ES2287731T3 - Ecrutinio para nuevos inhibidores de proteinas basado en una linea celular obtenida por ingenieria genetica que contiene un gen de sobreactividad inducible y un gen compensatorio. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar la presencia de un inhibidor de una proteína diana en una muestra, que comprende las etapas de: a) poner en contacto dicha muestra con una célula, en el que dicha célula contiene (i) una mutación de sobreactividad letal inducible en un gen que afecta a la proteína diana, en donde la actividad de la proteína diana es esencial para la célula; y (ii) una mutación en un segundo gen, en donde la mutación en el segundo gen compensa funcionalmente cualquier reducción en la actividad de la proteína diana; b) inducir la mutación de sobreactividad letal; y posteriormente c) determinar la inhibición de la proteína comparando el grado de supervivencia de la célula en presencia y ausencia de dicha muestra.

Description

Escrutinio para nuevos inhibidores de proteínas basado en una línea celular obtenida por ingeniería genética que contiene un gen de sobreactividad inducible y un gen compensatorio.

La presente invención se refiere a métodos para identificar nuevos inhibidores de proteínas (preferiblemente antibióticos) por medio de un ensayo que utiliza células que contienen mutaciones que afectan dos genes separados. La primera mutación es una mutación de sobreactividad letal e inducible (o condicional), que provoca preferiblemente una sobreiniciación de la replicación del DNA. Los inhibidores de proteínas se identifican por su capacidad para inhibir la función (por ejemplo, actividad) del producto génico codificado por la mutación de sobreactividad letal, superando con ello la característica de sobreactividad letal de la célula. La segunda mutación aumenta la sensibilidad del ensayo proporcionando un mecanismo alternativo/compensatorio, por ejemplo una vía alternativa de iniciación del DNA, permitiendo con ello que sobreviva la célula si el inhibidor de la proteína es suficientemente potente para inhibir fuertemente la función (por ejemplo, la actividad) del producto génico codificado por la mutación de sobreactividad letal hasta niveles en los que no pueda sobrevivir la célula. Se proporcionan también células, particularmente bacterias, para utilizar en el ensayo.

Los inhibidores de proteínas, que pueden actuar de diferentes modos para "inhibir" una proteína (por ejemplo, inhibiendo su síntesis o su actividad), se usan ampliamente como fármacos para combatir las enfermedades. Las enfermedades pueden ser provocadas por sobreexpresión o sobreactividad de la proteína en cuestión, como en el caso de diversos cánceres en los que la sobreexpresión de ciertos oncogenes está implicada en el crecimiento de tumores malignos, por ejemplo, HER2/neu en el cáncer de mama, el oncogen ras y el oncogen myc. La sobreexpresión puede provocar sobreactividad, o la sobreactividad puede ser el resultado de la mutación. Las proteínas oncógenas son frecuentemente componentes de una vía, tal como una vía de señalización, que es importante en la regulación del crecimiento celular. Una vez que se demuestra que se requiere una proteína en el origen o progreso de un estado morboso, es deseable "señalizar como diana" dicha proteína e intentar encontrar fármacos que actúen para evitar la función de la proteína relacionada con la enfermedad.

La enfermedad puede ser también una infección, tal como una infección fúngica o bacteriana. Dichas enfermedades pueden combatirse con antibióticos, que por otra parte actúan para inhibir la función de una proteína "diana" puesto que la infección introduce nuevas proteínas en las células infectadas. Estas proteínas que no se encuentran en la célula hospedante no infectada pueden ser proteínas diana.

Las enfermedades infecciosas son una importante causa de mortalidad en todo mundo y por tanto se requieren nuevos agentes que sean útiles para actuar contra la infección. Sin embargo, el abuso de antibióticos en particular ha conducido al fenómeno de resistencia a los antibióticos en el que los antibióticos se vuelven ineficaces contra los microorganismos y por consiguiente es de crucial importancia desarrollar nuevos y mejores antibióticos. Particularmente es importante identificar antibióticos que sean químicamente distintos de los usados actualmente. Los microorganismos que presentan resistencia a cierto antibiótico es más probable que presenten resistencia a otro que esté químicamente relacionado que a uno que sea estructural y funcionalmente distinto. Por consiguiente, pueden usarse particularmente nuevos compuestos antimicrobianos que se identifican basándose en su función en lugar de en su estructura. También es de gran interés el desarrollo de antibióticos que actúan contra dianas para las que no se sabe que existan antibióticos.

Las dianas actuales para antibióticos incluyen enzimas implicadas en la síntesis de proteínas y transportadoras de membranas o componentes de la pared celular. Estas dianas se identifican actualmente de varios modos. El enorme aumento de datos disponibles de secuencias de ácidos nucleicos ha conducido a un aumento en la capacidad de atribuir una función a una proteína basándose en la comparación de los datos de las secuencias. Sin embargo la gran cantidad de datos disponibles hace esto difícil y aproximadamente 25-40% de los genes de un genoma bacteriano no tendrá correspondencia con genes conocidos homólogos (Smith D.R. (1996) Trends Biotechnology 8: 290-3). Además, el hecho de que dos genes compartan homología de secuencias no siempre significa que tendrán estructura similar.

Las dianas para fármacos, tanto para antibióticos como para fármacos contra otras enfermedades, deben tener las siguientes propiedades: deben ser necesarias para que sobreviva, se desarrolle o actúe el agente patógeno o la enfermedad; con relación a las dianas para antibióticos, o dianas anti-patógenas, es también útil que la proteína diana esté ausente o sea distinta en los seres humanos, o en el mamífero que se va a tratar; y que sea preferiblemente alto el grado de conservación de la estructura de la diana para el fármaco entre las especies que se están combatiendo. Hasta la fecha, no ha sido identificado ningún fármaco que se dirija a la maquinaria de replicación del DNA.

Una vez que ha sido identificada una proteína diana, es necesario identificar los compuestos que pueden actuar para inhibir o impedir su función, tanto en un estado morboso como en el agente patógeno. El proceso de escrutinio de compuestos inhibidores, que anteriormente era laborioso y requería mucho tiempo ha sido mejorado por medio de tecnologías que permiten escrutinios con buenos resultados en los que pueden ensayarse simultáneamente o en paralelo cientos o incluso miles de compuestos.

En general, dichos escrutinios para la identificación de antibióticos u otros inhibidores de proteínas son escrutinios "negativos". En estos escrutinios, se identifica un inhibidor de una proteína por aplicación de una sustancia de ensayo a una población de células, si la población de células presenta una reducción de la viabilidad. Esto es debido a que una de las propiedades antes citadas de la diana es ser esencial para continuar el desarrollo y proliferación del agente patógeno en cuestión. La interferencia de esta función esencial afecta la viabilidad de la célula.

Por tanto, la mayoría de las técnicas de escrutinio dependen de un resultado negativo resultante de la anulación de la función de la diana, tal como la muerte o reducción del crecimiento o desarrollo de las células que la contienen o requieren. Este método adolece de varias desventajas. Deben realizarse diversos ensayos diferentes, secuencialmente o en paralelo, para garantizar que el efecto observado sobre la viabilidad de la célula es específico de la proteína diana. El hecho de que se observe el efecto, por ejemplo, sólo la muerte de la célula, no es suficiente para confirmar que dicho efecto es provocado por una acción sobre la proteína diana. La sustancia problema puede haber afectado a una proteína diana diferente o el efecto puede ser un hecho general que no esté en absoluto relacionado con la proteína diana específica. Por tanto, dichos escrutinios negativos requieren mucho tiempo y no es posible obtener resultados sin realizar múltiples ensayos.

Sería ventajoso encontrar un ensayo o escrutinio de inhibidores de proteínas que dependiera de un resultado positivo, tal como un aumento del crecimiento de la célula o la supervivencia de la célula mutante que no puede desarrollarse de otro modo. Dichos escrutinios positivos son ventajosos puesto que evitan muchos de los problemas asociados a los escrutinios negativos, tales como altos niveles de muerte celular o falta de desarrollo que no pueden ser atribuibles a la acción específica de un inhibidor potencial, sino que pueden ser debidos a otras razones. Ninguno de dichos escrutinios positivos son actualmente conocidos en la técnica. La presente invención proporciona ahora dicho ensayo.

Los mutantes de sobreactividad letal son mutantes que contienen mutaciones tales que la actividad de un producto génico particular producido o expresado es mayor, en comparación con el organismo natural o el producto génico "no mutado" (es decir, el producto génico antes de la introducción de la mutación de sobreactividad letal - no se excluye que el producto génico pueda llevar otras mutaciones no relacionadas con la sobreactividad letal). Esto puede ser debido a diferencias en la actividad del producto génico propiamente dicho, en sus niveles de expresión o producción, o en la regulación de su actividad (por ejemplo, debido a un aumento o disminución en la expresión y/o actividad de una molécula reguladora). Por tanto un mutante de sobreactividad letal puede ser considerado como un mutante en el que se aumenta la "funcionalidad" del producto génico considerado. El aumento de la actividad (o "funcionalidad") de este producto génico es perjudicial para la supervivencia y/o desarrollo de la célula mutante. El producto génico puede ser por tanto cualquier producto que sea letal, o que tenga un efecto negativo significativo sobre el desarrollo y/o la supervivencia del organismo, cuando su actividad supera ciertos niveles (por ejemplo, niveles "normales" por ejemplo antes de la mutación, o niveles originales o naturales) por ejemplo, cuando es "sobre-activo". Dicha sobre-actividad puede conseguirse, como se ha mencionado antes, de varios modos, incluyendo un aumento de la cantidad o contenido, o de los niveles del producto génico, por ejemplo, debido a un aumento de la expresión o una interrupción reducida o por aumento o prolongación de la actividad. Dichos mutantes son por consiguiente útiles en escrutinios positivos. Sin embargo, dichas mutaciones son raras en la naturaleza y pueden ser difíciles de generar.

La DnaA es una proteína eubacteriana que inicia la replicación cromosómica en las bacterias (Kornberg and Baker 1992, DNA replication, W.H. Freeman). Es en esta etapa en la que se regula el ciclo de replicación cromosómica. La replicación de DNA depende también de la presencia de una única secuencia cromosómica, el origen de replicación OriC. Se requieren tanto OriC como DnaA para la iniciación satisfactoria de la replicación, y estos dos componentes forman un complejo de nucleoproteínas. En el complejo OriC-DnaA están presentes aproximadamente 20-40 monómeros de la proteína DnaA. La DnaA unida a ATP hace que la doble cadena de DNA comience a desenrollarse, dejando así que la helicasa DnaB amplíe el desarrollamiento antes de la síntesis de las cadenas complementarias por la holoenzima DNA-polimerasa III (Skarstad and Boye, Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1217, 111-130, revisado por Katayama et al., Molecular Microbiology, 2001, 41(1), 9-17).

La iniciación de la replicación de DNA en procariotas y eucariotas está muy regulada por varios mecanismos, debido a su importancia en el ciclo celular. Episodios de iniciación excesivos conducen finalmente a la muerte celular.

Un ejemplo de una mutación que provoca la iniciación hiperactiva es DnaAcos, que es una mutación identificada en E. coli (Kellenberger-Gujer et al., Molec. Gen. Genet. 162, 9-16, 1978; y Katayama et al. (1994), Journal of Biological Chemistry, 269(17), 12698-12703). Este mutante se aisló como un supresor resistente a la temperatura a partir de un mutante DnaAts46 sensible a la temperatura. El DnaAts46 es un mutante en E. coli bien caracterizado que expresa una proteína DnaA que es inactiva a temperaturas elevadas (42ºC), dando como resultado una cepa mutante que no es capaz de iniciar la replicación a temperaturas elevadas (Kohiyama, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 33, 312-324 (1968); Hirota et al., J. Molec. Biol. 53, 369-387 (1970).

Se sabe que el mutante DnaAcos tiene las siguientes propiedades. En primer lugar, su desarrollo es sensible al frío; se desarrolla normalmente a 42ºC, sin embargo la replicación del DNA cromosómico se sobre-inicia inmediatamente una vez que las células se dejan crecer a la temperatura restringida de 30ºC. DnaAcos ha sido identificado como un mutante supresor de dnaAts46, es decir suprime el fenotipo dnaAts46 y representa un mutante supresor intragénico. Las mutaciones supresoras (Q156L y Y271H) resultan de sustituciones de bases en el gen de dnaA (Hansen. et al., 1992, Mol. Gen. Gent., 234, 15-21, Skarstad and Boye, 1994, Biochim Biophys Acta, 1217, 111-130, Kellenbergen-Gujer et al., 1978, Mol. Gen. Genet., 162, 9-16).

La sensibilidad al frío de dnaAcos es dominante con relación al alelo de dnaA natural y la sobre-iniciación observada a la temperatura restringida es independiente de la síntesis de la proteína de novo. Curiosamente, no aumenta la cantidad de proteína DnaA en este mutante y se cree que el fenotipo del mutante depende del aumento y/o prolongación de la actividad de DnaA. Puesto que la iniciación con el mutante tiene lugar repetidamente se ha sugerido que de alguna manera la competencia de iniciación de la proteína DnaAcos mutante es mantenida, por ejemplo, por un cambio conformacional.

El mecanismo de sobre-iniciación en el mutante no se entiende completamente, aunque la proteína DnaAcos haya sido purificada y caracterizada in vitro (Ratayama et al., 1995, Mol. Microbiol., 18, 813-820). Mantiene la afinidad a una secuencia de unión a la DnaA y actúa en la carga de la helicasa DnaB sobre el DNA monocatenario. La proteína DnaA natural purificada se une a ATP y a ADP. Sin embargo, la proteína DnaAcos no es capaz de unirse a un nucleótido. La ATP-DnaA natural es activa en la iniciación de la replicación mientras que la ADP-DnaA natural es inactiva (Sekimizu et al., 1987, Cell, 50, 259-265). La hidrólisis de la ATP-DnaA natural dando ADP-DnaA, inactiva la DnaA para regular su función y esto sucede tan pronto como las horquillas de replicación están actuando para evitar la reiniciación de un origen ya iniciado (Boye et al., 2000, EMBO Rep. 1, 479-483). Parece que la proteína DnaAcos es una forma "no regulada" de la proteína DnaA que está siempre "conectada" y por consiguiente provoca la replicación en exceso del DNA a temperaturas inferiores (30ºC). A mayores temperaturas (42ºC) la proteína es en apariencia parcialmente inactiva, lo que explica que se reduzca la sobre-iniciación en comparación con la que tiene lugar a la temperatura restringida y por consiguiente las células sobreviven.

Han sido, o pueden ser, desarrollados otros mutantes de DnaA que sean similares a DnaAcos, o tengan sus propiedades, (por ejemplo, que presenten una replicación sensible a la temperatura) por ejemplo, sobre-inhibición de la replicación a temperaturas inferiores (por ejemplo, 30ºC). Uno de dichos mutantes es DnaA219 usado en los ejemplos de la presente memoria.

La DnaA y formas homólogas de esta proteína en otros procariotas o en eucariotas o arqueas, representa un ejemplo de una diana para un inhibidor de proteínas, puesto que es una proteína esencial para E. coli y también se conserva muy bien entre diferentes especies de bacterias. Otras proteínas iniciadoras de la replicación del DNA (tanto eucariotas, procariotas como arqueas) pueden representar también dianas inhibidoras de proteínas.

Comparando 104 secuencias de 96 especies, se demostró que la DnaA posee una secuencia primaria altamente conservada y la disposición global de 15 hélices \alpha y 9 cadenas \beta observadas constituye más del 93% de las secuencias (Weigel and Messer 2002, www.molgen.mpg.de/messer). Además, las proteínas iniciadoras Cdc6 y Orc de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, presentan una gran similitud estructural con la DnaA y por consiguiente representan una proteína diana eucariota (Erzberger et al. (2002) EMBO J 21: 4763-73, Liu et al., (2000) Mol. Cell. 6: 637-48).

Los mutantes de sobreactividad de las proteínas dianas, por ejemplo, los mutantes de DnaA que sobre-inician la replicación del DNA, pueden usarse para analizar el potencial de los nuevos inhibidores de proteínas; cualquier inhibidor de proteínas que interfiera la función de la proteína diana (por ejemplo, DnaA) reducirá la cantidad de sobre-iniciación y por ello aumentará el crecimiento de la población de células mutantes en comparación con su crecimiento en ausencia de dicho inhibidor de proteínas. Sin embargo, dicho ensayo sólo permitiría la detección de débiles inhibidores de proteínas, es decir, los que sólo reducen la actividad de DnaA, hasta niveles normales o casi normales (es decir, hasta niveles comparables con la actividad del DnaA natural o con la actividad de la proteína DnaA antes de la introducción de la mutación de sobreactividad ("cos") (es decir, la proteína "fuente" u "origen" o "parental" en la que se introduce la mutación de sobreactividad letal)), de tal forma que haya suficiente actividad de DnaA para que sobrevivan las células, pero que la actividad de DnaA no sea demasiado alta para provocar una sobre-iniciación, que conduzca a la muerte de las células. Puede observarse que dicho escrutinio no permitiría distinguir entre la presencia en la muestra de un inhibidor fuerte de proteínas que redujera intensamente la proteína diana, por ejemplo los niveles de DnaA, y provocara la muerte de las células debido a la falta de iniciación de replicación del DNA, y la ausencia en la muestra de cualquier inhibidor, que causa la muerte de las células debido a una sobre-iniciación. Una situación análoga puede darse para otras proteínas dianas y sus mutantes de sobreactividad letales.

Como se usa en la presente memoria "mutación" se refiere a los cambios en la secuencia de nucleótidos y "mutante" se refiere al gen o producto génico o célula que contiene dicha mutación.

De este modo, incluso cuando se identifica una mutación que facilita el uso de un escrutinio "positivo", es decir un escrutinio en el que la presencia de un inhibidor de proteínas está indicada por un aumento en la viabilidad de la célula, en lugar de una disminución, puede observarse que dichos escrutinios no son siempre adecuados para identificar inhibidores de proteínas en un intervalo completo de potencia. La rareza relativa de mutantes de sobreactividad letal que provocan la muerte celular en virtud del aumento de su actividad, tal como DnaAcos (o mutaciones de sobre-actividad análogas en otras proteínas iniciadoras de la replicación del DNA), en combinación con este hecho, significa que no eran inmediatamente evidentes ni directos, como para idear un escrutinio positivo eficaz para inhibidores de proteínas.

Para aumentar la eficacia de este tipo de escrutinio y por consiguiente la gama de inhibidores que pueden ser identificados, los autores de la presente invención han identificado un mecanismo en el que el uso de una segunda mutación en la célula que contiene la primera mutación (es decir, sobreactividad letal) compensa cualquier reducción importante de la actividad de la proteína diana con mutación de sobreactividad letal que pueda ser causada por la presencia de un fuerte inhibidor de la proteína en una muestra de ensayo. Esta segunda mutación no afecta al desarrollo normal de la célula ni a la sobreactividad letal de la primera mutación, sin embargo su presencia compensa cualquier fuerte reducción de la actividad de la proteína diana provocada por la presencia de un fuerte inhibidor de la proteína en la muestra de ensayo. La segunda mutación salva así, o protege, la cepa de ensayo de una intensa o total reducción de la actividad en la proteína diana. De este modo, los autores de la presente invención han podido conseguir una valoración o escrutinio positivo fiable y eficaz para un inhibidor de proteínas.

El gen rnh de E. coli codifica RNasaH. Esta enzima actúa para escindir y por tanto degradar el RNA en los híbridos DNA:RNA. Así, una célula que contiene una inactivación funcional de rnh por medio, por ejemplo, de mutación o supresión del gen contendrá híbridos RNA:DNA persistentes y la presencia de dichos híbridos permite que tenga lugar la iniciación de la replicación independientemente de la DnaA, e independientemente del origen cromosómico OriC. Tiene lugar por tanto la iniciación de la replicación a partir de estos híbridos RNA:DNA, que no persisten en las células que contienen una enzima RNasaH funcional. De este modo, la iniciación de la replicación no requiere OriC ni DnaA, y transcurre en ausencia de un sistema de iniciación natural totalmente activo. Por ejemplo, se sabe que los mutantes rnh parcialmente funcionales permiten el desarrollo de mutantes que son incapaces de utilizar OriC, (Taya and Crouch, 1991, Mol. Gen. Genet., 227: 433-437; Kogoma and von Meyenburg, 1983, EMBO J. 2: 463-8).

La combinación de dos mutaciones, DnaAcos y una supresión en rnh en E. coli (o en otros organismos) no ha sido conseguida anteriormente.

Para que se propaguen células (por ejemplo, una población de células) que contienen estas dos mutaciones, el mutante de sobreactividad letal debe ser "inducible", es decir capaz de ser "conectado" o "encendido" o expresado sólo en condiciones particulares, de tal forma que pueda controlarse su expresión u observarse el fenotipo sólo cuando está en estado inducido. Las células se cultivan (por ejemplo, la población de células se expande y mantiene en cultivo) en condiciones en las que no se induzca la sobreactividad letal. El ensayo se efectúa entonces en condiciones en las que se induce la sobreactividad letal. Esto puede requerir, por ejemplo, que el gen mutado se coloque bajo el control de un promotor inducible o la mutación puede ser una mutación sensible a la temperatura o al frío, tal como DnaAcos, u otra mutación condicional.

A los métodos de la técnica anterior les falta describir escrutinios positivos para inhibidores de proteínas y antibióticos, y que permitan la detección de una gama completa de inhibidores.

Por tanto en un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un inhibidor de proteínas de una proteína diana, preferiblemente un inhibidor específico de una proteína (por ejemplo, identificar la presencia de un inhibidor de una proteína en una muestra de ensayo) comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto dicho inhibidor (o muestra de ensayo que contiene dicho inhibidor) con una célula (por ejemplo, una población de células), en el que dicha célula (por ejemplo, una población de células) contiene una mutación de sobreactividad letal inducible en un gen que afecta (por ejemplo, el gen que codifica) a la proteína diana (el "primer gen") y una mutación en un segundo gen, en el que la actividad de la proteína diana es esencial para la célula, y la mutación en el segundo gen compensa funcionalmente cualquier reducción en la actividad del primer producto génico (por ejemplo, la proteína diana);

b) inducir la mutación de sobreactividad letal; y posteriormente

c) determinar la inhibición de la proteína comparando el grado de supervivencia de la célula (por ejemplo, una población de células) en presencia y ausencia de dicho inhibidor (o muestra de ensayo).

Por tanto puede observarse que el método de la invención proporciona un ensayo para inhibidores de proteínas, por ejemplo nuevos inhibidores de proteínas, de una proteína diana deseada. El método puede usarse por tanto para escrutar (o como un escrutinio) nuevos inhibidores de proteínas (incluyendo tanto entidades como compuestos nuevos, o para identificar, o escrutar, una nueva actividad de los inhibidores de proteínas de entidades o compuestos existentes o conocidos).

Por "inhibidor de proteínas" se entiende cualquier entidad o compuesto capaz de evitar o reducir la función normal de la proteína diana, e incluye todas las entidades o sustancias capaces de disminuir directa o indirectamente la función de la proteína. Esto puede conseguirse afectando la transcripción, traducción, modificación posterior a la traducción, actividad o regulación de la actividad de la proteína. Preferiblemente se ve afectada la actividad de la proteína, y más particularmente, la proteína diana es una proteína funcional que presenta una actividad particular (por ejemplo, que media su función). Por tanto, la proteína diana puede ser una enzima o una proteína de unión y la inhibición puede conseguirse inhibiendo la actividad enzimática o de unión de la proteína diana. Esto puede conseguirse directamente interactuando y/o interfiriendo con el sitio activo de la enzima o el sitio de unión de la proteína de unión, u otro sitio en la proteína, interfiriendo o evitando el plegamiento correcto de la proteína de tal forma que no pueda actuar, por ejemplo, no pueda reconocer su sustrato o su pareja de unión o no se configuren correctamente los residuos de aminoácidos claves implicados en las reacciones químicas o de unión. Una "proteína de unión" puede ser cualquier proteína capaz de unirse a una molécula o sustancia en una célula (es decir, cualquier entidad celular). Preferiblemente, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a dicha entidad celular. La proteína de unión puede ejercer un efecto funcional bien por medio de la unión (por ejemplo, un efecto funcional mediado por la unión) o bien puede unirse a una entidad funcional (es decir, una entidad que realiza una función en una célula). Análogamente, la proteína diana puede ser cualquier clase de proteína efectora, que tenga un efecto funcional en la célula, por ejemplo, interactuando con otra componente en la célula y el inhibidor de la proteína puede inhibir el efecto funcional de dicha proteína.

La inhibición puede dar como resultado menos de 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% o 1% de la actividad normal. Preferiblemente la actividad es suprimida completamente y no permanece actividad proteínica residual.

La "proteína diana" puede ser cualquier proteína que sea esencial para la célula. Más particularmente, la proteína diana puede ser cualquier proteína que sea esencial para el crecimiento y/o supervivencia de la célula. De este modo puede ser una proteína asociada a un proceso celular vital, por ejemplo, un proceso celular esencial para el crecimiento y/supervivencia de la célula. Se entenderá a este respecto que dicha proteína sería esencial para este proceso. Por ejemplo, la proteína diana puede ser una proteína asociada o implicada en un proceso o reacción de biosíntesis, por ejemplo, la síntesis de un producto celular o molécula o compuesto intermedio biológico, incluyendo por ejemplo la síntesis de ácidos nucleicos (incluyendo todas las formas de DNA y RNA que puedan existir en las células) y proteínas, así como otras moléculas que pueden existir en las células. Una proteína diana puede por tanto estar implicada en la replicación de DNA (síntesis de DNA), síntesis de RNA (por ejemplo, la transcripción de DNA en mRNA), traducción de mRNA y síntesis de proteínas, así como en otras reacciones o procesos celulares o biológicos. La proteína diana puede ser una proteína asociada a la iniciación de cualquier proceso o reacción celular, por ejemplo una proteína iniciadora de la replicación de DNA o de la síntesis de proteínas. Se prefieren las proteínas iniciadoras de la replicación de DNA, particularmente proteínas iniciadoras de la replicación de DNA en procariotas, particularmente bacterias y especialmente en E. coli.

En tal caso, la mutación de sobreactividad letal en el primer gen da así como resultado un aumento de la replicación de DNA y en particular un aumento de la replicación de DNA a nivel letal. La segunda mutación compensa la reducción o pérdida de actividad de replicación de DNA (debido a la inhibición por el inhibidor de la proteína en ensayo proporcionando una vía o mecanismo alternativo para la replicación de DNA (es decir la segunda mutación da como resultado un aumento en la replicación de DNA o la replicación de DNA que no tendría lugar en ausencia de la segunda mutación).

La inhibición no se mide directamente, sino que se mide funcionalmente, ya que libera la célula mutante del ensayo debido el efecto de la mutación de sobreactividad letal sobre su supervivencia y/o crecimiento. La inhibición de la proteína diana puede medirse por consiguiente evaluando (por ejemplo, midiendo) los números de la población celular. Un resultado positivo, es decir la presencia de un inhibidor de una proteína está indicado por un aumento medible o detectable del crecimiento o desarrollo celular, por ejemplo un aumento estadísticamente significativo del crecimiento celular, por ejemplo al menos un aumento de diez, veinte, treinta, cincuenta o cien veces del crecimiento celular, por ejemplo medido por medios apropiados, por ejemplo espectrofotométricamente determinando un aumento de la absorbancia del cultivo celular (por ejemplo, el medio de crecimiento) o el aumento de la densidad óptica, por ejemplo DO_{450} u otros ensayos espectrofotométricos o colorimétricos de proteínas u otros componentes celulares. El crecimiento puede ser detectado por cualquier medio conveniente o deseado. De este modo, por medio de otro ejemplo, las colonias celulares (por ejemplo, bacterianas) pueden contarse o enumerase de otra forma.

Por inhibidor "específico" de una proteína se entiende que el inhibidor actúa sólo, o preferible o selectivamente sobre la proteína o clase de proteínas afectadas por la mutación de sobreactividad letal y no afecta a la función de otras proteínas o clases de proteínas estructural o funcionalmente no relacionadas. Por tanto el término "específico" puede entenderse que se refiere a la especie de la que procede la proteína diana o a la clase de proteínas. Un inhibidor específico es por consiguiente capaz de distinguir entre diferentes proteínas y sólo será detectado en el ensayo si es inhibida la función de la proteína afectada por la mutación de sobreactividad letal. El inhibidor específico de una proteína reducirá preferiblemente la actividad o la función de la proteína.

El inhibidor de la proteína puede ser otra proteína, o un péptido, una molécula pequeña por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, anticuerpo, ribozima, RNA o DNA antisentido, o un análogo del sustrato, etc. El inhibidor de una proteína puede ser por tanto cualquier entidad química. Preferiblemente, el inhibidor de una proteína es un antibiótico. El antibiótico puede obtenerse de forma natural o sintética y puede ser un derivado o variante sintetizado químicamente de un antibiótico obtenido de forma natural.

"Poner en contacto" como se usa en la presente memoria se refiere a proporcionar un contacto adecuado entre el inhibidor (o muestra de ensayo) y la célula (por ejemplo, población de células) de modo que permita que el inhibidor (o componentes de la muestra de ensayo) entre en las células (por ejemplo, atraviese la membrana celular y/o la pared celular) e interaccione y/o interfiera directamente o indirectamente con la proteína diana. Por tanto, la muestra de inhibidor/ensayo puede ser simplemente puesta en contacto con la(s) célula(s) por ejemplo añadiéndola a las células o a un medio que contiene la(s) célula(s), por ejemplo, un medio de cultivo o cultivo de las células. Convenientemente, las células pueden desarrollarse (o cultivarse o mantenerse) en un medio líquido en el que se introduce o añade la muestra de inhibidor/ensayo. Alternativamente, las células pueden estar dispuestas en o sobre un medio sólido (por ejemplo, una cápsula o recipiente o placa de cultivo) en el que se introduce o añade la muestra de inhibidor/ensayo.

La "muestra de ensayo" aplicada a la célula puede ser cualquier muestra, por ejemplo cualquier muestra que consista o contenga la sustancia inhibidora de ensayo (es decir, el inhibidor de la proteína que ha de ensayarse), por ejemplo, una muestra pura, o puede representar una mezcla de muestras puras o una quimioteca, por ejemplo preparada por química combinatoria. La muestra puede estar constituida por componentes conocidos y/o no caracterizados. Si se encuentra que una muestra que comprende compuestos no caracterizados contiene un inhibidor de proteína, la muestra puede fraccionarse usando técnicas estándar conocidas, tal como cromatografía (por ejemplo, HPLC, cromatografía en capa fina, FPLC, filtración por gel, desalinización, etc.) y las fracciones o aislados resultantes pueden servir como muestras de ensayo en el análisis. De este modo es posible seleccionar grandes mezclas de muestras con relativamente pocos ensayos, y además seleccionar muestras que contienen componentes nuevos o no caracterizados sin purificar primero los componentes. También es posible administrar al ensayo muestras puras. Por tanto la muestra de ensayo puede ser cualquier muestra de material puro o impuro, proporcionado de cualquier modo conveniente, por ejemplo, puede ser una sustancia de ensayo propiamente dicha o puede ser una composición que contenga un sustancia de ensayo (pudiendo ser dicha sustancia de ensayo propiamente dicha pura o impura) y un soporte o diluyente, por ejemplo un medio apropiado. Puede ser una preparación en bruto o una preparación purificada o parcialmente
purificada.

La muestra de ensayo puede comprender componentes naturales o sintéticos. Los componentes naturales pueden ser segregados, por ejemplo, por microorganismos tales como bacterias u hongos, y proporcionar una gran diversidad de productos químicos. La sustancia de ensayo puede ser así cualquier sustancia que pueda entrar en la célula. Por tanto puede tener cualquier naturaleza química incluyendo tanto moléculas complejas como sencillas, por ejemplo moléculas orgánicas o inorgánicas.

Si la sustancia de ensayo entra ineficazmente en las células o es sacada de la célula por bombas de evacuación, las células de ensayo pueden modificarse para compensar esta situación. Pueden generarse y usarse cepas permeables o los genes conocidos de bombas de evacuación pueden mutarse y/o delecionarse o inactivarse funcionalmente. Esto se realiza usando técnicas estándar.

La muestra de ensayo puede aplicarse a diferentes partes alícuotas de las células en paralelo o en serie a diferentes concentraciones. Sin embargo, preferiblemente sólo se requiere una única concentración por muestra de ensayo para establecer si está presente un inhibidor de una proteína, debido a la sensibilidad del escrutinio.

La(s) célula(s) usada(s) en la valoración será preferiblemente una población de células, especialmente de preferencia una población derivada por clonación, cuyas células individuales son genéticamente idénticas. La(s) célula(s) contendrán los dos genes mutados (es decir, el primer gen mutado que lleva la mutación de sobreactividad letal y el segundo gen mutado "de compensación"). Las mutaciones pueden introducirse en los genes o pueden introducirse en los genes mutados, de cualquier modo conveniente o deseado. Las células pueden haber sido transfectadas o transformadas o transducidas con los gentes mutados, o los genes pueden haber sido introducidos usando otras técnicas estándares de biología molecular conocidas por los expertos. Alternativamente las mutaciones pueden haber sido generadas usando mutagénesis estándar (que puede ser dirigida o no dirigida, por ejemplo, aleatoriamente) y técnicas de escrutinio, por ejemplo por identificación de genes reversibles, supresores o mutantes. Por ejemplo, supresores sensibles al frío de dnaA(ts), tal como DnaACos pueden ser identificados por procesos de escrutinio. Por ejemplo podría usarse como punto de partida una célula mutante sensible a la temperatura, que contenga una mutación en una proteína, tal que la proteína no pueda actuar normalmente a la temperatura superior (restringida). Los supresores pueden generarse por procesos normales o mutagénesis usando técnicas estándares. Si dichos mutantes son, por ejemplo sensibles al frío, esta propiedad puede de hecho resultar de la sobreactividad de la proteína, en lugar de la inactividad. De este modo, es posible identificar mutantes con sobreactividad letal.

Las células pueden ser cualquier célula, por ejemplo, células procariotas o eucariotas, incluyendo células eubacterianas y arqueas, así como células de plantas, hongos o animales, por ejemplo, células de bacterias, mamíferos o levadura (por ejemplo, Saccharomyces sp., por ejemplo, S. cerevisiae o S. pombe). Preferiblemente, las células son bacterianas, más preferiblemente las células son de E. coli.

En una realización más preferida, las células (preferiblemente células bacterianas) contienen una mutación de sobreactividad letal en DnaA y una mutación que inactiva la RNasaH (por ejemplo, una deleción de rnh). Un mutante particularmente preferido, DnaA219/rnh, se describe en los Ejemplos y se identifica como cepa SF53 depositada en the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Porton Down, UK, el 6 de mayo de 2003 con el número de registro 03050701. El depósito se realizó a nombre de The Norwegian Radium Hospital Research Foundation, de P.O. Box 56, Montebello, 0310 Oslo, Noruega.

En otro ejemplo representativo, la mutación de sobreactividad letal está en el gen Cdc6 o en un gen Orc. Cdc6 y Orc son genes que codifican proteínas iniciadoras de la replicación en eucariotas.

El término "mutación" como se usa en la presente memoria se refiere a uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos de un gen. El cambio puede representar la adición, deleción o sustitución de nucleótidos en las regiones codificadoras o no codificadoras del gen y puede afectar a la función del producto génico, por ejemplo la proteína codificada por dicho gen o puede afectar el control de expresión de dicho gen. Por ejemplo la mutación puede provocar una sobreexpresión, es decir un aumento en los niveles de expresión en comparación con un gen (por ejemplo, un gen natural) que no tenga esta mutación. Alternativamente, la mutación puede conducir a cambios en la estructura primaria, secundaria o terciaria del producto proteínico. Dichos cambios pueden afectar a la función de la proteína en comparación con la forma no mutada (por ejemplo, natural) de la proteína. Los cambios en la función pueden estar relacionados con el aumento de la actividad provocado, por ejemplo, por la unión alterada de sustratos o cofactores, y mecanismos alterados de la regulación o localización.

Por "mutación de sobreactividad letal" se entiende que el cambio o mutación genética como se ha definido antes provoca un aumento en la actividad de la proteína diana, en comparación con la forma no mutada de la proteína, es decir la forma de la proteína tal como se produce antes de o sin la mutación de sobreactividad letal (por ejemplo, codificada por el gen natural) y este aumento en la actividad disminuye la viabilidad de las células que contienen la mutación.

La mutación de sobreactividad letal puede estar en cualquier gen que afecte a la proteína diana, aunque generalmente estará en el gen que codifica la proteína diana. Además de los genes que codifican una proteína diana, un gen que afecta la proteína diana puede incluir cualquier gen que codifica un producto génico que tiene un efecto sobre la actividad de la proteína diana, por ejemplo, una molécula reguladora.

El aumento de la actividad de la proteína puede resultar de un aumento de la expresión de la proteína, o de un cambio estructural o funcional de la proteína (o su regulación), y puede hacer que disminuya la velocidad de crecimiento de las células que contienen la mutación o puede provocar la muerte de las células. La mutación puede afectar la actividad de cualquier proteína de la célula, por ejemplo, una enzima o una proteína estructural, una proteína receptora o señalizadora o en realidad cualquier otra proteína funcional o efectora siempre que la sobreactividad de esta proteína disminuya el crecimiento y/o viabilidad de la célula. El fenotipo detectable de una célula que contiene dicha mutación de sobreactividad letal (es decir, un mutante con sobreactividad letal) es por tanto una reducción en la capacidad para crecer, dividirse y/o sobrevivir.

Como se ha descrito antes, la mutación de sobreactividad letal está preferiblemente en un gen implicado en la replicación del DNA, más preferiblemente en un gen implicado en la iniciación de la replicación de DNA, más preferiblemente un gen implicado en la iniciación de la replicación de DNA, procariota y especialmente bacteriano, por ejemplo del gen dnaA. Las mutaciones en el gen dnaA incluyen dnaAcos e incluyen la mutación dnaA219 del DnaA de la proteína de iniciación de E. coli, como se describe en la presente memoria en el Ejemplo 1 siguiente.

La proteína diana preferida es por consiguiente un iniciador de la replicación de DNA. Puede usarse cualquier iniciador de la replicación de DNA, incluyendo tanto fuentes procariotas (incluida arqueas) como eucariotas. Por iniciador de la replicación de DNA se entiende una proteína que se une al origen de replicación, haciendo así que comience el proceso de replicación, es decir la proteína es responsable de la etapa primera o inicial del proceso de replicación de DNA. Las proteínas iniciadoras de la replicación eucariota incluyen proteínas Cdc (por ejemplo, Cdc6, Cdc18 y Cdc45), proteínas Cdt (por ejemplo, Cdt1), proteínas Orc (por ejemplo, Orc1) y proteínas MCM (Liu et al., 2000, Mol. Cell 6: 637).

También pueden usarse homólogas y ortólogas de dichas proteínas (por ejemplo, en otras especies).

En eucariotas la replicación comienza con un complejo del reconocimiento del origen (abreviadamente ORC, por la expresión inglesa Origin Recognition Complex) de seis subunidades unido al origen, en el que están incluidos Cdc6, las MCM y Cdc45. Las arqueas contienen ortólogas de diversas proteínas de replicación eucariotas, incluyendo Cdc6 y las MCM. Se sabe que la replicación de las arqueas actúa análogamente a las eucariotas, pero con menos complejidad. Las arqueas no contienen homólogas evidentes de Orc, sino que Orc1 tiene homología con Cdc6, de modo que se sabe que en las arqueas la proteína "Cdc6/Orc" (es decir, la homóloga a Cdc6) puede realizar ambas funciones. La Cdc6/Orc de una especie arquea y la DnaA han sido cristalizadas recientemente y se demostró que eran proteínas estructuralmente similares.

Aunque se prefieren iniciadores de la replicación de DNA como proteínas dianas, como se ha mencionado antes puede usarse cualquier proteína iniciadora, es decir cualquier proteína implicada en la iniciación de cualquier proceso celular, por ejemplo la trascripción o traducción en el proceso de síntesis de proteínas.

Pueden generarse y/o identificarse versiones mutantes de dichas proteínas que presentan sobreactividad letal usando procedimientos típicos, como se ha descrito antes. En el caso de ciertas proteínas, ya se conocen mutantes apropiados que pueden usarse y han sido descritos en la bibliografía. Incluyen mutantes de DnaA (por ejemplo, DnaAcos y DnaA219 antes mencionados) y de proteínas Cdc, por ejemplo Cdc6 en levadura. Por tanto, por ejemplo, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, los mutantes de cdc6 (cdc6-3 y cdc6-2) se siguen sobrerreplicando a la temperatura permitida y mueren a la temperatura no permitida (Liang and Stillman, 1997, Genes Dev. 11:3375). En la levadura Schizosaccharomyces pombe, Cdc6 se denomina Cdc18. Las células que tienen sobreactividad de Cdc18, se sobrerreplican (Nishitani and Nurse, 1995, Cell 83: 397; Muzi-Falconi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1566).

El término "inducible" como se usa en la presente memoria se refiere a la capacidad de actuar o no del fenotipo mutante de la célula que contiene el mutante de sobreactividad letal. Se presentan por consiguiente dos estados - el estado no inducido en el que la célula es capaz de crecer y dividirse normalmente y el estado inducido en el que esta capacidad está puesta en peligro por la actuación de la mutación. Esta "inductibilidad" puede ser activada de varios modos. Como ejemplo, para un mutante de sobreactividad letal dominante, que es introducido en la célula además de la existencia de un gen natural, y que tiene un efecto dominante sobre el gen natural, en el que se observa el fenotipo mutante a pesar de la presencia del gen natural, el gen mutante puede estar situado bajo el control de un promotor inducible. Similarmente, tanto si es dominante como si no lo es, cuando sólo está presente (o es activa) la versión de mutante de sobreactividad letal del gen en la célula (por ejemplo, cuando está ausente un gen "normal" o natural o ha sido inactivado, por ejemplo desactivado), puede usarse un promotor inducible. Este promotor requiere la presencia de cierto componente (es decir, efector) en el medio de cultivo para que tenga lugar la transcripción del gen que ha sido colocado artificialmente bajo su control. De este modo, no tiene lugar ninguna transcripción del gen mutante (por ejemplo, gen mutante exógeno) en ausencia de este componente (efector) y por tanto no se produce ninguna proteína mutante. En presencia del componente/efector, se transcribe el gen mutado y por consiguiente se produce la proteína mutada. Si es dominante el mutante de sobreactividad letal, su presencia afectará a la viabilidad celular, incluso en presencia de la proteína "no mutada" (por ejemplo, natural). En ausencia de la proteína "no mutada" (o en ausencia de su actividad) se observará igualmente el efecto de cualquier mutación de sobreactividad letal. Por ejemplo, el gen mutante puede estar colocado bajo el control del promotor lac, el promotor \lambda o el promotor de arabinosa.

Alternativamente, el fenotipo mutante de la proteína puede ser inducido por medios condicionales, es decir la mutación de sobreactividad letal puede ser una mutación condicional, en la que el fenotipo mutante de la proteína diana es inducido por un cambio en una o más condiciones (por ejemplo, parámetros) referentes a la célula (por ejemplo, temperatura u otras condiciones de cultivo, edad, nutrición). Condiciones restrictivas son aquellas en las que se observa el fenotipo mutante, mientras que condiciones permisivas son aquellas en las que se suprime el fenotipo mutante (por ejemplo, dando como resultado una función génica no sobreactiva, por ejemplo niveles de actividad natural o normal) (es decir, función génica "no mutada"). Por tanto el fenotipo mutante de la proteína mutante puede inducirse por un cambio en la temperatura de la célula. Las mutaciones sensibles a la temperatura o al frío son muy conocidas en la técnica y resultan de los cambios en la estructura primaria (es decir, en la secuencia de aminoácidos) de la proteína mutada. Ciertos aminoácidos en posiciones clave en la proteína pueden conferir sensibilidad a la temperatura. La estructura secundaria de la proteína cambia siguiendo un desplazamiento en la temperatura de crecimiento de la célula que contiene la proteína mutada.

Los cambios en la conformación de la proteína a diferentes temperaturas pueden dar como resultado cambios en las propiedades de la proteína. Por ejemplo, la proteína puede llegar a ser excesivamente activa a una temperatura, comportándose mientras esencialmente de la manera natural, normal a otra temperatura. Alternativamente, la proteína puede actuar normalmente, es decir con niveles de actividad natural a una temperatura y volverse inactiva o tener una actividad reducida por el cambio de temperatura. La temperatura a la que la proteína se comporta normalmente se denomina temperatura permisible. La temperatura a la que la proteína presenta las propiedades mutantes, por ejemplo, mayor o diferente actividad se denomina temperatura restrictiva.

Estos mutantes sensibles a la temperatura o al frío han demostrado ser muy útiles para estudiar los efectos de las mutaciones letales. El crecimiento y propagación de la célula u organismo a la temperatura permitida permite la expansión y perpetuación de células que alojan proteínas con las mutaciones en cuestión. Sometiendo las células al cambio de temperatura, y revelando de este modo el fenotipo mutante, es posible estudiar la función de mutaciones por lo demás letales. Las mutaciones sensibles a la temperatura y al frío son ventajosas, ya que el cambio en la estructura y función de la proteína ocurre con el cambio de la temperatura, y no tiene una fase de demora como puede verse cuando se usan otros sistemas inducibles, por ejemplo la adición de un inductor de la transcripción. De este modo se prefiere que los mutantes de sobreactividad letal de la invención sean sensibles a la temperatura y al frío. Es más preferible que la temperatura restrictiva sea 30ºC y la temperatura permisiva sea 42ºC.

Por "proteína diana" se entiende una proteína que se ha identificado esencial o crucial para el crecimiento y/o la supervivencia de la célula que la contiene o en la que se expresa y para la que se desea identificar un inhibidor, por ejemplo, para usar como fármaco candidato contra la proteína diana. Por tanto, por ejemplo, la proteína diana puede ser crucial o esencial para un agente patógeno o para la prolongación de un estado morboso. Como se ha mencionado antes ciertas proteínas pueden estar asociadas a estados morbosos particulares, por ejemplo, cáncer y por tanto pueden representar dianas para fármacos potenciales. Como también se ha descrito antes, pueden ser identificados fármacos que interfieren con estas proteínas dianas en escrutinios en los que se mide el efecto de un fármaco potencial sobre la proteína diana por medio del efecto del fármaco sobre el fenotipo de una célula que requiere dicha proteína diana para su crecimiento y/o supervivencia.

De acuerdo con la invención, la proteína diana se somete a mutación de tal forma que se produzca una mutación sobreactiva letal, es decir su actividad ha aumentado o es excesiva en comparación con la proteína no mutada o natural. De este modo, lo que se determina en el ensayo es la reducción de la sobreactividad mutante de la proteína diana. Esto proporciona un ensayo positivo en el que se detecta la reducción de actividad de la proteína sobreactiva letal mutante. Si las células que contienen la proteína sobreactiva mutante sobreviven, entonces puede observarse que la sustancia de ensayo comprende un compuesto que reduce la sobreactividad de la proteína diana mutada. Dicho compuesto puede usarse potencialmente como fármaco para interferir con la actividad normal de la proteína diana y reducir con ello la infección o combatir el estado morboso en cuestión.

Como se ha mencionado antes, la proteína diana puede ser cualquier proteína funcional (por ejemplo, cualquier proteína efectora), pero preferiblemente es una enzima o una proteína de unión que está implicada en el metabolismo de DNA. Especialmente preferida es una proteína que está implicada en la replicación del DNA cromosómico, tal como DnaA bacteriana (por ejemplo, E. coli) o una de sus homólogas. Homólogas de DnaA pueden encontrarse en otras especies, tales como E. coli, S. enterica, S. marcescens, P. mirabilis, B. aphidicola, Y. pestis, V. harveyi, V. cholerae, P. putida, P. aeruginosa, P. multocida, H. influenzae, S. putrefaciens, C. crescentus, R. meliloti, Z. mobilis, R. prowazekii, Wolbachia sp., H. pylori, C. jejuni, B. pertussis, N. meningitidis, T. ferrooxidans, C. difficile, B. subtilis, B. halodurans, B. anthracis, S. aureaus, S. pneumoniae, M. capricolum, M. genitalium, M. pneumoniae, U. urealyticum, S. citri, E. faecalis, M. luteus, C. diphtheriae, M. leprae, M. avium, M. tuberculosis, M. smegmatis, S. coelocolor, S. chrysomallus, P. marinus, Synechocystis sp., C. pneumoniae, C. trachomatis, C. muridarum, B. burgdorferi, T. pallidurn, T. denticola, T. maritima, T. thermophilus, D. radiodurans, A. aeolicus, C. tepidum, D. ethenogenes, P. gingivalis. También pueden usarse otras proteínas implicadas en la replicación de DNA por ejemplo, las proteínas eucariotas Cdc6/Orc antes mencionadas o cualquier otras iniciadoras de la replicación.

Se requiere la mutación en el segundo gen para permitir la detección de fuertes inhibidores de la proteína, que no serían detectados generalmente en el caso de un escrutinio positivo sencillo. En un escrutinio positivo normal, de un solo mutante, en el que se usa una célula que comprende un único mutante de sobreactividad letal, un inhibidor de proteína que compromete la actividad del mutante sobreactivo de forma que se reduce la actividad, pero no se suprime completamente, puede hacer que sobreviva la célula, o demostrar mayor supervivencia o crecimiento en presencia de dicho inhibidor en comparación con el crecimiento de las células mutantes en ausencia de dicho inhibidor. Sin embargo si está presente un fuerte inhibidor, que elimina sustancial o completamente la función del mutante de sobreactividad letal (por ejemplo, en la muestra de ensayo) entonces morirán las células mutantes, independientemente de la presencia de dicho inhibidor. Por su naturaleza, la proteína diana que contiene la mutación de sobreactividad letal, es esencial para la supervivencia y/o crecimiento continuados y la propagación de la célula y por esta razón constituye una proteína diana adecuada y por esta propiedad se mide la inhibición de la proteína diana. Sin embargo no es posible diferenciar en dicho sistema entre un fuerte inhibidor, que evite la supervivencia de células que contienen el mutante sobreactivo letal inhibiendo completa o significativamente la actividad de la proteína diana mutada, que es esencial para la supervivencia continuada de esta célula, y la ausencia de cualquier inhibición, en cuyas condiciones no pueden sobrevivir las células. De este modo, cualquier escrutinio positivo que utilice una sola mutación de sobreactividad letal es limitado con relación a la fuerza de inhibición que puede ser detectada en dicho escrutinio, ya que sólo son detectados inhibidores débiles o inhibidores fuertes usados únicamente en pequeñas cantidades.

Los autores del presente invento han desarrollado un nuevo ensayo en el que una segunda mutación que también está presente en la célula, permite sobrevivir a la célula si el inhibidor de la proteína es suficientemente fuerte (o está presente en cantidades suficientemente altas) para suprimir completamente la función de la proteína diana, o reducirla hasta un nivel inferior al que puede sobrevivir y/o desarrollarse la célula.

La segunda mutación sustituye y compensa la falta de actividad de la proteína diana originada por cualquier reducción de la actividad por el inhibidor de la proteína y su fenotipo es por consiguiente sólo detectable cuando se reduce la actividad del primer mutante de sobreactividad letal, puesto que el mutante de sobreactividad letal es dominante. La segunda mutación puede ser la inserción de un nuevo gen o genes, y el(los) producto(s) obtenido(s) puede(n) actuar para compensar la falta de actividad de la proteína diana. Alternativamente, la mutación puede ser una mutación que inactiva un gen/producto génico particular o reduce sustancialmente su expresión y/o actividad, por ejemplo, una mutación sin sentido en un gen o una deleción que elimina el producto o el producto funcional del gen de la célula.

La mutación en el segundo gen permite la supervivencia y crecimiento continuados de la célula en presencia de un inhibidor fuerte (o de concentraciones o cantidades elevadas de inhibidor), que reduce la actividad de la proteína diana. La mutación en el segundo gen puede actuar por tanto al mismo nivel o en dirección 3' del mutante de sobreactividad letal. Así, cuando la mutación se sobreactividad letal está en un iniciador de un proceso celular, la segunda mutación permite que prosiga este proceso en ausencia de iniciador funcional de este proceso. Por ejemplo, cuando el mutante con sobreactividad letal está en un iniciador de replicación del DNA, por ejemplo, en procariotas, y da como resultado una proteína iniciadora de la replicación del DNA sobreactiva (por ejemplo, DnaA), provocando la sobreiniciación de la replicación del DNA, la segunda mutación es preferiblemente una que permite que prosiga la replicación del DNA en ausencia de la proteína funcional iniciadora de la replicación del DNA (por ejemplo, DnaA), por ejemplo, proporcionando un mecanismo alternativo de replicación. De este modo, por ejemplo, dicha mutación puede ser cualquier mutación que inactive el gen rnh que codifica la RNasa H y más preferiblemente la deleción del gen rnh.

Por "compensa funcionalmente" se entiende que se introduce o suprime una actividad adicional o alternativa (o se reduce sustancialmente) en la célula mutante. La compensación consiste por tanto en proporcionar medios por los que la célula puede continuar actuando esencialmente de forma normal, a pesar de la ausencia o reducción de la actividad de una proteína diana clave. La segunda mutación puede por tanto compensar funcionalmente cualquier reducción de la actividad del primer producto génico (es decir, la proteína diana), por debajo de un nivel de viabilidad-mantenimiento (es decir, si la actividad de la proteína diana cae por debajo de un nivel en el que la célula puede sobrevivir y/o crecer). La actividad de la proteína diana no se mide directamente sino que se mide en un ensayo funcional.

Por ejemplo, en una vía de señalización lineal, la proteína diana puede estar "en una situación anterior" de la actividad alternativa. Proporcionando una proteína activa en una situación posterior de la actividad bloqueada, la vía de señalización continua actuando y la célula que es dependiente de esta vía sobrevivirá en ausencia de una señal funcional en situación anterior. La actividad alternativa puede por consiguiente estar en una situación posterior o actuar en un punto posterior en una vía de señalización.

"Grado de supervivencia" como se usa en la presente memoria se refiere a la evaluación (por ejemplo, medida) del crecimiento y proliferación de las células usadas en el ensayo. Las células morirán (o no podrán desarrollarse) por la mutación de sobreactividad letal, cuando está inducida, en ausencia de un inhibidor de proteína que inhibirá el efecto de la proteína diana. Esto por consiguiente representa un grado de supervivencia "cero", es decir, ninguna célula sobrevive o ninguna célula puede desarrollarse ni dividirse. Después de la inducción de la mutación de sobreactividad letal, puede pasar un cierto periodo de tiempo hasta que mueran las células. Por ejemplo, transcurren aproximadamente 3 horas desde la inducción de una mutación letalmente sobreactiva sensible a la temperatura en bacterias hasta que mueren las células. En presencia de un inhibidor específico de una proteína que reduce la actividad del mutante de sobreactividad letal, sobrevivirá y podrá proliferar un mayor número de células. Por tanto el grado de supervivencia está relacionado con el número de células presentes (por ejemplo, en el medio de desarrollo o cultivo celular) después de la inducción de la mutación de sobreactividad letal y la adición del inhibidor (o muestra de ensayo). El inhibidor (o muestra de ensayo) puede añadirse simultáneamente o subsiguientemente a la inducción de la mutación de sobreactividad letal. Si la inducción de la mutación de sobreactividad letal tiene lugar por el cambio de temperatura, es preferible que el inhibidor (o muestra de ensayo) se añada simultáneamente con la inducción de la mutación de sobreactividad letal. Si la inducción de la mutación de sobreactividad letal requiere la síntesis de proteínas de novo entonces el inhibidor (o muestra de ensayo) debe añadirse subsiguientemente a la inducción de la mutación de sobreactividad letal, preferiblemente en el momento en el que ha tenido lugar la síntesis de la proteína, por ejemplo, 3-5 horas o 5-8 horas después de la inducción de la mutación de sobreactividad letal.

Esto puede realizarse determinando, por ejemplo, por estimación o evaluación (por ejemplo, por recuento o medida) el número de células (por ejemplo, células vivas) en un momento definido en presencia y ausencia de la muestra de ensayo. Las células pueden enumerarse espectrofotométricamente, por ejemplo, midiendo la densidad óptica de la población celular a una longitud de onda apropiada, por ejemplo, una longitud de onda de 450 nm o por recuento directo de las células, o de una proporción representativa de la muestra celular. Si las células se hacen crecer en un medio sólido, puede determinarse el número de colonias.

Como se ha mencionado antes, si la inducción de la mutación de sobreactividad letal se produce en un cambio de temperatura, el inhibidor o la muestra de ensayo deben ponerse en contacto con las células inmediatamente después, por ejemplo, 1 generación, o simultáneamente a la inducción de la mutación de sobreactividad letal. Este se considera el tiempo cero. La determinación de los números relativos de células puede realizarse a continuación a intervalos de tiempo apropiados, por ejemplo, 3-30, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10, 8-12, 8-10, 3-5 generaciones después del tiempo cero, o después de un periodo de incubación apropiado, por ejemplo, incubación durante la noche de 8-30 horas, 8-24 horas, 8-18 horas, 8-12 horas, 12-30 horas, 12-24 horas, 12-18 horas; 18-30 horas, 18-24 horas, 20-30 horas, 20-24 horas. En este momento, el número de células en la población de células inducida en ausencia de la sustancia de ensayo es el valor de control. El número de células en esta población de células se compara con el número de células en la población de células inducida que se ha puesto en contacto con el inhibidor/muestra de ensayo. Por ejemplo, un aumento en la DO_{450} de 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces o 100 veces, con relación al valor en ausencia del inhibidor/muestra de ensayo indica la presencia de un inhibidor de la proteína en la sustancia de
ensayo.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a células para uso en el método de la invención. Dicha célula contiene una mutación de sobreactividad letal, inducible, preferiblemente sensible a la temperatura, por ejemplo al frío en un primer gen que afecta (por ejemplo, que codifica) una proteína diana, cuya actividad es esencial para la célula, y una segunda mutación (por ejemplo, en un segundo gen) que compensa funcionalmente cualquier reducción de la actividad del primer producto génico (es decir, de la proteína diana), por ejemplo una reducción de la actividad provocada por un inhibidor de la proteína.

Como se ha mencionado antes, la célula puede ser eucariota o procariota, incluyendo células de arqueas, por ejemplo levadura o células de mamíferos. Preferiblemente, la célula es eubacteriana, por ejemplo, E. coli.

Más preferiblemente, la célula es un mutante dnaA219\Deltarnh, procedente preferiblemente de la cepa WM2667, y más preferiblemente la célula es la cepa SF53 depositada como se ha definido antes, que contiene la mutación DnaA219cos\Deltarnh, con las características indicadas en la Tabla 1.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un kit para realizar el ensayo, que comprende células para realizar el ensayo. El kit puede contener también un medio de crecimiento y/o antibióticos para realizar el ensayo.

Los inhibidores de la proteína (por ejemplo, nuevos inhibidores de la proteína) pueden identificarse por método de ensayo de la invención, particularmente inhibidores de la replicación del DNA, especialmente inhibidores de la replicación del DNA bacteriano, y pueden usarse como agentes antimicrobianos.

La invención será descrita ahora con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitativos con referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1 muestra las curvas de crecimiento/desarrollo de la cepa de ensayo SF53 (dnaA219, rnh::cam) y la cepa SF58 (dnaA219, rnh::cam/pdnaA[1-86]-biotina);

La Figura 2 muestra el análisis de viabilidad de las células SF58 desarrolladas con diferentes cantidades de IPTG (0, 0,25, 0,5 y 1 mM) a 30ºC;

\newpage

La Figura 3 muestra las curvas de crecimiento/desarrollo de SF53 y SF58. El inóculo era una dilución 1:100 del medio de cultivo O.N. de 1,5 DO_{600}. La temperatura de incubación era 30ºC, la DO_{405} se midió cada 900 s. Ni SF53 ni SF58 muestran ningún desarrollo apreciable en estas condiciones hasta 1,5x10^{5} s (aproximadamente 42 h);

La Figura 4 muestra la curva de crecimiento/desarrollo de SF58 con IPTG a concentraciones de 0 a 10 mM. El inóculo era una dilución 1:100 del medio de cultivo de una noche de 1,5 DO_{600}. La temperatura de incubación era 30ºC, la DO_{405} se midió cada 900 s. Después de 18 horas (6,4 x 10^{4} s) las DO de los cultivos inducidos (IPTG 0,31 mM y superiores) son significativamente superiores a las de los controles (IPTG de 0 a 0,16 mM);

La Figura 5 muestra la distribución de frecuencias del valor de la DO_{620} de controles positivos (SF58 + IPTG 2,5 mM) y negativos (SF53 y SF58). Los valores del control positivo se agrupan alrededor de DO_{620} 1,1 y los valores del control negativo se agrupan alrededor de DO_{620} 0,1;

La Figura 6 muestra la distribución de frecuencias del valor de la DO_{620} de 4240 extractos microbianos. La mayoría de las muestras tienen una DO_{620} de alrededor de 0,1; y

La Figura 7 muestra la señal de la DO_{620} de los 41 extractos microbianos positivos.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de la cepa de ensayo SF53

WM2667 es un supresor de WM2062 sensible a la temperatura (dnaAtS46, Weigel et al., 1999, Mol. Microbial, 34: 53-66). WM2667 se parece mucho al mutante dnaAcos (Kellenberger-Gujer et al., supra) porque es un mutante sensible al frío de dnaA. Los mutantes se hacen crecer normalmente a la temperatura permisiva (42ºC), sin embargo después de crecimiento a la temperatura restrictiva, 30ºC durante 4 horas, menos del 10% de las células permanecen viables. A 30ºC, las células acumulan 3-4x más OriC DNA que los marcadores de control (dnaB, dnaC y att\lambda). Puede restablecerse el crecimiento o desarrollo por introducción de un plásmido OriC o la sobreexpresión moderada de la proteína Fis.

En el gen dnaA de WM2667 están presentes tres mutaciones; A184V y H252Y están ambas presentes en el gen dnaA de la cepa parental, mientras que R342C representa una mutación adicional encontrada sólo en WM2667. El alelo de dnaA se denomina dnaA219(cos).

Con el fin de construir una cepa que pudiera sobrevivir en el estado en el que la proteína DnaA219 está completamente inactivada, se introdujo la deleción del gen rnhA en la cepa WM2667 por transducción con P1 de acuerdo con un procedimiento estándar (Miller et al., (1992), A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for E. coli and related bacteria (Cold Spring Harbour Press)).

Lisado con P1 de la cepa SS198

Un cultivo durante una noche de SS198 (rnh::cam) se diluyó 1:100 en 10 ml de LB + cloranfenicol y se desarrolló hasta una DO = 0,3. Se añadió CaCl_{2} a 10 mM y se incubó a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió disolución madre de 100 \mul de P1 y se incubó a la temperatura ambiente durante 15 minutos. La incubación se continuó a 37ºC con agitación durante 4 horas. Se añadió 1 ml de cloroformo y se incubó a 37ºC durante 15 minutos. El tubo se centrifugó y el líquido sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo.

Transducción de rnh::cam a WM2667

CaCl_{2} 15 mM y MgCl_{2} 15 mM se añadieron a un cultivo durante una noche de la cepa WM2667 y se incubó a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió un lisado de 500 \mul de P1 a 1 ml de cultivo durante una noche y se incubó a 37ºC durante 15 minutos.

Se centrifugó el tubo y el cultivo se lavó con LB + citrato de Na 50 mM. El cultivo se volvió a poner en suspensión en 150 \mul de LB + citrato de Na 50 mM, y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Todo el cultivo se colocó sobre placas con LB y con antibióticos apropiados.

La cepa resultante, SF53 (dnaA219 rnh::Cam), carece de la proteína RNasa H. Esta cepa crece o se desarrolla normalmente a 42ºC pero no sobrevive a 30ºC. Dicho de otro modo, tiene el mismo genotipo que WM 2667.

La cepa SF53 no sobrevive a 30ºC. Para investigar la frecuencia de reversión de la sensibilidad al frío se realizó el siguiente experimento. Un cultivo durante una noche de SF53 hecho crecer a 42ºC se diluyó 1:1000 en un medio recién preparado de ABB_{1} glucosa CAA y se desarrolló de forma continuada a 42ºC hasta que la DO_{450} alcanzó aproximadamente 0,15 (es decir, aproximadamente 4 generaciones). El tiempo de duplicación del cultivo fue aproximadamente 90 minutos. Se colocaron diversas diluciones diferentes de la cepa sobre placas de ABB_{1} glucosa CAA y las placas se incubaron a 30ºC o a 42ºC. Se contaron las colonias después de 18, 24 y 42 horas. Las placas que habían sido incubadas a 42ºC mostraron aproximadamente 10^{7} colonias por ml de cultivo en placas lo que indica que 1 ml de cultivo de SF53 con una DO_{450} de 0,1 contiene 10^{7} células viables. Las placas incubadas a 30ºC durante 18 y 24 horas mostraron aproximadamente 10 colonias por 1 ml de cultivo en placas. Esto significa que 1 célula por cada 10^{6} no era ya sensible al frío. Las placas que se incubaron durante 42 horas tenían 5 a 10 veces más colonias resistentes al frío, lo que muestra que la incubación prolongada recoge un número superior de colonias reversibles.

Ejemplo 2 Supervivencia de la cepa SF53 en ausencia de la actividad de DnaA

Los siguientes experimentos se realizaron para obtener pruebas de que la cepa SF53 sobrevivirá cuando un fármaco tiene inactivada la proteína DnaA. Dicha prueba puede obtenerse sin un fármaco líder, usando la producción del dominio en el extremo N (Dominio I, aminoácidos 1 a 86) de la DnaA natural. El Dominio I de la DnaA es importante para la oligomerización y formación de complejos apropiados de iniciación. Si se sintetiza el Dominio I independiente, se formarán hetero-oligómeros inactivos de DnaA y el Dominio I, conduciendo de este modo a un "envenenamiento" de los complejos de iniciación. La cepa SF53 se transformó con un plásmido que lleva un gen inducible por IPTG que codifica el Dominio I marcado con biotina (pBEX5BA-dnaA[1-86]-biotina), transformantes comprobados, y la cepa denominada SF58 (Tabla 1).

Cepas TABLA 1

1

El crecimiento de la cepa SF58 se analizó a tres concentraciones diferentes de IPTG. Un cultivo durante una noche de la cepa SF58 desarrollado a 42ºC se diluyó 1:1000 en un medio recién preparado de ABB_{1} glucosa CAA y se dividió en cinco matraces. Se desarrollaron los cultivos números 1 a 4 a 30ºC y el cultivo nº 5 a 42ºC. Se añadió a los cultivos números 2, 3 y 4 IPTG a una concentración de 0,25, 0,5 y 1 mM, respectivamente, en el momento de la dilución. Se siguieron las curvas de crecimiento midiendo la DO_{450} durante 8 horas. El experimento muestra que el cultivo nº 1 desarrollado a 30ºC sin IPTG no sobrevive (Figura 1). La DO_{450} era inferior a 0,03 en todos los momentos. Este resultado confirma que la cepa dnaA219rnh no sobrevive a 30ºC.

El cultivo de control (nº 5) desarrollado a 42ºC presentó un tiempo de duplicación de aproximadamente 60 minutos. Los tres cultivos desarrollados a 30ºC con IPTG mostraron velocidades de desarrollo crecientes al aumentar la concentración de IPTG y por lo tanto tenían concentraciones de proteína en el Dominio I (véase a continuación). Este resultado muestra que fue restablecido el desarrollo de la cepa a 30ºC por inducción del Dominio I, y que la velocidad de desarrollo mejoró al aumentar las cantidades de Dominio I.

Las concentraciones del Dominio I presentes después de 4 generaciones cultivadas en presencia de las tres diferentes concentraciones de IPTG, fueron determinadas por transferencia Western. Después de aproximadamente 10 horas se obtuvo un diferencia de diez veces en la DO_{450} entre el cultivo desarrollado sin IPTG (cultivo nº 1) y el cultivo desarrollados con IPTG 1 mM (cultivo nº 4). Por tanto, cuando se realiza un escrutinio de fármacos con la cepa dnaA219rnb, se detectará un valor positivo con una diferencia de diez veces la DO_{450} después de aproximadamente 10 horas en presencia del fármaco.

Para determinar la solidez del escrutinio y también en que momento, en un ensayo de alto rendimiento, es óptimo medir la diferencia de DO_{450} se realizaron las siguientes medidas (Figura 2). Esencialmente se realizó el mismo experimento que en la Figura 1, pero se midió la DO_{450} en sólo tres momentos, 20 h, 27 h y 48 h, en 10 cultivos paralelos diferentes. Se obtuvo una diferencia de 20-40 veces después de 20 h y después de 27 h. Después de 48 h comenzó a aparecer un fondo en el cultivo no inducido y la diferencia disminuyó hasta aproximadamente 5 veces. Por consiguiente,
las medidas de la DO_{450} en escrutinios de alto rendimiento deben realizarse después de 10-30 horas de incubación.

Ejemplo 3 Procedimiento de escrutinio de alto rendimiento

Un cultivo de una noche de la cepa SF53 desarrollado en un medio de ABB_{1} glucosa CAA a 42ºC se diluyó 1:1000 en un medio recién preparado y se distribuyó en un número apropiado de placas de microtitulación de 96 pocillos. Se añadieron diferentes sustancias de ensayo, una a cada pocillo de microtitulación, excepto en dos de los pocillos de cada placa. Estos pocillos sirven como ensayos en blanco, es decir cultivos de referencia sin desarrollo. Las placas de microtitulación se incubaron a 30ºC durante 20-24 h y a continuación se midió la DO_{450}. Se encontraron valores positivos en pocillos con medidas de la DO 10-100 veces superiores a las de las muestras en blanco.

Ejemplo 4 Validación del ensayo

La primera parte de un procedimiento de transferencia y validación del ensayo implica la reproducción de los resultados en formato de microtitulación. Estos resultados se muestran en la Fig. 3, que indica que ni SF53 ni SF58 muestran desarrollo apreciable cuando se incuban en formato de microtitulación a 30ºC durante como máximo 1,5 x 10^{5} segundos (aproximadamente 42 horas). Los 48 cultivos repetidos de la misma placa de microtitulación de la Fig. 3 se comportaron de modo similar. A continuación, se reprodujeron las curvas de inducción por IPTG, como se muestra en la Fig. 4. SF58 puede mostrar una DO_{405} significativamente superior que la del control ya después de 3 x 10^{4} segundos (aproximadamente 8 horas). Además, después de 18 horas (6,4 x 10^{4} segundos) las DO de los cultivos inducidos son muy superiores a las de los controles. Estos resultados confirman que el comportamiento esperado de las cepas SF53 y SF58-IPTG, e indican que existe una amplia ventana temporal durante la cual se puede medir sin ambigüedad el efecto de un hipotético inhibidor de la DnaA.

A continuación se realizaron una serie de experimentos para determinar la señal en función del inóculo de partida (es decir, la DO teórica del cultivo presente en un pocillo de microtitulación). Los datos (no mostrados) indican que no existe diferencia significativa en la curva de desarrollo de SF58-IPTG si el inóculo se obtiene por dilución de un cultivo durante una noche o de un cultivo desarrollado activamente a 42ºC. En consecuencia, el tiempo para medir la DO se ajustó a 18 horas, y el proceso usado fue desarrollar 5 \mul de SF53 o SF58 en 30 ml de medio de glucosa CAA (con selección de anticuerpos) durante una noche a 42ºC hasta que la DO_{600} fue 1,2. La solución madre se diluyó 1:100 en glucosa CAA (sin anticuerpo). En cada pocillo se distribuyeron 90 \mul de esta dilución, con 10 \mul de la muestra. Se midió la DO_{620} después de una incubación de 18 horas a 30ºC.

Puesto que no se conocen inhibidores constituidos por pequeñas moléculas de la DnaA, la siguiente etapa para validar el ensayo era registrar el comportamiento del ensayo en presencia de muestras desconocidas. Para este fin, se usaron colecciones de extractos microbianos proporcionadas por Vicuron Pharmaceuticals. Debe observarse que esta colección está constituida por extractos de fermentación microbianos tratados. En resumen, cada cepa se fermenta en condiciones definidas y el caldo de fermentación se trata por extracción en fase sólida y las células se tratan por extracción con disolvente. En cada caso, el "extracto microbiano" se distribuye en placas de microtitulación y se seca. Los extractos microbianos se conservan en placas de microtitulación de 96 pocillos a 80 muestras por placa. Los 16 pocillos restantes por placa se usan como controles positivos y negativos. Cada muestra de la colección de extractos microbianos consiste por consiguiente en una mezcla de compuestos desconocidos a concentraciones desconocidas. Evaluando el comportamiento del ensayo con dicho complejo, la colección de muestras tiene el potencial de destacar cualquier posible interferencia y el mal comportamiento del ensayo.

El ensayo debe identificar la presencia de un inhibidor de DnaA como muestra que proporciona una DO_{620} significativamente superior a la de los controles. Desde un punto de vista teórico, se esperaría que los verdaderos positivos fueran relativamente escasos, puesto que deben contener dicho inhibidor a una concentración suficiente para permitir el desarrollo de SF53. Además, se pueden identificar teóricamente dos grupos de falsos positivos: un grupo podría surgir de todos los casos en los que la aparición de una DO_{620} significativa no depende del desarrollo de SF53 (es decir, un microbio contaminante o un muestra turbia genera la señal); otro grupo podría surgir de los casos en los que el pocillo particular contiene un alto número de cepas supresoras. Ambos grupos de falsos positivos pueden ser reconocidos fácilmente por la repetición del ensayo con o sin SF53. Considerando la naturaleza de las muestras, los posibles falsos negativos podrían consistir en todas aquellas muestras en las que está presente un hipotético inhibidor de DnaA junto con otro antibiótico activo sobre SF53. Sin embargo, se sabe que la frecuencia de extractos microbianos activos frente a una cepa de E. coli está alrededor del 1%, por tanto los falsos negativos deben ser bastante escasos.

Siguiendo el procedimiento antes descrito, se realizó un escrutinio de 4240 extractos microbianos. Cada placa de microtitulación de 96 pocillos contenía como controles cuatro pocillos inoculados con SF53, cuatro pocillos inoculados con SF58 y 8 pocillos inoculados con SF58 en presencia de IPTG 2,5 mM. A estos pocillos de control se añadieron 10 \mul de DMSO al 10% (el disolvente en el que se disuelven los extractos microbianos).

Se observó en primer lugar la distribución de frecuencias de los controles, representada en la Fig. 5. Todos los controles negativos (SF53 y SF58) estaban agrupados alrededor de una OD_{620} de 0,1, mientras que los controles positivos (SF58-IPTG) presentaban una curva de distribución amplia alrededor de una DO_{620} de 1,1. Una curva de distribución amplia para los controles positivos como en la Fig. 5 no es ideal en un programa de escrutinio. Sin embargo, podría deberse a la distribución manual del inóculo y debe mejorarse por la automatización de la distribución del inóculo. No obstante, existe una separación clara entre los controles negativos y positivos, y esto debe permitir la identificación inequívoca de las muestras positivas.

La distribución de frecuencias de los 4240 extractos microbianos se muestra en la Fig. 6. Puede observarse que la mayoría de las muestras se agrupan alrededor de una DO_{620} de 0,1. Esto indica que la mayor parte de las muestras no dan como resultado una DO_{620} significativamente diferente que la de los controles negativos. Además, esta distribución de frecuencias indica que podría usarse un umbral de la DO_{620} de 0,4 para identificar las muestras positivas verdaderas. Este límite identificó 41 muestras (que representa el 0,97% de las muestras ensayadas) con una DO_{620} superior a 0,4. Los valores observados de estas muestras positivas se recogen en la Fig. 7. Posteriormente se demostró que estos resultados eran falsos positivos debido a la presencia de contaminación microbiana procedente de los extractos usados en las muestras. Esta contaminación puede analizarse fácilmente usando técnicas microbiológicas estándar.

En esta etapa, se llegó a la conclusión de que:

a)

el ensayo puede realizarse en formato de 96 pocillos;

b)

se realiza adecuadamente para un programa HTS;

c)

los extractos microbianos positivos son todos falsos positivos.

Claims (22)

1. Un método para identificar la presencia de un inhibidor de una proteína diana en una muestra, que comprende las etapas de:

a)

poner en contacto dicha muestra con una célula, en el que dicha célula contiene

(i)

una mutación de sobreactividad letal inducible en un gen que afecta a la proteína diana, en donde la actividad de la proteína diana es esencial para la célula; y

(ii)

una mutación en un segundo gen, en donde la mutación en el segundo gen compensa funcionalmente cualquier reducción en la actividad de la proteína diana;

b)

inducir la mutación de sobreactividad letal; y posteriormente

c)

determinar la inhibición de la proteína comparando el grado de supervivencia de la célula en presencia y ausencia de dicha muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula es una población de células obtenidas por clonación.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la mutación de sobreactividad letal inducible está en el gen que codifica la proteína diana.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína diana es una enzima o una proteína de unión.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína diana está asociada con la síntesis de ácidos nucleicos.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicha proteína diana es un iniciador de la replicación del DNA.

7. El método de la reivindicación 5, en donde dicha proteína diana es un iniciador bacteriano de la replicación del DNA.

8. El método de la reivindicación 5, en donde dicha proteína diana es DnaA.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la mutación en el segundo gen proporciona un mecanismo alternativo para la replicación del DNA en ausencia de dicho iniciador de la replicación del DNA.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el grado de supervivencia de las células se mide determinando el número de células presentes después de la inducción de la mutación de sobreactividad
letal.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el número de células se determina 8-30 horas después de la inducción de la mutación de sobreactividad letal.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde el número de células se determina espectrofotométricamente.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el inhibidor es un inhibidor específico de una proteína.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde que dicho inhibidor es un antibiótico.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la célula es E. coli.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la mutación de sobreactividad letal está en DnaA.

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicha mutación de sobreactividad letal es o tiene las propiedades de DnaAcos o DnaA219.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17, en donde la segunda mutación inactiva la RNasaH.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 18, en donde la célula es DnaA219\Deltarnh, depositada en ECACC con el Nº de registro 03050701.

\newpage

20. Una célula que contiene una mutación de sobreactividad letal inducible en un primer gen que afecta a una proteína diana, en donde la actividad de dicha proteína diana es esencial para la célula y una segunda mutación que compensa funcionalmente cualquier reducción de la actividad de la proteína diana.

21. La cepa E. coli SF53 (DnaA219\Deltarnh), depositada en ECACC con el Nº de registro 03050701.

22. Un kit para realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende la célula de la reivindicación 20 ó 21.