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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung neuer
Proteininhibitoren (vorzugsweise Antibiotika) mithilfe eines Tests
unter Verwendung von Zellen, welche Mutationen enthalten, die zwei
separate Gene beeinflussen. Die erste Mutation ist eine induzierbare
(oder kontrollierbare) letale Überaktivitäts-Mutation,
welche vorzugsweise eine Über-Initiierung
der DNA-Replikation verursacht. Proteininhibitoren werden durch
ihre Fähigkeit
identifiziert, die Funktion (wie z. B. Aktivität) des durch die letale Überaktivitäts-Mutation kodierten
Genprodukts zu inhibieren, wodurch die letale Überaktivitäts-Eigenschaft der Zelle überwunden
wird. Die zweite Mutation erhöht
die Sensitivität
des Tests, indem ein alternativer/kompensierender Mechanismus, wie
z. B. ein alternativer DNA-initiierender Pfad bereitgestellt wird,
wodurch der Zelle ein Überleben
ermöglicht wird,
wenn der Proteininhibitor ausreichend wirksam ist, die Funktion
(wie z. B. die Aktivität)
des durch die letale Überaktivitäts-Mutation
kodierten Genprodukts stark zu inhibieren, bis zu einem Grad, bei
welchem die Zelle nicht überleben
kann. Zellen zur Verwendung bei diesem Test, insbesondere Bakterien,
werden ebenfalls bereitgestellt.
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Proteininhibitoren,
welche in verschiedener Weise ein Protein „inhibieren" können (z.
B. durch Inhibition seiner Synthese oder seiner Aktivität), werden
häufig
als Wirkstoffe zur Bekämpfung
von Erkrankungen verwendet. Die Erkrankungen können durch Überexpression oder Überaktivität des in
Rede stehenden Proteins verursacht sein, wie bei einer Vielzahl
von Krebsformen, wobei die Überexpression
bestimmter Onkogene bei der Entwicklung von Malignitäten involviert
ist, wie z. B. HER2/neu bei Brustkrebs, das ras-Onkogen und das
myc-Onkogen. Die Überexpression
kann eine Überaktivität verursachen
oder die Überaktivität kann aus einer
Mutation resultieren. Onkogenproteine sind häufig Komponenten eines Pfades,
wie z. B. eines Signalpfades, der für die Regulation des Zellwachstums
von Bedeutung ist. Wenn einmal für
ein Protein gezeigt worden ist, dass es für die Auslösung oder das Fortschreiten
eines Krankheitszustandes erforderlich ist, ist es erstrebenswert,
das Protein als „Target" zu definieren und
Wirkstoffe zu finden, welche die mit der Erkrankung verbundene Funktion
des Proteins zu unterbinden.
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Die
Erkrankung kann auch eine Infektion, wie eine pilzliche oder bakterielle
Infektion, sein. Derartige Erkrankungen können mit Antibiotika bekämpft werden,
welche wiederum als Inhibitor der Funktion eines „Target"-Proteins wirken,
da eine Infektion neue Proteine in die infizierten Zellen einführt. Diese
Proteine werden in der nicht infizierten Wirtszelle nicht gefunden
und können
somit Targetproteine sein.
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Infektionserkrankungen
sind eine Hauptursache für
Mortalität
weltweit und somit sind neue Agenzien erforderlich, welche gegen
Infektionen wirksam sind. Insbesondere die übermäßige Verwendung von Antibiotika
hat jedoch zu dem Phänomen
der Antibiotikaresistenz geführt,
wodurch Antibiotika unwirksam gegen Mikroorganismen werden und es
somit von essentieller Bedeutung ist, neue und verbesserte Antibiotika
zu entwickeln.
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Es
ist insbesondere von Bedeutung, Antibiotika zu identifizieren, welche
von den gegenwärtig
in Verwendung befindlichen Antibiotika chemisch verschieden sind.
Mikroorganismen, welche Antibiotikaresistenz gegenüber bestimmten
Antibiotika zeigen, besitzen eine höhere Wahrscheinlichkeit, Resistenz
gegenüber
einem Antibiotikum auszubilden, das chemisch verwandt ist als gegenüber einem
solchen, das strukturell und funktionell verschieden ist. Deshalb
können
neue antimikrobielle Verbindungen besonders brauchbar sein, welche
eher aufgrund ihrer Funktion als aufgrund ihrer Struktur identifiziert
werden. Die Entwicklung von Antibiotika, welche gegen Targets wirken,
für die
keine bekannten Antibiotika existieren, ist ebenfalls von besonderem
Interesse.
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Gegenwärtige Antibiotikatargets
umfassen Enzyme, welche in der Proteinsynthese involviert sind,
sowie Membrantransporter oder Zellwandkomponenten. Diese Targets
werden zurzeit auf verschiedene Weise identifiziert. Die starke
Zunahme an verfügbaren
Nukleinsäuresequenzdaten
hat die Fähigkeit
verbessert, einem Protein auf der Grundlage des Vergleichs von Sequenzdaten
eine Funktion zuzuweisen. Die schiere Menge verfügbarer Daten gestaltet dies
jedoch schwierig und etwa 25-40% der Gene in einem bakteriellen
Genom zeigen keine Übereinstimmungen
mit bekannten Genen (Smith D. R. (1996) Trends Biotechnology 8:
290-3). Zusätzlich
bedeutet die Tatsache, dass zwei Gene Sequenzhomologie zeigen, nicht
zwangsläufig,
dass beide strukturell ähnlich
sind.
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Wirkstofftargets,
sei es für
Antibiotika oder gegen andere Erkrankungen, sollten idealerweise
die folgenden Eigenschaften besitzen: sie müssen für das Überleben, das Wachstum oder
die Aktivität
des Pathogens oder der Erkrankung notwendig sein; im Hinblick auf
Antibiotikatargets oder anti-pathogene Targets ist es ebenfalls
nützlich,
dass das Targetprotein beim Menschen oder dem zu behandelnden Säuger fehlt
oder in anderer Form vorliegt; und der Konservierungsgrad der Struktur
des Wirkstofftargets zwischen Spezies, welche bekämpft werden
sollen, ist vorzugsweise hoch. Bis heute sind keine Wirkstoffe identifiziert
worden, welche als Target die DNA-Replikationsmaschinerie besitzen.
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Ist
einmal ein Targetprotein identifiziert worden, ist es erforderlich,
Verbindungen zu identifizieren, welche in einem Krankheitszustand
oder einem Pathogen dessen Funktion inhibieren oder erschweren können. Das
Verfahren zum Screenen inhibitorischer Verbindungen, das bisher
arbeits- und zeitaufwändig
war, wurde mithilfe von Technologien verbessert, welche ein Hochdurchsatzscreening
erlauben, bei dem viele hundert oder viele tausend Verbindungen
gleichzeitig oder parallel getestet werden können.
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Im
Allgemeinen sind solche Screenings zur Identifizierung von Antibiotika
oder anderen Proteininhibitoren „negative" Screenings. Bei diesen Screenings wird
ein Proteininhibitor im Anschluss an die Applikation einer Testsubstanz
auf eine Zellpopulation identifiziert, wenn die Zellpopulation eine
Verringerung der Lebensfähigkeit
zeigt. Dies folgt aus der Tatsache, dass eine der oben beschriebenen
Eigenschaften des Targets darin liegt, dass es für das fortgesetzte Wachstum
und die Proliferation des in Rede stehenden Pathogens essentiell ist.
Eine Wechselwirkung mit dieser essentiellen Funktion beeinflusst
die Lebensfähigkeit
der Zelle. Somit beruhen die meisten Screening-Techniken auf einem
negativen Ergebnis, welches aus einem Außerkraftsetzen einer Funktion
des Targets resultiert, wie dem Tod oder der Verringerung des Wachstums
von Zellen, welche dieses enthalten oder benötigen. Dieser Ansatz besitzt
jedoch mehrere Nachteile. Mehrere verschiedene Tests müssen durchgeführt werden,
entweder nacheinander oder parallel, um sicherzustellen, dass der
beobachtete Effekt auf die Zelllebensfähigkeit für das Targetprotein spezifisch
ist. Die Tatsache, dass der Effekt, wie z. B. der Zelltod, allein
beobachtet wird, ist keine hinreichende Bestätigung dafür, dass der Effekt durch einen
Effekt auf das Targetprotein verursacht wird. Die Testsubstanz kann
ein anderes Targetprotein beeinflusst haben oder der Effekt kann
ein allgemeiner Effekt sein, der mit dem spezifischen Targetgen
in keinerlei Zusammenhang steht. Somit sind solche negativen Screenings
zeitaufwändig
und es besteht keine Möglichkeit,
ein Resultat ohne Durchführung
mehrfacher Tests zu erhalten.
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Es
wäre von
Vorteil, einen Test oder ein Screening für Proteininhibitoren in Händen zu
haben, welcher auf einem positiven Ergebnis oder Ausgang beruht,
wie z. B erhöhtem
Zellwachstum oder dem Überleben
einer mutierten Zelle, welche anderenfalls nicht überlebensfähig wäre. Derartige
positive Screenings sind insofern von Vorteil, als sie viele mit
negativen Screenings verbundene Nachteile vermeiden, wie hohe Hintergrundwerte
für Zelltod
oder für
fehlendes Zellwachstum, welche keiner spezifischen Wirkung des potenziellen Inhibitors
zuzuordnen sind, sondern auf anderen Ursachen beruhen können. Im
Stand der Technik sind keine derartigen positiven Screenings bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt nunmehr einen derartigen Test bereit.
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Letale Überaktivitäts-Mutanten
sind Mutanten, die eine oder mehrere Mutationen enthalten, sodass die
Aktivität
eines spezifischen Genprodukts, das produziert oder exprimiert wird,
höher ist
im Vergleich zum Wildtyp-Organismus oder dem „nicht-mutierten" Genprodukt (d. h.
dem Genprodukt vor der Einführung
der letalen Überaktivitäts-Mutation – es ist
nicht ausgeschlossen, dass das Genprodukt andere Mutationen tragen kann,
welche mit der letalen Überaktivität nicht
in Verbindung stehen). Dies kann auf Unterschieden in der Aktivität des Genprodukts
selbst, in dessen Expressions- oder Produktionsgrad oder in dessen
Regulation der Aktivität
(wie z. B. aufgrund einer Zu- oder Abnahme der Expression und/oder
Aktivität
eines regulatorischen Moleküls)
beruhen. Somit kann eine letale Überaktivitäts-Mutante
als eine solche betrachtet werden, bei welcher die „Funktionalität" des betroffenen
Genprodukts erhöht
ist. Die Zunahme der Aktivität
(oder „Funktionalität") dieses Genprodukts
ist von entscheidender Bedeutung für das Überleben und/oder das Wachstum
der mutierten Zellen. Das Genprodukt kann somit jegliches Produkt
sein, das letal wirkt oder das einen signifikanten negativen Effekt
auf das Wachstum und/oder das Überleben
des Organismus besitzt, wenn dessen Aktivität bestimmte Werte überschreitet
(z. B. „normale" Werte, z. B. vor
der Mutation oder native oder Wildtyp-Werte), z. B. wenn dieses „über-aktiv" ist. Eine derartige,
oben beschriebene Überaktivität kann auf
verschiedenen Wegen erreicht werden. Diese umfassen die Zunahme
der Menge oder des Gehalts oder Niveaus des Genprodukts, beispielsweise
aufgrund einer erhöhten
Expression oder eines verringerten Abbaus oder durch erhöhte oder
verlängerte
Aktivität.
Derartige Mutanten sind somit brauchbar bei positiven Screenings.
Diese Mutanten sind jedoch in der Natur selten zu finden und können schwierig
herzustellen sein.
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DnaA
ist ein eubakterielles Protein, welches chromosomale Replikation
in Bakterien initiiert (Kornberg und Baker 1992, DNA replication,
W. H. Freeman). An dieser Stelle wird der Zyklus der chromosomalen
Replikation reguliert. Die DNA-Replikation ist ebenfalls abhängig vom
Vorliegen einer besonderen chromosomalen Sequenz, dem OriC, dem
Replikationsursprung. Sowohl OriC als auch DnaA sind für eine erfolgreiche
Initiierung der Replikation erforderlich und diese beiden Komponenten
bilden einen Nukleoproteinkomplex. Etwa 20 bis 40 Monomere des DnaA-Proteins
sind in dem OriC-DnaA-Komplex vorhanden. ATP-gebundenes DnaA bewirkt,
dass sich die DnaA-Duplex zu entdrillen beginnt, sodass die DnaB-Helikase
das Entdrillen vorantreiben kann, bevor die Synthese des komplementären Stranges
durch das DNA-Polymerase III Holoenzym erfolgt (Skarstad and Boye,
Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1217, 111-140, besprochen in Katayama
et al., Molecular Microbiology, 2001, 41(1), 9-17).
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Die
Initiierung der DNA-Replikation in Prokaryonten und Eukaryonten
wird durch eine Vielzahl von Mechanismen aufgrund seiner Bedeutung
für den
Zellzyklus stark reguliert. Eine übermäßige Zahl von Initiationsereignissen
führt gegebenenfalls
zu Zelltod.
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Ein
Beispiel für
eine Mutation, welches eine hyperaktive Initiierung verursacht ist
DnaAcos, welches eine in E. coli identifizierte Mutation darstellt
(Kellenberger-Gujer et al. (1994), Journal of Biological Chemistry, 269(17),
12698-12703). Diese Mutante wurde als temperaturresistenter Suppressor
aus einer temperatursensitiven DnaAts46 Mutante isoliert. DnaAts46
is eine hinreichend bekannte E. coli-Mutante, welche ein DnaA-Protein
exprimiert, das bei erhöhten
Temperaturen (42°C)
inaktiv wird, was in einem Mutantenstamm resultiert, der nicht fähig ist,
die Replikation bei erhöhten
Temperaturen zu initiieren (Kohiyama, Cold Spr. Harb. Symp. Quant.
Biol. 33, 312-324 (1968); Hirota et al., J. Molec. Biol. 53, 369-387
(1970)).
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Die
DnaAcos-Mutante weist bekanntlich folgende Eigenschaften auf: Erstens
ist ihr Wachstum kältesensitiv;
sie wächst
normalerweise bei 42°C,
die Replikation der chromosomalen DNA wird jedoch sofort über-initiiert,
wenn die Zellen in ein Wachstum bei restriktiver Temperatur von
30°C überführt werden;
DnaAcos wurde als Suppressormutante von dnaAts46 identifiziert,
d. h. sie unterdrückt
den dnaAts46 Phänotyp
und stellt eine intragenetische Suppressormutante dar. Die Suppressor-Mutationen
(Q156L and Y271H) resultieren aus einer Rasensubstitution im dnaA-Gen
(Hansen et al., 1992, Mol. Gen.Gent., 234, 15-21, Skarstad und Boye,
1994, Biochim. Biophys. Acta, 1217, 111-130, Kellenbergen-Gujer et al., 1978,
Mol. Gen. Genet., 162, 9-16).
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Die
Kältesensitivität von dnaAcos
ist im Vergleich zum Wildtyp dnaA-Allel dominant und die beobachtete Über-Initiierung
bei der restriktiven Temperatur ist unabhängig von der de-novo-Proteinsynthese.
Interessanterweise ist keine Zunahme der Menge an DnaA-Protein bei dieser
Mutante zu beobachten und man vermutet, dass der Mutanten-Phänotyp abhängig ist
von einer erhöhten
und/oder verlängerten
DnaA-Aktivität.
Da die Initiierung mit der Mutante wiederholt erfolgt, wurde vorgeschlagen,
dass die Initiations-Kompetenz der DnaAcos-Proteinmutante, beispielsweise über eine
Konformationsänderung,
in irgendeiner Weise aufrechterhalten wird.
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Der
Mechanismus der Über-Initiierung
in der Mutante wird nicht vollständig
verstanden, obwohl das DnaAcos-Protein gereinigt und in vitro charakterisiert
wurde (Katayama et al., 1995, Mol. Microbiol., 18, 813-820). Es
erhält
die Affinität
gegenüber
der DnaA-Bindungssequenz und zeigt Wirkung bei der Beladung einzelsträngiger DNA
mit DnaB Helikase. Das gereinigte Wildtyp-DnaA-Protein bindet ATP
und ADP. Das DnaAcos-Protein ist jedoch unfähig, Nukleotide zu binden.
Wildtyp-ATP-DnaA besitzt die Fähigkeit,
die Replikation zu initiieren, wogegen Wildtyp-ADP-DnaA inaktiv
ist (Sekimizu et al., 1987, Cell, 50, 259-265). Die Hydrolyse von
Wildtyp-ATP-DnaA zu ADP-DnaA inaktiviert DnaA und reguliert dessen
Funktion und dies erfolgt, sobald die Replikationsgabeln auf dem
Weg sind, sodass eine Reinitiation eines bereits initiierten Ursprungs unterbunden
wird (Boge et al., 2000, EMBO Rep. 1, 479-483). Das DnaAcos-Protein
scheint eine „unregulierte" Form des DnaA-Proteins
zu sein, das immer „angeschaltet" ist und folglich
eine übermäßige DNA-Replikation bei niedrigeren
Temperaturen (30°C)
verursacht. Bei höheren
Temperaturen (42°C)
ist das Protein offensichtlich teilweise inaktiv, was erklärt, dass
die Über-Initiation
im Vergleich zur restriktiven Temperatur verringert ist und die
Zellen folglich überleben.
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Andere
DnaA-Mutanten wurden entwickelt oder können entwickelt werden, welche
die Eigenschaften von DnaAcos besitzen oder ähnliche Eigenschaften wie dieses
aufweisen (welche z. B. eine temperatursensitive Replikation zeigen),
z. B. eine Über-Inhibition
der Replikation bei niedrigerer Temperatur (z. B. 30°C). Eine derartige
Mutante ist DnaA219, die in den Beispielen verwendet wird.
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DnaA
und Homologe dieses Proteins in anderen Prokaryonten oder in Eukaryonten
oder Archaea, stellen Beispiele für ein Proteininhibitortarget
dar, da es ein essentielles Protein für E. coli ist und ebenfalls
zwischen verschiedenen bakteriellen Spezies hoch konserviert ist.
Andere die DNA-Replikation initiierende Proteine (aus Eukaryoten,
Prokaryoten oder Archaea) können
ebenfalls Proteininhibitor-Targets darstellen.
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Bei
einem Vergleich von 104 Sequenzen aus 96 Spezies konnte gezeigt
werden, dass DnaA eine hoch konservierte Primärsequenz zeigt und dass die
Anordnung von 15 α-Helizes und 9 β-Strängen bei über 93% der
Sequenzen beobachtet wird (Weigel und Messer 2002, www.molgen.mpg.de
messer).
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Darüber hinaus
zeigen die Cdc6 und Orc Initiatorproteine der Hefe, wie z. B. von
Saccharomyces cerevisiae, eine auffällige strukturelle Ähnlichkeit
mit DnaA und stellen somit ein eukaryotisches Targetprotein dar (Erzberger
et al. (2002) EMBOJ 21:4763-73, Liu et al., (2000) Mol. Cell. 6:637-48).
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Überaktivitäts-Mutanten
von Targetproteinen, wie z. B. DnaA-Mutanten, welche eine DNA-Replikation über-initiieren,
können
in Tests auf potenzielle neue Proteininhibitoren eingesetzt werden;
jeglicher Proteininhibitor, der mit der Funktion des Targetproteins
(z. B. DnaA) wechselwirkt, wird den Grad der Über-Initiierung verringern
und somit das Wachstum der Zellpopulation von mutierten Zellen im
Vergleich zu deren Wachstum in Abwesenheit eines derartigen Proteininhibitors
verringern. Ein derartiger Test würde jedoch nur die Detektion
von schwachen Proteininhibitoren erlauben, d. h. von solchen, die
lediglich die DnaA-Aktivität
auf normale oder annähernd
normale Werte verringern (d. h. auf Werte, welche mit der Wildtyp-DnaA-Aktivität oder der
Aktivität
des DnaA-Proteins vor Einführung
der letalen Überaktivitäts-Mutation
(„cos")(d. h. der „Quelle" oder dem „Ursprung" oder dem „parentalen" Protein, in welches
die letale Überaktivitäts-Mutation
eingeführt
wurde) vergleichbar sind), sodass ausreichend DnaA-Aktivität vorliegt,
die es den Zellen erlaubt zu überleben,
wobei die DnaA-Aktivität
jedoch nicht hoch genug ist, eine Über-Initiierung zu verursachen,
welche zum Zelltod führt.
Es ist abzusehen, dass derartige Screenings nicht erlauben würden, eine
Unterscheidung zu treffen zwischen dem Vorliegen eines starken Proteininhibitors
in der Probe, welcher das Targetprotein stark verringern würde, wie
z. B. die DnaA-Spiegel, und einen Zelltod aufgrund des Fehlens einer
Initiierung der DNA-Replikation bewirken würde, und dem Fehlen jeglichen
Inhibitors in der Probe, der den Zelltod aufgrund einer Über-Initiierung verursacht.
Eine ähnliche
Situation kann man sich vorstellen für andere Targetproteine und
deren letale Überaktivitäts-Mutanten.
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Der
hierin verwendete Begriff „Mutation" bezeichnet Veränderungen
in der Nukleotidsequenz und der Begriff „Mutante" betrifft das Gen oder Genprodukt oder
Zellen, welche eine derartige Mutation enthalten.
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Selbst
wenn somit eine Mutation identifiziert worden ist, welche die Anwendung
eines „positiven" Screenings erlaubt,
d. h. eines Screenings, bei welchem das Vorliegen eines Proteininhibitors
durch eine Zunahme anstelle einer Abnahme der Zellüberlebensfähigkeit
angezeigt wird, ist zu erkennen, dass derartige Screenings nicht
immer zur Identifizierung von Proteininhibitoren über den
gesamten Wirksamkeitsbereich geeignet sind. Die relativ geringe
Häufigkeit
von letalen Überaktivitäts-Mutanten,
welche Zelltod aufgrund ihrer erhöhten Aktivität verursachen,
wie DnaAcos (oder analoge Überaktivitäts-Mutationen
in anderen DNA-Replikation initiierenden Proteinen), in Kombination
mit dieser Tatsache, bedeutet, dass es nicht unmittelbar offenkundig
oder naheliegend war, wie ein wirksames positives Screening für Proteininhibitoren
entwickelt werden könnte.
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Um
die Wirksamkeit dieses Screening-Typs und somit die Auswahl an Inhibitoren,
die identifiziert werden können,
zu erhöhen,
wurde von den Erfindern ein Mechanismus identifiziert, bei welchem
die Verwendung einer zweiten Mutation in der Zeile, welche die erste
(d. h. die letale Überaktivitäts-)Mutation
enthält,
jegliche starke Verringerung der Aktivität des letalen Überaktivitäts-Mutationsproteintargets
kompensiert, die durch die Präsenz
eines starken Proteininhibitors in der Probe verursacht wird. Diese
zweite Mutation beeinflusst nicht das normale Zellwachstum oder
die letale Überaktivität der ersten
Mutation, ihre Präsenz
kompensiert jedoch eine starke Verringerung der Aktivität des Targetproteins,
das durch die Präsenz
eines starken Proteininhibitors in der Probe verursacht wird. Die
zweite Mutation heilt oder rettet somit den Teststamm vor einer
starken oder vollständigen
Aktivitätsverringerung
des Targetproteins. Auf diese Weise konnten die Erfinder einen verlässlichen
und wirksamen positiven Screen oder Test auf Proteininhibitoren
bereitstellen.
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Das
rnh-Gen von E. coli kodiert für
RNaseH. Dieses Enzym bewirkt die Spaltung und somit den Abbau von
RNA in DNA:RNA-Hybriden. Somit wird eine Zelle, welche eine funktionale
Inaktivierung von rnh beispielsweise durch Mutation oder Deletion
des Gens enthält,
weiterhin RNA:DNA-Hybride enthalten und das Vorliegen derartiger
Hybride erlaubt die Initiierung der Replikation unabhängig von
DnaA und unabhängig
vom chromosomalen Ursprung OriC. Die Initiierung der Replikation
resultiert somit von diesen RNA:DNA-Hybriden, welche in Zellen, die ein
funktionales RNaseH-Enzym enthalten, nicht vorliegen. Auf diese
Weise benötigt
die Initiierung der Replikation kein OriC oder DnaA und verläuft auch
in Abwesenheit eines voll aktiven Wildtyp-Initiierungssystems. Beispielsweise
kennt man von partiell funktionalen rnh-Mutanten, dass diese das
Wachstum von Mutanten gestatten, welche zur Verwendung von OriC
nicht in der Lage sind (Taya und Crouch, 1991, Mol. Gen. Genet.,
227,:433-437; Kogoma und von Meyenburg, 1983, EMBO J. 2: 463-8).
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Die
Kombination dieser beiden Mutationen, DnaAcos und einer Deletion
in rnh in E. coli (oder tatsächlich
in anderen Organismen), war bisher nicht möglich.
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Zur
Vermehrung von Zellen (z. B. einer Population von Zellen), welche
diese beiden Mutationen enthalten, sollte die letale Überaktivitäts-Mutante „induzierbar" sein, d. h. „angeschaltet" oder „abgeschaltet" werden können oder
nur unter bestimmten Bedingungen exprimiert werden, sodass dessen
Expression kontrolliert werden kann oder dass der Phänotyp nur
im induzierten Zustand zu beobachten ist. Die Zellen werden kultiviert
(z. B. wird die Zellpopulation vergrößert und in Kultur gehalten)
unter Bedingungen, bei denen die letale Überaktivität nicht induziert ist. Der
Test wird dann unter Bedingungen durchgeführt, bei welchen die letale Überaktivität induziert
ist. Dafür
kann es beispielsweise erforderlich sein, das mutierte Gen unter
die Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu stellen oder die
Mutation kann eine temperatur- oder kältesensitive Mutation sein,
wie z. B. DnaAcos, oder eine andere konditionale Mutation.
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Im
Stand der Technik fehlen somit Verfahren, welche das positive Screening
auf Proteininhibitoren und Antibiotika beschreiben und welche die
Detektion eines vollen Spektrums von Inhibitoren erlauben.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Verfahren
zum Nachweis eines Proteininhibitors eines Targetproteins, vorzugsweise
eines spezifischen Proteininhibitors (wie z. B. den Nachweis des Vorliegens
eines Proteininhibitors in einer Probe) bereit, umfassend die folgenden
Schritte:
- a) das Inkontaktbringen des Inhibitors
(oder der den Inhibitor enthaltenden Probe) mit einer Zelle (z.
B. einer Zellpopulation), wobei diese Zelle (z. B. Zellpopulation)
eine induzierbare letale Überaktivitäts-Mutation
in einem Gen (z. B. dem kodierenden Gen), welches das Targetprotein
beeinflusst (das „erste" Gen) und eine Mutation
in einem zweiten Gen aufweist, wobei die Aktivität des Targetproteins für die Zelle
essentiell ist und die Mutation in dem zweiten Gen jegliche Verringerung
der Aktivität
des ersten Genprodukts (z. B. des Targetproteins) funktionell kompensiert;
- b) die Induzierung der letalen Überaktivitäts-Mutation; und anschließend
- c) die Bestimmung des Proteininhibitors durch Vergleich der Überlebensrate
der Zelle (z. B. Zellpopulation) in Gegenwart und in Abwesenheit
des Inhibitors (oder der Probe).
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann somit als Assay auf Proteininhibitoren, wie z. B. neue Proteininhibitoren,
für ein
gewünschtes
Targetprotein angesehen werden. Das Verfahren kann somit zum Screenen (oder
als Screening auf) neue Proteininhibitoren verwendet werden (was
neue Verbindungen oder Funktionseinheiten oder die Identifizierung
oder das Screening auf eine neue Proteininhibitor-Aktivität existierender
oder bekannter Verbindungen oder Funktionseinheiten beinhaltet).
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Unter
einem „Proteininhibitor" versteht man jegliche
Verbindung oder Funktionseinheit, welche die Fähigkeit besitzt, die normale
Funktion des Targetproteins zu unterbinden oder zu verringern und
umfasst somit jegliche Funktionseinheiten oder Substanzen, welche
die Fähigkeit
besitzen, die Funktion des Proteins direkt oder indirekt zu verringern.
Das kann erreicht werden durch Beeinflussung der Transkription,
der Translation, der post-translationalen Modifikation, der Aktivität oder der
Regulation der Aktivität
des Proteins. Vorzugsweise wird die Proteinaktivität beeinflusst
und insbesondere ist das Targetprotein ein funktionales Protein,
welches eine spezielle Aktivität
zeigt (welches z. B. seine Funktion vermittelt). Somit kann das
Targetprotein ein Enzym oder ein Bindungsprotein sein und die Inhibition
kann durch Inhibierung der enzymatischen oder Bindungsaktivität des Targetproteins
erreicht werden. Dies kann direkt erreicht werden durch Interaktion
und/oder Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum des Enzyms oder
der Bindungsstelle des Bindungsproteins oder anderer Proteinstellen,
durch Wechselwirkung mit oder Prävention
der korrekten Proteinfaltung, sodass dieses nicht funktionieren
kann, wie z. B. dass es sein Substrat oder seinen Bindungspartner
nicht erkennen kann oder dass Aminosäurereste in Schlüsselpositionen,
welche an chemischen oder Bindungsreaktionen beteiligt sind, nicht
korrekt konfiguriert sind. Ein „Bindungsprotein" kann jegliches Protein
sein, welches die Fähigkeit
besitzt, ein Molekül
oder eine Substanz in einer Zelle (d. h. jeglicher zellulären Funktionseinheit)
zu binden. Vorzugsweise besitzt das Bindungsprotein die Fähigkeit,
mit einer solchen zellulären
Funktionseinheit eine spezifische Bindung zu bilden. Das Bindungsprotein
kann einen funktionalen Effekt durch oder über diese Bindung ausüben (z.
B. kann ein funktionaler Effekt durch die Bindung vermittelt werden)
oder es kann eine funktionale Einheit binden (d. h. eine Funktionseinheit,
welche eine Funktion in einer Zelle ausübt). In analoger Weise kann das
Targetprotein jegliche Art von Effektorprotein sein, welches einen
funktionalen Effekt in der Zelle bewirkt, beispielsweise durch Wechselwirkung
mit einer anderen Komponente in der Zelle und der Proteininhibitor
kann diesen funktionalen Effekt des Proteins inhibieren.
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Die
Inhibition kann zu weniger als 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%,
5%, 2% oder 1% der normalen Aktivität führen. Vorzugsweise wird die
Aktivität
vollständig
aufgehoben, sodass keine restliche Proteinaktivität verbleibt.
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Das „Targetprotein" kann jegliches Protein
sein, das für
die Zelle essentiell ist. Insbesondere kann das Targetprotein jegliches
Protein sein, welches für
das Wachstum und/oder das Überleben
der Zelle essentiell ist. Es kann somit ein Protein sein, welches
mit einem entscheidenden zellulären
Prozess, wie z. B. einem zellulären
Prozess, der für
das Wachstum und/das Überleben
der Zelle essentiell ist, assoziiert ist. Selbstverständlich wäre ein solches
Protein essentiell für
diesen Prozess. Beispielsweise kann das Targetprotein ein Protein
sein, das mit einem Biosynthese-Prozess oder einer Biosynthese-Reaktion
assoziiert ist oder daran beteiligt ist, wie z. B. der Synthese
eines zellulären
Produkts oder eines biologischen Moleküls oder Intermediates, umfassend
beispielsweise die Synthese von Nukleinsäuren (einschließlich aller
Formen von DNA und RNA, welche in Zellen vorkommen können) und
Proteinen sowie anderen Molekülen,
welche in Zellen vorkommen können.
Ein Targetprotein kann somit bei der Replikation von DNA (DNA-Synthese),
der Synthese von RNA (z. B. Transkription von DNA in mRNA, Translation
von mRNA und Synthese von Proteinen) sowie an anderen zellulären oder
biologischen Reaktionen oder Prozessen beteiligt sein. Das Targetprotein
kann ein Protein sein, das mit der Initiierung jeglicher solcher
zellulärer
Prozesse oder Reaktionen assoziiert ist, wie z. B. ein Initiator
der DNA-Replikation
oder der Proteinsynthese. Initiatorproteine der DNA-Replikation
sind bevorzugt, insbesondere DNA-Replikation initiierende Proteine
in Prokaryonten, insbesondere in Bakterien, und vor allem in E.
coli.
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In
einem solchen Fall resultiert die letale Überaktivitäts-Mutation in dem ersten Gen
in einer erhöhten DNA-Replikation
und insbesondere in einer erhöhten
DNA-Replikation auf letalem Niveau. Die zweite Mutation kompensiert
die Verringerung oder den Verlust der DNA-Replikationsaktivität (verursacht
durch Inhibition durch den zu testenden Protein-Inhibitor), indem sie einen alternativen
Mechanismus oder Weg für
die DNA-Replikation bereitstellt (d. h. die zweite Mutation führt zu einer
erhöhten
DNA-Replikation oder zu einer Replikation, welche in Abwesenheit
der zweiten Mutation nicht erfolgen würde). Die Inhibition wird nicht
direkt gemessen sondern vielmehr funktional bestimmt, indem sie
die mutierte Zelle des Tests vom Effekt der letalen Überaktivitäts-Mutation
auf deren Überleben
und/oder Wachstum befreit. Die Inhibition des Target-Proteins kann
daher gemessen werden, indem man die Zellpopulation-Zahlen bestimmt
(z. B. misst). Ein positives Ergebnis, d. h. das Vorliegen eines
Proteininhibitors, wird durch eine messbare oder detektierbare Zunahme
des Zellwachstums, beispielsweise eine statistisch signifikante
Zunahme des Zellwachstums, wie z. B. eine wenigstens zehnfache,
zwanzigfache, dreißigfache,
fünfzigfache
oder hundertfache Zunahme, angezeigt, und wird beispielsweise durch
geeignete Mittel, wie z. B. spektrophotometrisch durch Bestimmung
einer Zunahme in der Extinktion der Zellkultur (z. B. Wachstumsmedium)
oder einer Zunahme in der optischen Dichte, wie Z. B. der OD450, oder durch andere spektrophotometrische
oder colorimetrische Tests auf Proteine oder andere Zellkomponenten
gemessen. Wachstum kann auf jede zweckmäßige oder gewünschte Art
und Weise detektiert werden. Beispielsweise können Zellkolonien (beispielsweise
von Bakterien) gezählt
oder in anderer Weise enumeriert werden.
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Unter
einem „spezifischen" Proteininhibitor
versteht man, dass der Inhibitor nur oder vorzugsweise oder selektiv
auf das Protein oder eine Klasse von Proteinen wirkt, welche durch
die letale Überaktivitäts-Mutation
beeinflusst werden und keine Funktion anderer strukturell oder funktional
nicht verwandter Proteine oder Klassen von Proteinen beeinflusst.
Somit kann sich „spezifisch" auf die Spezies
beziehen, von welcher das Targetprotein abgeleitet ist oder auf
eine Klasse von Proteinen. Ein spezifischer Inhibitor besitzt somit
die Fähigkeit
zwischen verschiedenen Proteinen zu unterscheiden und wird in dem
Test nur nachgewiesen werden, wenn die Funktion des Proteins durch
die letale Überaktivitäts-Mutation inhibiert
wird. Der spezifische Proteininhibitor wird vorzugsweise die Aktivität oder die
Funktion des Proteins reduzieren.
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Der
Proteininhibitor kann ein anderes Protein oder ein Peptid oder ein
kleines Molekül,
wie z. B. ein kleines organisches Molekül, ein Antikörper, ein
Ribozym, eine Antisense-RNA oder DNA oder ein Analoges des Substrates
und dergleichen sein. Der Proteininhibitor kann somit eine chemische
Funktionseinheit sein. Vorzugsweise ist der Proteininhibitor ein
Antibiotikum. Das Antibiotikum kann natürlichen Ursprungs oder synthetischen
Ursprungs sein und kann ein Derivat darstellen oder eine chemisch
synthetisierte Variante eines natürlichen Antibiotikums.
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„Inkontaktbringen" wird hierin so verstanden,
dass man einen geeigneten Kontakt zwischen dem Inhibitor (oder der
Probe) und der Zelle (z. B. Zellpopulation) bereitstellt, so dass
es dem Inhibitor (oder Komponenten der Probe) ermöglicht wird
in die Zellen einzutreten (z. B. die Zellmembran und/oder die Zellwand
zu durchdringen) und direkt oder indirekt mit dem Targetprotein
zu interagieren und/oder zu wechselwirken. Somit kann der Inhibitor/die
Probe einfach mit der (den) Zellen) beispielsweise dadurch in Kontakt
gebracht werden, dass man diesen zu den Zellen oder zu einem Medium
gibt, das die Zelle(n) wie z. B. ein Kulturmedium oder eine Kultur
der Zellen, enthält.
Zweckmäßigerweise
können
die Zellen in einem Flüssigmedium
vermehrt (oder kultiviert oder gehalten) werden, in welches der
Inhibitor/die Probe eingeführt
oder zugesetzt wird. Alternativ dazu können die Zellen in oder auf
einem Festmedium (wie z. B. Kultur-Schale oder –gefäß oder –platte) enthalten sein, in
welches der Inhibitor/die Probe eingeführt oder zugesetzt wird.
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Die „Probe", welche auf die
Zelle angewandt wird kann jegliche Probe sein, wie z. B. jegliche
Probe, die zu testende Inhibitorsubstanz (d. h. den zu testenden
Proteininhibitor) enthält
oder aus diesen besteht, wie z. B. eine reine Probe, oder sie kann
ein Pool reiner Proben oder eine chemische Bibliothek, beispielsweise hergestellt
durch kombinatorische Chemie, darstellen. Die Probe kann bekannte
und/oder nicht charakterisierte Komponenten umfassen. Wenn man feststellt,
dass eine Probe, umfassend nicht charakterisierte Verbindungen,
einen Proteininhibitor enthält,
dann kann diese Probe unter Verwendung von Standardtechniken, die aus
dem Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. Chromatographie (z.
B. HPLC, Dünnschichtchromatographie,
FPLC, Gelfiltration, Entsalzen usw.) fraktioniert werden und die
resultierenden Fraktionen oder Isolate können dann als Proben in diesem
Test dienen. Auf diese Weise besteht die Möglichkeit große Probenpools mit
einer relativ geringen Anzahl von Tests zu untersuchen und zusätzlich Proben
zu screenen, welche neue oder nicht charakterisierte Komponenten
enthalten, ohne zuerst die Komponenten reinigen zu müssen. Es
besteht außerdem
die Möglichkeit
reine Proben dem Test zuzusetzen. Somit kann die getestete Probe
jegliche Probe von gereinigtem oder ungereinigtem Material sein,
welche in herkömmlicher
Weise bereitgestellt wird. Beispielsweise kann die Probe die Testsubstanz
selbst sein oder sie kann eine Zusammensetzung sein, welche die
Testsubstanz (wobei die Testsubstanz selbst rein oder ungereinigt
vorliegen kann) und einen Träger oder
Verdünnungsmittel,
wie z. B. ein geeignetes Medium, umfassen. Sie kann ein Rohpräparat oder
ein gereinigtes oder partiell gereinigtes Präparat darstellen.
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Die
zu testende Probe kann synthetische oder natürlich vorkommende Komponenten
umfassen. Natürlich
vorkommende Komponenten können
beispielsweise von Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilzen,
sezerniert werden, und können
einen großen
Bereich chemischer Diversität
abdecken. Die zu testende Substanz kann somit jegliche Substanz
sein, welche in die Zelle eindringt. Sie kann somit von jeglicher
chemischer Natur sein und komplexe oder einfache Moleküle, wie
z. B. organische oder anorganische Moleküle, umfassen.
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Wenn
die zu testende Substanz in nicht effizienter Weise in die Zellen
eindringt oder aus den Zellen durch Efflux-Pumpen herausgepumpt
wird, so können
die Test-Zellen modifiziert werden, um dies zu kompensieren. Permeable
Stämme
können
erzeugt und verwendet werden oder die Gene bekannter Efflux-Pumpen können mutiert
und/oder deletiert oder funktional inaktiviert werden. Dies wird
mit Hilfe von Standardtechniken durchgeführt.
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Die
zu testende Probe kann verschiedenen aliquoten Teilen der Zellen
parallel oder sequentiell bei verschiedenen Konzentrationen zugesetzt
werden. Vorzugsweise wird jedoch nur eine einzelne Konzentration
jeder zu testender Probe benötigt,
um festzustellen, ob ein Proteininhibitor vorliegt, was durch die
Sensitivität des
Screenings bedingt ist.
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Die
in dem Test verwendete Zelle (verwendeten Zellen) ist (sind) vorzugsweise
eine Zellpopulation, insbesondere bevorzugt eine klonal abgeleitete
Population, wobei die einzelnen Zellen davon genetisch identisch
sind. Die Zelle(n) enthält
(enthalten) die beiden mutierten Gene (d. h. das erste mutierte
Gen, das die letale Überaktivitäts-Mutation
trägt und
das zweite „kompensatorische" mutierte Gen). Die
Mutationen können in
die Gene eingeführt
werden oder die mutierten Gene können
eingeführt
werden, jeweils auf jeglichem geeigneten oder gewünschten
Weg. Die Zellen können
transfiziert oder transformiert oder transduziert worden sein mit
den mutierten Genen oder die Gene können mit Hilfe anderer molekularbiologischer
Standardtechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, eingeführt worden
sein. Alternativ dazu können
die Mutationen unter Verwendung standardisierter Verfahren zur Mutagenese
(welche gerichtet oder nicht-gerichtet, z. B. zufällig, sein
kann) und von Selektionstechniken, wie z. B. durch Identifikation
von Revertanten, Suppressoren oder Mutanten, erzeugt worden sein.
Beispielsweise können
kältesensitive
Suppressoren von dnaA(ts), wie z. B. DnaACos, mit Hilfe von Screeningprozessen
identifiziert werden. Beispielsweise kann eine temperatursensitive
Zellmutante, die eine Mutation in einem Protein enthält, so dass
das Protein bei höherer
(restriktiver) Temperatur nicht normal funktionieren kann, als Ausgangspunkt
verwendet werden. Suppressoren können
mit Hilfe normaler Prozesse oder durch Mutagenese unter Verwendung
von Standardtechniken erzeugt werden. Wenn derartige Mutanten beispielsweise
kältesensitiv
sind, kann diese Eigenschaft tatsächlich von einer Überaktivität des Proteins
und nicht von dessen Inaktivität
resultieren. Auf diese Weise besteht die Möglichkeit letale Überaktivitäs-Mutanten
zu identifizieren.
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Die
Zellen können
jegliche Zellen sein, wie Z. B. prokaryotische oder eukaryotische
Zellen, einschließlich
Eubakterienzellen und Archaeazellen, sowie Zellen von Pflanzen,
Pilzen und Tieren, wie z. B. Zellen von Bakterien, Säugern oder
Hefen (z. B. Saccharomyces sp., wie z. B. S. cerevisiae oder S.
pombe). Vorzugsweise sind die Zellen bakteriell, insbesondere sind
die Zellen E. coli.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
enthalten die Zellen (vorzugsweise bakteriellen Zellen) eine letale Überaktivitäts-Mutation
in DnaA und eine Mutation, welche die RnaseH inaktiviert (z. B.
eine Deletion von rnh). Eine besonders bevorzugte derartige Mutation,
DnaA219Δrnh,
ist in den Beispielen beschrieben und wird als Stamm SF53 bezeichnet,
der bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Porton
Down, UK, am 6. Mai 2003 unter der Hinterlegungsnummer 03050701
hinterlegt ist. Die Hinterlegung erfolgte im Namen der The Norwegian
Radium Hospital Research Foundation, P.O. Box 56, Montebello, 0310 Oslo,
Norwegen.
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Gemäß einem
anderen repräsentativen
Beispiel befindet sich die Überaktivitätsmutation
in dem Cdc6-Gen oder einem Orc-Gen. Cdc6 und Orc sind Gene, welche
Replikations-Initiatorproteine in Eukaryonten kodieren.
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Der
Begriff „Mutation" wird hierin so verstanden,
dass er eine oder mehrere Veränderungen
in der Nukleotidsequenz eines Gens bezeichnet. Die Veränderung
kann eine Addition, Deletion oder Substitution von Nukleotiden in
kodierenden oder nichtkodierenden Bereichen des Gens sein und kann
die Funktion des Genproduktes, wie z. B. des durch das Gen kodierten
Proteins, beeinflussen oder es kann die Kontrolle der Expression
dieses Gens beeinflussen. Beispielsweise kann die Mutation eine Überexpression
verursachen, d. h. eine Zunahme des Expressionsgrades im Vergleich
zu einem Gen (z. B. einem Wild-Typ-Gen), das diese Mutation nicht
aufweist. Alternativ dazu kann die Mutation zu Veränderungen
in der Primär-,
Sekundär-
oder Tertiär-Struktur
des Proteinproduktes führen.
Derartige Veränderungen
können
die Funktion des Proteins im Vergleich zur nichtmutierten (z. B.
Wild-Typ-)Form des
Proteins beeinflussen. Die Veränderungen
in der Funktion können
im Zusammenhang mit einer erhöhten
Aktivität
stehen, die beispielsweise durch eine veränderte Bindung von Substraten
oder Cofaktoren, veränderten
Mechanismen der Regulation oder Lokalisation verursacht werden.
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Unter
einer „letalen Überaktivitäts-Mutante" versteht man, dass
die hierin beschriebene genetische Veränderung oder Mutation zu einer
Zunahme in der Aktivität
des Targetproteins führt,
im Vergleich zur nicht-mutierten Form des Proteins, d. h. der Form
des Proteins, wie sie vorher oder ohne die letale Überaktivitäts-Mutation
produziert wird (wie beispielsweise durch das Wild-Typ-Gen kodiert)
und wobei diese Zunahme in der Aktivität die Lebensfähigkeit
der diese Mutation enthaltenden Zellen verringert.
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Die
letale Überaktivitäts-Mutation
kann in jeglichem Gen vorliegen, welches das Targetprotein beeinflusst,
obwohl es im Allgemeinen in dem das Targetprotein kodierenden Gen
vorliegen wird. Zusätzlich
zu Genen, die das Targetprotein kodieren, kann ein das Targetprotein
beeinflussende Gen jegliches Gen beinhalten, welches für ein Genprodukt
kodiert, das einen Effekt auf das oder eine Aktivität von dem
Targetprotein aufweist, wie z. B. ein regulatorisches Molekül.
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Die
Zunahme der Aktivität
des Proteins kann aus einer Zunahme der Proteinexpression, aus einer strukturellen
oder funktionellen Veränderung
in dem Protein (oder dessen Regulation) resultieren und kann die Wachstumsrate
der Zellen, welche die Mutation enthalten, verringern oder kann
den Zelltod verursachen. Die Mutation kann die Aktivität jeglichen
Proteins der Zelle beeinflussen, wie z. B. eines Enzyms oder eines
Strukturproteins, eines Rezeptors oder eines Signalproteins, oder
kann jedes andere funktionale oder Effektorprotein beeinflussen,
solange die Überaktivität dieses
Proteins das Zellwachstum und/oder die Zellviabilität verringert.
Der detektierbare Phänotyp
einer Zeile, die eine derartige letale Überexpressions-Mutation enthält (d. h.
eine letale Überaktivitäts-Mutante) ist deshalb
eine Verringerung in der Fähigkeit
zum Wachstum, zur Teilung und/oder zum Überleben.
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Wie
oben diskutiert liegt die letale Überaktivitäts-Mutation vorzugsweise in
einem Gen vor, welches an der DNA-Replikation beteiligt ist, insbesondere
in einem Gen, welches an der Initiierung der DNA-Replikation und
vor allem einem Gen, welches an der Initiierung der prokaryontischen
und insbesondere bakteriellen DNA-Replikation beteiligt ist, wie
z. B. dem dnaA-Gen. Mutationen in dem dnaA-Gen umfassen dnaAcos
sowie die Mutation dnaA219 des E. coli Initiations-Proteins DnaA,
wie in folgendem Beispiel 1 beschrieben.
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Das
bevorzugte Targetprotein ist somit ein Initiator der DNA-Replikation.
Jeglicher Initiator der DNA-Replikation kann verwendet werden, einschließlich solcher
aus prokaryotischen (einschließlich
Archaea) und eukaryotischen Quellen. Unter einem Initiator der DNA-Replikation
versteht man ein Protein, welches an den Ursprung der Replikation
bindet und dadurch den Start des Prozesses der DNA-Replikation auslöst, d. h. das
Protein ist verantwortlich für
den ersten oder initialen Schritt im Prozess der DNA-Replikation.
Eukaryontische Replikations-Initiatorproteine umfassen Cdc Proteine
(z. B. Cdc6, Cdc18 und Cdc45, Cdt Proteine, z. B. Cdt1, Orc Proteine
(z. B. Orc1) und MCM Proteine (Liu et al., 2000, Mol. Cell 6: 637).
Homologe und orthologe von solchen Proteinen (z. B. von anderen
Spezies) können
ebenfalls verwendet werden.
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Bei
Eukaryoten beginnt die Replikation mit der Bindung des Sechs-Untereinheiten
umfassenden ORC-Kompexes an den Urspung an welchem außerdem Cdc6,
MCMs und Cdc45 rekrutiert werden. Archaea enthalten Orthologe von
mehreren eukaryotischen Replikationsproteinen, einschließlich Cdc6
und MCMs. Es wird angenommen, dass die Archaea-Replikation analog
zur Replikation bei Eukaryoten jedoch mit geringerer Komplexität funktioniert.
Archaea enthalten keine offensichtlichen Homologen von Orc, jedoch
ist Orc1 homolog zu Cdc6, so dass angenommen wird, dass in Archaea
das „Cdc6/Orc"-Protein (d. h. das
Cdc6 Homologe) beide Funktionen übernimmt.
Cdc6/Orc aus Archaeaspezies und DnaA wurden kürzlich kristallisiert und als strukturell ähnliche
Proteine beschrieben.
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Während Initiatoren
der DNA-Replikation als Targetproteine bevorzugt sind so können doch,
wie oben erwähnt,
jegliche Initiatorproteine verwendet werden, d. h. jedes Protein,
das bei der Initiation irgendeines zellulären Prozesses, wie z. B. der
Transkription oder Translation im Prozess der Proteinsynthese, involviert
ist.
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Mutierte
Versionen solcher Proteine, welche eine letale Überaktivität zeigen, können, wie oben diskutiert,
unter Verwendung von Standardverfahren erzeugt und/oder identifiziert
werden. Im Falle bestimmter Proteine sind geeignete Mutanten, welche
verwendet werden können
bereits bekannt und sind in der Literatur beschrieben. Diese umfassen
Mutanten von DnaA, z. B. DnaAcos und DnaA219 wie oben erwähnt) und
von Cdc Proteinen, wie z. B. Cdc6 in Hefe. So werden beispielsweise
in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Mutanten von cdc6 (cdc6-3
und cdc6-2) bereits bei permissiver Temperatur überrepliziert und sterben bei
nichtpermissiver Temperatur (Lang und Stillman, 1997, Genes Dev.
11:3375). In der Hefe Schizosaccharomyces pombe wird Cdc6 auch als
Cdc18 bezeichnet. Zellen mit Überaktivität von Cdc18
zeigen eine Überreplikation
(Nishitani und Nurse, 1995, Cell 83: 397; Muzi-Falconi et al., 1996,
Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1566).
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Der
hierin verwendete Ausdruck "induzierbar" beschreibt die Fähigkeit
den Mutationsphänotyp
der Zelle, welche die letale Überaktivitäts-Mutante
enthält,
an- und abzuschalten. Es gibt folglich zwei Zustände – den nicht-induzierten Zustand,
bei welchem die Zelle die Fähigkeit
besitzt normal zu wachsen und sich zu teilen und den induzierten
Zustand, bei welchem diese Fähigkeit
durch Einschalten der Mutation unterbunden ist. Diese „Induzierbarkeit" kann auf verschiedenen
Wegen erreicht werden. In einem Beispiel für eine dominante letale Überaktivitäts-Mutation,
welche in die Zelle zusätzlich
zu einem Wild-Typ-Gen
eingeführt
wird und welche einen dominanten Effekt über das Wild-Typ-Gen besitzt,
insofern als der Mutantenphänotyp
trotz des Vorliegens des Wild-Typ-Gens beobachtet wird, kann das
mutierte Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt
werden. In ähnlicher
Weise kann ein induzierbarer Promotor verwendet werden für den Fall, dass
nur die Version der letalen Überaktivitäts-Mutante,
dominant oder nicht, des Gens in der Zelle vorliegt (oder aktiv
ist) (z. B. wenn das „normale" oder Wild-Typ-Gen
fehlt oder inaktiviert, wie Z. B. ausgeschalten, wurde). Dieser
Promotor erfordert die Präsenz
einer bestimmten Komponente (des Effektors) im Wachstumsmedium,
damit Transkription des Gens, welches künstlich unter dessen Kontrolle
gestellt wurde, auftritt. Auf diese Weise ist keine Transkription
des mutierten Genes (z. B. des exogenen mutierten Gens) bei Fehlen
dieser Komponente (Effektor) zu beobachten und folglich wird kein
mutiertes Protein produziert. In Gegenwart der Komponente/des Effektors
wird das mutierte Gen transkribiert und die Proteinmutante wird
folglich produziert. Wenn die letale Überaktivitäts-Mutante dominant ist wird
deren Präsenz
die Zell-Viabilität
beeinflussen, und zwar sogar in Gegenwart des „nichtmutierten" (z. B. Wild-Typ)
Proteins. Bei Fehlen des „nicht-mutierten" Proteins (oder bei
Fehlen dessen Aktivität)
wird der Effekt jeglicher letaler Überaktivitäts-Mutation in gleicher Weise
zu beobachten sein. Beispielsweise kann das mutierte Gen unter die
Kontrolle des lac-Promotors des λ-Promotors
oder des Arabinose-Promotors gestellt werden.
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Alternativ
dazu kann der Mutanten-Phänotyp
des Proteins über
konditionale Mittel induziert werden, d. h. die letale Überaktivitäts-Mutation
kann eine konditionale Mutation sein, worin der Mutations-Phänotyp des Targetproteins
durch eine Veränderung
einer oder mehrerer Bedingungen (z. B. Parameter), welche die Zelle betreffen
(wie z. B. Temperatur oder andere Kulturbedingungen, Alter, Nährstoffe)
induziert werden. Restriktive Bedingungen sind solche, bei welchen
der Mutations-Phänotyp
beobachtet wird, während
permissive Bedingungen solche sind, bei denen der Mutations-Phänotyp unterdrückt ist
(was zu einer nicht-überaktiven
Genfunktion führt,
wie z. B. Wild-Typ- oder normale Aktivitätswerte) (d. h. „nicht-mutierte" Genfunktion). Somit
kann der Mutations-Phänotyp
der Proteinmutante durch Veränderung
der Temperatur der Zelle induziert werden. Temperatur- oder Kältesensitive
Mutationen sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt und
resultieren aus Veränderungen
in der Primärstruktur
(d. h. der Aminosäuresequenz)
des mutierten Proteins. Bestimmte Aminosäuren in Schlüsselpositionen
in dem Protein können
Temperatursensitivität
verleihen. Die Sekundärstruktur
des Proteins verändert
sich als Folge einer Verschiebung in der Wachstumstemperatur der
Zelle, welche das mutierte Protein enthält.
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Die
Veränderung
in der Konfirmation des Proteins bei verschiedenen Temperaturen
kann zu Veränderungen
in den Proteineigenschaften führen.
Beispielsweise kann das Protein übermäßig aktiv
bei einer Temperatur werden, während
es sich im Wesentlichen bei einer anderen Temperatur normal, wie
der Wild-Typ verhält.
Alternativ dazu kann das Protein normal, d. h. mit Wild-Typ-Aktivitätswerten
bei einer Temperatur funktionieren und inaktiv werden oder eine
verringerte Aktivität
zeigen bei Veränderung
der Temperatur. Die Temperatur, bei welcher sich das Protein normal
verhält
wird als permissive Temperatur bezeichnet. Die Temperatur bei welcher
das Protein Eigenschaften der Mutante zeigt, wie z. B. eine verringerte,
erhöhte
oder verschiedene Aktivität,
wird als restriktive Temperatur bezeichnet.
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Diese
temperatursensitiven oder kältesensitiven
Mutanten haben sich bei der Untersuchung der Auswirkungen letaler
Mutationen als sehr hilfreich erwiesen. Wachstum und Vermehrung
der Zelle oder des Organismus bei der permissiven Temperatur ermöglicht ein
Expandieren oder Perpetuieren von Zellen, welche Proteine mit den
betreffenden Mutationen beinhalten. Indem man diese Zellen einer
Temperaturverschiebung aussetzt und somit den Mutations-Phänotyp erzeugt
besteht die Möglichkeit,
die Funktion anderenfalls letaler Mutationen zu untersuchen. Temperatur-
und kältesensitive
Mutationen sind von Vorteil, da die Veränderung in der Proteinstruktur
und Funktion bei Veränderung
der Temperatur auftritt und keine Verzögerungsphase ausweist, die
bei Verwendung anderer induzierbarer Systeme beobachtet wurde, wie
z. B. bei der Zugabe eines Transkriptions-Induktors. Es ist somit bevorzugt, dass
die erfindungsgemäße letale Überaktivitäts-Mutanten temperatur-
oder kältesensitiv
sind. Am meisten bevorzugt liegt die restriktive Temperatur bei
30°C und
die permissive Temperatur bei 42°C.
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Unter
einem „Targetprotein" versteht man ein
Protein, das als essentiell oder kritisch für das Wachstum und/oder das Überleben
der Zelle, in welcher es vorliegt oder exprimiert wird, ist und
für welches
es wünschenswert
ist einen Inhibitor zu identifizieren, beispielsweise zur Verwendung
als Wirkstoffkandidat gegen das Targetprotein. Beispielsweise kann
somit das Targetprotein kritisch oder essentiell für ein Pathogen
oder für
die andauernde Existenz eines Krankheitszustandes sein. Wie oben
bereits erwähnt,
können
bestimmte Proteine mit speziellen Krankheitszuständen, wie z. B. Krebs, assoziiert
sein und können
somit potentielle Wirkstofftargets darstellen. Wie ebenfalls oben
diskutiert können
Wirkstoffe, welche mit diesen Targetproteinen Wechselwirken, mit
Hilfe von Screenings identifiziert werden, wobei der Effekt eines
potentiellen Wirkstoffes auf das Targetprotein über den Einfluss des Wirkstoffes
auf den Phänotyp
einer Zelle gemessen wird, welche das Targetprotein für sein Wachstum
und/oder Überleben
benötigt.
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Erfindungsgemäß wird das
Targetprotein so mutiert, dass es eine letale Überaktivitäts-Mutation darstellt, d. h.
dass es eine erhöhte
oder exzessive Aktivität
im Vergleich zum nicht-mutierten oder Wild-Typ-Protein aufweist.
Auf diese Weise wird die Reduktion der mutanten Überaktivität des Targetproteins in dem
Test bestimmt. Dadurch wird ein positiver Test bereitgestellt, in
dem die Verringerung der Aktivität
des mutierten letalen Überaktivitätsproteins
nachgewiesen wird. Wenn die Zellen, welche das mutierte Überaktivitätsprotein aufweisen, überleben,
dann enthält
die Testsubstanz eine Verbindung, welche die Überaktivität des mutierten Targetproteins
verringert. Eine derartige Verbindung besitzt ein Potential für die Verwendung
als Wirkstoff, der mit der normalen Aktivität des Targetproteins wechselwirkt,
um auf diese Weise eine Infektion zu verringern oder den betreffenden
Krankheitszustand zu bekämpften.
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Wie
oben bereits erwähnt,
kann das Targetprotein jegliches funktionale Protein sein (z. B.
jegliches Effektorprotein). Es ist aber bevorzugt ein Enzym oder
ein Bindungsprotein, insbesondere ein Enzym oder Bindungsprotein,
welches am DNA-Metabolismus beteiligt ist. Insbesondere bevorzugt
ist ein Protein, das an der Replikation chromosomaler DNA beteiligt
ist, wie z. B. das bakterielle DnaA (z. B. aus E. coli) oder ein
Homologes davon. Homologe von DnaA können in anderen Spezies gefunden
werden, wie Z. B. E. coli, S. enterica, S. marcescens, P. mirabilis,
B. aphidicola, Y. pestis, V. harveyi, V. cholera, P. putida, P.
aeruginosa, P. multocida, H. influenzae, S. putrefaciens, C. crescentus,
R. meliloti, Z. mobilis, R. prowazekii, Wolbachia sp., H. pylori, C.
jejuni, B. Pertussis, N. meningitidis, T. ferrooxidans, C. difficile,
B. subtilis, B. halodurans, B. anthracis, S. aureaus, S. pneumoniae,
M. capricolum, M. genitalium, M. pneumoniae, U. urealyticum, S.
citri, E. faecalis, M. luteus, C. diphtheriae, M. leprae, M. avium,
M. tuberculosis, M. smegmatis, S. coelicolor, S. chrysomallus, P. marinus,
Synechocystis sp., C. pneumoniae, C. trachomatis, C. muridarum,
B. burgdorferi, T. pallidum, T. denticola, T. maritima, T. thermophilus,
D. radiodurans, A. aeolicus, C. tepidum, D. ethenogenes, P. gingivalis.
Andere Proteine, welche an der DNA-Replikation beteiligt sind, können ebenfalls
verwendet werden, wie Z. B. die eurkaryotischen Cdc6/Orc-Proteine,
welche oben bereits erwähnt
wurden, oder irgendwelche anderen Replikationsinitiatoren.
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Die
Mutation in dem zweiten Gen ist erforderlich, um die Detektion starker
Proteininhibitoren zu ermöglichen,
welche gewöhnlich
im Falle eines einfachen Positiv-Screenings
nicht detektiert werden würden.
In einem normalen, auf einer Einzelmutation beruhenden Positiv-Screening,
worin eine Zelle verwendet wird, die eine einzelne letale Überaktivitäts-Mutation
umfasst, kann ein Proteininhibitor der die Aktivität der Überaktivitätsmutante
beeinträchtigt,
so dass die Aktivität
verringert wird, jedoch nicht vollständig verschwindet, ein Überleben
der Zelle bewirken oder bewirken, dass diese ein verbessertes Überleben
oder Wachstum in Gegenwart eines solchen Inhibitors im Vergleich
zu mutierten Zellen zeigen, die bei Fehlen eines solchen Inhibitors
wachsen. Wenn jedoch ein starker Inhibitor (beispielsweise in der
Probe) vorliegt, der die Funktion der letalen Überaktivitäts-Mutation im Wesentlichen
oder vollständig
unterbindet, dann werden die mutierten Zellen absterben unabhängig davon
ob ein derartiger Inhibitor vorliegt. Das Targetprotein, das die
letale Überaktivitäts-Mutation
enthält
ist aufgrund seiner Natur essentiell für das fortgesetzte Überleben
und/oder Wachstum und Vermehrung der Zelle und ist aus diesem Grund
ein geeignetes Targetprotein und die Inhibition des Targetproteins
wird über
diese Eigenschaft gemessen. Es ist jedoch nicht möglich in
einem solchen System zwischen einem starken Inhibitor, der ein Überleben
von Zellen, welche die letale Überaktivitäts-Mutante
enthalten, durch vollständige
oder signifikante Inhibition der Aktivität des mutierten Targetproteins,
welches für
das fortgesetzte Überleben
dieser Zellen essentiell ist, verhindert, und dem Fehlen jeglicher
Inhibition, unter welchen Bedingungen die Zellen nicht überleben
können,
zu differenzieren. Somit besteht für jegliches Positiv-Screening,
welches eine einzelne, letale Überaktivitäts-Mutation
verwendet, eine Beschränkung
im Hinblick auf die Stärke
des Inhibitors der mit Hilfe dieses Screenings detektiert werden
kann, insofern als nur schwache Inhibitoren oder stärkere Inhibitoren
lediglich bei Verwendung geringer Mengen detektiert werden.
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Die
Erfinder haben einen neuen Test entwickelt, bei welchem es eine
zweite Mutation, die in der Zelle ebenfalls vorliegt, der Zelle
ermöglicht
zu überleben,
wenn der Proteininhibitor ausreichend stark ist (oder in ausreichend
hoher Menge vorliegt) um die Funktion des Targetproteins vollständig zu
unterbinden oder unter ein Niveau zu verringern, bei welchem die
Zellen überleben
und/oder wachsen können.
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Die
zweite Mutation substituiert und kompensiert das Fehlen der Aktivität des Targetproteins,
welches durch eine Aktivitätsverringerung
durch den Proteininhibitor verursacht wird. Dessen Phänotyp ist
deshalb nur nachweisbar, wenn die Aktivität der ersten letalen Überaktivitäts-Mutante
verringert ist, da die letale Überaktivitäts-Mutante
dominant ist. Die zweite Mutation kann in der Insertion eines oder
mehrerer neuer Gene bestehen, dessen (deren) Genprodukt(e) die fehlende
Aktivität
des Targetproteins kompensieren kann (können). Alternativ dazu kann
die Mutation eine solche sein, welche ein bestimmtes Gen/Genprodukt
inaktiviert oder dessen Expression und/oder Aktivität substantiell
reduziert, wie z. B. eine Nonsense-Mutation in einem Gen oder eine
Deletion, welche das Produkt oder das funktionale Produkt des Gens
aus der Zelle entfernt.
-
Die
Mutation im zweiten Gen ermöglicht
das fortgesetzte Überleben
und Wachstum der Zeile in Gegenwart eines starken Inhibitors (oder
von hohen Konzentrationen oder Mengen des Inhibitors) der die Aktivität des Targetproteins
verringert. Die Mutation in dem zweiten Gen kann somit auf dem gleichen
Niveau wie die letale Überaktivitäts-Mutante
oder Downstream dazu wirken. Wenn also die letale Überaktivitäts-Mutation
in einem Initiator eines zellulären
Prozesses vorliegt, erlaubt die zweite Mutation, dass dieser Prozess
bei Fehlen eines jeglichen funktionalen Initiators dieses Prozesses
fortschreitet. Liegt beispielsweise die letale Überaktivitäts-Mutante in einem Initiator
der DNA-Replikation, wie z. B. in Prokaryonten, vor und führt zu einer Überaktivität des DNA-Replikation-Initiator-Proteins (z. B. DnaA)
und verursacht eine Über-Initiierung
der DNA-Replikation, ist die zweite Mutation vorzugsweise eine solche,
welche es der DNA-Replikation erlaubt, in Abwesenheit des funktionalen
DNA-Replikation-Initiatorproteins (z. B. DnaA) fortzuschreiten,
beispielsweise dadurch, dass ein alternativer Replikationsmechanismus
bereitgestellt wird. Somit kann diese Mutation jegliche Mutation
sein, welche das rnh-Gen, welches die Rnase H kodiert, inhibiert
und ist vorzugsweise die Deletion von rnh.
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Unter „funktionalem
Kompensieren" versteht
man, dass eine zusätzliche
oder alternative Aktivität
in die mutierten Zelle eingeführt
oder darin deletiert (oder substantiell reduziert) wird. Die Kompensation
liegt somit in der Bereitstellung eines Mittels, mit dessen Hilfe
die Zelle auch weiterhin im Wesentlichen normal funktionieren kann,
und zwar trotz des Fehlens oder der Verringerung der Aktivität eines
Targetproteins in Schlüsselposition.
Die zweite Mutation kann somit jegliche Reduktion der Aktivität des ersten
Genproduktes (d. h. des Targetproteins) funktional kompensieren,
und zwar unterhalb eines die Viabilität erhaltenden Wertes (d. h. wenn
die Aktivität
des Targetproteins unter einen Wert fällt, bei welchen die Zelle überleben
und/oder wachsen kann. Die Aktivität des Targetproteins wird nicht
direkt gemessen sondern in einem funktionalen Assay bestimmt.
-
Beispielsweise
kann in einem linearen Signalweg das Targetprotein „stromaufwärts" der alternativen Aktivität positioniert
sein. Durch Bereitstellung eines aktiven Proteins stromabwärts zur
blockierten Aktivität funktioniert
der Signalweg weiterhin und die Zelle, welche von diesem Weg abhängt, überlebt
bei Fehlen eines funktionalen Stromaufwärts-Signals. Die alternative Aktivität kann somit
stromabwärts
liegen und an einem späteren
Punkt in einem Signalweg wirken.
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Der
hierin verwendete Begriff „Überlebensgrad" betrifft die Bestimmung
(z. B. Messung) des Wachstums und der Proliferation der in dem Test
verwendeten Zellen. Die Zellen werden getötet (oder werden wachstumsunfähig) durch
die letale Überaktivitäts-Mutation, wenn diese
induziert ist, in Abwesenheit eines Proteininhibitors, der den Effekt
des Targetproteins inhibiert. Dies steht deshalb für einen
Lebensgrad von „Null", d. h. keine Zellen überleben
oder keine Zellen besitzen die Fähigkeit
zum Wachstum oder zur Teilung. Im Anschluss an die Induktion der
letalen Überaktivitäts-Mutation
kann es einen bestimmten Zeitraum dauern, bis die Zellen sterben.
Beispielsweise dauert es etwa 3 Stunden im Anschluss an die Induktion
einer temperatursensitiven letalen Überaktivitäts-Mutation in einem Bakterium
bis die Zellen sterben. In Gegenwart eines spezifischen Proteininhibitors,
der die Aktivität
der letalen Überaktivitäts-Mutante
verringert, wird eine zunehmende Anzahl von Zellen überleben
und kann proliferieren. Somit korreliert der Überlebensgrad mit der Anzahl
der vorliegenden Zellen (z. B. in dem Zellwachstums- oder Kulturmedium)
im Anschluss an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation und der Zugabe
des Inhibitors (oder der Probe). Der Inhibitor (oder die Probe)
können gleichzeitig
mit der Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation
oder anschließend
dazugegeben werden. Wenn die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation über einen
Temperaturshift erfolgt, dann ist es bevorzugt, dass der Inhibitor
(oder die Probe) gleichzeitig mit der Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation zugesetzt
wird. Wenn die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation die de novo-Proteinbiosynthese
erfordert, dann sollte der Inhibitor (oder die Probe) im Anschluss
an die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutante
zugesetzt werden, vorzugsweise zu einem Zeitpunkt, bei dem die Proteinsynthese
erfolgt ist, z. B. 3-5 Stunden oder 5-8 Stunden im Anschluss an
die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation.
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Dies
kann erfolgen durch die Ermittlung, wie z. B. durch Abschätzen oder
Bestimmen (wie z. B. durch Zählen
oder Messen) der Zellzahl (z. B. lebende Zellen) zu einem bestimmten
Zeitpunkt in Gegenwart und bei Fehlen der Probe. Die Zellen können spektrophotometrisch
ausgezählt
werden, wie z. B. durch Messen der optischen Dichte der Zellpopulation
bei einer geeigneten Wellenlänge,
wie z. B. einer Wellenlänge
von 450 nm oder durch direktes Zählen
der Zellen, oder eines repräsentativen
Anteils der Zellprobe. Wenn die Zellen auf festem Medium wachsen,
so kann die Zahl der Kolonien bestimmt werden.
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Wie
oben erwähnt
sollte der Inhibitor oder die Probe mit den Zellen kurz nach, z.
B. eine Generation, oder gleichzeitig mit der Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation
in Kontakt gebracht werden, wenn die Induktion der letalen Überaktivitäts-Mutation über einen
Temperaturshift erfolgt. Dies entspricht dem Zeitpunkt Null. Die
Bestimmung der relativen Zellzahlen kann dann in geeigneten Zeitintervallen,
wie z. B. 3-30, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10, 8-12, 8-10, 3-5 Generationen
nach dem Zeitpunkt Null oder nach einer geeigneten Inkubationsperiode,
wie z. B. einer Inkubation über
Nacht für
8-30 Stunden, 8-24 Stunden, 8-18
Stunden, 8-12 Stunden, 12-30 Stunden, 12-24 Stunden, 12-18 Stunden,
18-30 Stunden, 18-24 Stunden, 20-30 Stunden, 20-24 Stunden, erfolgen.
Zu diesem Zeitpunkt wird die Zellzahl in der inkubierten Zellpopulation
in Abwesenheit der Testsubstanz als Kontrollwert bestimmt. Die Anzahl
der Zellen in dieser Zellpopulation wird mit der Anzahl der Zellen
in der induzierten Zellpopulation, welche mit dem Inhibitor (der
Probe) in Kontakt gebracht worden war, verglichen. Beispielsweise
weist eine 10-fache, 20-fache, 30-fache, 50-fache oder 100-fache Zunahme der
OD450 relativ zum Wert in Abwesenheit des
Inhibitors/der Probe auf das Vorliegen eines Proteininhibitors in
der Testsubstanz hin.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Zellen zur Verwendung
in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Eine solche Zelle enthält
eine induzierbare, vorzugsweise Temperatursensitive, wie z. B. Kältesensitive,
letale Überaktivitäts-Mutation
in einem ersten Gen, das ein Targetprotein betrifft (z. B. kodiert),
dessen Aktivität
für die
Zelle essentiell ist, und eine zweite Mutation (z. B. in einem zweiten
Gen), welche jegliche Verringerung der Aktivität des ersten Genproduktes (d.
h. des Targetproteins), wie z. B. eine Verringerung der Aktivität, verursacht
durch einen Proteininhibitor, funktional kompensiert.
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Wie
oben erwähnt
kann die Zelle eine eukaryontische oder prokaryontische, einschließlich Archaea-Zelle
sein, wie z. B. Hefe oder Sängerzellen.
Vorzugsweise ist die Zelle eubakteriell, wie z. B. E. coli.
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Insbesondere
ist die Zelle eine dnaA219Δrnh-Mutante,
insbesondere abgeleitet vom Stamm WM2667 und vor allem ist die Zelle
ein hinterlegter Stamm SF53, wie oben beschrieben, der die DnaA219cosΔrnh-Mutation
enthält,
und die in Tabelle 1 aufgelisteten Charakteristika zeigt.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur
Durchführung
des Tests, umfassend Zellen zur Durchführung des Tests. Der Kit kann
außerdem
Wachstumsmedium und/oder Antibiotika zur Durchführung des Tests umfassen.
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Proteininhibitoren
(z. B. neue Proteininhibitoren) können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Testmethode
identifiziert werden, wie insbesondere Inhibitoren der DNA-Replikation,
vor allem Inhibitoren der bakteriellen DNA-Replikation und sie können Verwendung
finden als antimikrobielle Mittel.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden nichtlimitierenden
Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher beschrieben.
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1 zeigt
Wachstumskurven des Teststamms SF53 (dnaA219, rnh::cam) und des
Stamms SF58 (dnaA219, rnh::cam/pdnaA[1-86]-biotin);
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2 zeigt
die Überlebensfähigkeitsanalyse
von SF58-Zellen, welche bei verschiedenen Mengen von IPTG (0, 0,25,
0,5 und 1 mM) bei 30°C
wuchsen;
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3 zeigt
Wachstumskurven von SF53 und SF58. Das Inoculum war eine 1:100-Verdünnung einer 1,5
OD600 O.N. Kultur. Die Inkubationstemperatur
betrug 30°C,
die OD405 wurde alle 900 s gemessen. Weder SF53
noch SF58 zeigten nennenswertes Wachstum unter diesen Bedingungen
bis zu 1,5 × 105 s (annähernd 42
Stunden);
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4 zeigt
die Wachstumskurve von SF58 mit IPTG bei Konzentrationen von 0 und
10 mM. Das Inoculum war eine 1:100-Verdünnung einer 1,5 OD600 über-Nacht-Kultur.
Die Inkubationstemperatur betrug 30°C. Die OD405 wurde
alle 900 s gemessen. Nach 18 Stunden (6,4 × 104 s)
waren die ODs der induzierten Kulturen (0,31 mM IPTG und darüber) signifikant
höher als
die Kontrollen (0 bis 0,16 mM IPTG);
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5 zeigt
die Häufigkeitsverteilung
der OD620-Werte von positiven (SF58 + 2,5
mM IPTG) und negativen (SF53 und SF58) Kontrollen. Die positiven
Kontrollwerte lagen im Bereich um OD620 1,1
und die negativen Kontrollwerte lagen im Bereich um OD620 0,1;
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6 zeigt
die Häufigkeitsverteilung
von OD620-Werten von 4240 mikrobiellen Extrakten.
Die meisten Proben zeigen einen OD620-Wert
um 0,1; und
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7 zeigt
das OD620-Signal von 41 positiven mikrobiellen
Extrakten.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Konstruktion des Teststamms SF53
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WM2667
ist ein temperatursensitiver Suppressor von WM2062 (dnaAtS46, Weigel
et al., 1999, Mol. Microbial, 34: 53-66). WM2667 ähnelt stark
der dnaAcos Mutante (Kellenberger-Gujer et al., supra) insofern, als
er eine kältesensitive
Mutante von dnaA ist. Die Mutanten wachsen normalerweise bei der
permissiven Temperatur (42°C),
wobei aber nach Wachstum bei der restriktiven Temperatur, 30°C für 4 Stunden,
weniger als 10% der Zellen lebensfähig bleiben. Bei 30°C akkumulieren
die Zellen drei- bis viermal mehr OriC DNA als Kontrollmarker (dnaB,
dnaC und attλ).
Das Wachstum kann durch Einführung
eines OriC-Plasmids oder durch moderate Überexpression des Fis-Proteins
wiederhergestellt werden.
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Es
gibt drei Mutationen in dem dnaA-Gen von WM2667. A184V und H252Y
sind beide in dem dnaA-Gen des Ausgangsstammes zu finden, wohingegen
R342C eine zusätzliche
Mutation darstellt, die nur in WM2667 zu finden ist. Das dnaA-Allel
wird als dnaA219(cos) bezeichnet.
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Um
einen Stamm zu konstruieren, der eine Bedingung überlebt, unter welcher das
DnaA219 Protein vollständig inaktiviert ist, wird
eine Deletion des rhnA-Gens in den Stamm WM2667 durch P1-Transduktion nach
Standardverfahren eingeführt
(Miller et al. (1992), A short course in bacterial genetics: A laboratory
manual and handbook for E. coli and related bacteria (Cold Spring
Harbour Press)).
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P1-Lysat von Stamm SS198:
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Eine Übernachtkultur
von SS198 (rnh::cam) wurde 1:100 in 10 ml LB + Chloramphenicol verdünnt und bis
zu OD = 0,3 gezüchtet.
CaCl2 wurde in einer Konzentration von 10
mM zugegeben und es folgte eine Inkubation bei Zimmertemperatur
für 5 Minuten.
100 μl P1
Stammlösung
wurden hinzugesetzt und eine Inkubation bei Zimmertemperatur für 15 Minuten
folgte. Die Inkubation wurde bei 37°C unter Schütteln 4 Stunden fortgesetzt.
1 ml Chloroform wurde zugesetzt und es wurde 15 Minuten bei 37°C inkubiert.
Das Röhrchen
wurde zentrifugiert und der Überstand
wurde in ein neues Röhrchen überführt.
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Transduktion von rnh::cam zu WM2667:
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15
mM CaCl2 und 15 mM MgCl2 wurden
zugesetzt und eine Übernacht-Kultur
des Stammes WM2667 wurde bei Zimmertemperatur 15 Minuten inkubiert.
500 μl P1-Lysat
wurden zu 1 ml Übernacht-Kultur
gegeben und 15 Minuten bei 37°C
inkubiert.
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Das
Röhrchen
wurde zentrifugiert und die Kultur wurde mit LB + 50 mM Na-Citrat
gewaschen. Die Kultur wurde in 150 μl LB + 50 mM Na-Citrat resuspendiert
und 1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Sämtliche
Kulturen wurden auf LG-Platten mit geeigneten Antibiotika ausplattiert.
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Der
resultierende Stamm SF53 (dnaA219 rnh::Cam) weist kein RNase H Protein
auf. Dieser Stamm wächst
normalerweise bei 42°C, überlebt
aber nicht bei 30°C.
Im Übrigen
besitzt er den gleichen Genotyp wie WM2667.
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Stamm
SF53 überlebt
nicht bei 30°C.
Zur Untersuchung der Häufigkeit
einer Reversion der Kaltsensitivität wurde das folgende Experiment
durchgeführt.
Eine Übernacht-Kultur von SF53,
gezüchtet
bei 42°C,
wurde 1:1000 in frischem AGB1 Glucose CAA
Medium verdünnt
und die Kultivierung wurde bei 42°C
fortgesetzt, bis die OD450 einen Wert von
etwa 0,15 erreichte (d. h. etwa vier Generationen). Die Verdopplungszeit
der Kultur betrug etwa 90 Minuten. Mehrere verschiedene Verdünnungen
des Stammes wurden auf ABB1 Glucose CAA
Platten ausplattiert und die Platten wurden entweder bei 30°C oder 42°C inkubiert.
Die Kolonien wurden nach 18, 24 und 42 Stunden gezählt. Die
Platten, die bei 42°C
inkubiert wurden, zeigen etwa 107 Kolonien
pro ml ausplattierter Kultur und weisen darauf hin, dass 1 ml Kultur
von SF53 mit einer OD450 von 0,1 107 lebensfähige
Zellen aufweist. Die bei 30°C
für 18
und 24 Stunden inkubierten Platten zeigten etwa 10 Kolonien pro ml
ausplattierter Kultur. Dies bedeutet, dass eine von 106 Zellen
nicht länger
kältesensitiv
war. Die Platten, welche 42 Stunden inkubiert worden waren, zeigten
einen 5- bis 10-fachen Anstieg in der Anzahl kälteresistenter Kolonien, was
zeigte, dass eine verlängerte
Inkubationszeit eine höhere
Anzahl von Revertanten enthielt.
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Beispiel 2
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Überleben
des Stammes SF53 in Abwesenheit von DnaA-Aktivität
-
Die
folgenden Experimente wurden durchgeführt, um einen Beleg dafür zu erhalten,
dass der Stamm SF53 überlebt,
wenn ein Wirkstoff das DnaA-Protein inaktiviert hat. Ein derartiger
Beleg kann ohne einen Leitwirkstoff erhalten werden, wenn man die
N-terminale Domäne
(Domäne
I Aminosäuren
1 bis 86) von Wildtyp-DnaA produziert. Die Domäne I von DnaA spielt eine wichtige
Rolle für
die Oligomerisierung und Ausbildung eines geeigneten Initiationskomplexes.
Wenn unabhängige
Domäne
I synthetisiert wird, werden inaktive Hetero-Oligomere von DnaA
und Domäne
I gebildet und führen
zu einer Vergiftung der Initiationskomplexe. Stamm SF53 wurde mit
einem Plasmid transformiert, welches ein IPTG-induzierbares Gen enthielt, das für Biotin-markierte
Domäne
I (pBEX5BA-dnaA[1-86]-Biotin) kodiert. Die Transformanten wurden überprüft und der Stamm
wurde als SF58 bezeichnet (Tabelle 1).
Stamm | Genotyp | Referenz |
WM2667 | ArgE3,
del(lac-pro), dnaA219(Cos), galK2, his-4, lacY1, lambda-, leuB6,
mtl-1, rpsL31, supE44,
thi-1, tsx-33, xyl-5 (Derivat von AB1157) | (Weigel
et al, 1999) |
SF53 | WM2667rnh::Cam | Erfindung |
SF
58 | SF53/pBEX5BA-dnaA[1-86]-Biotin | Erfindung,
(Weigel
et al., 1999) |
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Das
Wachstum des Stamms SF58 wurde bei drei verschiedenen IPTG-Konzentrationen getestet.
Eine Übernacht-Kultur
des Stammes SF58, gezüchtet
bei 42°C,
wurde 1:1000 in frischem ABB1 Glucose CAA
Medium verdünnt
und auf fünf
Kolben verteilt.
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Die
Kulturen Nr. 1 bis 4 wurden bei 30°C und die Kultur Nr. 5 bei 42°C gezüchtet. IPTG
wurde zu den Kulturen Nr. 2, 3 und 4 in einer Konzentration von
0,25, 0,5 bzw. 1 mM zum Zeitpunkt der Verdünnung zugesetzt. Die Wachstumskurven
wurden durch Messung OD450 über 8 Stunden
aufgezeichnet. Das Experiment zeigt, dass Kultur Nr. 1, gezüchtet bei
30°C ohne
IPTG, nicht überlebte
(1). Die OD450 betrug weniger
als 0,03 zu allen Zeitpunkten. Dieses Ergebnis bestätigt, dass
der dnaλ219rnh-Stamm
30°C nicht überlebt.
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Die
Kontrollkultur (Nr. 5), gezüchtet
bei 42°C,
zeigte eine Verdopplungszeit von etwa 60 Minuten. Die drei Kulturen,
die bei 30°C
mit IPTG gezüchtet
worden waren, zeigten zunehmende Wachstumsraten mit zunehmender
IPTG-Konzentration und enthielten somit Konzentrationen an Domäne I Protein
(siehe unten). Dieses Ergebnis zeigt, dass Wachstum der Stämme bei
30°C durch
Induktion von Domäne
I wiederhergestellt wird und dass die Wachstumsrate mit zunehmenden
Mengen an Domäne
I verbessert wurde.
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Die
Konzentrationen von Domäne
I nach vier Wachstumsgenerationen in Gegenwart der drei verschiedenen
IPTG-Konzentrationen wurden durch Western-Blotting bestimmt. Eine
10-fache Differenz in der OD450 zwischen
der ohne IPTG gezüchteten
Kultur (Nr. 1) und der mit 1 mM IPTG gezüchteten Kultur (Nr. 4) wurde nach
etwa 10 Stunden beobachtet. Somit wird bei Durchführung eines
Wirkstoffscreens mit dem dnaλ219rnh-Stamm
ein positiver Befund bei einer 10-fachen Differenz in der OD450 nach etwa 10 Stunden in Gegenwart des
Wirkstoffs detektiert.
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Zur
Bestimmung der Robustheit des Screenings und zur Bestimmung, zu
welcher Zeit bei einem Hochdurchsatz-Test die Messung der OD450 optimalerweise erfolgt, wurden folgende
Messungen durchgeführt (2).
Es wurde im Wesentlichen das gleiche Experiment wie in 1 durchgeführt, wobei
jedoch die OD450 nur zu drei Zeitpunkten,
nämlich
nach 20 Stunden, 27 Stunden und 48 Stunden in zehn verschiedenen
parallelen Kulturen bestimmt wurde. Eine 20- bis 40-fache Differenz
wurde etwa nach 20 Stunden und nach 27 Stunden erhalten. Nach 48
Stunden begann sich in der nicht inkubierten Kultur ein Hintergrundsignal
zu entwickeln und die Differenz fiel auf etwa das Fünffache.
Deshalb sollten die OD450-Messungen in Hochdurchsatz-Screenings
nach 10 bis 30 Stunden Inkubation erfolgen.
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Beispiel 3
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Hochdurchsatz-Screeninq-Prozedur
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Eine Übernacht-Kultur
des Stammes SF53, gezüchtet
in einem ABB1 Glucose CAA Medium bei 42°C, wurde
1:1000 mit frischem Medium verdünnt
und auf eine geeignete Anzahl von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen
verteilt. Verschiedene Testsubstanzen, jeweils eine pro Mikrotiter-Vertiefung,
wurden mit Ausnahme von zwei Vertiefungen auf jeder Platte zugesetzt.
Diese beiden dienten als Leerwert, d. h. als Referenzkulturen ohne
Wachstum. Die Mikrotiterplatten wurden bei 30°C 20 bis 24 Stunden inkubiert,
dann wurde die OD450 gemessen. Positive
Ergebnisse wurden in Vertiefungen gefunden, die eine OD-Messung mit einem
Wert ergaben, der 10- bis 100-fach höher lag als derjenige der Leerproben.
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Beispiel 4
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Validierung des Assays
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Der
erste Teil einer Assay-Transfer- und Validierungsprozedur involviert
die Reproduktion der Ergebnisse in einem Mikrotiter-Format. Diese
Ergebnisse sind in 3 gezeigt und veranschaulichen,
dass weder SF53 noch SF58 nennenswertes Wachstum zeigen, wenn eine
Inkubation im Mikrotiter-Format bei 30°C über einen Zeitraum von bis
zu 1,5 × 105 s (etwa 42 Stunden) erfolgt. Alle 48 Replikatkulturen
der gleichen Mikrotiterplatte von 3 verhielten
sich ähnlich.
Als Nächstes
wurden die IPTG-Induktionskurven reproduziert, was in 4 gezeigt
wird. SF58 kann bereits nach 3 × 104 s (etwa 8 Stunden) einen OD405-Wert
zeigen, der signifikant höher
ist als derjenige des Kontrollansatzes. Zusätzlich lagen nach 18 Stunden
(6,4 × 104 s) die OD-Werte der induzierten Kulturen
deutlich oberhalb der Kontrollwerte. Diese Resultate bestätigen das
erwartete Verhalten der Stämme
SF53 und SF58-IPTG und weisen darauf hin, dass es ein großes Zeitfenster
gibt, innerhalb dessen ein hypothetischer DnaA-Inhibitor eindeutig
gemessen werden kann.
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Eine
Serie von Experimenten wurde anschließend durchgeführt, um
das Signal als Funktion des Start-Inoculums (d. h. der theoretischen
CD einer Kultur in einer Mikrotiter-Vertiefung) zu bestimmen. Die Daten
(nicht gezeigt) weisen darauf hin, dass es keinen signifikanten
Unterschied in der SF58-IPTG-Wachstumskurve gibt, wenn man das Inoculum durch
Verdünnung
einer Übernacht-Kultur
oder aus einer aktiv wachsenden 42°C-Kultur erhält. Folglich wurde die Messzeit
der CD auf 18 Stunden festgelegt und die Prozedur bestand darin,
5 μl SF53
oder SF58 in 30 ml Glucose CAA Medium (mit Antikörperselektion) über Nacht
bei 42°C wachsen
zu lassen, bis die OD600 1,2 betrug. Die
Stammlösung
wurde 1:100 in Glucose CAA (ohne Antikörper) verdünnt. 90 μl davon wurden in jede Vertiefung
mit 10 μl
einer Probe verteilt. Die OD620 wurde nach
einer 18-stündigen
Inkubation bei 30°C
gemessen.
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Da
es keine bekannten niedermolekularen Inhibitoren von DnaA gibt,
bestand der nächste
Schritt der Testvalidierung darin, die Test-Performance in Gegenwart
unbekannter Proben zu überprüfen. Zu
diesem Zweck wurde die Bibliothek mikrobieller Extrakte von Vicuron
Pharmaceuticals verwendet. Es sei darauf hingewiesen, dass diese
Bibliothek aus prozessierten mikrobiellen Fermentationsextrakten
besteht. Jeder Stamm wird hierzu unter definierten Bedingungen fermentiert
und die Fermentationsbrühe
wird durch Festphasen-Extraktion
prozessiert und die Zellen werden durch Lösungsmittelextraktion prozessiert.
In beiden Fällen
wird der „mikrobielle
Extrakt" auf Mikrotiterplatten
verteilt und getrocknet. Die mikrobiellen Extrakte werden in Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen bei 80 Proben je Platte gelagert. Die verbleibenden
16 Vertiefungen je Platte werden für positive und negative Kontrollen
verwendet. Jede Probe in der Bibliothek von mikrobiellen Extrakten besteht
daher aus einer Mischung unbekannter Verbindungen bei unbekannten
Konzentrationen. Die Evaluierung der Test-Performance mit einer
solch komplexen Bibliothek von Proben besitzt das Potential, jegliche mögliche Interferenz
und schlechte Test-Performance aufzuzeigen.
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Der
Test sollte die Präsenz
eines DnaA-Inhibitors über
eine Probe identifizieren, die einen OD620-Wert ergibt,
der signifikant höher
als die Kontrollwerte liegt. Ausgehend von einer theoretischen Betrachtungsweise wäre zu erwarten,
dass echt positive Ergebnisse relativ selten sind, da diese einen
derartigen Inhibitor bei einer Konzentration enthalten sollten,
die ausreicht, das Wachstum von SF53 zu ermöglichen. Zusätzlich können theoretisch
zwei Gruppen von falschpositiven Ergebnissen identifiziert werden:
eine Gruppe könnte
sich in all denjenigen Fällen
ergeben, in denen das Auftreten eines signifikanten OD620-Werts
nicht vom SF53-Wachstum abhängig
ist (d. h. eine kontaminierende Mikrobe oder eine trübe Probe
erzeugt das Signal); eine andere Gruppe könnte sich aus all denjenigen
Fällen
ergeben, bei denen eine bestimmte Vertiefung eine hohe Anzahl von Suppressorstämmen enthält. Beide
Gruppen von falschpositiven Ergebnissen können aber durch Testwiederholung
mit SF53 leicht erkannt werden. In Anbetracht der Natur der Proben
könnten
falsch-negative Ergebnisse aus all denjenigen der Proben resultieren,
in denen ein hypothetischer DnaA-Inhibitor vorliegt, zusammen mit
einem anderen Antibiotikum mit Aktivität auf SF53. Man weiß jedoch,
dass die Häufigkeit
mikrobieller Extrakte mit Aktivität gegen einen E. coli-Stamm
bei etwa 1% liegt, sodass falsch-negative Ergebnisse ziemlich selten
sein sollten.
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Der
oben beschriebenen Prozedur folgend wurde ein Screening von 4240
mikrobiellen Extrakten durchgeführt.
Jede Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen enthielt als Kontrollen
vier Vertiefungen inokuliert mit SF53, vier Vertiefungen inokuliert
mit SF58 und acht Vertiefungen inokuliert mit SF58 in Gegenwart
von 2,5 mM IPTG. 10 μl
10%iges DMSO (das Lösungsmittel,
in dem die mikrobiellen Extrakte verdünnt werden) wurde zu diesen
Kontrollvertiefungen gegeben.
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Als
Erstes wurde die Häufigkeitsverteilung
der Kontrollen, wie in 5 angegeben, untersucht. Sämtliche
negativen Kontrollen (SF53 und SF58) liefern Werte um 0,1 OD620, während
die positiven Kontrollen (SF58-IPTG) eine breite Verteilungskurve
um 1,1 OD620 zeigen. Eine breite Verteilungskurve
für positive
Kontrollen, wie in 5 gezeigt, ist nicht ideal in
einem Screeningprogramm. Ursache hierfür könnte aber die manuelle Verteilung
des Inoculums sein und sollte sich bei Automatisierung der Inokulumverteilung
verbessern. Nichtsdestotrotz besteht eine klare Trennung zwischen
negativen und positiven Kontrollen und dies sollte die eindeutige
Identifizierung positiver Proben erlauben.
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Die
Häufigkeitsverteilung
der 4240 mikrobiellen Extrakte ist in 6 gezeigt.
Man sieht, dass die meisten Proben sich im Bereich von 0,1 OD620 anhäufen.
Dies weist darauf hin, dass die meisten Proben zu keinem OD620-Wert führen, der von demjenigen der
Negativkontrollen signifikant unterschiedlich ist. Zusätzlich weist diese
Häufigkeitsverteilung
darauf hin, dass ein Grenzwert von 0,4 OD620 verwendet
werden könnte,
um echt positive Proben zu identifizieren. Diese Ausschlussgrenze
identifiziert 41 Proben (entsprechend 0,97% der getesteten Proben)
mit einem OD620-Wert höher als 0,4. Die beobachteten
Werte für
diese positiven Proben sind in 7 dargestellt.
Für diese
Resultate wurde anschließend
gezeigt, dass sie aufgrund der Präsenz einer mikrobiellen Kontamination
der als Proben verwendeten Extrakte falsch-positiv sind. Diese Kontaminationen
können
unter Verwendung mikrobiologischer Standardtechniken leicht bestimmt
werden.
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Zu
diesem Zeitpunkt kann gefolgert werden, dass:
- a)
der Test in einem 96-well-Format durchgeführt werden kann;
- b) er eine adäquate
Performance für
ein HTS-Programm zeigt und
- c) dass positive mikrobielle Extrakte durchweg falsch positiv
sind.