EP3724347A1 - Verfahren und vorrichtung zum qualitativen und quantitativen nachweis von in einem aquatischen system enthaltenen, biofilmbauenden bakterien - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum qualitativen und quantitativen nachweis von in einem aquatischen system enthaltenen, biofilmbauenden bakterien

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EP3724347A1
EP3724347A1 EP18803565.3A EP18803565A EP3724347A1 EP 3724347 A1 EP3724347 A1 EP 3724347A1 EP 18803565 A EP18803565 A EP 18803565A EP 3724347 A1 EP3724347 A1 EP 3724347A1
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EP
European Patent Office
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bacteria
aquatic system
microtiter plate
biofilm
contained
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18803565.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Anna Salek
Robert Priller
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Domatec GmbH
Original Assignee
Domatec GmbH
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/21—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
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    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
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    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/265—Enterobacter (G)

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for the qualitative and quantitative detection of contained in an aquatic system, biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus.
  • Biofilms represent microbial cell communities that are expressed in aquatic, i. aqueous systems, preferably at surfaces or interfaces of
  • the mucus layer forms a kind of matrix, in which the microbial cells, so especially bacteria of the genus Legionella spp. are embedded, including the species Legionella pneumophila, and thus are surrounded by an environment that allows the bacteria a long lifetime.
  • Legionella spp. can be found in both fresh and salt water and can be found in a temperature range between 25 ° C and 50 ° C
  • Hot water production and distribution plants swimming pools, air washers in air conditioners, cooling towers, dead pipes, water tanks and the like. In particular, they can occur in hot water pipes or cold water pipes with external heat, which are not used for a long time.
  • Cogeneration plant belonging cooling towers could be attributed.
  • Each of the above methods of analysis provides on-site sampling and detection in a laboratory equipped for testing for Legionella.
  • the document WO 2011/157584 A1 discloses a portable device and a method for the qualitative and quantitative determination of Legionella in water.
  • the known device operates in several stages, in which contained in a defined amount of sample microorganisms separated by filtration and the Legionella from the separated microorganisms selectively means
  • the immunomagnetic methods are separated to be subsequently labeled by means of suitable fluorescent markers.
  • the labeled Legionella are excited by a suitable excitation source for fluorescence, which can then be registered by means of a detector and evaluated qualitatively and / or quantitatively by a computer system.
  • the device is suitable for temporary or permanent integration in water-bearing systems, such as. Drinking water network, cooling towers, air conditioners, etc.
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • the invention is based on the object of a method and a device for the qualitative and quantitative detection of in an aquatic system
  • biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus such that a safe and rapid analysis and determination at least for the detection of Legionella pneumophila within one to two days
  • the device according to the invention should also be possible on site, ie in the form of a portable field device.
  • the solution of the problem underlying the invention is specified in claim 1.
  • the subject of claim 16 is a device in the form of a microtiter plate for carrying out the method according to the invention according to claim 1.
  • Preferred uses are subject matter of claims 21 to 25. Den
  • biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus on a biochemical reaction of the bacteria with at least one substance that initiates a bacteria-specific metabolic reaction by which a colorimetric reagent is chemically influenced, measured its spectrometric or more accurate, spectrophotometric properties and the Evidence of the biofilm-forming bacteria contained in the aquatic system.
  • the method according to the invention uses the measurement of catabolism-based vitality or activity of specific biofilm-producing bacteria.
  • the metabolic reactions necessary for the preservation of the living cells are considered, in which metabolic products are degraded from complex to simple molecules for the detoxification of the cell organism and for the production of energy.
  • the detection of bacteria of the bacterial genera Legionella, Pseudomonas, Escherichia and Enterobacter is the detection of bacteria of the bacterial genera Legionella, Pseudomonas, Escherichia and Enterobacter.
  • the choice of a bacteria-specific metabolic reaction initiating substance is a highly selective detection of bacteria of a particular
  • Legionella pneumophila are preferably amino acids for the purpose of catabolization or metabolism by these bacteria, since amino acids, especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen
  • Colorimetric reagent for example tetrazolium salt, preferably in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or in the form of (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- ( 2,4-disulfophenyl) -2FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
  • TTC formazan test detection
  • the colorimetric reagent which in the initial state is a colorless compound, is reduced by chemical reaction with the living and thus metabolically active bacteria to a soluble - formazan product - the amount of which is directly proportional to the number of living cells or bacteria within the aquatic system is.
  • the method of optical Spectrophotometry which measures the optical absorbance of the aquatic system stained by the color change of the colorimetric reagent.
  • an absolute extinction value and / or a temporally variable extinction function can be determined in order, for example, to determine the time
  • Color development Information on the density and / or catabolic activity of bacteria within the aquatic system is provided.
  • biofilm-producing bacteria in particular Legionella pneumophila amino acids, preferably L-serine and L-threonine or their degradation product catabolize a-ketobutyric acid preferably in a microaerophilic atmosphere
  • biochemical reaction of the biofilm-forming bacteria contained within the aquatic system with the determined selected substance and the colorimetric added Reagent preferably under conditions of microaerophilic incubation at a temperature in the range between 25 ° C and 45 ° C, preferably between 30 ° C and 40 ° C, in particular carried out at 37 ° C.
  • bacteria-specific substance of about 20 to 50 hours, preferably after just 24 hours, are obtained.
  • the method according to the solution is especially suitable for further detection of bacteria of the following bacterial genera: Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter.
  • the bacterium Pseudomonas aeruginosa is suitable as a substance for Initiation of the bacteria-specific metabolic reaction L-arginine, L-asparagine, itaconic acid or putrescine.
  • the bacterium Enterobacter aerogenes is suitable as substance for the initiation of the bacteria-specific metabolic reaction D-glucosaminic acid, D-cellobiose, ß-methyl-D-glucoside or D-mannitol.
  • bacteria-specific metabolic reaction initiating substance L-phenylalanine, ⁇ -D-glucose or glucose-1-phosphate is suitable as the bacteria-specific metabolic reaction initiating substance L-phenylalanine, ⁇ -D-glucose or glucose-1-phosphate.
  • At least a portion, preferably all of the aforementioned substances, which are catabolized by said biofilm-producing bacteria are used for the purpose of as comprehensive as possible detection of the biofilm-producing bacteria contained in an aquatic system. Flierzu the respective substances are stored separately in mutually isolated wells of a microtiter plate together with an above-described colorimetric reagent, in each of which a sample of the biofilm-forming bacteria-containing aquatic system is introduced.
  • the use of a microtiter plate allows a simple and above all uniform handling and implementation of the biochemical reaction within the individual cavities under uniform reaction conditions.
  • the use of a light-transparent microtiter plate known per se makes it possible to carry out a spectrophotometric measurement of all samples within the individual, mutually insulated cavities after a certain reaction time.
  • a further preferred embodiment of the microtiter plate designed above for the purpose of detecting Legionella pneumophila provides for a further detection of the bacterium Pseudomonas aeruginosa in at least two further cavities in each case one substance which in each case differs and are selected from the group of the following substances: Arginine, L-asparagine, itaconic acid, putrescine.
  • another embodiment provides for the additional detection of the bacterium Enterobacter aerogenes, in which at least two further cavities each contain a substance which is different from one another and those from the group of the following substances D-glucosaminic acid, D-cellobiose, ⁇ -methyl-D-glucoside, D-mannitol.
  • a last preferred embodiment provides alternatively or in combination with the above-described preferred embodiments for further detection of the bacterium Escherichia coli in at least two other cavities respectively different substances, which are selected from the group of the following substances: L-phenylalanine, aD-glucose, Glucose-1-phosphate
  • Tetrazolium salt preferably in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) - 2FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
  • a preferred use of the microtiter plate designed in accordance with the invention is for the qualitative and quantitative determination of Legionella pneumophila contained in aquatic systems, preferably of at least one further biofilm-producing bacterium of the following group: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli.
  • microtiter plate and the associated method according to the invention for the qualitative and quantitative detection of biofilm-forming bacteria is primarily for the study of water in water distribution systems, i. including from the source to the end user, both for human and animal care and in industrial installations such as
  • cooling towers for example cooling towers etc.
  • the use of the microplate according to the invention is of great use, in particular for the investigation of the following aquatic systems: body fluids, especially urine, cerebrospinal fluid, bile, saliva, gastric juice, breast milk, vaginal secretions, tear fluid, nasal secretions, ejaculate.
  • Bacteria all of which can be assigned to the so-called gram-negative bacterial group, become the ones to be detected and contained in the aquatic system
  • hydromechanical modification in which the cell membrane permeability of the bacteria is specifically conditioned.
  • the chemically and / or hydromechanically initiated modification leads to a change in the cell surface properties and an associated increase in the permeability of the bacterial membrane.
  • Gram-negative bacteria in the respective outer membrane have non-specific transmembrane proteins, so-called porins, which serve for the exchange of substances through the membrane. It shows, for example, that the addition of the surface-active chemical substance Polysorbate 80 to the bacteria to be detected, a significant increase in the permeability of the outer cell membrane of the bacteria can be achieved.
  • the membrane modification made at least the exchange of electrons or protons by the outer membrane with the aquatic environment is supported, whereby the bacteria-specific metabolic reaction which can be initiated by the at least one substance has a significantly higher efficiency and an associated temporal acceleration of the entire detection method can be carried out.
  • the increase in the material permeability of the outer cell membrane caused by the membrane modification also leads to an increase in the detection capability or an improvement in the sensory sensitivity of the detection method according to the invention.
  • low concentrations of bacteria can be detected in a sample and this within a very short detection periods of well below 24 h.
  • the bioenergetic activity ie the temporal catabolic behavior of Legionella pneumophila
  • the bioenergetic activity has already been determined by measuring the rates of electron flow into and through the electron transport chains on different metabolic substrates, for example of L-serine, L-threonine, a Ketobutyric acid and pyruvic acid methyl ester.
  • L-serine L-threonine
  • a Ketobutyric acid pyruvic acid methyl ester.
  • the electrons always migrate from the beginning to the distal part of the electron transport chain, where a redox dye as the terminal Electron or proton acceptor acts, which converts the dye according to reduction, and the color change can be detected in the manner described spectrophotometrically.
  • polysorbate 80 as one of
  • Biosurfactants are also suitable for conditioning the cell membrane permeability of the bacteria. First of all rhamnolipid or surfactin.
  • Fig. 1 is a schematic representation of the distribution of different substances within cavities of a microtiter plate.
  • Figure 1 shows a tabular arrangement consisting of four columns (1, 2, 3, 4) and eight rows (AH), in the 32 fields distinguishable from each other by a individual column and row membership are addressable.
  • the tabular arrangement illustrates very schematically a microtiter plate whose cavities are represented by the 32 fields.
  • Selected fields or cavities of a microtiter plate represented by the tabular arrangement contain in each case the substances which can be taken from FIG. 1 and each of which is able to initiate a bacteria-specific metabolic reaction.
  • the name of the bacterium is given in bold type
  • Substance in the aquatic system reduced by way of a metabolic reaction.
  • Representative in this context is the cavity located in column A column 2 mentioned, in which for the detection of the bacterium Enterobacter aerogenes the substance ß-methyl-D-glucoside is included.
  • water is stored as a neutral buffer medium in one cavity, preferably in the well A / 1, on the basis of a photometric measurement
  • a colorimetric reagent in the form of a redox indicator in the form of a redox indicator, preferably tetrazolium salt, is present in each well, for example in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or (2 - (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
  • Substances distributed in different cavities are not to be understood as limiting, of course, alternative spatial distributions of the substances in the wells of a microtiter plate are largely possible.
  • the fields / cavities filled with substances in FIG. 1, for example A / 3, B / 1, B / 2, B / 3, can also C / 1, etc., with further or already distributed in the microtiter plate substances are filled.

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Abstract

Beschrieben werden ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakterienart mittels biochemischer Reaktion der Bakterien mit wenigstens einer Substanz, die eine Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiiert, sowie einem von der Stoffwechselreaktion beeinflussbaren farbmetrischen Reagenz, dessen spektrophotometrische Eigenschaften gemessen und dem Nachweis zugrunde gelegt werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien
Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung.
Stand der Technik
Biofilme stellen mikrobielle Zellgemeinschaften dar, die sich in aquatischen, d.h. wässrigen Systemen, vorzugsweise an Oberflächen bzw. Grenzflächen von
Substraten in Form einer durch die mikrobiellen Zellen selbst hergestellten
Schleimschicht aus extrazellulären, polymeren Substanzen (EPS) ausbilden. Die Schleimschicht bildet dabei eine Art Matrix, in der die mikrobiellen Zellen, so insbesondere Bakterien der Gattung Legionella spp. inklusive der Art Legionella pneumophila eingebettet sind und auf diese Weis von einem Milieu umgeben sind, das den Bakterien eine lange Lebenszeit ermöglicht.
Legionella spp. können sowohl in Süßwasser, als auch in Salzwasser Vorkommen und finden in einem Temperaturbereich zwischen 25°C und 50°C optimale
Lebensbedingungen. So kommen sie häufig in Einrichtungen wie
Warmwassererzeugungs- und -Verteilungsanlagen, Schwimmbädern, Luftwäschern in Klimaanlagen, Kühltürmen, Totleitungen, Wassertanks und der gleichen vor. Insbesondere können sie in Warmwasserleitungen oder Kaltwasserleitungen mit Wärmeeinwirkung von außen, welche über längere Zeit nicht genutzt werden, auftreten.
Gerade in den letzten Jahren wurden viele Berichte über mögliche Infektionsquellen für den Menschen mit Legionella pneumophila Bakterien veröffentlicht. Dabei stellen vor allem kontaminierte Wasserverteilsysteme in Gebäuden sowie industrielle Anlagen, insbesondere Kühlturme, eine besondere Bedrohung für den Menschen dar. So ereignete sich Anfang Januar 2010 eine Legionellen-Epidemie in
Deutschland mit 5 Toten und 64 Infizierten, deren Ursache auf die zu einem
Blockheizkraftwerk gehörigen Kühltürme zurückgeführt werden konnte.
Gemäß den Vorgaben des DVGW (Deutscher Verein des Gas- und Wasserfaches e. V.) Arbeitsblatt W 551 gilt Trinkwasser bei einem Gehalt von 100 KbE
(koloniebildende Einheiten pro 100 ml) als kontaminiert mit einem geringen
Infektionsrisiko. Handlungsbedarf ist geboten ab einem Wert von größer 10.000 KbE/100 ml, welche Sofortmaßnahmen wie z. B. eine Desinfektion des
Leitungsnetzes und die Verhängung eines vorläufigen Nutzungsverbots notwendig macht.
Von Yanez, M.A., et. al. wird in "Quantitative detection of Legionella pneumophila in water samples by immunomagnetic purification and real-time PCR amplification of the dotA gene", Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 71 , Nr. 7, 07, S. 3434- 3436, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Legionella pneumophila in Wasserproben mittels immunomagnetischer Reinigung und echt-zeit PCR- Amplifikation von dotA Genen beschrieben.
Von Füchslin et. al. wird in "Rapid and quantitative detection of Legionalla
pneumophila applying immunomagnetic Separation and flow cytometry", Cytometry Part A, 77A, 03/2010, S.264-274, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Legionella pneumophilia in Wasserproben mittels einer Kombination aus
immunomagnetischer Separation und Durchflusscytometrie beschrieben.
Die vorstehenden Analysemethoden sehen jeweils eine Probennahme vor Ort und den Nachweis in einem für die Untersuchung auf Legionellen ausgerüsteten Labor vor.
Die Druckschrift WO 2011/157584 A1 offenbart eine portable Vorrichtung sowie ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Legionellen in Wasser. Die bekannte Vorrichtung arbeitet in mehreren Stufen, in welchen in einer definierten Probemenge enthaltene Mikroorganismen mittels Filtration abgetrennt und die Legionellen aus den abgetrennten Mikroorganismen selektiv mittels
immunomagnetischer Methoden separiert werden, um anschließend mittels geeigneter Fluoreszenzmarker markiert zu werden. Die markierten Legionellen werden durch eine geeignete Anregungsquelle zur Fluoreszenz angeregt, welche anschließend mittels eines Detektors registriert und über ein Rechnersystem qualitativ und/oder quantitativ ausgewertet werden kann. Insbesondere eignet sich die Vorrichtung zur temporären oder permanenten Integration in wasserführenden Systemen, wie bspw. Trinkwasserleitungsnetz, Kühltürme, Klimaanlagen etc.
Während die Identifizierung von Legionellen in Trinkwassersystemen bereits weit fortgeschritten ist, stellt diese in Verdunstungskühlsystemen, aufgrund einer erhöhten Biofilm-bauenden Begleitflora, wie bspw. Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes oder Escherichia coli und der damit einhergehenden Biofilmbildung, eine besondere Schwierigkeit dar. Der Artikel von Rahman, M. et al The catabolism of arginine by Pseudomonas aeruginosa, J. Gen. Microbiol. (1980), 116, S. 371 -380, diskutiert den Metabolismus von aus einem Pseudomonas aeruginosa-Stamm isolierten Mutanten, die nicht in der Lage sind L-Arginin oder L-Ornithin als Kohlenstoffquelle für das Wachstum zu verwenden.
Der Artikel von Sabaeifard P., Abdi-Ali A., Soudi MR. und Dinarvand R., Optimization of tetrazolium salt assay for Pseudomonas aeruginosa biofilm using microtiter plate method, J. Microbiol. Methods, 2014 Okt.,105, S.134-140, beschäftigt sich mit Pseudomonas aeruginosa, das eines der wichtigsten pathogenen Bakterien im Zusammenhang mit Biofilm-Infektionen ist. Aufgrund der Biofilm-Mehrfachresistenz sind Verfahren zur Biofilmbildungszählung von Interesse für die Beurteilung einer effizienten Medikamentenregimenentwicklung für die Biofilminhibierung oder - ausrottung. Bei der Bestimmung von der Biofilmbildung werden vitale oder nicht- vitale Farbstoffe eingesetzt. Gegenstand der vorliegenden Studie ist die Entwicklung eines Tests unter Verwendung eines Mitglieds der Tetrazoliumsalzfamilie, 2,3,5- Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), zum Nachweis der Pseudomonas aeruginosa- Biofilmbildung.
Darstellung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System
enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung derart anzugeben, so dass eine sichere und schnelle Analyse und Bestimmung wenigstens zum Nachweis von Legionella pneumophila innerhalb ein bis zwei Tagen,
vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden und weniger, möglich sein soll.
Insbesondere gilt es eine Bestimmung von Legionella pneumophila sowie weitere Bakterien unterschiedlicher Bakteriengattung innerhalb einer multizellulären
Gemeinschaft aus biofilmbauenden Bakterien innerhalb eines aquatischen Systems fehlerfrei zu detektieren, um möglichst gezielte Maßnahmen verzögerungsfrei zur Verhinderung bzw. Minimierung einer Biofilmbildung, wie beispielsweise der Einsatz von bakterienspezifischen Reinigungsmethoden, vornehmen zu können. Der Einsatz der lösungsgemäßen Vorrichtung soll auch vor Ort, d.h. in Form eines portablen Feldgerätes möglich sein.
Die Lösung der der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe ist im Anspruch 1 angegeben. Gegenstand des Anspruches 16 ist eine Vorrichtung in Form einer Mikrotiterplatte zur Durchführung des lösungsgemäßen Verfahrens nach Anspruch 1. Bevorzugte Verwendungen sind Gegenstand der Ansprüche 21 bis 25. Den
Erfindungsgedanken in vorteilhafter weise ausbildende Merkmale sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der weiteren Beschreibung unter Bezugnahme auf die illustrierten Ausführungsbeispiele zu entnehmen.
Im Unterschied zu bekannten Nachweisverfahren zur Detektion biofilmbauender Bakterien, die das Wachstumsverhalten (Anabolismus) von Bakterien untersuchen und infolgedessen viel Zeit in Anspruch nehmen, um eine zuverlässige Aussage über das Vorhandensein entsprechender Bakterien treffen zu können, basiert das lösungsgemäße Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung auf einer biochemischen Reaktion der Bakterien mit wenigstens einer Substanz, die eine bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiiert, durch die eine farbmetrische Reagenz chemisch beeinflussbar ist, dessen spektrometrische bzw. genauer, spektrophotometrische Eigenschaften gemessen und dem Nachweis der in dem aquatischen System enthaltenen biofilmbauenden Bakterien zugrunde gelegt wird.
Das lösungsgemäße Verfahren nutzt die Messung der auf Katabolismus beruhenden Vitalität bzw. Aktivität, spezifischer biofilmbauender Bakterien. Hierbei werden die zum Erhalt der lebenden Zellen erforderlichen Stoffwechselreaktionen in Betracht gezogen, bei denen Stoffwechselprodukte von komplexen zu einfachen Molekülen zur Entgiftung des Zellorganismus und zur Energiegewinnung abgebaut werden. Von besonderen Interesse hierbei ist der Nachweis von Bakterien der Bakteriengattungen Legionella, Pseudomonas, Escherichia und Enterobacter. Durch die Wahl der eine Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiierenden Substanz ist ein hochselektiver Nachweis von Bakterien einer bestimmten
Bakteriengattung innerhalb eines aquatischen Systems möglich.
Für den Nachweis von Bakterien der Baktieriengattung Legionella, insbesondere der Bakteriumsart Legionella pneumophila, eignen sich vorzugsweise Aminosäuren zum Zwecke der Katabolisierung bzw. Verstoffwechselung durch diese Bakterien, da Aminosäuren, allen voran L-Serin, L-Threonin eine bevorzugte Kohlenstoff- und Stickstoffquelle für Legionella pneumophila darstellen. Neben den vorstehenden Aminosäuren eignen sich auch a-Ketobuttersäure, als Abbauprodukt der
Aminosäuren Threonin -, sowie Brenztraubensäure - zum Zwecke der
Katabolisierung durch das Bakterium Legionella pneumophila.
Zur Bestimmung der Anzahl der innerhalb des aquatischen Systems enthaltenen Bakterien Legionella pneumophila, deren Stoffwechsel durch wenigstens eine der vorstehenden Substanzen gezielt angeregt bzw. aktiviert wird, dient ein
farbmetrisches Reagenz, beispielsweise Tetrazolium Salz, vorzugsweise in Form von (2,3,5-Tripheny-2FI-Terazoliumchlorid, TTC) oder in Form von (2-(4-lodophenyl)-3-(4- Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5- Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator).
Zudem eignet sich der als TTC- oder Formazan-Test bekannte Nachweis für die Bestimmung der Vitalität von Zellen bzw. Bakterien, insbesondere von Legionella pneumophila, besonders gut zur messtechnischen Erfassung der im aquatischen System enthaltenen biofilmbauenden Bakterien. Das farbmetrische Reagenz, das im Ausgangzustand eine farblose Verbindung darstellt, wird durch chemische Reaktion mit den lebenden und somit metabolisch aktiven Bakterien zu einem löslichen - Formazan-Produkt- reduziert, dessen Menge direkt proportional zur Anzahl der lebenden Zellen bzw. Bakterien innerhalb des aquatischen Systems ist.
Zur messtechnischen Erfassung der spektrophotometrischen Eigenschaften des farbmetrischen Reagenz im aquatischen System dient das Verfahren der optischen Spektrophotometrie, mit dem die optische Extinktion des durch den Farbumschlag des farbmetrischen Reagenz eingefärbten aquatischen Systems gemessen wird. Hierbei kann je nach Analyseart ein absoluter Extinktionswert und/oder eine zeitliche veränderliche Extinktionsfunktion ermittelt werden, um bspw. die zeitliche
Veränderung der Aktivität der die Substanz metabolisierenden Bakterien im aquatischen System erfassen zu können. So liefert die Geschwindigkeit der
Farbentwicklung Informationen über die Dichte und/oder die katabolische Aktivität der Bakterien innerhalb des aquatischen Systems.
Da biofilmbauende Bakterien, insbesondere Legionella pneumophila Aminosäuren, vorzugsweise L-Serin und L-Threonin oder deren Abbauprodukt a-Ketobuttersäure bevorzugt in mikroaerophiler Atmosphäre katabolieren, wird die biochemische Reaktion der innerhalb des aquatischen Systems enthaltenen biofilmbauenden Bakterien mit der bestimmt ausgewählten Substanz sowie dem beigegeben farbmetrischen Reagenz vorzugsweise unter Bedingungen einer mikroaerophilen Bebrütung bei einer Temperatur im Bereich zwischen 25°C und 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 40°C, insbesondere bei 37°C durchgeführt.
Belastbare Messresultate über die Menge, d.h. Anzahl, sowie auch Aktivität der innerhalb des aquatischen Systems vorhandenen biofilmbauenden Bakterien können bereits nach einer Reaktionszeit zwischen den Bakterien und der jeweils
bakterienspezifischen Substanz von etwa 20 bis 50 Stunden, vorzugsweise nach bereits 24 Stunden, gewonnen werden.
Neben der qualitativen sowie auch quantitativen Erfassung von Legionella
pneumophila innerhalb des aquatischen Systems eignet sich das lösungsgemäße Verfahren vor allem auch zur weiteren Erfassung von Bakterien der nachfolgenden Bakteriengattungen: Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter.
Für den Nachweis von Bakterien der Bakteriengattung Pseudomona, so
insbesondere das Bakterium Pseudomonas aeruginosa eignet sich als Substanz zur Initiierung der Bakterien-spezifischen Stoffwechselreaktion L-Arginin, L-Aspargin, Itakonsäure oder Putrescin.
Für den Nachweis von Bakterien der Bakteriengattung Enterobacter, so
insbesondere des Bakteriums Enterobacter aerogenes eignet sich als Substanz zur Initiierung der Bakterien-spezifischen Stoffwechselreaktion D-Glukosaminsäure, D- Cellobiose, ß-Methyl-D-Glukosid oder D-Mannitol.
Für den Nachweis von Bakterien der Bakteriengattung Escherichia, so insbesondere des Bakteriums Escherichia coli, eignet sich als für die Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiierende Substanz L-Phenylalanin, a-D-Glukose oder Glukose-1 -Phosphat.
Wenigstens ein Teil, vorzugsweise alle der vorstehend genannten Substanzen, die von den genannten biofilmbauenden Bakterien katabolisiert werden, werden zum Zweck eines möglichst allumfassenden Nachweises der in einem aquatischen System enthaltenen Biofilmbauenden Bakterien eingesetzt. Flierzu werden die betreffenden Substanzen jeweils getrennt in voneinander isolierten Kavitäten einer Mikrotiterplatte gemeinsam mit einem vorstehend erläuterten, farbmetrischen Reagenz bevorratet, in die jeweils eine Probe des die biofilmbauenden Bakterien enthaltenden aquatischen Systems eingebracht wird. Die Verwendung einer Mikrotiterplatte ermöglicht eine einfache und vor allem einheitliche Handhabung und Durchführung der biochemischen Reaktion innerhalb der einzelnen Kavitäten unter einheitlichen Reaktionsbedingungen. Die Verwendung einer an sich bekannten lichttransparenten Mikrotiterplatte ermöglicht es nach Ablauf einer bestimmten Reaktionszeit eine spektralphotometrische Vermessung sämtlicher Proben innerhalb der einzelnen, voneinander isolierten Kavitäten durchzuführen.
Die lösungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung eines qualitativen und
quantitativen Nachweises von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien mit jeweils einer Substanz und einem farbmetrischen Reagenz enthaltenden Kavitäten zeichnet sich somit durch eine lichttransparente Mikrotiterplatte aus, wobei in wenigstens zwei Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich voneinander unterscheiden und die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: a-Ketobuttersäure-, L-Serin, L- Threonin, Brenztraubensäure Methyl Ester.
Eine bevorzugte weitere Ausgestaltung der vorstehend zum Zwecke des Nachweises von Legionella pneumophila konzipierten Mikrotiterplatte sieht für einen weiteren Nachweis des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz vor, die sich jeweils unterscheiden und aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: L-Arginin, L-Asparagin, Itakonsäure, Putrescin.
Alternativ oder in Kombination mit beiden vorstehend erläuterten, bevorzugten Ausführungsbeispielen, sieht ein weiteres Ausführungsbeispiel die zusätzliche Erfassung des Bakteriums Enterobacter aerogenes vor, bei dem in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich voneinander unterscheiden und die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: D-Glukosaminsäure, D-Cellobiose, ß-Methyl-D-Glukosid, D-Mannitol.
Ein letztes bevorzugtes Ausführungsbeispiel sieht alternativ oder in Kombination mit den vorstehend erläuterten bevorzugten Ausführungsbeispielen zum weiteren Nachweis des Bakteriums Escherichia coli in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils unterschiedliche Substanzen vor, die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: L-Phenylalanin, a-D-Glukose, Glukose-1 -Phosphat
In sämtlichen der vorstehend erläuterten Ausführungsbeispielen zur Ausbildung einer lösungsgemäßen Mikrotiterplatte ist jeweils neben den vorstehend genannten
Substanzen jeweils ein farbmetrisches Reagenz vorzugsweise in Form von
Tetrazolium Salz, vorzugsweise in Form von (2,3,5-Tripheny-2FI-Terazoliumchlorid, TTC) oder (2-(4-lodophenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5-Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator) enthalten. Eine bevorzugte Verwendung der lösungsgemäß ausgebildeten Mikrotiterplatte dient der qualitativen und quantitativen Bestimmung von in aquatischen Systemen enthaltenen Legionella pneumophila, vorzugsweise von wenigstens einem weiteren biofilmbauenden Bakterium der nachfolgenden Gruppe: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli.
Die lösungsgemäße Mikrotiterplatte sowie das damit verbundene lösungsgemäße Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis biofilmbauender Bakterien eignet sich in erster Linie zur Untersuchung von Wasser in Wasserverteilsystemen, d.h. umfassend von einschließlich der Quelle bis hin zum Endverbraucher, sowohl zur Versorgung von Mensch und Tier als auch in industriellen Anlagen, wie
beispielsweise Kühltürmen etc.
Selbstverständlich sind auch weitere Anwendungen zur Untersuchung aquatischer Systeme hinsichtlich spezifischer Bakterienarten denkbar, so insbesondere im medizinischen, chemischen oder biochemischen Bereich, wo es gilt relevante
Flüssigkeiten zu analysieren, die aquatische Systeme darstellen und jeweils ein Milieu zum Überleben von Biofilmbauenden Bakterien darstellen. Vor allem im medizinischen Bereich ist der Einsatz der lösungsgemäßen Mikrotiterplatte von großem Nutzen insbesondere zur Untersuchung folgender aquatischer Systeme: Körperflüssigkeiten, vor allem Urin, Liquor, Gallenflüssigkeit, Speichel, Magensaft, Muttermilch, Vaginalsekret, Tränenflüssigkeit, Nasensekret, Ejakulat.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform zur Durchführung der
lösungsgemäßen Nachweismethode für die vorstehenden, biofilmbauenden
Bakterien, die allesamt der sogenannten gramnegativen Bakteriengruppe zuordenbar sind, werden die nachzuweisenden und im aquatischen System enthaltenen
Bakterien vor und/oder während der den Bakterien-spezifischen Stoffwechsel initiierenden biochemischen Reaktion einer chemischen und/oder
hydromechanischen Modifikation unterzogen, bei der die Zellmembranpermeabilität der Bakterien gezielt konditioniert wird. Die chemisch und/oder hydromechanisch initiierte Modifikation führt zur Veränderung der Zelloberflächeneigenschaften und einer damit verbundenen Erhöhung der Permeabilität der Bakterienmembran.
So verfügen gramnegative Bakterien in der jeweils äußeren Membran über unspezifische Transmembranproteine, so genannten Porine, die dem Stoffaustausch durch die Membran dienen. Es zeigt sich bspw., dass durch die Zugabe der grenzflächenaktiven chemischen Substanz Polysorbat 80 an die nachzuweisenden Bakterien eine signifikante Erhöhung der Permeabilität der äußeren Zellmembran der Bakterien erzielbar ist.
Durch die vorgenommene Membranmodifikation wird zumindest der durch die äußere Membran erfolgende Elektronen- oder Protonen- Austausch mit der aquatischen Umgebung unterstützt, wodurch die durch die wenigstens eine Substanz initiierbare Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion mit einer signifikant höheren Effizienz und einer damit verbundenen zeitlichen Beschleunigung des gesamten Nachweisverfahrens durchgeführt werden kann. Die durch die Membranmodifikation bedingte Steigerung der stofflichen Durchlässigkeit der äußeren Zellmembran führt auch zu einer Steigerung des Nachweisvermögens bzw. einer Verbesserung der sensorischen Sensitivität der lösungsgemäßen Nachweismethode. So können geringe Konzentrationen von Bakterien in einer Probe nachgewiesen werden und dies innerhalb sehr kurzer Nachweisdauern von deutlich unter 24 h.
Im Zusammenhang mit der Verwendung von Polysorbat 80 wurde bereits die bioenergetische Aktivität, d.h. das zeitlich katabolische Verhalten von Legionella pneumophila durch Messen der Raten des Elektronenflusses in und durch die Elektronentransportketten bei unterschiedlichen metabolischen Substraten, bspw. von L-Serin, L-Threonin, a-Ketobuttersäure und Brenztraubensäure Methyl Ester gemessen. Gleichwohl jede der Substanzen verschiedenen Elektronentransport- ketten durch die Zellwand besitzen, wandern die Elektronen stets jeweils vom Anfang zum distalen Teil der Elektronentransportkette, wo ein Redoxfarbstoff als terminaler Elektronen- bzw. Protonen-Akzeptor fungiert, der bei Reduktion den Farbstoff entsprechend umwandelt, und dessen Farbänderung in der beschriebenen Weise spektrophotometrisch erfasst werden kann.
Alternativ oder in Kombination zur Verwendung von Polysorbat 80 als ein die
Zelloberflächeneigenschaften veränderndes chemisches Mittel, eignen sich auch Biotenside, um die Zellmembranpermeabilität der Bakterien entsprechend zu konditionieren. Allen voran Rhamnolipid oder Surfactin.
Eine mit den vorstehenden, chemischen Maßnahmen vergleichbare Möglichkeit zur Einflussnahme auf die Membranpermeabilität bzw. auf die in der äußeren Membran der gramnegativen Bakterien enthaltenen Porine, besteht in der Applikation hydrodynamischer Kräfte auf die im aquatischen System enthaltenen Bakterien, nämlich durch Einkoppeln von Ultraschallwellen in das aquatische System. So zeigen Versuche, dass gramnegative Bakterien bei einer Ultraschallwellenapplikation mit einer Wirkdauer von ca. 15 Minuten über eine erhöhte Zellmembranpermeabilität verfügen. Ein besonders vorteilhafter Effekt stellt sich bei der Kombination der Ultraschallwellenapplikation mit wenigstens einer der vorstehend erläuterten, chemischen Zellmembrankonditionierungen an den jeweils nachzuweisenden gramnegativen Bakterien ein.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen
Erfindungsgedankens anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die Zeichnung exemplarisch beschrieben. Es zeigt:
Fig. 1 schematisierte Darstellung zur Verteilung unterschiedlicher Substanzen innerhalb von Kavitäten einer Mikrotiterplatte.
Wege zur Ausführung der Erfindung, gewerbliche Verwendbarkeit
Figur 1 zeigt eine tabellarische Anordnung bestehend auf vier Spalten (1 , 2, 3, 4) und acht Zeilen (A-H), in der 32 Felder unterscheidbar voneinander durch eine individuelle Spalten- und Zeilenzugehörigkeit adressierbar sind. Die tabellarische Anordnung illustriert stark schematisiert eine Mikrotiterplatte, deren Kavitäten durch die 32 Felder repräsentiert sind.
Ausgewählte Felder bzw. Kavitäten einer durch die tabellarische Anordnung repräsentierten Mikrotiterplatte enthalten jeweils die aus Figur 1 entnehmbaren Substanzen, die jeweils eine Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion zu initiieren vermögen. Jeweils unterhalb der in den einzelnen Feldern/Kavitäten angegebenen Substanzen ist in Fettdruck der Name jenes Bakteriums angegeben, das die
Substanz im aquatischen System im Wege einer Stoffwechselreaktion reduziert. Repräsentativ sei in diesem Zusammenhang die in Zeile A Spalte 2 befindliche Kavität genannt, in der zum Nachweis des Bakteriums Enterobacter aerogenes die Substanz ß-Methyl-D-Glukosid enthalten ist.
Neben den zwölf mit unterschiedlichen Substanzen belegten Feldern/Kavitäten ist in einer Kavität, vorzugsweise in der Kavität A/1 , Wasser als neutrales Puffermedium bevorratet, anhand dem im Rahmen einer photometrischen Messung ein
Referenzabgleich mit einer sogenannten Null-Probe vorgenommen werden kann.
Gemeinsam mit den in den Kavitäten bevorratenden Substanzen befindet sich in jeder Kavität ein farbmetrisches Reagenz in Form eines Redox-Indikators, vorzugsweise Tetrazolium Salz, bspw. in Form von (2,3,5-Tripheny-2FI- Terazoliumchlorid, TTC) oder (2-(4-lodophenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4- Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5-Methyl- Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator).
Die in Figur 1 illustrierte geometrische Anordnung der einzelnen auf die
unterschiedlichen Kavitäten verteilten Substanzen ist nicht einschränkend zu verstehen, selbstverständlich sind alternative räumliche Verteilungen der Substanzen in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte weitgehend beliebig möglich. Auch können die in Figur 1 nicht mit Substanzen befüllten Felder/Kavitäten, bspw. A/3, B/1 , B/2, B/3, C/1 etc., mit weiteren oder den bereits in der Mikrotiterplatte verteilt angeordneten Substanzen aufgefüllt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung mittels biochemischer Reaktion der Bakterien mit wenigstens einer Substanz, die eine Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiiert, sowie einem von der Stoffwechselreaktion beeinflussbaren farbmetrischen Reagenz, dessen spektrometrische Eigenschaften gemessen und dem Nachweis zugrunde gelegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass die im aquatischen System enthaltenen Bakterien zu einer der nachfolgenden Bakterienarten zuordenbar sind: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Legionella, insbesondere des Bakteriums Legionella pneumophila, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: a-Ketobuttersäure, L-Serin, L-Threonin, Brenztraubensäure Methyl Ester.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Pseudomonas, insbesondere des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: L-Arginin, L-Asparagin, Itakonsäure, Putrescin.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Enterobacter, insbesondere des Bakteriums
Enterobacter aerogenes, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: D-Glucosaminsäure, D-Cellobiose, ß-Methyl-D-Glukosid, D- Mannitol.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Escherichia, insbesondere des Bakteriums
Escherichia coli, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: D-Mannitol, L-Phenyloalanin, a-D-Glukose, Glukose-1 -Phosphat.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, dass als farbmetrische Reagenz ein Redoxindikator verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, dass als Redoxindikator Tetrazolium Salz, in Form von (2,3,5-Tripheny-2H-Terazoliumchlorid, TTC) oder in Form von (2-(4-lodophenyl)-3-(4- Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5- Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator) verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass die spektrometrischen Eigenschaften des
farbmetrischen Reagenz im aquatischen System im Wege einer optischen
Spektrophotometrie erfasst werden, bei der eine dem die Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung enthaltenden aquatischen System zuordenbare optische Extinktion gemessen wird, zum Erhalt eines absoluten Extinktionswertes und/oder einer zeitlich veränderlichen Extinktionsfunktion.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion unter Bedingungen einer mikroaerophilen Bebrütung bei einer Temperatur im Bereich zwischen 25°C und 45°C, vorzugsweise bei 37 °C, durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, dass die spektrophotometrischen- Eigenschaften des farbmetrischen Reagenz im aquatischen System nach einer Reaktionszeit der biochemischen Reaktion von 20 Stunden bis 50 Stunden, vorzugsweise nach 24 Stunden, gemessen werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von voneinander isolierten Kavitäten verwendet wird, in denen jeweils eine der wenigstens einen Substanz sowie das farbmetrische Reagenz bevorratet werden, und dass jeweils eine Probe des die biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung enthaltenden aquatischen Systems in die Kavitäten der
Mikrotiterplatte eingebracht wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, dass vor und/oder während der Durchführung
der biochemischen Reaktion die Bakterien einer chemischen und/oder
hydromechanischen Modifikation unterzogen werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Modifikation durch Zugabe wenigstens eines chemischen Mittels an die Bakterien erfolgt, das aus den nachfolgenden Mitteln auswählbar ist: Polysorbat 80, Rhamnolipid, Surfactin.
15. Verfharen nach Anspruch 13 oder 14,
dadurch gekennzeichnet, dass die hydromechanische Modifikation durch
Applikation von Ultraschallwellen an die Bakterien erfolgt.
16. Mikrotiterplatte zur Durchführung eines qualitativen und quantitativen
Nachweises von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien mit jeweils einer Substanz und einem farbmetrischen Reagenz
enthaltenden Kavitäten,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich unterscheiden und aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: a-Ketobuttersäure, L-Serin, L-Threonin, Brenztraubensäure Methyl Ester.
17. Mikrotiterplatte nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich unterscheiden und aus der Gruppe der
nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: L-Arginin, L-Asparagin, Itakonsäure, Putrescin.
18. Mikrotiterplatte nach Anspruch 16 oder 17,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich unterscheiden und aus der Gruppe der
nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: D-Glukosaminsäure, D-Cellobiose, ß- Methyl-D-Glukosid, D-Mannitol.
19. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 16 bis Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils unterschiedliche Substanzen enthalten sind, die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: - und a-D-Glukose.
20. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 16 bis 19,
dadurch gekennzeichnet, dass in den Kavitäten als farbmetrische Reagenz ein Redoxindikator in Form von Tetrazolium Salz (2,3,5-Tripheny-2H-Terazoliumchlorid, TTC) oder (2-(4-lodophenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2H-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5-Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator) enthalten ist.
21. Verwendung der Mirkotiterplatte nach Anspruch 16 zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen Legionella pneumophila.
22. Verwendung der Mikrotiterplatte nach Anspruch 20 zum qualitativen und quantitativen Nachweis von biofilmbauenden Bakterien, von denen wenigstens eine Bakterienart der nachfolgenden Bakterienarten in einem aquatischen System enthalten sind: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli.
23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 zur Untersuchung von Wasser als aquatisches System, das aus Wasserverteilsystemen für Mensch und Tier, industriellen Anlagen und Kühltürmen entnehmbar ist.
24. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 im medizinischen, chemischen oder biochemischen Bereich zur Untersuchung von Flüssigkeiten als aquatisches System.
25. Verwendung nach Anspruch 24,
dadurch gekennzeichnet, dass im medizinischen Bereich Körperflüssigkeiten, vor allem Urin, Liquor, Gallenflüssigkeit, Speichel, Magensaft, Muttermilch,
Vaginalsekret, Tränenflüssigkeit, Nasensekret, Ejakulat, als aquatisches System untersucht werden.
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