DE602004006412T2

DE602004006412T2 - Siebtest für neue proteininhibitoren auf der grundlage einer manipulierten zelllinie, die ein induzierbares überaktives gen und ein kompensatorisches gen enthält

Info

Publication number: DE602004006412T2
Application number: DE602004006412T
Authority: DE
Inventors: Kirsten The Norwegian Radium Hospital Skarstad; Solveig The Norwegian Radium Hospital Fossum; Walter Messer; Christoph Weigel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2004-06-03
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2024-06-04
Also published as: JP2006526402A; ES2287731T3; AU2004245739A1; ATE361997T1; AU2004245739B2; PT1629115E; US20070009890A1; EP1629115A1; WO2004108958A1; GB0312972D0; CA2526012A1; DK1629115T3; DE602004006412D1; US7867702B2; EP1629115B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung neuer Proteininhibitoren (vorzugsweise Antibiotika) mithilfe eines Tests unter Verwendung von Zellen, welche Mutationen enthalten, die zwei separate Gene beeinflussen. Die erste Mutation ist eine induzierbare (oder kontrollierbare) letale Überaktivitäts-Mutation, welche vorzugsweise eine Über-Initiierung der DNA-Replikation verursacht. Proteininhibitoren werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Funktion (wie z. B. Aktivität) des durch die letale Überaktivitäts-Mutation kodierten Genprodukts zu inhibieren, wodurch die letale Überaktivitäts-Eigenschaft der Zelle überwunden wird. Die zweite Mutation erhöht die Sensitivität des Tests, indem ein alternativer/kompensierender Mechanismus, wie z. B. ein alternativer DNA-initiierender Pfad bereitgestellt wird, wodurch der Zelle ein Überleben ermöglicht wird, wenn der Proteininhibitor ausreichend wirksam ist, die Funktion (wie z. B. die Aktivität) des durch die letale Überaktivitäts-Mutation kodierten Genprodukts stark zu inhibieren, bis zu einem Grad, bei welchem die Zelle nicht überleben kann. Zellen zur Verwendung bei diesem Test, insbesondere Bakterien, werden ebenfalls bereitgestellt.
Proteininhibitoren, welche in verschiedener Weise ein Protein „inhibieren" können (z. B. durch Inhibition seiner Synthese oder seiner Aktivität), werden häufig als Wirkstoffe zur Bekämpfung von Erkrankungen verwendet. Die Erkrankungen können durch Überexpression oder Überaktivität des in Rede stehenden Proteins verursacht sein, wie bei einer Vielzahl von Krebsformen, wobei die Überexpression bestimmter Onkogene bei der Entwicklung von Malignitäten involviert ist, wie z. B. HER2/neu bei Brustkrebs, das ras-Onkogen und das myc-Onkogen. Die Überexpression kann eine Überaktivität verursachen oder die Überaktivität kann aus einer Mutation resultieren. Onkogenproteine sind häufig Komponenten eines Pfades, wie z. B. eines Signalpfades, der für die Regulation des Zellwachstums von Bedeutung ist. Wenn einmal für ein Protein gezeigt worden ist, dass es für die Auslösung oder das Fortschreiten eines Krankheitszustandes erforderlich ist, ist es erstrebenswert, das Protein als „Target" zu definieren und Wirkstoffe zu finden, welche die mit der Erkrankung verbundene Funktion des Proteins zu unterbinden.
Die Erkrankung kann auch eine Infektion, wie eine pilzliche oder bakterielle Infektion, sein. Derartige Erkrankungen können mit Antibiotika bekämpft werden, welche wiederum als Inhibitor der Funktion eines „Target"-Proteins wirken, da eine Infektion neue Proteine in die infizierten Zellen einführt. Diese Proteine werden in der nicht infizierten Wirtszelle nicht gefunden und können somit Targetproteine sein.
Infektionserkrankungen sind eine Hauptursache für Mortalität weltweit und somit sind neue Agenzien erforderlich, welche gegen Infektionen wirksam sind. Insbesondere die übermäßige Verwendung von Antibiotika hat jedoch zu dem Phänomen der Antibiotikaresistenz geführt, wodurch Antibiotika unwirksam gegen Mikroorganismen werden und es somit von essentieller Bedeutung ist, neue und verbesserte Antibiotika zu entwickeln.
Es ist insbesondere von Bedeutung, Antibiotika zu identifizieren, welche von den gegenwärtig in Verwendung befindlichen Antibiotika chemisch verschieden sind. Mikroorganismen, welche Antibiotikaresistenz gegenüber bestimmten Antibiotika zeigen, besitzen eine höhere Wahrscheinlichkeit, Resistenz gegenüber einem Antibiotikum auszubilden, das chemisch verwandt ist als gegenüber einem solchen, das strukturell und funktionell verschieden ist. Deshalb können neue antimikrobielle Verbindungen besonders brauchbar sein, welche eher aufgrund ihrer Funktion als aufgrund ihrer Struktur identifiziert werden. Die Entwicklung von Antibiotika, welche gegen Targets wirken, für die keine bekannten Antibiotika existieren, ist ebenfalls von besonderem Interesse.
Gegenwärtige Antibiotikatargets umfassen Enzyme, welche in der Proteinsynthese involviert sind, sowie Membrantransporter oder Zellwandkomponenten. Diese Targets werden zurzeit auf verschiedene Weise identifiziert. Die starke Zunahme an verfügbaren Nukleinsäuresequenzdaten hat die Fähigkeit verbessert, einem Protein auf der Grundlage des Vergleichs von Sequenzdaten eine Funktion zuzuweisen. Die schiere Menge verfügbarer Daten gestaltet dies jedoch schwierig und etwa 25-40% der Gene in einem bakteriellen Genom zeigen keine Übereinstimmungen mit bekannten Genen (Smith D. R. (1996) Trends Biotechnology 8: 290-3). Zusätzlich bedeutet die Tatsache, dass zwei Gene Sequenzhomologie zeigen, nicht zwangsläufig, dass beide strukturell ähnlich sind.
Wirkstofftargets, sei es für Antibiotika oder gegen andere Erkrankungen, sollten idealerweise die folgenden Eigenschaften besitzen: sie müssen für das Überleben, das Wachstum oder die Aktivität des Pathogens oder der Erkrankung notwendig sein; im Hinblick auf Antibiotikatargets oder anti-pathogene Targets ist es ebenfalls nützlich, dass das Targetprotein beim Menschen oder dem zu behandelnden Säuger fehlt oder in anderer Form vorliegt; und der Konservierungsgrad der Struktur des Wirkstofftargets zwischen Spezies, welche bekämpft werden sollen, ist vorzugsweise hoch. Bis heute sind keine Wirkstoffe identifiziert worden, welche als Target die DNA-Replikationsmaschinerie besitzen.
Ist einmal ein Targetprotein identifiziert worden, ist es erforderlich, Verbindungen zu identifizieren, welche in einem Krankheitszustand oder einem Pathogen dessen Funktion inhibieren oder erschweren können. Das Verfahren zum Screenen inhibitorischer Verbindungen, das bisher arbeits- und zeitaufwändig war, wurde mithilfe von Technologien verbessert, welche ein Hochdurchsatzscreening erlauben, bei dem viele hundert oder viele tausend Verbindungen gleichzeitig oder parallel getestet werden können.
Im Allgemeinen sind solche Screenings zur Identifizierung von Antibiotika oder anderen Proteininhibitoren „negative" Screenings. Bei diesen Screenings wird ein Proteininhibitor im Anschluss an die Applikation einer Testsubstanz auf eine Zellpopulation identifiziert, wenn die Zellpopulation eine Verringerung der Lebensfähigkeit zeigt. Dies folgt aus der Tatsache, dass eine der oben beschriebenen Eigenschaften des Targets darin liegt, dass es für das fortgesetzte Wachstum und die Proliferation des in Rede stehenden Pathogens essentiell ist. Eine Wechselwirkung mit dieser essentiellen Funktion beeinflusst die Lebensfähigkeit der Zelle. Somit beruhen die meisten Screening-Techniken auf einem negativen Ergebnis, welches aus einem Außerkraftsetzen einer Funktion des Targets resultiert, wie dem Tod oder der Verringerung des Wachstums von Zellen, welche dieses enthalten oder benötigen. Dieser Ansatz besitzt jedoch mehrere Nachteile. Mehrere verschiedene Tests müssen durchgeführt werden, entweder nacheinander oder parallel, um sicherzustellen, dass der beobachtete Effekt auf die Zelllebensfähigkeit für das Targetprotein spezifisch ist. Die Tatsache, dass der Effekt, wie z. B. der Zelltod, allein beobachtet wird, ist keine hinreichende Bestätigung dafür, dass der Effekt durch einen Effekt auf das Targetprotein verursacht wird. Die Testsubstanz kann ein anderes Targetprotein beeinflusst haben oder der Effekt kann ein allgemeiner Effekt sein, der mit dem spezifischen Targetgen in keinerlei Zusammenhang steht. Somit sind solche negativen Screenings zeitaufwändig und es besteht keine Möglichkeit, ein Resultat ohne Durchführung mehrfacher Tests zu erhalten.
Es wäre von Vorteil, einen Test oder ein Screening für Proteininhibitoren in Händen zu haben, welcher auf einem positiven Ergebnis oder Ausgang beruht, wie z. B erhöhtem Zellwachstum oder dem Überleben einer mutierten Zelle, welche anderenfalls nicht überlebensfähig wäre. Derartige positive Screenings sind insofern von Vorteil, als sie viele mit negativen Screenings verbundene Nachteile vermeiden, wie hohe Hintergrundwerte für Zelltod oder für fehlendes Zellwachstum, welche keiner spezifischen Wirkung des potenziellen Inhibitors zuzuordnen sind, sondern auf anderen Ursachen beruhen können. Im Stand der Technik sind keine derartigen positiven Screenings bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt nunmehr einen derartigen Test bereit.
Letale Überaktivitäts-Mutanten sind Mutanten, die eine oder mehrere Mutationen enthalten, sodass die Aktivität eines spezifischen Genprodukts, das produziert oder exprimiert wird, höher ist im Vergleich zum Wildtyp-Organismus oder dem „nicht-mutierten" Genprodukt (d. h. dem Genprodukt vor der Einführung der letalen Überaktivitäts-Mutation – es ist nicht ausgeschlossen, dass das Genprodukt andere Mutationen tragen kann, welche mit der letalen Überaktivität nicht in Verbindung stehen). Dies kann auf Unterschieden in der Aktivität des Genprodukts selbst, in dessen Expressions- oder Produktionsgrad oder in dessen Regulation der Aktivität (wie z. B. aufgrund einer Zu- oder Abnahme der Expression und/oder Aktivität eines regulatorischen Moleküls) beruhen. Somit kann eine letale Überaktivitäts-Mutante als eine solche betrachtet werden, bei welcher die „Funktionalität" des betroffenen Genprodukts erhöht ist. Die Zunahme der Aktivität (oder „Funktionalität") dieses Genprodukts ist von entscheidender Bedeutung für das Überleben und/oder das Wachstum der mutierten Zellen. Das Genprodukt kann somit jegliches Produkt sein, das letal wirkt oder das einen signifikanten negativen Effekt auf das Wachstum und/oder das Überleben des Organismus besitzt, wenn dessen Aktivität bestimmte Werte überschreitet (z. B. „normale" Werte, z. B. vor der Mutation oder native oder Wildtyp-Werte), z. B. wenn dieses „über-aktiv" ist. Eine derartige, oben beschriebene Überaktivität kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Diese umfassen die Zunahme der Menge oder des Gehalts oder Niveaus des Genprodukts, beispielsweise aufgrund einer erhöhten Expression oder eines verringerten Abbaus oder durch erhöhte oder verlängerte Aktivität. Derartige Mutanten sind somit brauchbar bei positiven Screenings. Diese Mutanten sind jedoch in der Natur selten zu finden und können schwierig herzustellen sein.
DnaA ist ein eubakterielles Protein, welches chromosomale Replikation in Bakterien initiiert (Kornberg und Baker 1992, DNA replication, W. H. Freeman). An dieser Stelle wird der Zyklus der chromosomalen Replikation reguliert. Die DNA-Replikation ist ebenfalls abhängig vom Vorliegen einer besonderen chromosomalen Sequenz, dem OriC, dem Replikationsursprung. Sowohl OriC als auch DnaA sind für eine erfolgreiche Initiierung der Replikation erforderlich und diese beiden Komponenten bilden einen Nukleoproteinkomplex. Etwa 20 bis 40 Monomere des DnaA-Proteins sind in dem OriC-DnaA-Komplex vorhanden. ATP-gebundenes DnaA bewirkt, dass sich die DnaA-Duplex zu entdrillen beginnt, sodass die DnaB-Helikase das Entdrillen vorantreiben kann, bevor die Synthese des komplementären Stranges durch das DNA-Polymerase III Holoenzym erfolgt (Skarstad and Boye, Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1217, 111-140, besprochen in Katayama et al., Molecular Microbiology, 2001, 41(1), 9-17).
Die Initiierung der DNA-Replikation in Prokaryonten und Eukaryonten wird durch eine Vielzahl von Mechanismen aufgrund seiner Bedeutung für den Zellzyklus stark reguliert. Eine übermäßige Zahl von Initiationsereignissen führt gegebenenfalls zu Zelltod.
Ein Beispiel für eine Mutation, welches eine hyperaktive Initiierung verursacht ist DnaAcos, welches eine in E. coli identifizierte Mutation darstellt (Kellenberger-Gujer et al. (1994), Journal of Biological Chemistry, 269(17), 12698-12703). Diese Mutante wurde als temperaturresistenter Suppressor aus einer temperatursensitiven DnaAts46 Mutante isoliert. DnaAts46 is eine hinreichend bekannte E. coli-Mutante, welche ein DnaA-Protein exprimiert, das bei erhöhten Temperaturen (42°C) inaktiv wird, was in einem Mutantenstamm resultiert, der nicht fähig ist, die Replikation bei erhöhten Temperaturen zu initiieren (Kohiyama, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 33, 312-324 (1968); Hirota et al., J. Molec. Biol. 53, 369-387 (1970)).
Die DnaAcos-Mutante weist bekanntlich folgende Eigenschaften auf: Erstens ist ihr Wachstum kältesensitiv; sie wächst normalerweise bei 42°C, die Replikation der chromosomalen DNA wird jedoch sofort über-initiiert, wenn die Zellen in ein Wachstum bei restriktiver Temperatur von 30°C überführt werden; DnaAcos wurde als Suppressormutante von dnaAts46 identifiziert, d. h. sie unterdrückt den dnaAts46 Phänotyp und stellt eine intragenetische Suppressormutante dar. Die Suppressor-Mutationen (Q156L and Y271H) resultieren aus einer Rasensubstitution im dnaA-Gen (Hansen et al., 1992, Mol. Gen.Gent., 234, 15-21, Skarstad und Boye, 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1217, 111-130, Kellenbergen-Gujer et al., 1978, Mol. Gen. Genet., 162, 9-16).
Die Kältesensitivität von dnaAcos ist im Vergleich zum Wildtyp dnaA-Allel dominant und die beobachtete Über-Initiierung bei der restriktiven Temperatur ist unabhängig von der de-novo-Proteinsynthese. Interessanterweise ist keine Zunahme der Menge an DnaA-Protein bei dieser Mutante zu beobachten und man vermutet, dass der Mutanten-Phänotyp abhängig ist von einer erhöhten und/oder verlängerten DnaA-Aktivität. Da die Initiierung mit der Mutante wiederholt erfolgt, wurde vorgeschlagen, dass die Initiations-Kompetenz der DnaAcos-Proteinmutante, beispielsweise über eine Konformationsänderung, in irgendeiner Weise aufrechterhalten wird.
Der Mechanismus der Über-Initiierung in der Mutante wird nicht vollständig verstanden, obwohl das DnaAcos-Protein gereinigt und in vitro charakterisiert wurde (Katayama et al., 1995, Mol. Microbiol., 18, 813-820). Es erhält die Affinität gegenüber der DnaA-Bindungssequenz und zeigt Wirkung bei der Beladung einzelsträngiger DNA mit DnaB Helikase. Das gereinigte Wildtyp-DnaA-Protein bindet ATP und ADP. Das DnaAcos-Protein ist jedoch unfähig, Nukleotide zu binden. Wildtyp-ATP-DnaA besitzt die Fähigkeit, die Replikation zu initiieren, wogegen Wildtyp-ADP-DnaA inaktiv ist (Sekimizu et al., 1987, Cell, 50, 259-265). Die Hydrolyse von Wildtyp-ATP-DnaA zu ADP-DnaA inaktiviert DnaA und reguliert dessen Funktion und dies erfolgt, sobald die Replikationsgabeln auf dem Weg sind, sodass eine Reinitiation eines bereits initiierten Ursprungs unterbunden wird (Boge et al., 2000, EMBO Rep. 1, 479-483). Das DnaAcos-Protein scheint eine „unregulierte" Form des DnaA-Proteins zu sein, das immer „angeschaltet" ist und folglich eine übermäßige DNA-Replikation bei niedrigeren Temperaturen (30°C) verursacht. Bei höheren Temperaturen (42°C) ist das Protein offensichtlich teilweise inaktiv, was erklärt, dass die Über-Initiation im Vergleich zur restriktiven Temperatur verringert ist und die Zellen folglich überleben.
Andere DnaA-Mutanten wurden entwickelt oder können entwickelt werden, welche die Eigenschaften von DnaAcos besitzen oder ähnliche Eigenschaften wie dieses aufweisen (welche z. B. eine temperatursensitive Replikation zeigen), z. B. eine Über-Inhibition der Replikation bei niedrigerer Temperatur (z. B. 30°C). Eine derartige Mutante ist DnaA219, die in den Beispielen verwendet wird.
DnaA und Homologe dieses Proteins in anderen Prokaryonten oder in Eukaryonten oder Archaea, stellen Beispiele für ein Proteininhibitortarget dar, da es ein essentielles Protein für E. coli ist und ebenfalls zwischen verschiedenen bakteriellen Spezies hoch konserviert ist. Andere die DNA-Replikation initiierende Proteine (aus Eukaryoten, Prokaryoten oder Archaea) können ebenfalls Proteininhibitor-Targets darstellen.
Bei einem Vergleich von 104 Sequenzen aus 96 Spezies konnte gezeigt werden, dass DnaA eine hoch konservierte Primärsequenz zeigt und dass die Anordnung von 15 α-Helizes und 9 β-Strängen bei über 93% der Sequenzen beobachtet wird (Weigel und Messer 2002, www.molgen.mpg.de messer).
Darüber hinaus zeigen die Cdc6 und Orc Initiatorproteine der Hefe, wie z. B. von Saccharomyces cerevisiae, eine auffällige strukturelle Ähnlichkeit mit DnaA und stellen somit ein eukaryotisches Targetprotein dar (Erzberger et al. (2002) EMBOJ 21:4763-73, Liu et al., (2000) Mol. Cell. 6:637-48).
Überaktivitäts-Mutanten von Targetproteinen, wie z. B. DnaA-Mutanten, welche eine DNA-Replikation über-initiieren, können in Tests auf potenzielle neue Proteininhibitoren eingesetzt werden; jeglicher Proteininhibitor, der mit der Funktion des Targetproteins (z. B. DnaA) wechselwirkt, wird den Grad der Über-Initiierung verringern und somit das Wachstum der Zellpopulation von mutierten Zellen im Vergleich zu deren Wachstum in Abwesenheit eines derartigen Proteininhibitors verringern. Ein derartiger Test würde jedoch nur die Detektion von schwachen Proteininhibitoren erlauben, d. h. von solchen, die lediglich die DnaA-Aktivität auf normale oder annähernd normale Werte verringern (d. h. auf Werte, welche mit der Wildtyp-DnaA-Aktivität oder der Aktivität des DnaA-Proteins vor Einführung der letalen Überaktivitäts-Mutation („cos")(d. h. der „Quelle" oder dem „Ursprung" oder dem „parentalen" Protein, in welches die letale Überaktivitäts-Mutation eingeführt wurde) vergleichbar sind), sodass ausreichend DnaA-Aktivität vorliegt, die es den Zellen erlaubt zu überleben, wobei die DnaA-Aktivität jedoch nicht hoch genug ist, eine Über-Initiierung zu verursachen, welche zum Zelltod führt. Es ist abzusehen, dass derartige Screenings nicht erlauben würden, eine Unterscheidung zu treffen zwischen dem Vorliegen eines starken Proteininhibitors in der Probe, welcher das Targetprotein stark verringern würde, wie z. B. die DnaA-Spiegel, und einen Zelltod aufgrund des Fehlens einer Initiierung der DNA-Replikation bewirken würde, und dem Fehlen jeglichen Inhibitors in der Probe, der den Zelltod aufgrund einer Über-Initiierung verursacht. Eine ähnliche Situation kann man sich vorstellen für andere Targetproteine und deren letale Überaktivitäts-Mutanten.
Der hierin verwendete Begriff „Mutation" bezeichnet Veränderungen in der Nukleotidsequenz und der Begriff „Mutante" betrifft das Gen oder Genprodukt oder Zellen, welche eine derartige Mutation enthalten.
Selbst wenn somit eine Mutation identifiziert worden ist, welche die Anwendung eines „positiven" Screenings erlaubt, d. h. eines Screenings, bei welchem das Vorliegen eines Proteininhibitors durch eine Zunahme anstelle einer Abnahme der Zellüberlebensfähigkeit angezeigt wird, ist zu erkennen, dass derartige Screenings nicht immer zur Identifizierung von Proteininhibitoren über den gesamten Wirksamkeitsbereich geeignet sind. Die relativ geringe Häufigkeit von letalen Überaktivitäts-Mutanten, welche Zelltod aufgrund ihrer erhöhten Aktivität verursachen, wie DnaAcos (oder analoge Überaktivitäts-Mutationen in anderen DNA-Replikation initiierenden Proteinen), in Kombination mit dieser Tatsache, bedeutet, dass es nicht unmittelbar offenkundig oder naheliegend war, wie ein wirksames positives Screening für Proteininhibitoren entwickelt werden könnte.
Um die Wirksamkeit dieses Screening-Typs und somit die Auswahl an Inhibitoren, die identifiziert werden können, zu erhöhen, wurde von den Erfindern ein Mechanismus identifiziert, bei welchem die Verwendung einer zweiten Mutation in der Zeile, welche die erste (d. h. die letale Überaktivitäts-)Mutation enthält, jegliche starke Verringerung der Aktivität des letalen Überaktivitäts-Mutationsproteintargets kompensiert, die durch die Präsenz eines starken Proteininhibitors in der Probe verursacht wird. Diese zweite Mutation beeinflusst nicht das normale Zellwachstum oder die letale Überaktivität der ersten Mutation, ihre Präsenz kompensiert jedoch eine starke Verringerung der Aktivität des Targetproteins, das durch die Präsenz eines starken Proteininhibitors in der Probe verursacht wird. Die zweite Mutation heilt oder rettet somit den Teststamm vor einer starken oder vollständigen Aktivitätsverringerung des Targetproteins. Auf diese Weise konnten die Erfinder einen verlässlichen und wirksamen positiven Screen oder Test auf Proteininhibitoren bereitstellen.
Das rnh-Gen von E. coli kodiert für RNaseH. Dieses Enzym bewirkt die Spaltung und somit den Abbau von RNA in DNA:RNA-Hybriden. Somit wird eine Zelle, welche eine funktionale Inaktivierung von rnh beispielsweise durch Mutation oder Deletion des Gens enthält, weiterhin RNA:DNA-Hybride enthalten und das Vorliegen derartiger Hybride erlaubt die Initiierung der Replikation unabhängig von DnaA und unabhängig vom chromosomalen Ursprung OriC. Die Initiierung der Replikation resultiert somit von diesen RNA:DNA-Hybriden, welche in Zellen, die ein funktionales RNaseH-Enzym enthalten, nicht vorliegen. Auf diese Weise benötigt die Initiierung der Replikation kein OriC oder DnaA und verläuft auch in Abwesenheit eines voll aktiven Wildtyp-Initiierungssystems. Beispielsweise kennt man von partiell funktionalen rnh-Mutanten, dass diese das Wachstum von Mutanten gestatten, welche zur Verwendung von OriC nicht in der Lage sind (Taya und Crouch, 1991, Mol. Gen. Genet., 227,:433-437; Kogoma und von Meyenburg, 1983, EMBO J. 2: 463-8).
Die Kombination dieser beiden Mutationen, DnaAcos und einer Deletion in rnh in E. coli (oder tatsächlich in anderen Organismen), war bisher nicht möglich.
Zur Vermehrung von Zellen (z. B. einer Population von Zellen), welche diese beiden Mutationen enthalten, sollte die letale Überaktivitäts-Mutante „induzierbar" sein, d. h. „angeschaltet" oder „abgeschaltet" werden können oder nur unter bestimmten Bedingungen exprimiert werden, sodass dessen Expression kontrolliert werden kann oder dass der Phänotyp nur im induzierten Zustand zu beobachten ist. Die Zellen werden kultiviert (z. B. wird die Zellpopulation vergrößert und in Kultur gehalten) unter Bedingungen, bei denen die letale Überaktivität nicht induziert ist. Der Test wird dann unter Bedingungen durchgeführt, bei welchen die letale Überaktivität induziert ist. Dafür kann es beispielsweise erforderlich sein, das mutierte Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu stellen oder die Mutation kann eine temperatur- oder kältesensitive Mutation sein, wie z. B. DnaAcos, oder eine andere konditionale Mutation.
Im Stand der Technik fehlen somit Verfahren, welche das positive Screening auf Proteininhibitoren und Antibiotika beschreiben und welche die Detektion eines vollen Spektrums von Inhibitoren erlauben.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Nachweis eines Proteininhibitors eines Targetproteins, vorzugsweise eines spezifischen Proteininhibitors (wie z. B. den Nachweis des Vorliegens eines Proteininhibitors in einer Probe) bereit, umfassend die folgenden Schritte:

a) das Inkontaktbringen des Inhibitors (oder der den Inhibitor enthaltenden Probe) mit einer Zelle (z. B. einer Zellpopulation), wobei diese Zelle (z. B. Zellpopulation) eine induzierbare letale Überaktivitäts-Mutation in einem Gen (z. B. dem kodierenden Gen), welches das Targetprotein beeinflusst (das „erste" Gen) und eine Mutation in einem zweiten Gen aufweist, wobei die Aktivität des Targetproteins für die Zelle essentiell ist und die Mutation in dem zweiten Gen jegliche Verringerung der Aktivität des ersten Genprodukts (z. B. des Targetproteins) funktionell kompensiert;
b) die Induzierung der letalen Überaktivitäts-Mutation; und anschließend
c) die Bestimmung des Proteininhibitors durch Vergleich der Überlebensrate der Zelle (z. B. Zellpopulation) in Gegenwart und in Abwesenheit des Inhibitors (oder der Probe).

Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit als Assay auf Proteininhibitoren, wie z. B. neue Proteininhibitoren, für ein gewünschtes Targetprotein angesehen werden. Das Verfahren kann somit zum Screenen (oder als Screening auf) neue Proteininhibitoren verwendet werden (was neue Verbindungen oder Funktionseinheiten oder die Identifizierung oder das Screening auf eine neue Proteininhibitor-Aktivität existierender oder bekannter Verbindungen oder Funktionseinheiten beinhaltet).
Unter einem „Proteininhibitor" versteht man jegliche Verbindung oder Funktionseinheit, welche die Fähigkeit besitzt, die normale Funktion des Targetproteins zu unterbinden oder zu verringern und umfasst somit jegliche Funktionseinheiten oder Substanzen, welche die Fähigkeit besitzen, die Funktion des Proteins direkt oder indirekt zu verringern. Das kann erreicht werden durch Beeinflussung der Transkription, der Translation, der post-translationalen Modifikation, der Aktivität oder der Regulation der Aktivität des Proteins. Vorzugsweise wird die Proteinaktivität beeinflusst und insbesondere ist das Targetprotein ein funktionales Protein, welches eine spezielle Aktivität zeigt (welches z. B. seine Funktion vermittelt). Somit kann das Targetprotein ein Enzym oder ein Bindungsprotein sein und die Inhibition kann durch Inhibierung der enzymatischen oder Bindungsaktivität des Targetproteins erreicht werden. Dies kann direkt erreicht werden durch Interaktion und/oder Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum des Enzyms oder der Bindungsstelle des Bindungsproteins oder anderer Proteinstellen, durch Wechselwirkung mit oder Prävention der korrekten Proteinfaltung, sodass dieses nicht funktionieren kann, wie z. B. dass es sein Substrat oder seinen Bindungspartner nicht erkennen kann oder dass Aminosäurereste in Schlüsselpositionen, welche an chemischen oder Bindungsreaktionen beteiligt sind, nicht korrekt konfiguriert sind. Ein „Bindungsprotein" kann jegliches Protein sein, welches die Fähigkeit besitzt, ein Molekül oder eine Substanz in einer Zelle (d. h. jeglicher zellulären Funktionseinheit) zu binden. Vorzugsweise besitzt das Bindungsprotein die Fähigkeit, mit einer solchen zellulären Funktionseinheit eine spezifische Bindung zu bilden. Das Bindungsprotein kann einen funktionalen Effekt durch oder über diese Bindung ausüben (z. B. kann ein funktionaler Effekt durch die Bindung vermittelt werden) oder es kann eine funktionale Einheit binden (d. h. eine Funktionseinheit, welche eine Funktion in einer Zelle ausübt). In analoger Weise kann das Targetprotein jegliche Art von Effektorprotein sein, welches einen funktionalen Effekt in der Zelle bewirkt, beispielsweise durch Wechselwirkung mit einer anderen Komponente in der Zelle und der Proteininhibitor kann diesen funktionalen Effekt des Proteins inhibieren.
Die Inhibition kann zu weniger als 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% oder 1% der normalen Aktivität führen. Vorzugsweise wird die Aktivität vollständig aufgehoben, sodass keine restliche Proteinaktivität verbleibt.
Das „Targetprotein" kann jegliches Protein sein, das für die Zelle essentiell ist. Insbesondere kann das Targetprotein jegliches Protein sein, welches für das Wachstum und/oder das Überleben der Zelle essentiell ist. Es kann somit ein Protein sein, welches mit einem entscheidenden zellulären Prozess, wie z. B. einem zellulären Prozess, der für das Wachstum und/das Überleben der Zelle essentiell ist, assoziiert ist. Selbstverständlich wäre ein solches Protein essentiell für diesen Prozess. Beispielsweise kann das Targetprotein ein Protein sein, das mit einem Biosynthese-Prozess oder einer Biosynthese-Reaktion assoziiert ist oder daran beteiligt ist, wie z. B. der Synthese eines zellulären Produkts oder eines biologischen Moleküls oder Intermediates, umfassend beispielsweise die Synthese von Nukleinsäuren (einschließlich aller Formen von DNA und RNA, welche in Zellen vorkommen können) und Proteinen sowie anderen Molekülen, welche in Zellen vorkommen können. Ein Targetprotein kann somit bei der Replikation von DNA (DNA-Synthese), der Synthese von RNA (z. B. Transkription von DNA in mRNA, Translation von mRNA und Synthese von Proteinen) sowie an anderen zellulären oder biologischen Reaktionen oder Prozessen beteiligt sein. Das Targetprotein kann ein Protein sein, das mit der Initiierung jeglicher solcher zellulärer Prozesse oder Reaktionen assoziiert ist, wie z. B. ein Initiator der DNA-Replikation oder der Proteinsynthese. Initiatorproteine der DNA-Replikation sind bevorzugt, insbesondere DNA-Replikation initiierende Proteine in Prokaryonten, insbesondere in Bakterien, und vor allem in E. coli.
In einem solchen Fall resultiert die letale Überaktivitäts-Mutation in dem ersten Gen in einer erhöhten DNA-Replikation und insbesondere in einer erhöhten DNA-Replikation auf letalem Niveau. Die zweite Mutation kompensiert die Verringerung oder den Verlust der DNA-Replikationsaktivität (verursacht durch Inhibition durch den zu testenden Protein-Inhibitor), indem sie einen alternativen Mechanismus oder Weg für die DNA-Replikation bereitstellt (d. h. die zweite Mutation führt zu einer erhöhten DNA-Replikation oder zu einer Replikation, welche in Abwesenheit der zweiten Mutation nicht erfolgen würde). Die Inhibition wird nicht direkt gemessen sondern vielmehr funktional bestimmt, indem sie die mutierte Zelle des Tests vom Effekt der letalen Überaktivitäts-Mutation auf deren Überleben und/oder Wachstum befreit. Die Inhibition des Target-Proteins kann daher gemessen werden, indem man die Zellpopulation-Zahlen bestimmt (z. B. misst). Ein positives Ergebnis, d. h. das Vorliegen eines Proteininhibitors, wird durch eine messbare oder detektierbare Zunahme des Zellwachstums, beispielsweise eine statistisch signifikante Zunahme des Zellwachstums, wie z. B. eine wenigstens zehnfache, zwanzigfache, dreißigfache, fünfzigfache oder hundertfache Zunahme, angezeigt, und wird beispielsweise durch geeignete Mittel, wie z. B. spektrophotometrisch durch Bestimmung einer Zunahme in der Extinktion der Zellkultur (z. B. Wachstumsmedium) oder einer Zunahme in der optischen Dichte, wie Z. B. der OD₄₅₀, oder durch andere spektrophotometrische oder colorimetrische Tests auf Proteine oder andere Zellkomponenten gemessen. Wachstum kann auf jede zweckmäßige oder gewünschte Art und Weise detektiert werden. Beispielsweise können Zellkolonien (beispielsweise von Bakterien) gezählt oder in anderer Weise enumeriert werden.
Unter einem „spezifischen" Proteininhibitor versteht man, dass der Inhibitor nur oder vorzugsweise oder selektiv auf das Protein oder eine Klasse von Proteinen wirkt, welche durch die letale Überaktivitäts-Mutation beeinflusst werden und keine Funktion anderer strukturell oder funktional nicht verwandter Proteine oder Klassen von Proteinen beeinflusst. Somit kann sich „spezifisch" auf die Spezies beziehen, von welcher das Targetprotein abgeleitet ist oder auf eine Klasse von Proteinen. Ein spezifischer Inhibitor besitzt somit die Fähigkeit zwischen verschiedenen Proteinen zu unterscheiden und wird in dem Test nur nachgewiesen werden, wenn die Funktion des Proteins durch die letale Überaktivitäts-Mutation inhibiert wird. Der spezifische Proteininhibitor wird vorzugsweise die Aktivität oder die Funktion des Proteins reduzieren.
Der Proteininhibitor kann ein anderes Protein oder ein Peptid oder ein kleines Molekül, wie z. B. ein kleines organisches Molekül, ein Antikörper, ein Ribozym, eine Antisense-RNA oder DNA oder ein Analoges des Substrates und dergleichen sein. Der Proteininhibitor kann somit eine chemische Funktionseinheit sein. Vorzugsweise ist der Proteininhibitor ein Antibiotikum. Das Antibiotikum kann natürlichen Ursprungs oder synthetischen Ursprungs sein und kann ein Derivat darstellen oder eine chemisch synthetisierte Variante eines natürlichen Antibiotikums.
„Inkontaktbringen" wird hierin so verstanden, dass man einen geeigneten Kontakt zwischen dem Inhibitor (oder der Probe) und der Zelle (z. B. Zellpopulation) bereitstellt, so dass es dem Inhibitor (oder Komponenten der Probe) ermöglicht wird in die Zellen einzutreten (z. B. die Zellmembran und/oder die Zellwand zu durchdringen) und direkt oder indirekt mit dem Targetprotein zu interagieren und/oder zu wechselwirken. Somit kann der Inhibitor/die Probe einfach mit der (den) Zellen) beispielsweise dadurch in Kontakt gebracht werden, dass man diesen zu den Zellen oder zu einem Medium gibt, das die Zelle(n) wie z. B. ein Kulturmedium oder eine Kultur der Zellen, enthält. Zweckmäßigerweise können die Zellen in einem Flüssigmedium vermehrt (oder kultiviert oder gehalten) werden, in welches der Inhibitor/die Probe eingeführt oder zugesetzt wird. Alternativ dazu können die Zellen in oder auf einem Festmedium (wie z. B. Kultur-Schale oder –gefäß oder –platte) enthalten sein, in welches der Inhibitor/die Probe eingeführt oder zugesetzt wird.
Die „Probe", welche auf die Zelle angewandt wird kann jegliche Probe sein, wie z. B. jegliche Probe, die zu testende Inhibitorsubstanz (d. h. den zu testenden Proteininhibitor) enthält oder aus diesen besteht, wie z. B. eine reine Probe, oder sie kann ein Pool reiner Proben oder eine chemische Bibliothek, beispielsweise hergestellt durch kombinatorische Chemie, darstellen. Die Probe kann bekannte und/oder nicht charakterisierte Komponenten umfassen. Wenn man feststellt, dass eine Probe, umfassend nicht charakterisierte Verbindungen, einen Proteininhibitor enthält, dann kann diese Probe unter Verwendung von Standardtechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. Chromatographie (z. B. HPLC, Dünnschichtchromatographie, FPLC, Gelfiltration, Entsalzen usw.) fraktioniert werden und die resultierenden Fraktionen oder Isolate können dann als Proben in diesem Test dienen. Auf diese Weise besteht die Möglichkeit große Probenpools mit einer relativ geringen Anzahl von Tests zu untersuchen und zusätzlich Proben zu screenen, welche neue oder nicht charakterisierte Komponenten enthalten, ohne zuerst die Komponenten reinigen zu müssen. Es besteht außerdem die Möglichkeit reine Proben dem Test zuzusetzen. Somit kann die getestete Probe jegliche Probe von gereinigtem oder ungereinigtem Material sein, welche in herkömmlicher Weise bereitgestellt wird. Beispielsweise kann die Probe die Testsubstanz selbst sein oder sie kann eine Zusammensetzung sein, welche die Testsubstanz (wobei die Testsubstanz selbst rein oder ungereinigt vorliegen kann) und einen Träger oder Verdünnungsmittel, wie z. B. ein geeignetes Medium, umfassen. Sie kann ein Rohpräparat oder ein gereinigtes oder partiell gereinigtes Präparat darstellen.
Die zu testende Probe kann synthetische oder natürlich vorkommende Komponenten umfassen. Natürlich vorkommende Komponenten können beispielsweise von Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilzen, sezerniert werden, und können einen großen Bereich chemischer Diversität abdecken. Die zu testende Substanz kann somit jegliche Substanz sein, welche in die Zelle eindringt. Sie kann somit von jeglicher chemischer Natur sein und komplexe oder einfache Moleküle, wie z. B. organische oder anorganische Moleküle, umfassen.
Wenn die zu testende Substanz in nicht effizienter Weise in die Zellen eindringt oder aus den Zellen durch Efflux-Pumpen herausgepumpt wird, so können die Test-Zellen modifiziert werden, um dies zu kompensieren. Permeable Stämme können erzeugt und verwendet werden oder die Gene bekannter Efflux-Pumpen können mutiert und/oder deletiert oder funktional inaktiviert werden. Dies wird mit Hilfe von Standardtechniken durchgeführt.
Die zu testende Probe kann verschiedenen aliquoten Teilen der Zellen parallel oder sequentiell bei verschiedenen Konzentrationen zugesetzt werden. Vorzugsweise wird jedoch nur eine einzelne Konzentration jeder zu testender Probe benötigt, um festzustellen, ob ein Proteininhibitor vorliegt, was durch die Sensitivität des Screenings bedingt ist.
Die in dem Test verwendete Zelle (verwendeten Zellen) ist (sind) vorzugsweise eine Zellpopulation, insbesondere bevorzugt eine klonal abgeleitete Population, wobei die einzelnen Zellen davon genetisch identisch sind. Die Zelle(n) enthält (enthalten) die beiden mutierten Gene (d. h. das erste mutierte Gen, das die letale Überaktivitäts-Mutation trägt und das zweite „kompensatorische" mutierte Gen). Die Mutationen können in die Gene eingeführt werden oder die mutierten Gene können eingeführt werden, jeweils auf jeglichem geeigneten oder gewünschten Weg. Die Zellen können transfiziert oder transformiert oder transduziert worden sein mit den mutierten Genen oder die Gene können mit Hilfe anderer molekularbiologischer Standardtechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, eingeführt worden sein. Alternativ dazu können die Mutationen unter Verwendung standardisierter Verfahren zur Mutagenese (welche gerichtet oder nicht-gerichtet, z. B. zufällig, sein kann) und von Selektionstechniken, wie z. B. durch Identifikation von Revertanten, Suppressoren oder Mutanten, erzeugt worden sein. Beispielsweise können kältesensitive Suppressoren von dnaA(ts), wie z. B. DnaACos, mit Hilfe von Screeningprozessen identifiziert werden. Beispielsweise kann eine temperatursensitive Zellmutante, die eine Mutation in einem Protein enthält, so dass das Protein bei höherer (restriktiver) Temperatur nicht normal funktionieren kann, als Ausgangspunkt verwendet werden. Suppressoren können mit Hilfe normaler Prozesse oder durch Mutagenese unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt werden. Wenn derartige Mutanten beispielsweise kältesensitiv sind, kann diese Eigenschaft tatsächlich von einer Überaktivität des Proteins und nicht von dessen Inaktivität resultieren. Auf diese Weise besteht die Möglichkeit letale Überaktivitäs-Mutanten zu identifizieren.
Die Zellen können jegliche Zellen sein, wie Z. B. prokaryotische oder eukaryotische Zellen, einschließlich Eubakterienzellen und Archaeazellen, sowie Zellen von Pflanzen, Pilzen und Tieren, wie z. B. Zellen von Bakterien, Säugern oder Hefen (z. B. Saccharomyces sp., wie z. B. S. cerevisiae oder S. pombe). Vorzugsweise sind die Zellen bakteriell, insbesondere sind die Zellen E. coli.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthalten die Zellen (vorzugsweise bakteriellen Zellen) eine letale Überaktivitäts-Mutation in DnaA und eine Mutation, welche die RnaseH inaktiviert (z. B. eine Deletion von rnh). Eine besonders bevorzugte derartige Mutation, DnaA219Δrnh, ist in den Beispielen beschrieben und wird als Stamm SF53 bezeichnet, der bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Porton Down, UK, am 6. Mai 2003 unter der Hinterlegungsnummer 03050701 hinterlegt ist. Die Hinterlegung erfolgte im Namen der The Norwegian Radium Hospital Research Foundation, P.O. Box 56, Montebello, 0310 Oslo, Norwegen.
Gemäß einem anderen repräsentativen Beispiel befindet sich die Überaktivitätsmutation in dem Cdc6-Gen oder einem Orc-Gen. Cdc6 und Orc sind Gene, welche Replikations-Initiatorproteine in Eukaryonten kodieren.
Der Begriff „Mutation" wird hierin so verstanden, dass er eine oder mehrere Veränderungen in der Nukleotidsequenz eines Gens bezeichnet. Die Veränderung kann eine Addition, Deletion oder Substitution von Nukleotiden in kodierenden oder nichtkodierenden Bereichen des Gens sein und kann die Funktion des Genproduktes, wie z. B. des durch das Gen kodierten Proteins, beeinflussen oder es kann die Kontrolle der Expression dieses Gens beeinflussen. Beispielsweise kann die Mutation eine Überexpression verursachen, d. h. eine Zunahme des Expressionsgrades im Vergleich zu einem Gen (z. B. einem Wild-Typ-Gen), das diese Mutation nicht aufweist. Alternativ dazu kann die Mutation zu Veränderungen in der Primär-, Sekundär- oder Tertiär-Struktur des Proteinproduktes führen. Derartige Veränderungen können die Funktion des Proteins im Vergleich zur nichtmutierten (z. B. Wild-Typ-)Form des Proteins beeinflussen. Die Veränderungen in der Funktion können im Zusammenhang mit einer erhöhten Aktivität stehen, die beispielsweise durch eine veränderte Bindung von Substraten oder Cofaktoren, veränderten Mechanismen der Regulation oder Lokalisation verursacht werden.
Unter einer „letalen Überaktivitäts-Mutante" versteht man, dass die hierin beschriebene genetische Veränderung oder Mutation zu einer Zunahme in der Aktivität des Targetproteins führt, im Vergleich zur nicht-mutierten Form des Proteins, d. h. der Form des Proteins, wie sie vorher oder ohne die letale Überaktivitäts-Mutation produziert wird (wie beispielsweise durch das Wild-Typ-Gen kodiert) und wobei diese Zunahme in der Aktivität die Lebensfähigkeit der diese Mutation enthaltenden Zellen verringert.
Die letale Überaktivitäts-Mutation kann in jeglichem Gen vorliegen, welches das Targetprotein beeinflusst, obwohl es im Allgemeinen in dem das Targetprotein kodierenden Gen vorliegen wird. Zusätzlich zu Genen, die das Targetprotein kodieren, kann ein das Targetprotein beeinflussende Gen jegliches Gen beinhalten, welches für ein Genprodukt kodiert, das einen Effekt auf das oder eine Aktivität von dem Targetprotein aufweist, wie z. B. ein regulatorisches Molekül.
Die Zunahme der Aktivität des Proteins kann aus einer Zunahme der Proteinexpression, aus einer strukturellen oder funktionellen Veränderung in dem Protein (oder dessen Regulation) resultieren und kann die Wachstumsrate der Zellen, welche die Mutation enthalten, verringern oder kann den Zelltod verursachen. Die Mutation kann die Aktivität jeglichen Proteins der Zelle beeinflussen, wie z. B. eines Enzyms oder eines Strukturproteins, eines Rezeptors oder eines Signalproteins, oder kann jedes andere funktionale oder Effektorprotein beeinflussen, solange die Überaktivität dieses Proteins das Zellwachstum und/oder die Zellviabilität verringert. Der detektierbare Phänotyp einer Zeile, die eine derartige letale Überexpressions-Mutation enthält (d. h. eine letale Überaktivitäts-Mutante) ist deshalb eine Verringerung in der Fähigkeit zum Wachstum, zur Teilung und/oder zum Überleben.
Wie oben diskutiert liegt die letale Überaktivitäts-Mutation vorzugsweise in einem Gen vor, welches an der DNA-Replikation beteiligt ist, insbesondere in einem Gen, welches an der Initiierung der DNA-Replikation und vor allem einem Gen, welches an der Initiierung der prokaryontischen und insbesondere bakteriellen DNA-Replikation beteiligt ist, wie z. B. dem dnaA-Gen. Mutationen in dem dnaA-Gen umfassen dnaAcos sowie die Mutation dnaA219 des E. coli Initiations-Proteins DnaA, wie in folgendem Beispiel 1 beschrieben.
Das bevorzugte Targetprotein ist somit ein Initiator der DNA-Replikation. Jeglicher Initiator der DNA-Replikation kann verwendet werden, einschließlich solcher aus prokaryotischen (einschließlich Archaea) und eukaryotischen Quellen. Unter einem Initiator der DNA-Replikation versteht man ein Protein, welches an den Ursprung der Replikation bindet und dadurch den Start des Prozesses der DNA-Replikation auslöst, d. h. das Protein ist verantwortlich für den ersten oder initialen Schritt im Prozess der DNA-Replikation. Eukaryontische Replikations-Initiatorproteine umfassen Cdc Proteine (z. B. Cdc6, Cdc18 und Cdc45, Cdt Proteine, z. B. Cdt1, Orc Proteine (z. B. Orc1) und MCM Proteine (Liu et al., 2000, Mol. Cell 6: 637). Homologe und orthologe von solchen Proteinen (z. B. von anderen Spezies) können ebenfalls verwendet werden.
Bei Eukaryoten beginnt die Replikation mit der Bindung des Sechs-Untereinheiten umfassenden ORC-Kompexes an den Urspung an welchem außerdem Cdc6, MCMs und Cdc45 rekrutiert werden. Archaea enthalten Orthologe von mehreren eukaryotischen Replikationsproteinen, einschließlich Cdc6 und MCMs. Es wird angenommen, dass die Archaea-Replikation analog zur Replikation bei Eukaryoten jedoch mit geringerer Komplexität funktioniert. Archaea enthalten keine offensichtlichen Homologen von Orc, jedoch ist Orc1 homolog zu Cdc6, so dass angenommen wird, dass in Archaea das „Cdc6/Orc"-Protein (d. h. das Cdc6 Homologe) beide Funktionen übernimmt. Cdc6/Orc aus Archaeaspezies und DnaA wurden kürzlich kristallisiert und als strukturell ähnliche Proteine beschrieben.
Während Initiatoren der DNA-Replikation als Targetproteine bevorzugt sind so können doch, wie oben erwähnt, jegliche Initiatorproteine verwendet werden, d. h. jedes Protein, das bei der Initiation irgendeines zellulären Prozesses, wie z. B. der Transkription oder Translation im Prozess der Proteinsynthese, involviert ist.
Mutierte Versionen solcher Proteine, welche eine letale Überaktivität zeigen, können, wie oben diskutiert, unter Verwendung von Standardverfahren erzeugt und/oder identifiziert werden. Im Falle bestimmter Proteine sind geeignete Mutanten, welche verwendet werden können bereits bekannt und sind in der Literatur beschrieben. Diese umfassen Mutanten von DnaA, z. B. DnaAcos und DnaA219 wie oben erwähnt) und von Cdc Proteinen, wie z. B. Cdc6 in Hefe. So werden beispielsweise in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Mutanten von cdc6 (cdc6-3 und cdc6-2) bereits bei permissiver Temperatur überrepliziert und sterben bei nichtpermissiver Temperatur (Lang und Stillman, 1997, Genes Dev. 11:3375). In der Hefe Schizosaccharomyces pombe wird Cdc6 auch als Cdc18 bezeichnet. Zellen mit Überaktivität von Cdc18 zeigen eine Überreplikation (Nishitani und Nurse, 1995, Cell 83: 397; Muzi-Falconi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1566).
Der hierin verwendete Ausdruck "induzierbar" beschreibt die Fähigkeit den Mutationsphänotyp der Zelle, welche die letale Überaktivitäts-Mutante enthält, an- und abzuschalten. Es gibt folglich zwei Zustände – den nicht-induzierten Zustand, bei welchem die Zelle die Fähigkeit besitzt normal zu wachsen und sich zu teilen und den induzierten Zustand, bei welchem diese Fähigkeit durch Einschalten der Mutation unterbunden ist. Diese „Induzierbarkeit" kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. In einem Beispiel für eine dominante letale Überaktivitäts-Mutation, welche in die Zelle zusätzlich zu einem Wild-Typ-Gen eingeführt wird und welche einen dominanten Effekt über das Wild-Typ-Gen besitzt, insofern als der Mutantenphänotyp trotz des Vorliegens des Wild-Typ-Gens beobachtet wird, kann das mutierte Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt werden. In ähnlicher Weise kann ein induzierbarer Promotor verwendet werden für den Fall, dass nur die Version der letalen Überaktivitäts-Mutante, dominant oder nicht, des Gens in der Zelle vorliegt (oder aktiv ist) (z. B. wenn das „normale" oder Wild-Typ-Gen fehlt oder inaktiviert, wie Z. B. ausgeschalten, wurde). Dieser Promotor erfordert die Präsenz einer bestimmten Komponente (des Effektors) im Wachstumsmedium, damit Transkription des Gens, welches künstlich unter dessen Kontrolle gestellt wurde, auftritt. Auf diese Weise ist keine Transkription des mutierten Genes (z. B. des exogenen mutierten Gens) bei Fehlen dieser Komponente (Effektor) zu beobachten und folglich wird kein mutiertes Protein produziert. In Gegenwart der Komponente/des Effektors wird das mutierte Gen transkribiert und die Proteinmutante wird folglich produziert. Wenn die letale Überaktivitäts-Mutante dominant ist wird deren Präsenz die Zell-Viabilität beeinflussen, und zwar sogar in Gegenwart des „nichtmutierten" (z. B. Wild-Typ) Proteins. Bei Fehlen des „nicht-mutierten" Proteins (oder bei Fehlen dessen Aktivität) wird der Effekt jeglicher letaler Überaktivitäts-Mutation in gleicher Weise zu beobachten sein. Beispielsweise kann das mutierte Gen unter die Kontrolle des lac-Promotors des λ-Promotors oder des Arabinose-Promotors gestellt werden.
Alternativ dazu kann der Mutanten-Phänotyp des Proteins über konditionale Mittel induziert werden, d. h. die letale Überaktivitäts-Mutation kann eine konditionale Mutation sein, worin der Mutations-Phänotyp des Targetproteins durch eine Veränderung einer oder mehrerer Bedingungen (z. B. Parameter), welche die Zelle betreffen (wie z. B. Temperatur oder andere Kulturbedingungen, Alter, Nährstoffe) induziert werden. Restriktive Bedingungen sind solche, bei welchen der Mutations-Phänotyp beobachtet wird, während permissive Bedingungen solche sind, bei denen der Mutations-Phänotyp unterdrückt ist (was zu einer nicht-überaktiven Genfunktion führt, wie z. B. Wild-Typ- oder normale Aktivitätswerte) (d. h. „nicht-mutierte" Genfunktion). Somit kann der Mutations-Phänotyp der Proteinmutante durch Veränderung der Temperatur der Zelle induziert werden. Temperatur- oder Kältesensitive Mutationen sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt und resultieren aus Veränderungen in der Primärstruktur (d. h. der Aminosäuresequenz) des mutierten Proteins. Bestimmte Aminosäuren in Schlüsselpositionen in dem Protein können Temperatursensitivität verleihen. Die Sekundärstruktur des Proteins verändert sich als Folge einer Verschiebung in der Wachstumstemperatur der Zelle, welche das mutierte Protein enthält.
Die Veränderung in der Konfirmation des Proteins bei verschiedenen Temperaturen kann zu Veränderungen in den Proteineigenschaften führen. Beispielsweise kann das Protein übermäßig aktiv bei einer Temperatur werden, während es sich im Wesentlichen bei einer anderen Temperatur normal, wie der Wild-Typ verhält. Alternativ dazu kann das Protein normal, d. h. mit Wild-Typ-Aktivitätswerten bei einer Temperatur funktionieren und inaktiv werden oder eine verringerte Aktivität zeigen bei Veränderung der Temperatur. Die Temperatur, bei welcher sich das Protein normal verhält wird als permissive Temperatur bezeichnet. Die Temperatur bei welcher das Protein Eigenschaften der Mutante zeigt, wie z. B. eine verringerte, erhöhte oder verschiedene Aktivität, wird als restriktive Temperatur bezeichnet.
Diese temperatursensitiven oder kältesensitiven Mutanten haben sich bei der Untersuchung der Auswirkungen letaler Mutationen als sehr hilfreich erwiesen. Wachstum und Vermehrung der Zelle oder des Organismus bei der permissiven Temperatur ermöglicht ein Expandieren oder Perpetuieren von Zellen, welche Proteine mit den betreffenden Mutationen beinhalten. Indem man diese Zellen einer Temperaturverschiebung aussetzt und somit den Mutations-Phänotyp erzeugt besteht die Möglichkeit, die Funktion anderenfalls letaler Mutationen zu untersuchen. Temperatur- und kältesensitive Mutationen sind von Vorteil, da die Veränderung in der Proteinstruktur und Funktion bei Veränderung der Temperatur auftritt und keine Verzögerungsphase ausweist, die bei Verwendung anderer induzierbarer Systeme beobachtet wurde, wie z. B. bei der Zugabe eines Transkriptions-Induktors. Es ist somit bevorzugt, dass die erfindungsgemäße letale Überaktivitäts-Mutanten temperatur- oder kältesensitiv sind. Am meisten bevorzugt liegt die restriktive Temperatur bei 30°C und die permissive Temperatur bei 42°C.
Unter einem „Targetprotein" versteht man ein Protein, das als essentiell oder kritisch für das Wachstum und/oder das Überleben der Zelle, in welcher es vorliegt oder exprimiert wird, ist und für welches es wünschenswert ist einen Inhibitor zu identifizieren, beispielsweise zur Verwendung als Wirkstoffkandidat gegen das Targetprotein. Beispielsweise kann somit das Targetprotein kritisch oder essentiell für ein Pathogen oder für die andauernde Existenz eines Krankheitszustandes sein. Wie oben bereits erwähnt, können bestimmte Proteine mit speziellen Krankheitszuständen, wie z. B. Krebs, assoziiert sein und können somit potentielle Wirkstofftargets darstellen. Wie ebenfalls oben diskutiert können Wirkstoffe, welche mit diesen Targetproteinen Wechselwirken, mit Hilfe von Screenings identifiziert werden, wobei der Effekt eines potentiellen Wirkstoffes auf das Targetprotein über den Einfluss des Wirkstoffes auf den Phänotyp einer Zelle gemessen wird, welche das Targetprotein für sein Wachstum und/oder Überleben benötigt.
Erfindungsgemäß wird das Targetprotein so mutiert, dass es eine letale Überaktivitäts-Mutation darstellt, d. h. dass es eine erhöhte oder exzessive Aktivität im Vergleich zum nicht-mutierten oder Wild-Typ-Protein aufweist. Auf diese Weise wird die Reduktion der mutanten Überaktivität des Targetproteins in dem Test bestimmt. Dadurch wird ein positiver Test bereitgestellt, in dem die Verringerung der Aktivität des mutierten letalen Überaktivitätsproteins nachgewiesen wird. Wenn die Zellen, welche das mutierte Überaktivitätsprotein aufweisen, überleben, dann enthält die Testsubstanz eine Verbindung, welche die Überaktivität des mutierten Targetproteins verringert. Eine derartige Verbindung besitzt ein Potential für die Verwendung als Wirkstoff, der mit der normalen Aktivität des Targetproteins wechselwirkt, um auf diese Weise eine Infektion zu verringern oder den betreffenden Krankheitszustand zu bekämpften.
Wie oben bereits erwähnt, kann das Targetprotein jegliches funktionale Protein sein (z. B. jegliches Effektorprotein). Es ist aber bevorzugt ein Enzym oder ein Bindungsprotein, insbesondere ein Enzym oder Bindungsprotein, welches am DNA-Metabolismus beteiligt ist. Insbesondere bevorzugt ist ein Protein, das an der Replikation chromosomaler DNA beteiligt ist, wie z. B. das bakterielle DnaA (z. B. aus E. coli) oder ein Homologes davon. Homologe von DnaA können in anderen Spezies gefunden werden, wie Z. B. E. coli, S. enterica, S. marcescens, P. mirabilis, B. aphidicola, Y. pestis, V. harveyi, V. cholera, P. putida, P. aeruginosa, P. multocida, H. influenzae, S. putrefaciens, C. crescentus, R. meliloti, Z. mobilis, R. prowazekii, Wolbachia sp., H. pylori, C. jejuni, B. Pertussis, N. meningitidis, T. ferrooxidans, C. difficile, B. subtilis, B. halodurans, B. anthracis, S. aureaus, S. pneumoniae, M. capricolum, M. genitalium, M. pneumoniae, U. urealyticum, S. citri, E. faecalis, M. luteus, C. diphtheriae, M. leprae, M. avium, M. tuberculosis, M. smegmatis, S. coelicolor, S. chrysomallus, P. marinus, Synechocystis sp., C. pneumoniae, C. trachomatis, C. muridarum, B. burgdorferi, T. pallidum, T. denticola, T. maritima, T. thermophilus, D. radiodurans, A. aeolicus, C. tepidum, D. ethenogenes, P. gingivalis. Andere Proteine, welche an der DNA-Replikation beteiligt sind, können ebenfalls verwendet werden, wie Z. B. die eurkaryotischen Cdc6/Orc-Proteine, welche oben bereits erwähnt wurden, oder irgendwelche anderen Replikationsinitiatoren.
Die Mutation in dem zweiten Gen ist erforderlich, um die Detektion starker Proteininhibitoren zu ermöglichen, welche gewöhnlich im Falle eines einfachen Positiv-Screenings nicht detektiert werden würden. In einem normalen, auf einer Einzelmutation beruhenden Positiv-Screening, worin eine Zelle verwendet wird, die eine einzelne letale Überaktivitäts-Mutation umfasst, kann ein Proteininhibitor der die Aktivität der Überaktivitätsmutante beeinträchtigt, so dass die Aktivität verringert wird, jedoch nicht vollständig verschwindet, ein Überleben der Zelle bewirken oder bewirken, dass diese ein verbessertes Überleben oder Wachstum in Gegenwart eines solchen Inhibitors im Vergleich zu mutierten Zellen zeigen, die bei Fehlen eines solchen Inhibitors wachsen. Wenn jedoch ein starker Inhibitor (beispielsweise in der Probe) vorliegt, der die Funktion der letalen Überaktivitäts-Mutation im Wesentlichen oder vollständig unterbindet, dann werden die mutierten Zellen absterben unabhängig davon ob ein derartiger Inhibitor vorliegt. Das Targetprotein, das die letale Überaktivitäts-Mutation enthält ist aufgrund seiner Natur essentiell für das fortgesetzte Überleben und/oder Wachstum und Vermehrung der Zelle und ist aus diesem Grund ein geeignetes Targetprotein und die Inhibition des Targetproteins wird über diese Eigenschaft gemessen. Es ist jedoch nicht möglich in einem solchen System zwischen einem starken Inhibitor, der ein Überleben von Zellen, welche die letale Überaktivitäts-Mutante enthalten, durch vollständige oder signifikante Inhibition der Aktivität des mutierten Targetproteins, welches für das fortgesetzte Überleben dieser Zellen essentiell ist, verhindert, und dem Fehlen jeglicher Inhibition, unter welchen Bedingungen die Zellen nicht überleben können, zu differenzieren. Somit besteht für jegliches Positiv-Screening, welches eine einzelne, letale Überaktivitäts-Mutation verwendet, eine Beschränkung im Hinblick auf die Stärke des Inhibitors der mit Hilfe dieses Screenings detektiert werden kann, insofern als nur schwache Inhibitoren oder stärkere Inhibitoren lediglich bei Verwendung geringer Mengen detektiert werden.
Die Erfinder haben einen neuen Test entwickelt, bei welchem es eine zweite Mutation, die in der Zelle ebenfalls vorliegt, der Zelle ermöglicht zu überleben, wenn der Proteininhibitor ausreichend stark ist (oder in ausreichend hoher Menge vorliegt) um die Funktion des Targetproteins vollständig zu unterbinden oder unter ein Niveau zu verringern, bei welchem die Zellen überleben und/oder wachsen können.
Die zweite Mutation substituiert und kompensiert das Fehlen der Aktivität des Targetproteins, welches durch eine Aktivitätsverringerung durch den Proteininhibitor verursacht wird. Dessen Phänotyp ist deshalb nur nachweisbar, wenn die Aktivität der ersten letalen Überaktivitäts-Mutante verringert ist, da die letale Überaktivitäts-Mutante dominant ist. Die zweite Mutation kann in der Insertion eines oder mehrerer neuer Gene bestehen, dessen (deren) Genprodukt(e) die fehlende Aktivität des Targetproteins kompensieren kann (können). Alternativ dazu kann die Mutation eine solche sein, welche ein bestimmtes Gen/Genprodukt inaktiviert oder dessen Expression und/oder Aktivität substantiell reduziert, wie z. B. eine Nonsense-Mutation in einem Gen oder eine Deletion, welche das Produkt oder das funktionale Produkt des Gens aus der Zelle entfernt.
Die Mutation im zweiten Gen ermöglicht das fortgesetzte Überleben und Wachstum der Zeile in Gegenwart eines starken Inhibitors (oder von hohen Konzentrationen oder Mengen des Inhibitors) der die Aktivität des Targetproteins verringert. Die Mutation in dem zweiten Gen kann somit auf dem gleichen Niveau wie die letale Überaktivitäts-Mutante oder Downstream dazu wirken. Wenn also die letale Überaktivitäts-Mutation in einem Initiator eines zellulären Prozesses vorliegt, erlaubt die zweite Mutation, dass dieser Prozess bei Fehlen eines jeglichen funktionalen Initiators dieses Prozesses fortschreitet. Liegt beispielsweise die letale Überaktivitäts-Mutante in einem Initiator der DNA-Replikation, wie z. B. in Prokaryonten, vor und führt zu einer Überaktivität des DNA-Replikation-Initiator-Proteins (z. B. DnaA) und verursacht eine Über-Initiierung der DNA-Replikation, ist die zweite Mutation vorzugsweise eine solche, welche es der DNA-Replikation erlaubt, in Abwesenheit des funktionalen DNA-Replikation-Initiatorproteins (z. B. DnaA) fortzuschreiten, beispielsweise dadurch, dass ein alternativer Replikationsmechanismus bereitgestellt wird. Somit kann diese Mutation jegliche Mutation sein, welche das rnh-Gen, welches die Rnase H kodiert, inhibiert und ist vorzugsweise die Deletion von rnh.
Unter „funktionalem Kompensieren" versteht man, dass eine zusätzliche oder alternative Aktivität in die mutierten Zelle eingeführt oder darin deletiert (oder substantiell reduziert) wird. Die Kompensation liegt somit in der Bereitstellung eines Mittels, mit dessen Hilfe die Zelle auch weiterhin im Wesentlichen normal funktionieren kann, und zwar trotz des Fehlens oder der Verringerung der Aktivität eines Targetproteins in Schlüsselposition. Die zweite Mutation kann somit jegliche Reduktion der Aktivität des ersten Genproduktes (d. h. des Targetproteins) funktional kompensieren, und zwar unterhalb eines die Viabilität erhaltenden Wertes (d. h. wenn die Aktivität des Targetproteins unter einen Wert fällt, bei welchen die Zelle überleben und/oder wachsen kann. Die Aktivität des Targetproteins wird nicht direkt gemessen sondern in einem funktionalen Assay bestimmt.
Beispielsweise kann in einem linearen Signalweg das Targetprotein „stromaufwärts" der alternativen Aktivität positioniert sein. Durch Bereitstellung eines aktiven Proteins stromabwärts zur blockierten Aktivität funktioniert der Signalweg weiterhin und die Zelle, welche von diesem Weg abhängt, überlebt bei Fehlen eines funktionalen Stromaufwärts-Signals. Die alternative Aktivität kann somit stromabwärts liegen und an einem späteren Punkt in einem Signalweg wirken.
Der hierin verwendete Begriff „Überlebensgrad" betrifft die Bestimmung (z. B. Messung) des Wachstums und der Proliferation der in dem Test verwendeten Zellen. Die Zellen werden getötet (oder werden wachstumsunfähig) durch die letale Überaktivitäts-Mutation, wenn diese induziert ist, in Abwesenheit eines Proteininhibitors, der den Effekt des Targetproteins inhibiert. Dies steht deshalb für einen Lebensgrad von „Null", d. h. keine Zellen überleben oder keine Zellen besitzen die Fähigkeit zum Wachstum oder zur Teilung. Im Anschluss an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation kann es einen bestimmten Zeitraum dauern, bis die Zellen sterben. Beispielsweise dauert es etwa 3 Stunden im Anschluss an die Induktion einer temperatursensitiven letalen Überaktivitäts-Mutation in einem Bakterium bis die Zellen sterben. In Gegenwart eines spezifischen Proteininhibitors, der die Aktivität der letalen Überaktivitäts-Mutante verringert, wird eine zunehmende Anzahl von Zellen überleben und kann proliferieren. Somit korreliert der Überlebensgrad mit der Anzahl der vorliegenden Zellen (z. B. in dem Zellwachstums- oder Kulturmedium) im Anschluss an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation und der Zugabe des Inhibitors (oder der Probe). Der Inhibitor (oder die Probe) können gleichzeitig mit der Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation oder anschließend dazugegeben werden. Wenn die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation über einen Temperaturshift erfolgt, dann ist es bevorzugt, dass der Inhibitor (oder die Probe) gleichzeitig mit der Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation zugesetzt wird. Wenn die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation die de novo-Proteinbiosynthese erfordert, dann sollte der Inhibitor (oder die Probe) im Anschluss an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutante zugesetzt werden, vorzugsweise zu einem Zeitpunkt, bei dem die Proteinsynthese erfolgt ist, z. B. 3-5 Stunden oder 5-8 Stunden im Anschluss an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation.
Dies kann erfolgen durch die Ermittlung, wie z. B. durch Abschätzen oder Bestimmen (wie z. B. durch Zählen oder Messen) der Zellzahl (z. B. lebende Zellen) zu einem bestimmten Zeitpunkt in Gegenwart und bei Fehlen der Probe. Die Zellen können spektrophotometrisch ausgezählt werden, wie z. B. durch Messen der optischen Dichte der Zellpopulation bei einer geeigneten Wellenlänge, wie z. B. einer Wellenlänge von 450 nm oder durch direktes Zählen der Zellen, oder eines repräsentativen Anteils der Zellprobe. Wenn die Zellen auf festem Medium wachsen, so kann die Zahl der Kolonien bestimmt werden.
Wie oben erwähnt sollte der Inhibitor oder die Probe mit den Zellen kurz nach, z. B. eine Generation, oder gleichzeitig mit der Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation in Kontakt gebracht werden, wenn die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation über einen Temperaturshift erfolgt. Dies entspricht dem Zeitpunkt Null. Die Bestimmung der relativen Zellzahlen kann dann in geeigneten Zeitintervallen, wie z. B. 3-30, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10, 8-12, 8-10, 3-5 Generationen nach dem Zeitpunkt Null oder nach einer geeigneten Inkubationsperiode, wie z. B. einer Inkubation über Nacht für 8-30 Stunden, 8-24 Stunden, 8-18 Stunden, 8-12 Stunden, 12-30 Stunden, 12-24 Stunden, 12-18 Stunden, 18-30 Stunden, 18-24 Stunden, 20-30 Stunden, 20-24 Stunden, erfolgen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Zellzahl in der inkubierten Zellpopulation in Abwesenheit der Testsubstanz als Kontrollwert bestimmt. Die Anzahl der Zellen in dieser Zellpopulation wird mit der Anzahl der Zellen in der induzierten Zellpopulation, welche mit dem Inhibitor (der Probe) in Kontakt gebracht worden war, verglichen. Beispielsweise weist eine 10-fache, 20-fache, 30-fache, 50-fache oder 100-fache Zunahme der OD₄₅₀ relativ zum Wert in Abwesenheit des Inhibitors/der Probe auf das Vorliegen eines Proteininhibitors in der Testsubstanz hin.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Zellen zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren. Eine solche Zelle enthält eine induzierbare, vorzugsweise Temperatursensitive, wie z. B. Kältesensitive, letale Überaktivitäts-Mutation in einem ersten Gen, das ein Targetprotein betrifft (z. B. kodiert), dessen Aktivität für die Zelle essentiell ist, und eine zweite Mutation (z. B. in einem zweiten Gen), welche jegliche Verringerung der Aktivität des ersten Genproduktes (d. h. des Targetproteins), wie z. B. eine Verringerung der Aktivität, verursacht durch einen Proteininhibitor, funktional kompensiert.
Wie oben erwähnt kann die Zelle eine eukaryontische oder prokaryontische, einschließlich Archaea-Zelle sein, wie z. B. Hefe oder Sängerzellen. Vorzugsweise ist die Zelle eubakteriell, wie z. B. E. coli.
Insbesondere ist die Zelle eine dnaA219Δrnh-Mutante, insbesondere abgeleitet vom Stamm WM2667 und vor allem ist die Zelle ein hinterlegter Stamm SF53, wie oben beschrieben, der die DnaA219cosΔrnh-Mutation enthält, und die in Tabelle 1 aufgelisteten Charakteristika zeigt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur Durchführung des Tests, umfassend Zellen zur Durchführung des Tests. Der Kit kann außerdem Wachstumsmedium und/oder Antibiotika zur Durchführung des Tests umfassen.
Proteininhibitoren (z. B. neue Proteininhibitoren) können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Testmethode identifiziert werden, wie insbesondere Inhibitoren der DNA-Replikation, vor allem Inhibitoren der bakteriellen DNA-Replikation und sie können Verwendung finden als antimikrobielle Mittel.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden nichtlimitierenden Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher beschrieben.
1 zeigt Wachstumskurven des Teststamms SF53 (dnaA219, rnh::cam) und des Stamms SF58 (dnaA219, rnh::cam/pdnaA[1-86]-biotin);
2 zeigt die Überlebensfähigkeitsanalyse von SF58-Zellen, welche bei verschiedenen Mengen von IPTG (0, 0,25, 0,5 und 1 mM) bei 30°C wuchsen;
3 zeigt Wachstumskurven von SF53 und SF58. Das Inoculum war eine 1:100-Verdünnung einer 1,5 OD₆₀₀ O.N. Kultur. Die Inkubationstemperatur betrug 30°C, die OD₄₀₅ wurde alle 900 s gemessen. Weder SF53 noch SF58 zeigten nennenswertes Wachstum unter diesen Bedingungen bis zu 1,5 × 10⁵ s (annähernd 42 Stunden);
4 zeigt die Wachstumskurve von SF58 mit IPTG bei Konzentrationen von 0 und 10 mM. Das Inoculum war eine 1:100-Verdünnung einer 1,5 OD₆₀₀ über-Nacht-Kultur. Die Inkubationstemperatur betrug 30°C. Die OD₄₀₅ wurde alle 900 s gemessen. Nach 18 Stunden (6,4 × 10⁴ s) waren die ODs der induzierten Kulturen (0,31 mM IPTG und darüber) signifikant höher als die Kontrollen (0 bis 0,16 mM IPTG);
5 zeigt die Häufigkeitsverteilung der OD₆₂₀-Werte von positiven (SF58 + 2,5 mM IPTG) und negativen (SF53 und SF58) Kontrollen. Die positiven Kontrollwerte lagen im Bereich um OD₆₂₀ 1,1 und die negativen Kontrollwerte lagen im Bereich um OD₆₂₀ 0,1;
6 zeigt die Häufigkeitsverteilung von OD₆₂₀-Werten von 4240 mikrobiellen Extrakten. Die meisten Proben zeigen einen OD₆₂₀-Wert um 0,1; und
7 zeigt das OD₆₂₀-Signal von 41 positiven mikrobiellen Extrakten.
Beispiele
Beispiel 1
Konstruktion des Teststamms SF53
WM2667 ist ein temperatursensitiver Suppressor von WM2062 (dnaAtS46, Weigel et al., 1999, Mol. Microbial, 34: 53-66). WM2667 ähnelt stark der dnaAcos Mutante (Kellenberger-Gujer et al., supra) insofern, als er eine kältesensitive Mutante von dnaA ist. Die Mutanten wachsen normalerweise bei der permissiven Temperatur (42°C), wobei aber nach Wachstum bei der restriktiven Temperatur, 30°C für 4 Stunden, weniger als 10% der Zellen lebensfähig bleiben. Bei 30°C akkumulieren die Zellen drei- bis viermal mehr OriC DNA als Kontrollmarker (dnaB, dnaC und attλ). Das Wachstum kann durch Einführung eines OriC-Plasmids oder durch moderate Überexpression des Fis-Proteins wiederhergestellt werden.
Es gibt drei Mutationen in dem dnaA-Gen von WM2667. A184V und H252Y sind beide in dem dnaA-Gen des Ausgangsstammes zu finden, wohingegen R342C eine zusätzliche Mutation darstellt, die nur in WM2667 zu finden ist. Das dnaA-Allel wird als dnaA219(cos) bezeichnet.
Um einen Stamm zu konstruieren, der eine Bedingung überlebt, unter welcher das DnaA219 _Protein vollständig inaktiviert ist, wird eine Deletion des rhnA-Gens in den Stamm WM2667 durch P1-Transduktion nach Standardverfahren eingeführt (Miller et al. (1992), A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for E. coli and related bacteria (Cold Spring Harbour Press)).
P1-Lysat von Stamm SS198:
Eine Übernachtkultur von SS198 (rnh::cam) wurde 1:100 in 10 ml LB + Chloramphenicol verdünnt und bis zu OD = 0,3 gezüchtet. CaCl₂ wurde in einer Konzentration von 10 mM zugegeben und es folgte eine Inkubation bei Zimmertemperatur für 5 Minuten. 100 μl P1 Stammlösung wurden hinzugesetzt und eine Inkubation bei Zimmertemperatur für 15 Minuten folgte. Die Inkubation wurde bei 37°C unter Schütteln 4 Stunden fortgesetzt. 1 ml Chloroform wurde zugesetzt und es wurde 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Röhrchen wurde zentrifugiert und der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt.
Transduktion von rnh::cam zu WM2667:
15 mM CaCl₂ und 15 mM MgCl₂ wurden zugesetzt und eine Übernacht-Kultur des Stammes WM2667 wurde bei Zimmertemperatur 15 Minuten inkubiert. 500 μl P1-Lysat wurden zu 1 ml Übernacht-Kultur gegeben und 15 Minuten bei 37°C inkubiert.
Das Röhrchen wurde zentrifugiert und die Kultur wurde mit LB + 50 mM Na-Citrat gewaschen. Die Kultur wurde in 150 μl LB + 50 mM Na-Citrat resuspendiert und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Sämtliche Kulturen wurden auf LG-Platten mit geeigneten Antibiotika ausplattiert.
Der resultierende Stamm SF53 (dnaA219 rnh::Cam) weist kein RNase H Protein auf. Dieser Stamm wächst normalerweise bei 42°C, überlebt aber nicht bei 30°C. Im Übrigen besitzt er den gleichen Genotyp wie WM2667.
Stamm SF53 überlebt nicht bei 30°C. Zur Untersuchung der Häufigkeit einer Reversion der Kaltsensitivität wurde das folgende Experiment durchgeführt. Eine Übernacht-Kultur von SF53, gezüchtet bei 42°C, wurde 1:1000 in frischem AGB₁ Glucose CAA Medium verdünnt und die Kultivierung wurde bei 42°C fortgesetzt, bis die OD₄₅₀ einen Wert von etwa 0,15 erreichte (d. h. etwa vier Generationen). Die Verdopplungszeit der Kultur betrug etwa 90 Minuten. Mehrere verschiedene Verdünnungen des Stammes wurden auf ABB₁ Glucose CAA Platten ausplattiert und die Platten wurden entweder bei 30°C oder 42°C inkubiert. Die Kolonien wurden nach 18, 24 und 42 Stunden gezählt. Die Platten, die bei 42°C inkubiert wurden, zeigen etwa 10⁷ Kolonien pro ml ausplattierter Kultur und weisen darauf hin, dass 1 ml Kultur von SF53 mit einer OD₄₅₀ von 0,1 10⁷ lebensfähige Zellen aufweist. Die bei 30°C für 18 und 24 Stunden inkubierten Platten zeigten etwa 10 Kolonien pro ml ausplattierter Kultur. Dies bedeutet, dass eine von 10⁶ Zellen nicht länger kältesensitiv war. Die Platten, welche 42 Stunden inkubiert worden waren, zeigten einen 5- bis 10-fachen Anstieg in der Anzahl kälteresistenter Kolonien, was zeigte, dass eine verlängerte Inkubationszeit eine höhere Anzahl von Revertanten enthielt.
Beispiel 2
Überleben des Stammes SF53 in Abwesenheit von DnaA-Aktivität

Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um einen Beleg dafür zu erhalten, dass der Stamm SF53 überlebt, wenn ein Wirkstoff das DnaA-Protein inaktiviert hat. Ein derartiger Beleg kann ohne einen Leitwirkstoff erhalten werden, wenn man die N-terminale Domäne (Domäne I Aminosäuren 1 bis 86) von Wildtyp-DnaA produziert. Die Domäne I von DnaA spielt eine wichtige Rolle für die Oligomerisierung und Ausbildung eines geeigneten Initiationskomplexes. Wenn unabhängige Domäne I synthetisiert wird, werden inaktive Hetero-Oligomere von DnaA und Domäne I gebildet und führen zu einer Vergiftung der Initiationskomplexe. Stamm SF53 wurde mit einem Plasmid transformiert, welches ein IPTG-induzierbares Gen enthielt, das für Biotin-markierte Domäne I (pBEX5BA-dnaA[1-86]-Biotin) kodiert. Die Transformanten wurden überprüft und der Stamm wurde als SF58 bezeichnet (Tabelle 1).

Stamm	Genotyp	Referenz
WM2667	ArgE3, del(lac-pro), dnaA219(Cos), galK2, his-4, lacY1, lambda-, leuB6, mtl-1, rpsL31, supE44, thi-1, tsx-33, xyl-5 (Derivat von AB1157)	(Weigel et al, 1999)
SF53	WM2667rnh::Cam	Erfindung
SF 58	SF53/pBEX5BA-dnaA[1-86]-Biotin	Erfindung, (Weigel et al., 1999)

Das Wachstum des Stamms SF58 wurde bei drei verschiedenen IPTG-Konzentrationen getestet. Eine Übernacht-Kultur des Stammes SF58, gezüchtet bei 42°C, wurde 1:1000 in frischem ABB₁ Glucose CAA Medium verdünnt und auf fünf Kolben verteilt.
Die Kulturen Nr. 1 bis 4 wurden bei 30°C und die Kultur Nr. 5 bei 42°C gezüchtet. IPTG wurde zu den Kulturen Nr. 2, 3 und 4 in einer Konzentration von 0,25, 0,5 bzw. 1 mM zum Zeitpunkt der Verdünnung zugesetzt. Die Wachstumskurven wurden durch Messung OD₄₅₀ über 8 Stunden aufgezeichnet. Das Experiment zeigt, dass Kultur Nr. 1, gezüchtet bei 30°C ohne IPTG, nicht überlebte (1). Die OD₄₅₀ betrug weniger als 0,03 zu allen Zeitpunkten. Dieses Ergebnis bestätigt, dass der dnaλ219rnh-Stamm 30°C nicht überlebt.
Die Kontrollkultur (Nr. 5), gezüchtet bei 42°C, zeigte eine Verdopplungszeit von etwa 60 Minuten. Die drei Kulturen, die bei 30°C mit IPTG gezüchtet worden waren, zeigten zunehmende Wachstumsraten mit zunehmender IPTG-Konzentration und enthielten somit Konzentrationen an Domäne I Protein (siehe unten). Dieses Ergebnis zeigt, dass Wachstum der Stämme bei 30°C durch Induktion von Domäne I wiederhergestellt wird und dass die Wachstumsrate mit zunehmenden Mengen an Domäne I verbessert wurde.
Die Konzentrationen von Domäne I nach vier Wachstumsgenerationen in Gegenwart der drei verschiedenen IPTG-Konzentrationen wurden durch Western-Blotting bestimmt. Eine 10-fache Differenz in der OD₄₅₀ zwischen der ohne IPTG gezüchteten Kultur (Nr. 1) und der mit 1 mM IPTG gezüchteten Kultur (Nr. 4) wurde nach etwa 10 Stunden beobachtet. Somit wird bei Durchführung eines Wirkstoffscreens mit dem dnaλ219rnh-Stamm ein positiver Befund bei einer 10-fachen Differenz in der OD₄₅₀ nach etwa 10 Stunden in Gegenwart des Wirkstoffs detektiert.
Zur Bestimmung der Robustheit des Screenings und zur Bestimmung, zu welcher Zeit bei einem Hochdurchsatz-Test die Messung der OD₄₅₀ optimalerweise erfolgt, wurden folgende Messungen durchgeführt (2). Es wurde im Wesentlichen das gleiche Experiment wie in 1 durchgeführt, wobei jedoch die OD₄₅₀ nur zu drei Zeitpunkten, nämlich nach 20 Stunden, 27 Stunden und 48 Stunden in zehn verschiedenen parallelen Kulturen bestimmt wurde. Eine 20- bis 40-fache Differenz wurde etwa nach 20 Stunden und nach 27 Stunden erhalten. Nach 48 Stunden begann sich in der nicht inkubierten Kultur ein Hintergrundsignal zu entwickeln und die Differenz fiel auf etwa das Fünffache. Deshalb sollten die OD₄₅₀-Messungen in Hochdurchsatz-Screenings nach 10 bis 30 Stunden Inkubation erfolgen.
Beispiel 3
Hochdurchsatz-Screeninq-Prozedur
Eine Übernacht-Kultur des Stammes SF53, gezüchtet in einem ABB₁ Glucose CAA Medium bei 42°C, wurde 1:1000 mit frischem Medium verdünnt und auf eine geeignete Anzahl von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verteilt. Verschiedene Testsubstanzen, jeweils eine pro Mikrotiter-Vertiefung, wurden mit Ausnahme von zwei Vertiefungen auf jeder Platte zugesetzt. Diese beiden dienten als Leerwert, d. h. als Referenzkulturen ohne Wachstum. Die Mikrotiterplatten wurden bei 30°C 20 bis 24 Stunden inkubiert, dann wurde die OD₄₅₀ gemessen. Positive Ergebnisse wurden in Vertiefungen gefunden, die eine OD-Messung mit einem Wert ergaben, der 10- bis 100-fach höher lag als derjenige der Leerproben.
Beispiel 4
Validierung des Assays
Der erste Teil einer Assay-Transfer- und Validierungsprozedur involviert die Reproduktion der Ergebnisse in einem Mikrotiter-Format. Diese Ergebnisse sind in 3 gezeigt und veranschaulichen, dass weder SF53 noch SF58 nennenswertes Wachstum zeigen, wenn eine Inkubation im Mikrotiter-Format bei 30°C über einen Zeitraum von bis zu 1,5 × 10⁵ s (etwa 42 Stunden) erfolgt. Alle 48 Replikatkulturen der gleichen Mikrotiterplatte von 3 verhielten sich ähnlich. Als Nächstes wurden die IPTG-Induktionskurven reproduziert, was in 4 gezeigt wird. SF58 kann bereits nach 3 × 10⁴ s (etwa 8 Stunden) einen OD₄₀₅-Wert zeigen, der signifikant höher ist als derjenige des Kontrollansatzes. Zusätzlich lagen nach 18 Stunden (6,4 × 10⁴ s) die OD-Werte der induzierten Kulturen deutlich oberhalb der Kontrollwerte. Diese Resultate bestätigen das erwartete Verhalten der Stämme SF53 und SF58-IPTG und weisen darauf hin, dass es ein großes Zeitfenster gibt, innerhalb dessen ein hypothetischer DnaA-Inhibitor eindeutig gemessen werden kann.
Eine Serie von Experimenten wurde anschließend durchgeführt, um das Signal als Funktion des Start-Inoculums (d. h. der theoretischen CD einer Kultur in einer Mikrotiter-Vertiefung) zu bestimmen. Die Daten (nicht gezeigt) weisen darauf hin, dass es keinen signifikanten Unterschied in der SF58-IPTG-Wachstumskurve gibt, wenn man das Inoculum durch Verdünnung einer Übernacht-Kultur oder aus einer aktiv wachsenden 42°C-Kultur erhält. Folglich wurde die Messzeit der CD auf 18 Stunden festgelegt und die Prozedur bestand darin, 5 μl SF53 oder SF58 in 30 ml Glucose CAA Medium (mit Antikörperselektion) über Nacht bei 42°C wachsen zu lassen, bis die OD₆₀₀ 1,2 betrug. Die Stammlösung wurde 1:100 in Glucose CAA (ohne Antikörper) verdünnt. 90 μl davon wurden in jede Vertiefung mit 10 μl einer Probe verteilt. Die OD₆₂₀ wurde nach einer 18-stündigen Inkubation bei 30°C gemessen.
Da es keine bekannten niedermolekularen Inhibitoren von DnaA gibt, bestand der nächste Schritt der Testvalidierung darin, die Test-Performance in Gegenwart unbekannter Proben zu überprüfen. Zu diesem Zweck wurde die Bibliothek mikrobieller Extrakte von Vicuron Pharmaceuticals verwendet. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Bibliothek aus prozessierten mikrobiellen Fermentationsextrakten besteht. Jeder Stamm wird hierzu unter definierten Bedingungen fermentiert und die Fermentationsbrühe wird durch Festphasen-Extraktion prozessiert und die Zellen werden durch Lösungsmittelextraktion prozessiert. In beiden Fällen wird der „mikrobielle Extrakt" auf Mikrotiterplatten verteilt und getrocknet. Die mikrobiellen Extrakte werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 80 Proben je Platte gelagert. Die verbleibenden 16 Vertiefungen je Platte werden für positive und negative Kontrollen verwendet. Jede Probe in der Bibliothek von mikrobiellen Extrakten besteht daher aus einer Mischung unbekannter Verbindungen bei unbekannten Konzentrationen. Die Evaluierung der Test-Performance mit einer solch komplexen Bibliothek von Proben besitzt das Potential, jegliche mögliche Interferenz und schlechte Test-Performance aufzuzeigen.
Der Test sollte die Präsenz eines DnaA-Inhibitors über eine Probe identifizieren, die einen OD₆₂₀-Wert ergibt, der signifikant höher als die Kontrollwerte liegt. Ausgehend von einer theoretischen Betrachtungsweise wäre zu erwarten, dass echt positive Ergebnisse relativ selten sind, da diese einen derartigen Inhibitor bei einer Konzentration enthalten sollten, die ausreicht, das Wachstum von SF53 zu ermöglichen. Zusätzlich können theoretisch zwei Gruppen von falschpositiven Ergebnissen identifiziert werden: eine Gruppe könnte sich in all denjenigen Fällen ergeben, in denen das Auftreten eines signifikanten OD₆₂₀-Werts nicht vom SF53-Wachstum abhängig ist (d. h. eine kontaminierende Mikrobe oder eine trübe Probe erzeugt das Signal); eine andere Gruppe könnte sich aus all denjenigen Fällen ergeben, bei denen eine bestimmte Vertiefung eine hohe Anzahl von Suppressorstämmen enthält. Beide Gruppen von falschpositiven Ergebnissen können aber durch Testwiederholung mit SF53 leicht erkannt werden. In Anbetracht der Natur der Proben könnten falsch-negative Ergebnisse aus all denjenigen der Proben resultieren, in denen ein hypothetischer DnaA-Inhibitor vorliegt, zusammen mit einem anderen Antibiotikum mit Aktivität auf SF53. Man weiß jedoch, dass die Häufigkeit mikrobieller Extrakte mit Aktivität gegen einen E. coli-Stamm bei etwa 1% liegt, sodass falsch-negative Ergebnisse ziemlich selten sein sollten.
Der oben beschriebenen Prozedur folgend wurde ein Screening von 4240 mikrobiellen Extrakten durchgeführt. Jede Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen enthielt als Kontrollen vier Vertiefungen inokuliert mit SF53, vier Vertiefungen inokuliert mit SF58 und acht Vertiefungen inokuliert mit SF58 in Gegenwart von 2,5 mM IPTG. 10 μl 10%iges DMSO (das Lösungsmittel, in dem die mikrobiellen Extrakte verdünnt werden) wurde zu diesen Kontrollvertiefungen gegeben.
Als Erstes wurde die Häufigkeitsverteilung der Kontrollen, wie in 5 angegeben, untersucht. Sämtliche negativen Kontrollen (SF53 und SF58) liefern Werte um 0,1 OD₆₂₀, während die positiven Kontrollen (SF58-IPTG) eine breite Verteilungskurve um 1,1 OD₆₂₀ zeigen. Eine breite Verteilungskurve für positive Kontrollen, wie in 5 gezeigt, ist nicht ideal in einem Screeningprogramm. Ursache hierfür könnte aber die manuelle Verteilung des Inoculums sein und sollte sich bei Automatisierung der Inokulumverteilung verbessern. Nichtsdestotrotz besteht eine klare Trennung zwischen negativen und positiven Kontrollen und dies sollte die eindeutige Identifizierung positiver Proben erlauben.
Die Häufigkeitsverteilung der 4240 mikrobiellen Extrakte ist in 6 gezeigt. Man sieht, dass die meisten Proben sich im Bereich von 0,1 OD₆₂₀ anhäufen. Dies weist darauf hin, dass die meisten Proben zu keinem OD₆₂₀-Wert führen, der von demjenigen der Negativkontrollen signifikant unterschiedlich ist. Zusätzlich weist diese Häufigkeitsverteilung darauf hin, dass ein Grenzwert von 0,4 OD₆₂₀ verwendet werden könnte, um echt positive Proben zu identifizieren. Diese Ausschlussgrenze identifiziert 41 Proben (entsprechend 0,97% der getesteten Proben) mit einem OD₆₂₀-Wert höher als 0,4. Die beobachteten Werte für diese positiven Proben sind in 7 dargestellt. Für diese Resultate wurde anschließend gezeigt, dass sie aufgrund der Präsenz einer mikrobiellen Kontamination der als Proben verwendeten Extrakte falsch-positiv sind. Diese Kontaminationen können unter Verwendung mikrobiologischer Standardtechniken leicht bestimmt werden.
Zu diesem Zeitpunkt kann gefolgert werden, dass:

a) der Test in einem 96-well-Format durchgeführt werden kann;
b) er eine adäquate Performance für ein HTS-Programm zeigt und
c) dass positive mikrobielle Extrakte durchweg falsch positiv sind.

Claims

Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Proteininhibitors eines Targetproteins in einer Probe, umfassend die Schritte des (a) Inkontaktbringens der Probe mit einer Zelle, wobei diese Zelle enthält: (i) eine induzierbare, letale Überaktivitäts-Mutation in einem Gen, das das Targetprotein beeinflusst, wobei die Aktivität des Targetproteins für die Zelle essentiell ist; und (ii) eine Mutation in einem zweiten Gen, worin die Mutation in dem zweiten Gen jegliche Verringerung in der Aktivität des Targetproteins funktionell kompensiert; (b) Induzierens der letalen Überaktivitäts-Mutation, und anschließend (c) Bestimmens der Proteininhibition durch Vergleich der Überlebensrate der Zelle in Gegenwart und in Abwesenheit der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zelle eine von einem Klon abgeleitete Zellpopulation ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die induzierbare letale Überaktivitäts-Mutation in dem Gen vorliegt, welches das Targetprotein kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Targetprotein ein Enzym oder ein Bindungsprotein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Targetprotein mit der Synthese von Nukleinsäuren assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Targetprotein ein Initiator der DNA-Replikation ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Targetprotein ein bakterieller Initiator der DNA-Replikation ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Targetprotein DnaA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin die Mutation in dem zweiten Gen einen alternativen Mechanismus zur DNA-Replikation in Abwesenheit des DNA-Replikationsinitiators bereitstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Überlebensrate der Zellen durch Bestimmung der Zellzahl erfolgt, die im Anschluss an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Zellzahl 8 bis 30 Stunden im Anschluss an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die Zellzahl spektrophotometrisch bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der Inhibitor ein spezifischer Proteininhibitor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin der Inhibitor ein Antibiotikum ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Zelle E. coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin die letale Überaktivitäts-Mutation in DnaA vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die letale Überaktivitäts-Mutation DnaAcos oder DnaA219 ist oder die Eigenschaften davon besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 17, worin die zweite Mutation die RNaseH inaktiviert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 18, worin die Zelle DnaA219Δrnh, hinterlegt bei der ECACC unter der Zugangsnummer 03050701, ist.
Zelle, enthaltend eine induzierbare letale Überaktivitäts-Mutation in einem ersten Gen, welches ein Targetprotein beeinflusst, wobei die Aktivität des Targetproteins essentiell für die Zelle ist, und eine zweite Mutation umfasst, welche jegliche Verringerung der Aktivität des Targetproteins funktional kompensiert.
E. coli-Stamm SF53 (DnaA219Δrnh), hinterlegt bei der ECACC unter der Zugangsnummer 03050701.
Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, umfassend eine Zelle nach Anspruch 20 oder 21.