DE60122141T2

DE60122141T2 - Assay zur detektion der transferaseenzymaktivität beim screening von medikamenten

Info

Publication number: DE60122141T2
Application number: DE60122141T
Authority: DE
Inventors: Sunita Maria Desousa; Suresh Solapure
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2000-06-08
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-06-06
Also published as: WO2001094623A1; AU2001264483A1; EP1292701A1; US20030143635A1; US20030108969A1; US20060228766A1; EP1292701B1; ZA200208625B; EP1292702A1; ES2269413T3; ZA200208624B; JP2003535598A; DE60122141D1; JP2003535597A; US20060172361A1; CA2407934A1; AU2001264482A1; CA2407718A1; ATE335841T1; WO2001094622A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Enzymen, die an der Peptidoglycanbiosynthese in Bakterien beteiligt sind.
Bei Peptidoglycan handelt es sich um einen Hauptbestandteil der Bakterienzellwand, der dieser ihre Form und Stärke verleiht. Es kommt nur in Bakterien vor und wird in allen Bakterien, sowohl gram-positiven als auch gram-negativen, angetroffen. Bei Peptidoglycan handelt es sich um ein Polymer aus Glycansträngen, die über kurze Peptidbrücken quervernetzt sind. Es besteht aus einander abwechselnden β1-4-verknüpften Resten von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc). An MurNAc ist eine Pentapeptidkette gebunden (MurNAc-Pentapeptid), wobei die Quervernetzung zwischen diesen Peptidketten erfolgt.
Die Biosynthese von Peptidoglycan läßt sich in drei Stufen einteilen: erstens die Synthese der Vorstufen in Zytoplasma, zweitens die Übertragung der Vorstufen auf ein Lipidträgermolekül und drittens der Einbau der Vorstufen in die Zellwand und die Kopplung an bereits bestehendes Peptidoglycan.
Bei den im Zytoplasma synthetisierten Vorstufen handelt es sich um die Zuckernukleotide:
UDP-N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc) und UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid (UDP-MurNAc-Pentapeptid).
Die zweite Stufe, die in der Zytoplasmamembran erfolgt, wird von zwei Enzymen katalysiert und beinhaltet die Synthese einer Disaccharideinheit auf einem Lipidträger, Undecaprenylphosphat. Der Lipidträger ist auch an der Synthese weiterer Bestandteile der Bakterienzellwand beteiligt.
Das erste Enzym katalysiert die Übertragung von Phosphoryl-N-acetylmuramylpentapeptid von UDP-MurNAc-Pentapeptid auf Undecaprenolphosphat bei gleichzeitiger Freisetzung von UMP. Dieses Enzym wird Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translokase (nachfolgend als "die Translokase" bezeichnet) genannt und ist das Produkt des Gens mra Y in Escherichia coli. Das Produkt, Undecaprenolpyrophosphat-N-acetylmuramylpentapeptid (Lipid-P-P-MurNAc-Pentapeptid) bzw. Lipid I oder lipid-verknüpfte Vorstufe I, ist das Sustrat für das zweite Enzym.
N-Acetylglucosaminyl-Transferase überträgt N-Acetylglucosamin von UDP-GlcNAc (bei gleichzeitiger Freisetzung von UDP) unter Bildung von Undecaprenolpyrophosphoryl-N-acetylmuramylpentapeptid-N-acetylglucosamin bzw. Lipid II oder lipid-verknüpfter Vorstufe II. Dieses Enzym wird auch UDP-N-Acetylglucosamin:N-Acetylmuramyl(pentapeptid)-P-P-undecaprenol-N-acetylglucosamin-Transferase (nachfolgend als "die Transferase" bezeichnet) genannt. Das Enzym ist das Produkt des Gens murG in Escherichia coli.
Die Translokase- und Transferase-Enzyme sind für die Lebensfähigkeit der Bakterien essentiell (siehe D. S. Boyle und W. D. Donachie, J. Bacteriol., (1998), 180, 6429–6432 bzw. D. Mengin-Lecreulx, L. Texier, M. Rousseaue und Y. Van Heijernoot, J. Bacteriol., (1991), 173, 4625–4636).
In der dritten Stufe findet an der Außenseite der Zytoplasmamembran die Polymerisation des Glycans statt. Dabei wird die Disaccharid-Pentapeptideinheit vom Lipidträger auf eine bereits bestehende Disaccharideinheit oder ein bereits bestehendes Polymer durch eine Peptidoglycan-Transglycosylase (auch als Peptidoglycan-Polymerase bezeichnet) (nachfolgend als "die Transglycosylase" bezeichnet) übertragen. Die Verbindung der Peptidbrücke wird durch Peptidoglycan-Transpeptidase (nachfolgend als "die Transpeptidase" bezeichnet) katalysiert. Beide Enzymaktivitäten, die jeweils essentiell sind, befinden sich im gleichen Molekül, den Penizillin-Bindungsproteinen (oder PBPs), wie bei PBP1a oder 1b in Escherichia coli. Es handelt sich hierbei um die Produkte der Gene ponA und ponB in Escherichia coli.
In der Bakterienzelle gibt es mehrere PBPs, die sich in zwei Klassen, und zwar PBPs mit geringem Molekulargewicht (LMM) und hohem Molekulargewicht (HMM), einteilen lassen. Bei den HMM-PBPs handelt es sich um bifunkionelle Enzyme, die sowohl Transpeptidase- als auch Transglycosylaseaktivität aufweisen. Es konnte gezeigt werden, daß von diesen Enzymen PBP2 und PBP3 sowie entweder PBP1A oder PBP1B von E. coli für die Zellviabilität essentiell sind. Die LMM-PBPs scheinen wichtig, jedoch nicht essentiell für das Zellwachstum zu sein (z. B. die PBPs 4, 5, 6 von E. coli lassen sich deletieren, was zu Wachstumsdefekten führt, wobei die Zelle jedoch überlebt, siehe S. A. Denome, P. K. Elf, T. A. Henderson, D. E. Nelson und K. D. Young, J. Bacteriol., (1999), 181(13), 3981–3993).
Bei der Übertragung der Disaccharid-Pentapeptideinheit von der Lipidvorstufe auf eine bereits bestehende Peptidoglycankette wird das Lipid in Form eines Moleküls Undecaprenolpyrophosphat freigesetzt. Letzteres muß von einer bacitracin-sensitiven Undecaprenyl-Pyrophosphorylase, auch Undecaprenol-Pyrophosphorylase oder C55-Isoprenyl-Pyrophosphorylase (nachfolgend als die "Lipid-Pyrophosphorylase" bezeichnet) genannt, gespalten werden, um Undecaprenolphosphat zu erzeugen, das dann in der zweiten Stufe in den Kreislauf zurückkehren kann.
Sowohl die Translokase als auch die Transferase (Genprodukte von mraY bzw. murG) stellen Hauptziele für die Entdeckung von Arzneistoffen dar, die aufgrund des Fehlens eines geeigneten Tests, der einem Screening mit hohem Durchsatz zugänglich ist, noch nicht genutzt wurden.
Sowohl in der Translokase- als auch der Transferasereaktion wird ein Zuckermolekül übertragen, und zwar von einer nukleotid-verknüpften Vorstufe auf ein Lipidsubstrat. Ein herkömmlicher Enzymtest für sowohl die Translokase als auch die Transferase beinhaltet die Verwendung einer radioaktiv markierten Zuckervorstufe und das Verfolgen des Einbaus der radioaktiven Markierung in das Lipidprodukt. Das Lipidprodukt wird entweder über Papierchromatographie oder über Extraktion des Produkts in Butanol: 6 M Pyridiniumacetat, pH 4,1 (2:1 v/v) verfolgt. Im Papierchromatogramm laufen die beiden Lipidprodukte Lipid I und Lipid II mit einem Rf-Wert von ~0,9.
Ein weiterer bekannter Test, bei dem lediglich Translokaseaktivität verfolgt wird, verwendet ein dansyliertes UDP-MurNAc-Pentapeptid als Substrat, wobei dieses fluoresziert. Wird das fluoreszierende Substrat auf den Lipidträger in der Membran übertragen, so ändert sich seine Umgebung von einer wäßrigen zu einer hydrophoben Umgebung. Dies führt zu einer Blauverschiebung eines Emissionsspektrums (525 nm bis 495 nm), das während des Tests verfolgt wird. Die Fluoreszenzintensität ändert sich lediglich um das zwei- bis dreifache, und daher handelt es sich um keinen sehr empfindlichen Test.
Ein radioaktiver Test mit hohem Durchsatz für das Transferaseenzym wurde in der WO 99/38958 beschrieben, doch wird dabei die chemische Synthese eines künstlichen Substrats benötigt.
Es wäre wünschenswert, ein Verfahren zum Testen der Aktivität des Translokaseenzyms und/oder des Transferaseenzyms zu entwickeln, das sich für ein Screening mit hohem Durchsatz eignet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zum Testen der Enzymaktivität von UDP-N-Acetylglucosamin:N-Acetylmuramyl(pentapeptid)-P-P-undecaprenol-N-acetylglucosamin-Transferase und gegebenenfalls ebenso der Enzymaktivität von Phospho-N-Acetylmuramylpentapeptid-Translokase bereitgestellt, wobei man die folgenden Schritte ausführt:

(1) Inkubieren eines Reaktionsansatzes, umfassend Undecaprenolpyrophosphat-N-acetylmuramylpentapeptid (Lipid I), radioaktiv markiertes UDP-N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc), eine Quelle für zweiwertige Metallionen sowie eine Quelle für das Transferaseenzym, und wobei Bakterienzellmembranen eine Quelle für ein oder mehrere Mitglieder der Gruppe Undecaprenylphosphat, Translokaseenzym und Transferaseenzym darstellen und wobei die Bakterienzellmembranen aus einer Peptidoglycan-Transglycosylaseenzym-Mangelmutante gewonnen werden, unter für den Ablauf der Synthese von Undecaprenolpyrophosphoryl-N-acetylmuramylpentapeptid-N-acetylglucosamin (Lipid II) geeigneten Bedingungen;
(2) Abstoppen der Reaktion aus Schritt (1);
(3) Versetzen des Reaktionsansatzes aus Schritt (2) mit einer Fluoreszenzverbindung; und
(4) Messen der von der Fluoreszenzverbindung emittierten Lichtenergie.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung ist zu verstehen, daß sich die Abkürzung "UDP" auf Uridin(5'-)diphosphat bezieht.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird am zweckmäßigsten unter Verwendung von 96-Loch-Mikrotiterplatten durchgeführt, was einen schnellen, einfachen und reproduzierbaren Weg zur Messung von Enzymaktivität ermöglicht.
Sollen sowohl das Transferase- als auch das Translokaseenzym getestet werden, so wird in diesem Fall in Schritt (1) das Lipid I in situ gebildet, indem der Reaktionsansatz UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid (UDP-MurNAc-Pentapeptid), eine Quelle für Undecaprenylphosphat sowie eine Quelle für das Translokase-Enzym enthält.
Bei dem verwendeten UDP-MurNAc-Pentapeptid kann es sich um eines der üblicherweise in natürlich vorkommenden Peptidoglycanen vorhandenen UDP-MurNAc-Pentapeptide handeln, wobei dieses zweckmäßigerweise aus Bakterien aufgereinigt oder enzymatisch mit Vorstufen aus Bakterien hergestellt wird, beispielsweise mit ähnlichen Verfahren zu denen von T. den Blaauwen, M. Aarsman und N. Nanninga, J. Bacteriol., (1990), 172, 63–70 beschriebenen. Ein bevorzugtes zu verwendendes UDP-MurNAc-Pentapeptid ist UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin aus Bacillus cereus. Die Konzentration des verwendeten UDP-MurNAc-Pentapeptids liegt typischerweise im Bereich von 5 μM bis 300 μM, vorzugsweise von 5 μM bis 200 μM, stärker bevorzugt von 5 μM bis 100 μM und ganz besonders von 5 μM bis 50 μM, insbesondere 15 μM, pro Loch der Mikrotiterplatte.
Als radioaktiv markiertes UDP-N-Acetylglucosamin wird zweckmäßigerweise tritiertes UDP-N-Acetylglucosamin (UDP-[³H]GlcNAc, im Handel erhältlich von NEN-Dupont), vorzugsweise in einer Konzentration von 0,25 bis 25 μM pro Loch der Mikrotiterplatte, z. B. bei einer Konzentration von 2,5 μM mit 0,1 bis 0,5 μCi Radioaktivität pro Loch, vorzugsweise 0,2 μCi pro Loch der Mikrotiterplatte, verwendet.
Bei den verwendeten zweiwertigen Metallionen handelt es sich vorzugsweise um Magnesiumionen. Eine geeignete Quelle für Magnesiumionen ist Magnesiumchlorid, vor zugsweise in einem Konzentrationsbereich von 10 bis 30 mM, vorzugsweise von 10 bis 25 mM.
Als Quelle für Undecaprenylphosphat, Translokaseenzym und Transferaseenzym können zweckmäßigerweise und in der Tat bevorzugt die Membranen von Escherichia coli-Bakterien verwendet werden. Die Menge an verwendeten Membranen liegt typischerweise im Bereich von 1 bis 20 μg, insbesondere von 4 bis 6 μg, Protein pro Loch der Mikrotiterplatte. Die Membranen können wie in Beispiel 1 der WO 99/60155 beschrieben hergestellt werden. Da in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Menge an in Lipid II eingebauter radioaktiver Markierung verfolgt wird, ist es wichtig, bei Verwendung einer Membranpräparation sicherzustellen, daß das vorhandene Transglycosylaseenzym unwirksam gemacht wird, sodaß das radioaktiv markierte Disaccharid nicht durch die Aktivität des Transglycosylaseenzyms auf ebenfalls in der Membranpräparation vorhandenes Peptidoglycan übertragen wird. Dies erreicht man, indem man Membranen beispielsweise aus einer Escherichia coli-Mutante verwendet, die kein funktionierendes Transglycosylaseenzym aufweist (wie beispielsweise in der WO 96/16082 beschrieben).
In Schritt (1) kann die Verwendung eines wäßrigen Mediums, wie beispielsweise einer Pufferlösung, z. B. von HEPES-Ammoniak, HEPES-KOH (wobei es sich bei HEPES um N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] handelt) oder Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid ("Tris-HCl"), zweckmäßig sein, wobei die Pufferlösung einen pH-Wert von etwa 7,5 aufweist. HEPES und Tris-HCl sind im Handel von der Firma Sigma-Aldrich Co. Ltd. erhältlich.
Der Reaktionsansatz aus Schritt (1) wird bei einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 37°C über einen Zeitraum von 2 bis 90 Minuten, z. B. 5 Minuten, unter für den Ablauf der enzymkatalysierten Synthese von Lipid II geeigneten Bedingungen gehalten.
Soll das erfindungsgemäße Verfahren als Screening zur Identifizierung antibakterieller Verbindungen, bei denen es sich um Antagonisten des Transferaseenzyms und gegebenenfalls des Translokaseenzyms handelt, verwendet werden, so kann der Reaktionsansatz aus Schritt (1) ferner eine oder mehrere Testverbindungen in verschiedenen Konzentrationen umfassen. Da die Enzyme Transferase und Translokase für das Bakterienwachstum essentiell und auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, stellen diese Enzyme gute Ziele für die Entwicklung antibakterieller Arzneistoffe dar. Derartige Arzneistoffe werden jeweils dahingehend vorteilhaft sein, daß sie nicht in den Bakterienorganismus durch die Zellwand eindringen müßten, um wirksam zu sein, womit die üblichen Schwierigkeiten der Zellwandpermeabilität und Arzneistoffresistenz, die durch Änderungen von Zellwandpermeabilität und -austrittsströmung hervorgerufen werden, vermieden würden.
Die Reaktion wird in Schritt (2) mit einem beliebigen geeigneten Mittel, beispielsweise durch Zugabe eines Quenchers gestoppt (bzw. gequencht). Falls das Transferaseenzym allein getestet wird, so wird die weitere Reaktion zweckmäßigerweise durch Zugabe eines Überschusses an nicht markiertem UDP-N-Acetylglucosamin gestoppt. Werden andererseits das Transferaseenzym und das Translokaseenzym zusammen getestet, so kann die weitere Reaktion durch Zugabe einer geeigneten Menge einer zweiwertigen Metallionenchelatorverbindung, z. B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die im Handel von der Firma Sigma-Aldrich Co., Ltd. erhältlich ist, gestoppt werden. Die Konzentration der Chelatorverbindung hängt natürlich von der jeweils verwendeten Chelatorverbindung ab und sollte ausreichen, um alle zweiwertigen Metallionen zu chelatieren; im Falle von EDTA liegt die Konzentration typischerweise bei etwa 15 mM pro Loch der Mikrotiterplatte.
Bei der in Schritt (3) verwendeten Fluoreszenzverbindung kann es sich um eine der routinemäßig in Scintillationsproximitätstests eingesetzten Fluoreszenzverbindungen handeln. Die Fluoreszenzverbindung ist üblicherweise mit Kügelchen, beispielsweise mit Lektin beschichteten Kügelchen, mit anti-Maus-Antikörper beschichteten Yttriumsilicatkügelchen, mit Polylysin (z. B. poly(L-)Lysin) beschichteten Yttriumsilicatkügelchen, mit Protein A beschichteten Yttriumsilicatkügelchen, mit anti-Maus-Antikörper beschichteten PVT (Polyvinyltoluol)-kügelchen oder mit Weizenkeimagglutinin beschichteten PVT-Kügelchen, assoziiert oder davon, darin oder darauf geträgert, wobei alle diese Kügelchen im Handel von der Firma Amersham Inc. erhältlich sind. Die gewählten Kügelchen sollten in der Lage sein, an Bakterienzellwände zu binden.
Bevorzugt ist die Verwendung von mit einer Fluoreszenzverbindung imprägnierten, mit Lektin beschichteten Kügelchen, wie beispielsweise in US-Patent Nr. 4,568,649 und dem Europäischen Patent Nr. 154,734 beschrieben. Die Kügelchen (unter SPA ("Scintillation Proximity Assay")-Beads bekannt) sind im Handel von der Firma Amersham Inc. erhältlich. Am stärksten bevorzugt sind mit Weizenkeimagglutinin beschichtete SPA-Kügelchen, die zur Bindung von Zuckermolekülen, insbesondere N-Acetylglucosamin fähig sind. Man nimmt an, daß über die Bindung von N-Acetylglucosamin an die SPA-Kügelchen in Schritt (1) gebildetes radioaktiv markiertes Lipid II in enge Nachbarschaft mit der Fluoreszenzverbindung gebracht wird, die durch die Strahlungsenergie aktiviert wird, was zur Emission von Lichtenergie führt, die anschließend in Schritt (4) gemessen wird.
Die Kügelchen (mit Fluoreszenzverbindung), die zweckmäßigerweise in Form einer wäßrigen Suspension zugegeben werden, werden mit dem Reaktionsansatz aus Schritt (2) über einen Zeitraum von wenigstens 10 Minuten, vorzugsweise 3 Stunden oder mehr (z. B. über Nacht) in Kontakt gebracht, bevor die Platte in Schritt (4) beispielsweise in einem "Microbeta Tilux"-Zählgerät "ausgezählt" wird.
Durch die vorliegende Erfindung wird ebenso ein Verfahren zum Testen der Enzymaktivität von Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translokase bereitgestellt, wobei man die folgenden Schritte ausführt:

(A) Inkubieren eines Reaktionsansatzes, umfassend ein UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid (UDP-MurNAc-Pentapeptid), ein radioaktiv markiertes Derivat eines UDP-N-Acetylmuramylpentapeptids, eine Quelle für zweiwertige Metallionen, eine Quelle für Undecaprenylphosphat sowie eine Quelle für das Translokaseenzym, unter für die Bildung eines gekoppelten Produkts zwischen dem radioaktiv markierten Derivat und dem Undecaprenylphosphat geeigneten Bedingungen;
(B) Abstoppen der Reaktion aus Schritt (A);
(C) Versetzen des Reaktionsansatzes aus Schritt (B) mit einer Fluoreszenzverbindung; und
(D) Messen der von der Fluoreszenzverbindung emittierten Lichtenergie.

Bei dem in Schritt (A) verwendeten UDP-MurNAc-Pentapeptid kann es sich um eines der üblicherweise in natürlich vorkommenden Peptidoglycanen vorhandenen UDP-MurNAc-Pentapeptide handeln, das zweckmäßigerweise aus Bakterien aufgereinigt oder enzymatisch mit Vorstufen aus Bakterien, beispielsweise mit ähnlichen Verfahren wie denen von T. den Blaauwen, M. Aarsman und N. Nanninga, J. Bacteriol., (1990), 172, 63–70 beschriebenen, hergestellt wird. Dabei handelt es sich bei einem bevorzugt zu verwendenden UDP-MurNAc-Pentapeptid um UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin aus Bacillus cereus.
Das radioaktiv markierte Derivat eines UDP-N-Acetylmuramylpentapeptids enthält vorzugsweise Tritium [³H], ³³P oder ¹²⁵I. Eine derartige Verbindung kann beispielsweise durch Einbau von ³H-Propionat an der e-Aminogruppe des meso-DAP-Rests von UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin synthetisiert werden.
Die Gesamtmenge an UDP-MurNAc-Pentapeptid und an radioaktiv markiertem Derivat liegt typischerweise im Bereich von 4,5 μM bis 15 μM, vorzugsweise von 4 μm bis 10 μM, z. B. von 4 μm bis 5,5 μM, pro Loch der Mikrotiterplatte. Die Menge des verwendeten radioaktiv markierten Derivats ist so bemessen, daß die Radioaktivität zwischen z. B. 0,1 μCi bis 0,6 μCi pro Loch, vorzugsweise 0,1 μCi bis 0,4 μCi pro Loch, insbesondere bei 0,2 μCi pro Loch, liegt.
Bei den verwendeten zweiwertigen Metallionen handelt es sich um die gleichen wie die zuvor beschriebenen.
Als Quelle für Undecaprenylphosphat und Translokaseenzym können zweckmäßigerweise und in der Tat bevorzugt die Membranen von Escherichia coli-Bakterien verwendet werden. Die Menge an verwendeten Membranen liegt typischerweise im Bereich von 5 bis 25 μg, insbesondere von 10 bis 15 μg, Protein pro Loch der Mikrotiterplatte. Die Membranen können wie in Beispiel 1 der WO 99/60155 beschrieben hergestellt werden.
In Schritt (A) kann die Verwendung eines wäßrigen Mediums, wie beispielsweise einer Pufferlösung, z. B. von HEPES-Ammoniak, HEPES-KOH (wobei es sich bei HEPES um N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] handelt) oder Tris[hydroxymethyl]aminomethan hydrochlorid ("Tris-HCl"), zweckmäßig sein, wobei die Pufferlösung einen pH-Wert von etwa 7,5 aufweist. HEPES und Tris-HCl sind im Handel von der Firma Sigma-Aldrich Co. Ltd. erhältlich.
Der Reaktionsansatz aus Schritt (A) wird bei einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 37°C über einen Zeitraum von 2 bis 15 Minuten, z. B. 8 Minuten, unter für den Ablauf der enzymkatalysierten Synthese von Lipid I geeigneten Bedingungen gehalten.
In einem bevorzugten Aspekt umfaßt der Reaktionsansatz aus Schritt (A) zusätzlich geeignete Mengen an Detergens (wie z. B. Triton X-100 bei 0,1% (w/v)) und Kaliumchlorid, um das bei der Durchführung von Schritt (D) des erfindungsgemäßen Verfahrens beobachtete Signal zu verbessern.
Soll das erfindungsgemäße Verfahren als Screening zur Identifizierung antibakterieller Verbindungen, bei denen es sich um Antagonisten des Translokaseenzyms handelt, verwendet werden, so kann der Reaktionsansatz aus Schritt (A) ferner eine oder mehrere Testverbindungen in verschiedenen Konzentrationen umfassen.
Die Reaktion wird in Schritt (B) mit einem beliebigen geeigneten Mittel, beispielsweise durch Zugabe, und zwar in Form eines Quenchers, einer geeigneten Menge einer zweiwertigen Metallionenchelatorverbindung, z. B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die im Handel von der Firma Sigma-Aldrich Co. Ltd. erhältlich ist, gestoppt (bzw. gequencht). Die Konzentration der Chelatorverbindung hängt natürlich von der jeweils verwendeten Chelatorverbindung ab und sollte ausreichen, um alle zweiwertigen Metallionen zu chelatieren; im Falle von EDTA liegt die Konzentration typischerweise bei etwa 35 mM pro Loch der Mikrotiterplatte.
Bei der in Schritt (C) verwendeten Fluoreszenzverbindung kann es sich um eine der routinemäßig in Scintillationsproximitätstests eingesetzten Fluoreszenzverbindungen handeln. Die Fluoreszenzverbindung ist üblicherweise mit Kügelchen, beispielsweise mit Lektin beschichteten Kügelchen, mit anti-Maus-Antikörper beschichteten Yttriumsilicatkügelchen, mit Polylysin (z. B. poly(L-)Lysin) beschichteten Yttriumsilicatkügelchen, mit Protein A beschichteten Yttriumsilicatkügelchen, mit anti-Maus-Antikörper beschichteten PVT (Polyvinyltoluol)-kügelchen oder mit Weizenkeimagglutinin beschichteten PVT-Kügelchen, assoziiert oder davon, darin oder darauf geträgert, wobei alle diese Kügelchen im Handel von der Firma Amersham Inc. erhältlich sind. Die gewählten Kügelchen sollten in der Lage sein, an Bakterienzellwände zu binden.
Bevorzugt ist die Verwendung von mit einer Fluoreszenzverbindung imprägnierten, mit Lektin beschichteten Kügelchen, wie beispielsweise in US-Patent Nr. 4,568,649 und dem Europäischen Patent Nr. 154,734 beschrieben. Die Kügelchen (unter SPA ("Scintillation Proximity Assay")-Beads bekannt) sind im Handel von der Firma Amersham Inc. erhältlich. Am stärksten bevorzugt sind mit Weizenkeimagglutinin beschichtete SPA-Kügelchen, die zur Bindung von Zuckermolekülen, insbesondere N-Acetylglucosamin fähig sind. Man nimmt an, daß das gekoppelte Produkt auf den mit Lektin beschichteten Kügelchen über die Bindung von N-Acetylglucosamin, das in den Zellwandfragmenten, die mit den Bakterienmembranen assoziiert sind, vorhanden ist, falls diese im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, eingefangen wird. Aufgrund des spezifischen Einfangens des gekoppelten Produkts wird die radioaktive Markierung in enge Nachbarschaft mit der Fluoreszenzverbindung gebracht, die durch die Strahlungsenergie aktiviert wird, was zur Emission von Lichtenergie führt, die anschließend in Schritt (D) gemessen wird.
Die Kügelchen (mit Fluoreszenzverbindung), die zweckmäßigerweise in Form einer wäßrigen Suspension zugegeben werden, werden mit dem Reaktionsansatz aus Schritt (B) über einen Zeitraum von wenigstens 10 Minuten, vorzugsweise 3 Stunden oder mehr (z. B. über Nacht) in Kontakt gebracht, bevor die Platte in Schritt (D) beispielsweise in einem "Microbeta Tilux"-Zählgerät "ausgezählt" wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden veranschaulichenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1

(i) Die Löcher einer Mikrotiterplatte wurden einzeln mit einem Gesamtvolumen von jeweils 25 μl eines Reaktionsansatzes, umfassend eine wäßrige Pufferlösung von 50 mM HEPES-Ammoniak (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) (pH 7,5) sowie 10 mM Magnesiumchlorid, 15 μM UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin, 2,5 μM tritiertes UDP-N-Acetylglucosamin (0,2 μCi pro Loch), 3 μM Moenomycin, 4 μg Escherichia coli AMA 1004-Zellmembranen sowie eine Lösung der Testverbindung (z. B. Tunicamycin, Vancomycin, Nisin) mit unterschiedlicher Konzentration in 4% Dimethylsulfoxid, gefüllt. Tunicamycin ist ein bekannter Antagonist des Translokaseenzyms, Nisin ein bekannter Antagonist des Transferaseenzyms und Vancomycin ein bekannter Antagonist sowohl des Translokase- als auch des Transferaseenzyms (Moenomycin ist ein bekannter Antagonist des Transglycosylaseenzyms und wird zugegeben, um den Einbau der radioaktiven Markierung in Peptidoglycan zu verhindern).

Vier Löcher der Mikrotiterplatte wurden als Kontrollen verwendet: zwei Löcher enthielten kein UDP-N-Acetyl muramylpentapeptid (Kontrollen für 0% Umsetzung), und zwei weitere Löcher enthielten keine Testverbindung (Kontrollen für 100% Umsetzung).
Liegt der Zweck des Screenings in der Untersuchung der Auswirkung eines Inhibitors der Transferase oder Translokase, so wird die Testverbindung zusammen mit den Substraten in Schritt (i) zugegeben.
Die E. coli-Membranen wurden wie in der Patenanmeldung WO 99/60155 beschrieben präpariert.
Die Mikrotiterplatte wurde 5 min bei 37°C inkubiert, wonach 5 μl Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugegeben wurden, sodaß eine EDTA-Endkonzentration von 15 mM erhalten wurde.

(ii) Nach der Zugabe der EDTA wurde jedes Loch mit 170 μl einer wäßrigen Suspension von mit Weizenkeimagglutinin beschichteten SPA-Kügelchen, umfassend 500 μg Kügelchen in einer Lösung von HEPES-Ammoniak, pH 7,5, versetzt, sodaß die Endkonzentration an HEPES-Ammoniak 50 mM betrug.

Man ließ die Platte drei Stunden/über Nacht bei Raumtemperatur stehen, bevor sie im "Microbeta Trilux"-Zählgerät ausgezählt wurde.
Bei 1 handelt es sich um eine graphische Auftragung der prozentualen Hemmung von Translokase (und somit der Lipid-II-Synthese) gegen die Tunicamycinkonzentration (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung).
Bei 2 handelt es sich um eine graphische Auftragung der prozentualen Hemmung von Transferase (und somit der Lipid-II-Synthese) gegen die Nisinkonzentration (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung).
Bei 3 handelt es sich um eine graphische Auftragung der prozentualen Hemmung von Translokase und Transferase (und somit der Lipid-II-Synthese) gegen die Vancomycinkonzentration (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung).
Beispiel 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren kann alternativ unter Verwendung der Membranen einer Escherichia coli-Mutante, AMA 1004 Δpon B::Spc^R, einer Mutante, bei der das für PBPIb codierende Gen ponB inaktiviert wurde, wie bei S. Y. Yousif, J. K. Broome-Smith und B. G. Spratt, J. Gen. Microbiol., (1985), 131, 2839–2845 beschrieben, durchgeführt werden. Diesen Membranen fehlt PBPIb-Aktivität, bei der es sich um die Haupttransglycosylase in Escherichia coli handelt, womit die in Lipid II eingebaute radioaktive Markierung nicht auf Peptidoglycan übertragen wird. Somit braucht dem Reaktionsansatz kein Moenomycin zugesetzt werden.
Bei 4 handelt es sich um eine graphische Auftragung der prozentualen Hemmung von Transferase (und somit der Lipid-II-Synthese) gegen die Nisinkonzentration (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung).
Bei 5 handelt es sich um eine graphische Auftragung der prozentualen Hemmung von Translokase und Transferase (und somit der Lipid-II-Synthese) gegen die Vancomycinkonzentration (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung).
Beispiel 3

(i) Die Löcher einer Mikrotiterplatte wurden einzeln mit einem Gesamtvolumen von jeweils 25 μl eines Reaktionsansatzes, umfassend eine wäßrige Puffer lösung von 50 mM HEPES-Ammoniak (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) (pH 7,5) sowie 10 mM Magnesiumchlorid, 15 μM UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin, 2,5 μM tritiertes UDP-N-Acetylglucosamin (0,2 μCi pro Loch), 6 μg Escherichia coli AMA 1004-Zellmembranen, wie unten beschrieben präpariert, sowie eine Lösung der Testverbindung (z. B. Tunicamycin, Vancomycin) mit unterschiedlicher Konzentration in 4% Dimethylsulfoxid, gefüllt. Tunicamycin ist ein bekannter Antagonist des Translokaseenzyms und Vancomycin ein bekannter Antagonist sowohl des Translokase- als auch des Transferaseenzyms.

Vier Löcher der Mikrotiterplatte wurden als Kontrollen verwendet: zwei Löcher enthielten kein UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid (Kontrollen für 0% Umsetzung), und zwei weitere Löcher enthielten keine Testverbindung (Kontrollen für 100% Umsetzung).
Liegt der Zweck des Screenings in der Untersuchung der Auswirkung eines Inhibitors der Transferase oder Translokase, so wird die Testverbindung zusammen mit den Substraten in Schritt (i) zugegeben.
Die E. coli-Membranen wurden wie folgt präpariert.
Vier bis fünf Kolonien der Bakterien wurden von einer LB (Luria-Bertani-Medium)-Agarplatte zum Animpfen in 5 ml LB-Brühe gegeben und über Tag (6–8 Stunden) bei 37°C angezogen. Am Abend wurden 0,5 ml dieser Kultur zum Animpfen von 500 ml LB-Brühe in einem 2-l-Kolben verwendet. Der Kolben wurde über Nacht bei 30°C auf einen Schüttler inkubiert; dabei wurde typischerweise ein A600-Wert von 2,0–2,5 erreicht. Diese Kultur wurde früh am nächsten Morgen zum Animpfen von 6 l LB-Brühe (mit 500 ml LB-Brühe pro 2-l-Kolben) verwendet, sodaß der A600-Ausgangswert 0,4–0,6 betrug. Man ließ die Kultur unter starkem Schütteln/Belüften bei 37°C zwei Stunden wachsen; dabei wurde ein A600-Wert zwischen 1,4 und 2,0 erreicht. An diesem Punkt wurden die Bakterien auf Eis abgekühlt und durch Zentrifugation bei 5000 × g 15 Minuten sedimentiert. Das Zellsediment wurde mit 500 ml Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5/0,1 mM MgCl₂) gewaschen. Anschließend wurden sie in kalter 20%iger Saccharoselösung in 20 mM Tris-HCl pH 8,0 resuspendiert, wobei ein Volumen eingesetzt wurde, das dem 7,5fachen des Feuchtgewichts der Zellen entsprach. Es wurde mit Lysozym auf eine Konzentration von 200 μg/ml versetzt, und die Zellen wurden leicht 10 min auf Eis gerührt. Über einen Zeitraum von einer Stunde wurde dann mit einer EDTA-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,02 M versetzt. Die Zellen wurden 20 min bei 12000 × g zentrifugiert, und das aus der Zentrifugation erhaltene Sediment wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 mit 1 mM MgCl₂ und RNAse sowie DNAse bei einer Endkonzentration von jeweils 20 μg/ml resuspendiert. Die Suspension wurde leicht bei Raumtemperatur 1 Std. gerührt. Das Zelllysat wurde 45 Minuten bei 3500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, mit Puffer A auf 100 ml verdünnt und 45 Minuten bei 150000 × g ultrazentrifugiert. Das Sediment dieser Zentrifugation wurde durch Resuspendieren in 100 ml Puffer A und nochmaliges, 30minütiges Zentrifugieren bei 150000 × g gewaschen. Dieses Sediment wurde in einem Minimalvolumen (5–10 ml für 6 l Kultur) Puffer A vorsichtig resuspendiert und nach dem Einfrieren portionsweise bei –70°C gelagert. Dies wird die Membranpräparation genannt, wobei diese im Test als Quelle für die Translokase- und Transferaseenzyme sowie von Undecaprenylphosphat verwendet wurde.
Die Mikrotiterplatte wurde 30 min bei 37°C inkubiert und anschließend mit jeweils 5 μl Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) versetzt, sodaß eine EDTA-Endkonzentration von 15 mM erhalten wurde.

Man ließ die Platte drei Stunden/über Nacht bei Raumtemperatur stehen, bevor sie im "Microbeta Trilux"-Zählgerät ausgezählt wurde.
In Tabelle 1 unten sind die Hemmeffekte von Tunicamycin und Vancomycin auf die Translokase- und Transferaseenzyme (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung) aufgelistet.
Tabelle 1
Beispiel 4

(i) Die Löcher einer Mikrotiterplatte wurden einzeln mit einem Gesamtvolumen von jeweils 15 μl eines Reaktionsansatzes, umfassend eine wäßrige Pufferlösung von 50 mM HEPES-Ammoniak (pH 7,5) (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) und 10 mM Magnesiumchlorid, 15 μM UDP-MurNAc-L-Alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin sowie 4 μg Zellmembranen der Escherichia coli-Mutante AMA 1004 Δpon B::Spc^R, einer Mutante, bei der das für PBPIb codierende Gen ponB inaktiviert worden war, wie bei S. Y. Yousif, J. K. Broome-Smith und B. G. Spratt, J. Gen. Microbiol., (1985), 131, 2839–2845 beschrieben, gefüllt. Die Platte wurde 20 min bei 37°C inkubiert.
(ii) Anschließend wurde mit Tunicamycin auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml und danach mit einer Testverbindung (z. B. Vancomycin oder Nisin) unterschiedlicher Konzentration in Dimethylsulfoxid versetzt. Nisin und Vancomycin sind bekannte Antagonisten des Transferaseenzyms.
(iii) Anschließend wurde in die Reaktionsvertiefung das Substrat für die Transferase, 2,5 μM tritiertes UDP-N-Acetylglucosamin (0,5 μCi pro Loch) in einem Volumen von 5 μl gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde 5 min bei 37°C inkubiert.
(iv) Die Reaktion wurde durch Ausverdünnen der radioaktiven Markierung, d. h. durch Zugabe von 25 μl 200 μM unmarkiertes UDP-GlcNAc, gestoppt.
(v) Nach Zugabe des UDP-GlcNAc wurden 150 μl einer wäßrigen Suspension von mit Weizenkeimagglutinin beschichteten SPA-Kügelchen, umfassend 500 μg Kügelchen in einer Lösung von HEPES-Ammoniak, pH 7,5, in jedes Loch gegeben, sodaß die Endkonzentration an HEPES-Ammoniak 50 mM betrug. Man ließ die Platte drei Stunden bei Raumtemperatur stehen, bevor im Zellgerät "Microbeta Trilux" ausgezählt wurde.

Vier Löcher der Mikrotiterplatte wurden als Kontrollen verwendet: zwei Löcher enthielten kein UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid (Kontrollen für 0% Umsetzung), und zwei weitere Löcher enthielten keine Testverbindung (Kontrollen für 100% Umsetzung).
In Tabelle 2 sind die Hemmeffekte von Nisin und Vancomycin auf das Transferaseenzym (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung) aufgelistet.
Tabelle 2
Beispiel 5

(i) Die Löcher einer Mikrotiterplatte wurden individuell mit einem Gesamtvolumen von 25 μl eines Reaktionsansatzes, umfassend eine wäßrige Pufferlösung von 100 mM HEPES-Ammoniak pH 7,5, 25 mM Magnesiumchlorid, 50 mM KCl, 0,1% w/v Triton X-100, 4 μM UDP-MurNAc-Pentapeptid plus UDP-MurNAc-[³H]-Pentapeptid (0,2 μCi pro Loch), 12,5 μg der Zellmembranen der Escherichia coli-Mutante AMA 1004 Δpon B::Spc^R (einer Mutante, bei der das für PBP1b codierende Gen ponB inaktiviert worden war, wie bei S. Y. Yousif, J. K. Broome-Smith und B. G. Spratt, J. Gen. Microbiol., (1985), 131, 2839–2845 beschrieben) sowie eine Lösung der Testverbindung (z. B. Tunicamycin, Vancomycin) unterschiedlicher Konzentration, gefüllt. Tunicamycin und Vancomycin sind bekannte Antagonisten des Translokaseenzyms.

Die E. coli-Membranen wurden wie in der Patentanmeldung WO 99/60155 beschrieben präpariert.
UDP-MurNAc-[³H]-Pentapeptid wurde wie folgt synthetisiert.
20 nmol UDP-MurNAc-Pentapeptid (aufgereinigt aus den Heißwasserextrakten von B. cereus) wurden mit 1 mCi ³H-N-Hydroxysuccinimidylpropionat (spezifische Aktivität –91 Ci/mmol) in 20 μl 100 mM Natriumboratpuffer, pH 8,5, bei 4°C 20 Std. inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde auf ein Gesamtvolumen von 100 μl mit 80 μl 0,1 M Ammoniumacetatpuffer, pH 8,5, verdünnt und auf eine im gleichen Puffer äquilibrierte 500-μl-DEAE-Sepharose-Säule geladen. Die Säule wurde mit 6 bis 7 ml 0,1 M Ammoniumacetatpuffer, pH 8,5, zur Abtrennung des nichtgebundenen, nichtumgesetzten ³H-NHS-Propionats gewaschen. Das gebundene Produkt UDP-MurNAc-L-Ala-γ-D-Glu-m-DAP(N^e-³H-Propionat)-D-Ala-D-Ala wurde mit 0,5 M Ammoniumacetatpuffer, pH 8,5, eluiert. Fraktionen von jeweils 0,5 ml wurden gesammelt und auf ihre Aktivität hin beobachtet, indem sie als Substrat im Enzymtest verwendet wurden. Aktive Fraktionen wurden vereinigt, und die spezifische Aktivität wurde bestimmt.
Vier Löcher der Mikrotiterplatte wurden als Kontrollen verwendet: zwei Löcher enthielten dabei eine Stop-Lösung zum Zeitpunkt 0 (Kontrollen für 0% Umsetzung), wobei zwei weitere Löcher keine Testverbindung enthielten (Kontrollen für 100% Umsetzung).

(ii) Die Mikrotiterplatte wurde acht Minuten bei 22°C inkubiert.
(iii) Es wurde mit EDTA (5 μl) auf eine Endkonzentration von 35 mM versetzt, und anschließend wurden 270 μl einer wäßrigen Suspension von mit Weizenkeimagglutinin beschichteten SPA-Kügelchen, umfassend 2000 μg Kügelchen in einer Lösung von HEPES-Ammoniak, pH 7,5, und Natriumazid in jedes Loch gegeben, sodaß eine Endkonzentration von 100 mM HEPES bzw. 0,02 (w/v) Natriumazid erhalten wurde.

Man ließ die Platte 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen, bevor sie im Zählgerät "Microbeta Trilux" ausgezählt wurde.
Bei 6 handelt es sich um eine graphische Auftragung der prozentualen Hemmung von Translokase (und somit der Lipid-I-Synthese) gegen die Tunicamycinkonzentration (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung).
Bei 7 handelt es sich um eine graphische Auftragung der prozentualen Hemmung von Translokase (und somit der Lipid-I-Synthese) gegen die Vancomycinkonzentration (nach Subtrahieren der entsprechenden abgelesenen Werte für 0% Umsetzung).

Claims

Verfahren zum Testen der Enzymaktivität von UDP-N-Acetylglucosamin:N-Acetylmuramyl(pentapeptid)-P-P-undecaprenol-N-acetylglucosamin-Transferase und gegebenenfalls ebenso der Enzymaktivität von Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translokase, wobei man die folgenden Schritte ausführt: (1) Inkubieren eines Reaktionsansatzes, umfassend Undecaprenolpyrophosphat-N-acetylmuramylpentapeptid (Lipid I), radioaktiv markiertes UDP-N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc), eine Quelle für zweiwertige Metallionen sowie eine Quelle für das Transferaseenzym, und wobei Bakterienzellmembranen eine Quelle für ein oder mehrere Mitglieder der Gruppe Undecaprenylphosphat, Translokaseenzym und Transferaseenzym darstellen und wobei die Bakterienzellmembranen aus einer Peptidoglycan-Transglycosylaseenzym-Mangelmutante gewonnen werden, unter für den Ablauf der Synthese von Undecaprenolpyrophosphoryl-N-acetylmuramylpentapeptid-N-acetylglucosamin (Lipid II) geeigneten Bedingungen; (2) Abstoppen der Reaktion aus Schritt (1); (3) Versetzen des Reaktionsansatzes aus Schritt (2) mit einer Fluoreszenzverbindung; und (4) Messen der von der Fluoreszenzverbindung emittierten Lichtenergie.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lipid I in situ aus einem UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid und einer Undecaprenylphosphat-Quelle in Gegenwart einer Phospho-N-acetylmuramylpentapeptid-Translokaseenzym-Quelle gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid um UDP-MurNAc-L-alanin-γ-D-glutaminsäure-m-diaminopimelinsäure-D-alanin-D-alanin handelt und wobei Bakterienzellmembranen eine Quelle für ein oder mehrere Mitglieder der Gruppe Undecaprenylphosphat, Translokaseenzym und Transferaseenzym darstellen und der Reaktionsansatz aus Schritt (1) gegebenenfalls ferner einen Peptidoglycan-Transglycosylaseenzym-Inhibitor umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bakterienzellmembranen aus Escherichia coli stammen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Peptidoglycan-Transglycosylaseenzym-Inhibitor um Moenomycin handelt und wobei die Bakterienzellmembranen aus einer Peptidoglycan-Transglycosylaseenzym-Mangelmutante gewonnen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei als Quelle für zweiwertige Metallionen Magnesiumchlorid eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Reaktionsansatz aus Schritt (1) ferner eine Testverbindung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei der Testverbindung um einen Antagonisten des Translokaseenzyms oder des Transferaseenzyms handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in Schritt (2) ein Überschuß an nicht markiertem UDP-N-acetylglucosamin oder eine Chelatorverbindung für zweiwertige Metallionen zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Fluoreszenzverbindung mit mit Lectin beschich teten Kügelchen, mit Anti-Maus-Antikörper beschichteten Kügelchen oder mit Polylysin beschichteten Kügelchen assoziiert oder davon, darin oder darauf geträgert ist.