Schritt (3)
bei einer Temperatur im Bereich von beispielsweise 20°C bis 37°C über einen
Zeitraum von beispielsweise 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 oder 50 Minuten bis
zu und einschließlich
100, 110, 120, 130, 140 oder 150 Minuten, unter geeigneten Bedingungen,
so daß die
enzymkatalysierte nicht quervernetzte Peptidoglycansynthese stattfinden
kann, inkubiert.
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In
Schritt (4) der Erfindung wird eine Quelle für Peptidoglycan-Transpeptidase
zugegeben um die Synthese von quervernetztem Peptidoglycan zu gestatten.
Ebenso wird in Schritt (4) eine Testverbindung mit potentiell antibakteriellen
Eigenschaften zugegeben, und zwar typischerweise in einer wäßrigen Lösung von
Dimethylsulfoxid.
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Der
Reakionsansatz aus Schritt (4) wird über einen weiteren Zeitraum
bei einer Temperatur im Bereich von beispielsweise 20°C bis 37°C inkubiert.
Dabei ist der Inkubationszeitraum normalerweise kürzer als
der Inkubationszeitraum für
den Reaktionsansatz aus Schritt (3), z. B. im Bereich von 1, 5,
10 oder 15 Minuten bis zu und einschließlich 20, 25 oder 30 Minuten.
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Nach
dem Ende der Inkubation wird jede weitere Reaktion bei Zugabe des
von einem geeigneten Substrat geträgerten, darin oder darauf befindlichen
Fluoreszenzmoleküls
sowie des Detergens zum Reaktionsansatz in Schritt (5) gestoppt.
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Bei
dem Detergens handelt es sich um ein beliebiges Agens, das Öl emulgieren
kann und/oder als Benetzungsmittel oder Tensid wirkt. Als Detergentien
können
beispielsweise unter anderem Triton X-100TM (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol),
Tween 20 (Polyoxyethylensorbitan-monolaurat), Tween 80 (Polyoxyethylensorbitan-monooleat),
Octyl-β-glycosid,
CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat),
Brij-35 (Polyoxyethylen-laurylether) und SarkosylTM (Natriumlaurylsarcosinat)
verwendet werden.
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Bei
dem verwendeten Fluoreszenzmolekül
kann es sich um eines der routinemäßig in Scintillationsproximitätstests
eingesetzten Fluoreszenzmoleküle
handeln. Das Fluoreszenzmolekül
ist mit einem Substrat, beispielsweise mit Lectin beschichteten
Kügelchen,
RNA bindenden Kügelchen,
mit Anti-Maus-Antikörper
beschichteten PVT (Polyvinyltoluol)-Kügelchen oder mit Weizenkeimagglutinin
beschichteten PVT-Kügelchen, assoziiert
oder davon, darin oder darauf geträgert, wobei alle diese Kügelchen
im Handel von der Firma Amersham Inc. erhältlich sind. Das gewählte Substrat
(z. B. Kügelchen)
sollte in der Lage sein, an Bakterienzellwände zu binden.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden mit einem Fluoreszenzmolekül imprägnierte, mit Lectin beschichtete
Kügelchen
(insbesondere mit Weizenkeimagglutinin beschichtete Kügelchen)
verwendet, wie beispielsweise im
US-Patent
Nr. 4 568 649 und im
europäischen Patent
Nr. 154 734 beschrieben. Die Kügelchen (bekannt unter dem
Namen SPA ("Scintillation Proximity
Assay")-Beads) sind
im Handel bei der Firma Amersham Inc. erhältlich.
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Die
Kügelchen
(mit Fluoreszenzmolekül),
die zweckmäßigerweise
in Form einer wäßrigen Suspension zugegeben
werden, werden mit dem Reaktionsansatz aus Schritt (4) über einen
Zeitraum von wenigstens 10 Minuten, vorzugsweise 3 bis 10 Stunden,
oder länger
(z. B. über
Nacht), in Kontakt gebracht, bevor die Platte in Schritt (6) beispielsweise
in einem "Microbeta
Tilux"-Zählgerät "ausgezählt" wird.
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Ohne
an irgendeine besondere Theorie gebunden zu sein wird angenommen,
daß über die
Bindung des Substrats an Bakterienzellwandmaterial (beispielsweise
sind mit Weizenkeimagglutinin beschichtete SPA-Beads in der Lage,
im Bakterienzellwandmaterial vorhandene Zuckermoleküle, insbesondere
N-Acetylglucosamin, zu binden) in Schritt (4) gebildetes radioaktiv
markiertes quervernetztes Peptidoglycan in enge Nachbarschaft mit
dem Fluoreszenzmolekül
gebracht wird, wobei letzteres durch die Strahlungsenergie aktiviert
wird, was zur Emission von Lichtenergie führt, welche in Schritt (6)
gemessen wird. Somit wird angenommen, daß von dem Fluoreszenzmolekül emittiertes
Licht einen Indikator für
die Bildung von quervernetztem Peptidoglycan darstellt.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden
veranschaulichenden Beispiele, bei denen die Abkürzung HEPES sich auf N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] bezieht, näher erläutert.
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Beispiel 1
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(i) Bildung von radioaktiv markiertem
nicht quervernetztem Peptidoglycan
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Wie
in der
WO 99/60 155 beschrieben
präparierte
Escherichia coli AMA1004-Zellmembranen (4 mg) wurden mit 5 ml 100
mM Ampicillin in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, und 0,1 mM MgCl
2 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Membranen wurden durch 15 minütige Zentrifugation bei 150
000 × g
sedimentiert und anschließend
dreimal gewaschen. Schließlich
wurden sie in 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer und 0,1 mM MgCl
2 resuspendiert.
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Die
Löcher
einer Mikrotiterplatte wurden einzeln jeweils mit 15 μl einer Lösung mit
5 μg mit
Ampicillin wie oben beschrieben behandelten Escherichia coli AMA1004-Zellmembranen
(durch die Membranen wurde eine Quelle für Translokase, Transferase,
Transglycosylase, Lipid-Pyrophosphorylase und Undecaprenyiphosphat
bereitgestellt), 15 μM
UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin,
4,2 μM tritiertes
UDP-N-Acetylglucosamin (0,6 μCi – 1,2 μCi pro Loch),
50 mM HEPES-Ammoniak-Puffer pH 7,5, und 10 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) gefüllt.
Die Mikrotiterplatte wurde 120 Minuten bei 37°C inkubiert.
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(ii) Bildung von radioaktiv markiertem
quervernetztem Peptidoglycan
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In
jedes Loch wurden dann jeweils 10 μl mit 50 mM HEPES-Ammoniak-Puffer,
pH 7,5, 10 mM MgCl2, UDP-N-Acetylglucosamin
bis zu einer Endkonzentration (in 25 μl) von 250 μM, einem PBP1b (einer Quelle
für Transpeptidase-Enzym)
enthaltenden Extrakt, der aus den Membranen von Escherichia coli
AMA1004 ΔponA; pBS96
gewonnen wurde, und 2 μl
Testverbindung (Penicillin G, einem bekannten Transpeptidase-Inhibitor)
in Dimethylsulfoxid (DMSO) gegeben.
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In
Escherichia coli AMA1004 ΔponA;
pBS96, ist das für
PBP1a codierende ponA-Gen inaktiviert und das für PBP1b codierende ponB-Gen überexprimiert,
da der Stamm ein Plasmid mit einer weiteren Kopie von ponB unter
der Kontrolle seines nativen Promotors enthält. Die Membranen dieses E.
coli-Stamms wurden wie in der
WO
99/60 155 beschrieben präpariert. Sie wurden anschließend mit
einem Detergens, 1% (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat
(CHAPS), und 1 M NaCl bei einer Proteinkonzentration von 5 mg/ml
1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Der Ansatz wurde dann 15
Minuten bei 150 000 × g
in einer Beckman-Tischultrazentrifuge zentrifugiert und der PBP1b
enthaltende Überstand
gesammelt. Bei der verwendeten PBP1b-Proteinmenge handelte es sich
um die zu 5 μg
Ausgangsmembran äquivalente "lösliche Fraktion".
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Die
Mikrotiterplatte wurde 15 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach 75 μl 6 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
zugegeben wurden.
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(iii) Nachweis von radioaktiv markiertem
quervernetztem Peptidoglycan
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Nach
Zugabe der EDTA wurden in jedes Loch jeweils 100 μl einer wäßrigen Suspension
von mit Weizenkeimagglutinin beschichteten Scintillation-Proximity-Assay-Beads,
die 500 μg
Kügelchen
in einer Lösung von
50 mM HEPES-Ammoniak-Puffer, pH 7,5, mit 0,4% "Sarkosyl"-Detergens (Natriumlaurylsarcosinat)
enthielt, so daß die
Endkonzentration des "Sarkosyl"-Detergens (in 200 μl) 0,2% betrug.
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Man
ließ die
Mikrotiterplatte 3 bis 10 Stunden bei Raumtemperatur stehen, wonach
im "Microbeta Trilux"-Zählgerät ausgezählt wurde.
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Vier
Löcher
der Mikrotiterplatte wurden als Kontrollen verwendet: zwei Löcher enthielten
keinen Extrakt mit PBP1b (0%-Reaktionskontrollen), wobei zwei weitere
Löcher
keine Testverbindung enthielten (100%-Reaktionskontrollen).
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Nachfolgend
sind in Tabelle 1 die Hemmeffekte von Penicillin G auf das Transpeptidase-Enzym
(nach Subtraktion der entsprechenden 0%-Reaktionsablesewerte) aufgeführt. Tabelle 1
| Testverbindung | Counts
pro Minute | %
Hemmung |
| | 5296 | 0 |
| Penicillin
G | 319 | 94 |
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Beispiel 2
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In
diesem Beispiel wird das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt,
mit der Ausnahme, daß es
sich bei den in (i) verwendeten Membranen um diejenigen aus Escherichia
coli AMA1004 ΔponB::Spcr, einer Mutante, aus der das für PBP1b
codierende Gen ponB inaktiviert wurde, wie bei S. Y. Yousif, J.
K. Broome-Smith und B. G. Spratt, J. Gen. Microbiol., (1985), 131,
2839–2845
beschrieben, handelte. Die Mutante wird mit einem PBP1b exprimierenden
Plasmid, das eine Ser510Ala-Mutation aufweist, transformiert. Hierbei handelt
es sich um das Serin des aktiven Zentrums, an das die β-Lactame
kovalent binden. Somit fehlt den Membranen Transpeptidase-Aktivität, und diese
brauchen daher nicht mit Ampicillin behandelt zu werden.
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Schlüssel zu den Figuren
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1
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- Figure → Figur
- inhibition → Hemmung
- Conc → Konz.
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2
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- Figure Figur
- inhibition → Hemmung
- Conc → Konz.
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3
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- Figure → Figur
- inhibition → Hemmung
- Conc → Konz.
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4
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- Figure → Figur
- inhibition → Hemmung
- Conc → Konz.
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5
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- Figure → Figur
- inhibition → Hemmung
- Conc → Konz.