DE60014879T2 - Test zum nachweis der aktivität von phospho-n-acetylmuramyl-pentapeptid-translokase - Google Patents
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Description
- Die folgende Erfindung betrifft einen neuen Test zum Nachweis der Enzymaktivität von Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translocase (im folgenden als "Translocase-Enzym" bezeichnet).
- Peptidoglycan ist ein Hauptbestandteil der bakteriellen Zellwand, der der Wand ihre Form und Stärke verleiht. Es kommt nur in Bakterien vor und wird in allen Bakterien, sowohl grammpositiven als auch grammnegativen, angetroffen. Bei Peptidoglycan handelt es sich um ein Polymer aus Glycansträngen, die über kurze Peptidbrücken quervernetzt sind. Es besteht aus einander abwechselnden β1-4-verknüpften Resten von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc). Eine Pentapeptidkette wird an MurNAc gebunden (MurNAc-pentapeptid), und die Peptidoglycan-Polymere werden über diese Peptidketten quervernetzt.
- Die Biosynthese von Peptidoglycan läßt sich in drei Stufen einteilen: erstens, Synthese der Vorläufermoleküle im Cytoplasma, zweitens, Transfer der Vorläufermoleküle zu einem Lipid-Trägermolekül und drittens, Insertion der Vorläufermoleküle in die Zellwand und Kopplung an existierendes Peptidoglycan.
- Für die Biosynthese der Peptidoglycankomponente der Bakterienzellwand verantwortliche Enzyme sind neue Zielmoleküle für den Entwurf neuer Antibiotika. Aufgrund des weltweiten Auftretens von gegenüber zur Zeit erhältlichen Antibiotika resistenten Bakterienstämmen wurde es notwendig, neue antimikrobielle Agenzien zu entwickeln. Das Translocase-Enzym katalysiert den ersten Schritt im Membranzyklus der Peptidoglycanbiosynthese, nämlich den Transfer von Phospho-N-acetylmuramyl-L-Ala-γ-D-Glu-m-diaminopimellinsäure-D-Ala-D-Ala von Uridin-5'-diphosphat-phospho-N-acetylmuramyl-L-Ala-γ-D-Glu-m-diaminopimelinsäure-D-Ala-D-Ala (im folgenden als "UDP-MurNAc-pentapeptid" bzw. "UDP-Mpp" bezeichnet) auf einen membrangebundenen Lipidträger, Undecaprenylphosphat. Das Translocase-Enzym wird durch das mraY-Gen in Escherichia coli codiert.
- Das Translocase-Enzym ist für die bakterielle Viabilität essentiell (siehe D. Mengin-Lecreulx, L. Texier, M. Rousseaue und J. Van Heijemoot, J. Bacteriol., (1991), 173, 4625–4636).
- Keine der zur Zeit verwendeten kommerziellen Antibiotika sind gegen das Translocase-Enzym gerichtet. Es stellt daher ein Zielmolekül für neue antibakterielle Agenzien dar, das bisher noch nicht ausgenutzt worden ist.
- Das Translocase-Enzym wird normalerweise dadurch getestet, daß das UDP-MurNAc-pentapeptid radioaktiv markiert und der Transfer des Phospho-N-acetylmuramylpentapeptids vom UDP-MurNAc-pentapeptid auf Undecaprenylphosphat, was zur Bildung einer Lipid-Zwischenverbindung, Lipid I, führt, verfolgt wird. Die radioaktive Markierung wird üblicherweise durchgeführt, indem entweder das Enzymligase zur Markierung des D-Alanin-D-Alanin-Endes verwendet wird oder der In-Vivo-Einbau an der Membran erfolgt. Beide Verfahren produzieren niedrige Ausbeuten und sind somit nicht kostengünstig bei der Entwicklung von Screening-Tests mit hohem Durchsatz (high-throughput-screening (HTS)-Assays).
- Aus Mengin-Lectreulx et al. (1991), 'The murG gene of Escherichia coli codes for the UDP-N-acetylgludosamine:N-acetylmuramyl-(pentapeptide)phosphoryl-undecaprenol N-acetylglucosamine transferase involved in the membrane steps of peptidoglycan synthesis, Journal of Bacteriology, Band 173, Nr. 15, Seiten 4625 bis 4636 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Phospho-N-Acetylmuranylpentapeptid- Translocase bekannt, bei dem man
- a) das Enzym mit an den beiden D-Ala-Resten mit 14C markiertem UDP-MurNAc-pentapeptid, Mg2+ und Membranen umsetzt;
- b) das Reaktionsgemisch zum Abstoppen der Reaktion kocht;
- c) die Reagenzien und Produkte durch Chromatographie trennt und die Radioaktivität mißt.
- Als Alternative kann die Translocase-Enzymaktivität mit einem fluoreszierenden Substrat, wie z.B. Dansylchlorid, getestet werden, wie von Brandish et al., J. Biol. Chem., (1996), 271, 7609–7614 beschrieben. Bestimmte Verbindungen können jedoch die Fluoreszenz quenchen, sodaß dadurch falsche Inhibitoren der Enzymreaktion gefunden werden.
- Es wäre wünschenswert, einen Test für das Translocase-Enzym zu entwickeln, der sich für ein Screening mit hohem Durchsatz eignet.
- Erfindungsgemäß wird daher ein Test zum Nachweise der Enzymaktivität von Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translocase bereitgestellt, bei dem man:
- (1) einen Reaktionsansatz, der in einem wäßrigen Medium mit [2,3-3H]-Propionsäure-N-succinimidylester substituiertes UDP-MurNAc-pentapeptid, mit Propionsäure-N-succinimidylester substituiertes UDP-MurNAc-pentapeptid (nicht radioaktiv), eine Quelle zweiwertiger Metallionen, eine Undecaprenylphosphat-Quelle, eine Translocaseenzym-Quelle sowie ein Detergenz enthält, unter Bedingungen, die für das Auftreten von Enzymaktivität geeignet sind, inkubiert;
- (2) den Reaktionsansatz mit einem geeigneten Puffer, der ein quaternäres Ammoniumsalz bei einem pH-Wert von ca. 4,2 enthält, zum Abstoppen der Enzymreaktion aus Schritt (1) ansäuert; und
- (3) eventuell als Produkt gebildetes Undecaprenolpyrophosphat-[2,3-3H]propionat-N-acetylmuramylpentapeptid extrahiert und die Radioaktivität mit einem Szintillationszähler mißt.
- Dabei kann es sich bei dem in Schritt (1) verwendeten UDP-MPP um eines der normalerweise in natürlich vorkommenden Peptidoglykanen vorhandenen UDP-MPP-Molekülen handeln. Es wird zweckmäßigerweise aus Bakterien gereinigt oder enzymatisch mit Vorläufermolekülen aus Bakterien hergestellt, beispielsweise mit Verfahren, ähnlich wie dem von Blaauwen et al.; J. Bacteriol. (1990), 172, 63–70 beschriebenen. Als Alternative kann es aus Zellen von B. subtilits W23 mit der von Lugtenberg et al.; J.Bacteriol. (1972), 109, 326–335 beschriebenen Methodik isoliert werden. Bevorzugt wird als UDP-MPP UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimellinsäure-D-alanin-D-alanin aus Bacillus cereus verwendet.
- Das so erhaltene UDP-MPP wird mit [2,3-3H]-Propionsäure-N-succinimidylester (kommerziell erhältlich von Amersham Ltd.) unter Erhalt von mit [2,3-3H]-Propionsäure-N-succinimidylester substituiertem UDP-MurNAc-Pentapeptid (im folgenden als "3H-propioniertes UDP-MPP" bezeichnet) umgesetzt.
- Die Konzentration des im Test verwendeten 3H-propionierten UDP-MPP liegt typischerweise im Bereich von 2 bis 50 μM, vorzugsweise von 2 bis 40 μM und besonders bevorzugt von 2 bis 25 μM.
- Die Konzentration des ebenfalls in der Reaktion verwendeten nichtmarkierten, nichtradioaktiven mit Propionsäure-N-succinimidylester substituierten UDP-MPP (im folgenden als "propioniertes nicht radioaktives UDP-MPP" bezeichnet) kann im Bereich von 5 bis 70 μM, vorzugsweise von 5 bis 50 μM und vor allem von 8 bis 30 μM liegen.
- Bei den in der Reaktion verwendeten zweiwertigen Metallionen handelt es sich vorzugsweise um Magnesiumionen. Eine geeignete Quelle von Magnesiumionen ist Magnesiumchlorid. Die Konzentration der verwendeten zweiwertigen Metallionen kann im Bereich von 20 mM bis 100 mM, vorzugsweise von 20 mM bis 80 mM, ganz besonders bevorzugt von 20 mM bis 50 mM, z.B. 25 mM, liegen.
- Darüberhinaus kann Kaliumchlorid in einer Konzentration und im Bereich von 50 mM bis 100 mM zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
- Zweckmäßigerweise können die Membranen von Escherichia coli-Bakterien verwendet werden und sind in der Tat als Quelle für Undecaprenylphosphat und Translocaseenzym bevorzugt. Die Menge der verwendeten Memranen liegt typischerweise im Bereich von 5 bis 200 μg, vorzugsweise 50 μg, pro 50 μl Reaktionsgemisch. Die Membranen können mit im Fachgebiet bekannten Verfahren präpariert werden.
- Bei dem in Schritt (1) verwendeten wäßrigen Medium handelt es sich vorzugsweise um eine Pufferlösung, z.B. von Tris[hydroxymethyl]aminomethan-hydrochlorid ("Tris-HCl"), mit einem pH-Wert von etwa 7,5. Tris-HCl ist kommerziell von Sigma Aldrich Co. Ltd. erhältlich.
- Das Reaktionsgemisch kann zusätzlich 0,01 Einheit alkalische Phosphatase enthalten.
- Bei dem verwendeten Detergenz kann es sich beispielsweise um Triton X-100 in einer Konzentration von 0,1% (w/v) handeln. Das Detergenz kann bei der Solubilisierung der Bakterienmembranen, falls diese verwendet werden, wirksam sein.
- Falls der Test als Screen zur Identifizierung antibakterieller Verbindungen, die Antagonisten des Translocase-Enzyms sind, verwendet werden soll, so kann das Reaktionsgemisch im Schritt (1) weiterhin eine oder mehrere Testverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen umfassen. Da es sich bei der Translocase um das im ersten Schritt der Peptidoglycansynthese benötigte Enzym handelt, stellt es ein geeignetes Ziel für die Entwicklung antibakterieller Arzneistoffe dar.
- Das Reaktionsgemisch aus Schritt (1) wird bei einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 37°C, vorzugsweise 25°C, über einen kurzen Zeitraum, z.B. bis zu 10 Minuten, insbesondere 6–8 Minuten, gehalten.
- Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von beispielsweise 6 M Pyridiniumacetat und n-Butanol (pH ~ 4,2) in einem 2:1-Gemisch gestoppt. Dies stellt Schritt (2) dar.
- In Schritt (3) wird das Produkt beispielsweise mit n-Butanol extrahiert. Es wird dann in einem Szintillationszähler quantifiziert.
- Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel weiter veranschaulicht.
- Beispiel 1
- Eppendorfröhrchen wurden zunächst einzeln jeweils mit insgesamt 40μl des Reaktionsgemischs gefüllt. Das Reaktionsgemisch bestand aus einer wäßrigen Pufferlösung von 100 mM Tris-HCl (Tris[hydroxymethyl]aminomethan-hydrochlorid), 25 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Kaliumchlorid, 0,1% (w/v) Triton X-100, 8 μM propioniertes nichtradioaktives UDP-MPP, 2 μM 3H-propioniertes UDP-MPP bei Raumtemperatur, 10 μl des Enzyms in einer Konzentration von 5 μg pro ml und 17,5 μl Wasser. Dies wird mit einer Lösung einer Testverbindung (z.B. Tunicamycin) unterschiedlicher Konzentration versetzt. Tunicamycin ist ein bekannter Antagonist des Translocase-Enzyms. Die Reaktion wird durch die Zugabe des Enzyms gestartet.
- Die Escherichia coli-Membranen, die als Quelle für das Enzym dienen, wurden auf folgende Weise präpariert.
- Die Membranen werden aus Sphäroplasten-Pellets, die kommerziell erhältlich sind, präpariert. Jedes Pellet enthält eine bestimmte Menge E. coli Hfr H. Das Pellet wird über Nacht bei 4°C aufgetaut. Das Pellet wird dann gewogen und der Wert mit 7,5 multipliziert. Dies ergibt das Volumen der Pufferlösung, das zugegeben werden muß. Die verwendete Pufferlösung besteht aus 20 μM Tris-HCl pH 8,0 mit 20% Sucrose. Das Gemisch wird in der Kälte 10 Minuten mit einem Magnetrührer vorsichtig gerührt. Es wird dann mit einer Lösung von Lysozym aus Hühnereiweiß versetzt, bis die Konzentration eine Endkonzentration von 0,2 mg pro ml erreicht. Es wird dann auf Eis weitere 10 Minuten gerührt. Hierzu wird dann Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), kommerziell erhältlich von Sigma Aldrich Co. Ltd., mit einer Konzentration von 0,2 M in 20 mM Tris-HCl pH 8,0 langsam über einen Zeitraum von einer Stunde zugegeben, bis eine Endkonzentration von 0,02 M erhalten wird. Diese Zugabe erfolgt im Kühlraum bei einer Temperatur von 4–8°C. Das Gemisch wird dann bei 12000 g 20 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wird wiederum im gleichen Volumen an 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,5, wie im vorhergehenden Abschnitt berechnet, das 20 μg/ml DNAse, 20 μg/ml RNAse, 1 mM Magnesiumchlorid und 1 mM β-Mercaptoethanol enthält, resuspendiert. Es wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bis die Probe homogen wird. Die Membranfraktion wird durch eine Stunde Zentrifugieren in einer Ultrazentrifuge bei 100000 g gewonnen.
- Das als Substrat verwendete 3H-propionierte UDP-MPP wird auf folgende Weise hergestellt.
- Ein festes Volumen von 4 O.D. bei einer Wellenlänge von 262 nm, d.h. ungefähr 450–500 μg, nicht markiertes UDP-MPP wird in einem leeren Eppendorfröhrchen aufgenommen. In einem weiteren Eppendorfröhrchen wird 0,5 mCi tritiummarkierter Propionsäure N-Succinimidylester ([2,3-3H]-Propionsäure-N-succinimidylester) aufgenommen und zu diesem etwa 180 μl 1% NaHCO3 gegeben. Das zweite Röhrchen wird gut gemischt und in das erste Röhrchen überführt. Das zweite Röhrchen wird mit 180 μl 1% NaHCO3 gut gespült und wiederum in das erste Röhrchen überführt. Das das Gemisch enthaltende Röhrchen wird über Nacht auf einem Schüttler bei Raumtemperatur belassen, um die Markierung zu erleichtern. Auf ähnliche Weise wird propioniertes nichtradioaktives UDP-MPP hergestellt, wobei statt der radioaktiven Verbindung Propionsäure-N-succinimidylester verwendet wird.
- Die Reinigung erfolgt folgendemaßen:
- (1) Eine Glassäule wird mit 1 ml kommerziell erhältlichem Sephadex A-25 gepackt.
- (2) Die Säule wird mit einem 10-fachen Bettvolumen Wasser gewaschen.
- (3) Sie wird dann mit einem 10-fachen Bettvolumen 1% NaHcO3 äquilibriert.
- (4) Das Reaktionsgemisch wird auf die Säule geladen und der Durchfluß gesammelt.
- (5) Der Durchfluß wird zweimal durch die Säule geleitet, um die Bindung zu erleichtern.
- (6) Die Säule wird dann mit 0,5 ml 1% NaHCO3 gewaschen.
- (7) Die Waschlösung und der Durchfluß werden im gleichen Röhrchen gesammelt und markiert.
- (8) Die Säule wird mit 6 ml 1% NaHCO3 zweimal gewaschen.
- (9) Die zwei Waschlösungen werden im gleichen Röhrchen gesammelt und markiert.
- (10) Die Säule wird mit 1 ml 1% NaHCO3 mit 0,4 M Lithiumchlorid eluiert.
- (11) Die Fraktionen werden gesammelt und markiert.
- (12) Die Fraktionen werden gezählt und die reinsten davon in der Reaktion eingesetzt.
- Das das Reaktionsgemisch enthaltende Eppendorfröhrchen wird etwa 4 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach alle zwei Minuten 50 μl eines 2:1-Gemischs aus Pyridiniumacetat und n-Butanol zugegeben werden, um die Reaktion zu stoppen.
- Das Produkt wird mit gesättigtem n-Butanol extrahiert und mit 50 μl Wasser gewaschen. Es wird dann in einem Szintillationszähler gezählt, und zwar jeweils in Portionen von 25–50 μl.
- Die vom Enzym Translocase katalysierte Reaktion ist bekanntermaßen reversibel. Zur Darstellung der reversiblen Reaktion wurde die Enzymreaktion 10 Minuten fortgesetzt, sodaß das radioaktive Produkt, Undecaprenol-pyrophosphat-[2,3-3H]propionat-N-acetylmuramylpentapeptid, Lipid I, gebildet wird. Dieses wird von seiner organischen Phase getrennt. Sobald sich das radioaktive Produkt gebildet hat, wird ein Satz von Reaktionen unter Verwendung des 2:1 Gemischs aus Pyridiniumacetat und n-Butanol, wie zuvor beschrieben, gestoppt. In einem parallelen Satz von Reaktionen wird 1μM UMP zugegeben. Die Reaktion wird dann nach etwa 3–4 Minuten gestoppt. Die Lipidfraktion läßt sich aus beiden Reaktionssätzen extrahieren. Dabei sieht man, daß die gezählte Radioaktivität in der organischen Phase mit UMP auf Grundniveaus reduziert wird. Dies zeigt die Rückverwandlung von Lipid I in das wasserlösliche Vorläufermolekül an.
- Dieses Beispiel verdeutlicht, daß das vorliegende Testsystem nur für die Translocasereaktion spezifisch ist, selbst wenn eine partikuläre Membran als Enzymquelle verwendet wurde.
- In
1 ist ein Graph dargestellt, der die Zählwerte pro Minute (counts per Minute, cpm), aufgetragen gegen die Zeit, bezogen auf die für die 100%-Kontrollen abgelesenen Werte, zeigt. - In
2 ist die Rate der Translocasehemmung durch Tunicamycin bei einer Konzentration von 0,3 μg/ml (angedeutet durch), verglichen mit der Kontrolle (andedeutet durch
), dargestellt. Dies bestätigt, daß Tunicamycin ein Antagonist des Translocase-Enzyms ist.
Claims (10)
- Test zum Nachweis der Enzymaktivität von Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translocase, bei dem man: (1) einen Reaktionsansatz, der in einem wäßrigen Medium mit [2,3-3H]-Propionsäure-N-succinimidylester substituiertes UDP-MurNAc-pentapeptid, mit Propionsäure-N-succinimidylester substituiertes UDP-MurNAc-pentapeptid (nicht radioaktiv), eine Quelle zweiwertiger Metallionen, eine Undecaprenylphosphat-Quelle, eine Translocaseenzym-Quelle sowie ein Detergenz enthält, unter Bedingungen, die für das Auftreten von Enzymaktivität geeignet sind, inkubiert; (2) den Reaktionsansatz mit einem geeigneten Puffer, der ein quaternäres Ammoniumsalz bei einem pH-Wert von ca. 4,2 enthält, zum Abstoppen der Enzymreaktion aus Schritt (1) ansäuert; und (3) eventuell als Produkt gebildetes Undecaprenolpyrophosphat-[2,3-3H]propionat-N-acetylmuramylpentapeptid extrahiert und die Radioaktivität mit einem Szintillationszähler mißt.
- Test nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem substituierten UDP-N-acetylmuramylpentapeptid um UDP-MurNAc-L-alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimellinsäure-D-alanin-D-alanin handelt.
- Test nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei als Quelle der zweiwertigen Metallionen Magnesiumchlorid verwendet wird.
- Test nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei als eine Quelle für Undecaprenylphosphat oder Translocaseenzym oder für beide Bakterienzellmembranen verwendet werden.
- Test nach Anspruch 4, wobei die Bakterienzellmembranen aus Escherichia coli stammen.
- Test nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Reaktionsansatz aus Schritt (1) weiterhin eine Testverbindung enthält.
- Test nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Testverbindung um einen Antagonisten des Translocaseenzyms handelt.
- Test nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei zum Abstoppen der Reaktion in Schritt (2) ein 2:1-Gemisch aus Pyridiniumacetat und n-Butanol verwendet wird.
- Test nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Produkt in Schritt (3) mit n-Butanol extrahiert wird.
- Kit zur Verwendung bei der Durchführung eines Tests nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der (1) mit [2,3-3H]-Propionsäure-N-succinimidylester substituiertes UDP-MurNAc-pentapeptid, (2) mit Propionsäure-N-succinimidylester substituiertes UDP-MurNAc-pentapeptid (nicht radioaktiv), (3) eine Quelle zweiwertiger Metallionen, (4) eine Undecaprenylphosphat-Quelle, (5) eine Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translocaseenzym-Quelle und (6) ein Detergenz enthält.
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