PT1629115E - Rastreio para novos inibidores de proteínas com base numa linha celular modificada contendo um gene de sobreactividade induzível e um gene compensatório. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"RASTREIO PARA NOVOS INIBIDORES DE PROTEÍNAS COM BASE NUMA LINHA CELULAR MODIFICADA CONTENDO UM GENE DE SOBREACTIVIDADE INDUZÍVEL E UM GENE COMPENSATÓRIO" A presente invenção refere-se a métodos para identificar novos inibidores de proteína (de um modo preferido antibióticos) por meio de um ensaio utilizando células que contêm mutações que afectam dois qenes separados. A primeira mutação é uma mutação de sobreactividade letal indutível (ou condicional), provocando de um modo preferido sobreiniciação da replicação de ADN. Os inibidores de proteína são identificados pela sua capacidade para inibir a função (e. g. actividade) do produto genético codificado pela mutação de sobreactividade letal, superando desse modo a característica de sobreactividade letal da célula. A segunda mutação aumenta a sensibilidade do ensaio proporcionando um mecanismo alternativo/compensatório, e. g. uma via de iniciação de ADN alternativa, permitindo assim que a célula sobreviva se o inibidor da proteína for suficientemente potente para inibir fortemente a função (e. g. actividade) do produto genético codificado pela mutação de sobreactividade letal até níveis nos quais a célula não pode sobreviver. São proporcionadas células, particularmente bactérias, para utilização no ensaio.

Inibidores de proteínas, que podem funcionar de diferentes modos para "inibir" uma proteína (e. g. inibindo a sua síntese ou a sua actividade), são largamente utilizados como fármacos para combater doenças. As doenças podem ser provocadas pela 1 sobre-expressão ou sobreactividade da proteína em questão, como no caso de uma variedade de cancros em que a sobre-expressão de certos oncogenes está envolvida com o desenvolvimento de malignidades, e. g., HER2/neu no cancro da mama, o oncogene ras e o oncogene myc. A sobre-expressão pode provocar sobreactividade ou a sobreactividade pode resultar da mutação. As proteínas de oncogene são, frequentemente, componentes de uma via, tal como a via de sinalização, que é importante na regulação do crescimento celular. Uma vez que uma proteína mostra ser necessária para a causa ou a progressão de um estado de doença, é desejável "tornar a proteína um alvo" e tentar encontrar fármacos que actuem na prevenção da função da proteína relacionada com a doença. A doença também pode ser uma infecção, tais como uma infecção fúngica ou bacteriana. Essas doenças podem ser combatidas com antibióticos que, novamente, actuam para inibir a função de uma proteína "tornada alvo" à medida que a infecção introduz novas proteínas para as células infectadas. Estas proteínas que não se encontram na célula hospedeira infectada podem ser proteínas alvo.

As doenças infecciosas são uma causa principal de mortalidade mundialmente e, como tal, são necessários novos agentes que sejam úteis para actuar contra a infecção. Todavia, a sobre-utilização de antibióticos, em particular, conduziu ao fenómeno da resistência a antibióticos quando os antibióticos se tornam ineficazes contra microrganismos e é, por isso, de importância crucial desenvolver antibióticos novos e melhorados. É particularmente importante identificar antibióticos que são quimicamente distintos daqueles que são normalmente utilizados.

Os microrganismos que exibem resistência a antibióticos para um 2 certo antibiótico apresentam mais provavelmente resistência a um que é quimicamente próximo, do que a um que é estruturalmente e funcionalmente distinto. Por isso, novos compostos antimicrobianos que são identificados com base na sua função, em vez de na sua estrutura, podem ser de utilização particular. 0 desenvolvimento de antibióticos que actuam contra alvos para os quais não existem antibióticos conhecidos é também de particular interesse.

Os alvos de antibiótico actuais incluem enzimas envolvidas na sintese de proteínas e transportadores de membrana ou componentes de parede celular. Estes alvos são presentemente identificados de várias maneiras. 0 enorme aumento dos dados de sequências de ácidos nucleicos que estão disponíveis conduziu a um aumento na capacidade para atribuir uma função a uma proteína com base na comparação dos dados de sequências. A quantidade elevadíssima de dados disponíveis torna isto, todavia, difícil e cerca de 25-40% dos genes num genoma bacteriano não possuirão correspondências com genes homólogos, conhecidos (Smith D.R. (1996) Trends Biotechnology 8:290-3). Adicionalmente, o facto de dois genes partilharem homologia de sequência nem sempre significa que eles sejam estruturalmente semelhantes.

Alvos de fármacos, quer sejam para antibióticos ou contra outras doenças, devem, idealmente, possuir as seguintes propriedades: devem ser necessários para o patogénio ou doença sobreviverem, crescerem ou actuarem; em relação a alvos de antibiótico, ou alvos antipatogénicos é também útil que a proteína alvo esteja ausente ou seja distinta em humanos, ou o mamífero que vai ser tratado; e o grau de conservação de estrutura do alvo do fármaco entre espécies que estão a ser combatidas é, de um modo preferido, elevado. Até à data, não 3 foram identificados fármacos dirigidos à maquinaria de replicação do ADN.

Uma vez identificada uma proteína alvo, é necessário identificar compostos que podem actuar para inibir ou impedir a sua função, quer num estado de doença ou no patogénio. 0 processo de rastreio para compostos inibidores, que anteriormente tem sido trabalhoso e demorado, foi melhorado por tecnologias que permitem o rastreio de elevado rendimento em que muitas centenas ou mesmo milhares de compostos podem ser testados simultaneamente ou em paralelo.

Em geral, esses rastreios para identificar antibióticos ou outros inibidores de proteína são rastreios "negativos". Nestes rastreios, um inibidor de proteína é identificado após a aplicação de uma substância de teste a uma população de células, em que a população de células apresenta uma redução da viabilidade. Isto advém do facto de uma das propriedades do alvo delineado acima ser que é essencial para o crescimento continuado e proliferação do patogénio em questão. Interferir com esta função essencial afecta a viabilidade celular. Assim, a maior parte das técnicas de rastreio baseiam-se num resultado negativo subsequente à abolição da função do alvo, tal como a morte ou redução no crescimento das células que a contêm e requerem. Esta abordagem sofre de várias desvantagens. Devem ser realizados vários ensaios diferentes, sequencialmente ou em paralelo, para assegurar que o efeito observado na viabilidade celular é específico para a proteína alvo. 0 facto de o efeito, e. g. morte celular, ser observada isoladamente não é suficiente para confirmar que o efeito é provocado por um efeito na proteína alvo. A substância de teste pode ter afectado uma proteína alvo diferente ou o efeito pode ser um efeito geral que 4 está inteiramente não relacionado com a proteína alvo específica. Assim, esses rastreios negativos são demorados e não é possível obter um resultado sem realizar ensaios múltiplos.

Seria vantajoso dispor de um ensaio ou rastreio para inibidores de proteína que dependa de um resultado ou consequência positivos, tais como aumento do crescimento celular ou sobrevivência de uma célula mutante que é incapaz de crescer de outro modo. Esses rastreios positivos são vantajosos na medida em que evitam muitos dos problemas associados a rastreios negativos, tais como níveis de fundo elevados de morte celular ou falta de crescimento que pode não ser atribuível à acção específica de um inibidor potencial, mas pode ser devido a outras razões. Não são conhecidos, actualmente, tais rastreios positivos na técnica. A presente invenção proporciona agora um tal teste.

Mutantes de sobreactividade letal são mutantes que contêm mutação (ões) de modo que a actividade de um produto genético particular produzido ou expresso é superior, comparada com a do organismo selvagem ou produto genético "não mutado" (í. e., o produto genético antes da introdução da mutação de sobreactividade letal - não é excluído que o produto genético possa comportar outras mutações não relacionadas com a sobreactividade letal). Isto pode ser devido às diferenças na actividade do próprio produto genético, nos seus níveis de expressão ou produção, ou na regulação da sua actividade (e. g., devido a um aumento ou diminuição na expressão e/ou actividade de uma molécula reguladora). Assim, um mutante de sobreactividade letal pode ser encarado como um em que a "funcionalidade" do produto genético em questão é aumentada. 0 aumento da actividade (ou "funcionalidade") deste produto 5 genético é prejudicial à sobrevivência e/ou crescimento da célula mutante. 0 produto genético pode, deste modo, ser qualquer produto que é letal, ou que possui um efeito negativo significativo no crescimento e/ou sobrevivência do organismo, quando a sua actividade excede certos níveis (e. g., níveis "normais" e. g., níveis antes da mutação, ou nativos ou selvagens) e. g., quando é "sobreactivo". Essa sobreactividade pode, como mencionado acima, ser alcançada de vários modos, incluindo por um aumento na quantidade ou conteúdo, ou níveis do produto genético e. g., devido à expressão aumentada ou degradação reduzida, ou actividade aumentada ou prolongada. Esses mutantes são, por isso, úteis em rastreios positivos. Todavia, essas mutações são raras na natureza e podem ser difíceis de gerar.

DnaA é uma proteína eubacteriana que inicia a replicação cromossómica em bactérias (Kornberg e Baker 1992, DNA replication, W.H. Freeman). É nesta fase que o ciclo da replicação cromossómica é regulado. A replicação do ADN está também dependente da presença de uma sequência cromossómica única, OriC, a origem de replicação. Tanto OriC como DnaA são necessárias para o sucesso da iniciação de replicação e estes dois componentes formam um complexo de nucleoproteína. Cerca de 20-40 monómeros da proteína DnaA estão presentes no complexo OriC-DnaA, a DnaA ligada a ATP provoca o início do desenrolar do duplex de ADN, permitindo assim que a helicase de DnaB estenda o desenrolar, antes da síntese das cadeias complementares pela holoenzima polimerase III de ADN (Skarstad e Boye, Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1217, 111-130, revisto em Katayama et al., Molecular Microbiology, 2001, 41(1), 9-17). 6 A iniciação da replicação de ADN em procariotas e eucariotas é altamente regulada por vários mecanismos, devido à sua importância no ciclo celular. Os eventos de iniciação excessivos conduzem, eventualmente, à morte celular.

Um exemplo de uma mutação que provoca iniciação hiperactiva é DnaAcos, que é uma mutação identificada em E. coli (Kellenberger-Gujer et al., Molec. Gen. Genet. 162, 9-16, 1978; e Katayama et al. (1994), Journal of Biological Chemistry, 269(17), 12698-12703). Este mutante foi isolado como um supressor resistente a temperatura de um mutante de DnaAts46 sensível à temperatura. DnaAts46 é um mutante de E. coli bem caracterizado que expressa uma proteína DnaA que é inactiva a temperaturas elevadas (42 °C) , resultando numa estirpe mutante que é incapaz de iniciar a replicação a temperaturas elevadas (Kohiyama, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 33, 312-324 (1968); Hirota et al., J. Molec. Biol. 53, 369-387(1970). O mutante DnaAcos é conhecido por possuir as seguintes propriedades. Em primeiro lugar, o seu crescimento é sensível ao frio; cresce normalmente a 42 °C, todavia a replicação do ADN cromossómico sobre-inicia imediatamente assim que as células são deslocadas para crescer a uma temperatura restritiva de 30 °C. DnaAcos foi identificado como um mutante supressor de dnaAts46 i. e., suprime o fenótipo dnaAts46 e representa um mutante supressor intragénico. As mutações supressoras (Q156L e Y271H) resultam das substituições de bases no gene dnaA (Hansen et al., 1992, Mol. Gen. Gent., 234, 15-21, Skarstad e Boye, 1994,

Biochim Biophys Acta, 1217, 111-130, Kellenbergen-Gujer et al., 1978, Mol. Gen. Genet., 162, 9-16). 7 A sensibilidade ao frio de dnaAcos é dominante sobre o alelo de dnaA selvagem, e a sobre-iniciação observada na temperatura restritiva é independente da síntese de proteínas de novo. De forma interessante, não há aumento na quantidade de proteína DnaA neste mutante e pensa-se que o fenótipo do mutante depende da actividade aumentada e/ou prolongada de DnaA. Uma vez que a iniciação com o mutante ocorre repetidamente foi sugerido que, de alguma forma, a competência de iniciação da proteína do mutante DnaAcos é mantida, e. g., através de uma alteração conformacional. 0 mecanismo de sobre-iniciação no mutante não é totalmente compreendido, embora a proteína DnaAcos tenha sido purificada e caracterizada in vitro (Katayama et al., 1995, Mol. Microbiol., 18, 813-820) . Mantém a afinidade para uma sequência de ligação a

DnaA e funciona na aplicação de helicase de DnaB a ADN de cadeia simples. A proteína DnaA selvagem purificada liga-se a ATP e ADP. Todavia, a proteína DnaAcos é incapaz de se ligar a nucleótidos. ATP-DnaA selvagem é activa na iniciação de replicação enquanto que a ADP-DnaA selvagem é inactiva (Sekimizu et al., 1987, Cell, 50, 259-265). A hidrólise de ATP-DnaA selvagem para ADP-DnaA inactiva DnaA para regular a sua função e isto ocorre assim que a bifurcação de replicação está a decorrer para prevenir a reiniciação de uma origem já iniciada (Boye et al., 2000, EMBO Rep. 1, 479-483). A proteína DnaAcos parece ser uma forma "desregulada" da proteína DnaA que está sempre "ligada" e, por isso, provoca excesso de replicação de ADN a temperaturas mais baixas (30 °C). A temperaturas mais elevadas (42 °C) a proteína é aparentemente parcialmente inactiva, explicando que a sobre-iniciação é reduzida em comparação com a temperatura restritiva, e as células, deste modo, sobrevivem.

Foram, ou podem ser, desenvolvidos outros mutantes de DnaA que são semelhantes a, ou possuem as propriedades de DnaAcos (e. g. que apresentam replicação sensível à temperatura) e. g., sobre-inibição de replicação a temperatura mais baixa (e. g., 30 °C) . Um desses mutantes é DnaA219 aqui utilizado nos Exemplos.

DnaA e homólogos desta proteína noutros procariotas ou em eucariotas ou Archaea, representam um exemplo de um alvo para um inibidor de proteína, já que é uma proteína essencial para E. coli e é também altamente conservada entre diferentes espécies bacterianas. Outras proteínas inibidoras de replicação de ADN (sejam eucariotas, procariotas ou archae) também podem representar alvos de inibidor de proteína.

Numa comparação de 104 sequências de 96 espécies, DnaA demonstrou possuir uma sequência primária altamente conservada, e o arranjo global de 15 hélices α e cadeias 9β observado é superior a 93% das sequências (Weigel e Messer 2002, www.molgen.mpg.de/~messer). Além disso, as proteínas iniciadoras Cdc6 e Orc de levedura, e. g. Saccharomyces cerevisiae apresenta uma semelhança estrutural espantosa com DnaA e desse modo representa uma proteína alvo eucariótica (Erzberger et al. (2002) EMBOJ 21: 4763-73, Liu et al., (2000) Mol. Cell. 6: 637-48) .

Mutantes de sobreactividade de proteínas alvo, e. g. mutantes de DnaA que sobre-iniciam a replicação de ADN, podem ser utilizados para ensaio para novos potenciais inibidores de proteína; qualquer inibidor de proteína que interfere com a função da proteína alvo (e. g. DnaA) irá reduzir a quantidade de sobre-iniciação e, deste modo, aumentar o crescimento da 9 população de células mutantes comparadas com o seu crescimento na ausência de um tal inibidor de proteína. Todavia, um tal ensaio permitiria apenas a detecção de inibidores de proteína fracos, i. e., aqueles que apenas reduzem a actividade de DnaA, até níveis normais ou próximo do normal (i. e., até níveis comparáveis com a actividade de DnaA selvagem ou com a actividade da proteína DnaA antes da introdução da mutação de sobreactividade letal ("cos") (i. e., a proteína "fonte" ou de "origem" ou "parental" na qual a mutação de sobreactividade letal é introduzida) ) , de modo a que existe actividade de DnaA suficiente para as células sobreviverem, mas a actividade de

DnaA não é suficientemente elevada para provocar sobre-iniciação, que conduz à morte das células. Pode ser observado que um tal rastreio não permitiria que fosse feita a distinção entre a presença na amostra de um forte inibidor de proteína que iria reduzir severamente a proteína alvo, e. g. níveis de DnaA, e provocar a morte das células devida à falta de iniciação de replicação de ADN, e a ausência na amostra de qualquer inibidor, que causa a morte das células devido a sobre-iniciação. Uma situação análoga pode ser contemplada para outras proteínas alvo, e os seus mutantes de sobreactividade letal.

Como aqui utilizado, "mutação" refere-se às alterações na sequência de nucleótidos e "mutante" refere-se ao gene ou produto genético, ou célula contendo uma tal mutação.

Assim, mesmo quando é identificada uma mutação que permite a utilização de um rastreio "positivo" i. e., um rastreio em que a presença de um inibidor de proteína é indicado por um aumento na viabilidade celular, mais do que uma diminuição, pode ser observado que esses rastreios não são sempre adequados para identificar inibidores de proteína ao longo de um intervalo 10 completo de potência. A raridade relativa de mutantes de sobreactividade letal que provoca a morte celular em virtude da sua actividade aumentada, tal como DnaAcos (ou mutações de sobreactividade análogas noutras proteínas de iniciador de replicação de ADN), em combinação com este facto, significa que não foi imediatamente óbvio, ou directo, como criar um rastreio positivo eficaz para inibidores de proteína.

Para aumentar a eficiência deste tipo de rastreio e, por esse motivo, o intervalo de inibidores que podem ser identificados, os presentes requerentes identificaram um mecanismo pelo qual a utilização de uma segunda mutação na célula contendo a primeira mutação (i. e., sobreactividade letal) compensa qualquer redução severa na actividade da proteína de mutação de sobreactividade letal alvo que pode ser provocada pela presença de um inibidor de proteína forte numa amostra de teste. Esta segunda mutação não afecta o crescimento celular normal ou a sobreactividade letal da primeira mutação, todavia, a sua presença compensa para qualquer redução severa na actividade da proteína alvo causada pela presença de um inibidor de proteína forte na amostra de teste. A segunda mutação, deste modo, salva, ou recupera, a estirpe de uma redução severa ou total da actividade na proteína alvo. Deste modo, os requerentes foram capazes de alcançar um rastreio fiável e positivo eficaz ou ensaio para um inibidor de proteína. 0 gene rnh de E. coli codifica RNaseH. Esta enzima funciona para clivar e, deste modo, degradar o ARN em híbridos ADN:ARN. Deste modo, uma célula contendo uma inactivação funcional de rnh através de e. g., mutação ou deleção do gene irá conter híbridos ARN:ADN persistentes, e a presença desses híbridos permite que ocorra a iniciação de replicação independentemente de DnaA, e 11 independentemente da origem cromossómica OriC. A iniciação de replicação ocorre, por isso, a partir destes híbridos ARN:ADN, que não persiste em células que contêm uma enzima RNaseH funcional. Deste modo, a iniciação de replicação não necessita de OriC ou DnaA, e prossegue na ausência de um sistema de iniciação selvagem totalmente activo. Por exemplo, são conhecidos mutantes rnh parcialmente funcionais que permitem o crescimento de mutantes que são incapazes de utilizar OriC, (Taya e Crouch, 1991, Mol. Gen. Genet., 227: 433-437; Kogoma e von Meyenburg, 1983, EMBO J. 2: 463-8). A combinação das duas mutações, DnaAcos e uma deleção em rnh em E. coli (ou, na verdade noutros organismos) não foi alcançada previamente.

De modo a que as células (e. g., uma população de células) contendo estas duas mutações sejam propagadas, o mutante de sobreactividade letal deve ser "indutível" í. e., capaz de ser "ligado" ou "iniciado" ou expresso apenas em condições particulares, de modo a que a sua expressão possa ser controlada, ou o fenótipo é apenas observado quando no estado induzido. As células são cultivadas (e. g. a população celular é expandida e mantida em cultura) em condições pelas quais a sobreactividade letal não é induzida. 0 ensaio é então realizado nas condições pelas quais a sobreactividade letal é induzida. Isto pode, por exemplo requerer que o gene mutado seja colocado sob o controlo de um promotor indutível ou a mutação pode ser uma mutação sensível a temperatura ou frio, tal como DnaAcos, ou outra mutação condicional.

Os métodos da técnica anterior não têm, desse modo, esses rastreios positivos descritos para inibidores de proteína e 12 antibióticos, e que permitem a detecção de um intervalo total de inibidores.

Assim, num aspecto, a invenção proporciona um método para identificar um inibidor de proteína de uma proteína alvo, de um modo preferido um inibidor de proteína específico, (e. g. identificar a presença de um inibidor de proteína numa amostra de teste) compreendendo o referido método os passos de: a) colocar em contacto o referido inibidor (ou amostra de teste contendo o referido inibidor) com uma célula (e. g., uma população de células), em que a referida célula (e. g., população de células) contém uma mutação de sobreactividade letal indutível num gene que afecta (e. g., o gene que codifica) a proteína alvo (o "primeiro gene") e uma mutação num segundo gene, em que a actividade da proteína alvo é essencial para a célula, e a mutação no segundo gene compensa funcionalmente qualquer redução na actividade do primeiro produto genético (e. g., proteína alvo); b) induzir a mutação da sobreactividade letal; e subsequentemente c) avaliar a inibição da proteína por comparação do grau de sobrevivência da célula (e. g. população de células) na presença e na ausência doo referido inibidor (ou amostra de teste) . 0 método da invenção pode ser assim observado para proporcionar um ensaio para inibidores de proteína e. g., novos inibidores de proteína, de uma proteína alvo desejada. 0 método pode ser assim utilizado para rastrear (ou como um rastreio 13 para) novos inibidores de proteína (que inclui tanto compostos novos como entidades, ou para identificar, ou rastrear, uma nova actividade de inibidor de proteína que existe ou compostos ou entidades conhecidas).

Por "inibidor de proteína" entende-se qualquer composto ou entidade que é capaz de evitar ou reduzir a função normal da proteína alvo, e inclui todas as entidades ou substâncias que são capazes de diminuir directamente ou indirectamente a função da proteína. Isto pode ser conseguido afectando a transcrição, tradução, modificação pós-tradução, actividade ou regulação da actividade da proteína. De um modo preferido, a actividade da proteína é afectada, e mais particularmente, a proteína alvo é uma proteína funcional que apresenta uma actividade particular (e. g., que medeia a sua função). Deste modo, a proteína alvo pode ser uma enzima ou uma proteína de ligação e a inibição pode ser conseguida pela inibição da actividade enzimática ou de ligação da proteína alvo. Isto pode ser conseguido directamente por interacção e/ou interferência com o sitio activo da enzima ou o sítio de ligação da proteína de ligação, ou outro sitio na proteína, por interferência com ou evitando o enrolamento correcto da proteína, de modo que não possua capacidade para a sua função, e. g., não pode reconhecer o seu substrato ou parceiro de ligação ou resíduos de aminoácidos chave, envolvidos nas reacções químicas ou de ligação, não estão na configuração correcta. Uma "proteína de ligação" pode ser qualquer proteína que é capaz de ligar uma molécula ou substância numa célula (i. e., qualquer entidade celular). De um modo preferido, a proteína de ligação é capaz de ligar especificamente tal entidade celular. A proteína de ligação pode exercer um efeito funcional por, ou através de, ligação (e. g., um efeito funcional mediado pela ligação) ou pode ligar-se a uma entidade 14 funcional (i. e., uma entidade que comporta uma função numa célula) . De modo análogo, a proteína alvo pode ser qualquer género de proteína efectora, que possui um efeito funcional na célula e. g., por interacção com outro componente na célula e o inibidor de proteína pode inibir o efeito funcional dessa proteína. A inibição pode resultar em menos do que 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% ou 1% da actividade normal. De um modo preferido, a actividade é completamente eliminada e não permanece qualquer actividade residual da proteína. A "proteína alvo" pode ser qualquer proteína que é essencial à célula. Mais particularmente, a proteína alvo pode ser qualquer proteína que é essencial ao crescimento e/ou sobrevivência da célula. Pode, deste modo, ser uma proteína associada com um processo celular vital, e. g., um processo celular essencial ao crescimento e/ou sobrevivência da célula. Deve ser entendido a este respeito que uma tal a proteína deve ser essencial a esse processo. Por exemplo, a proteína alvo pode ser uma proteína associada com ou envolvida num processo ou reacção de biossíntese, e. g., síntese de um produto celular ou molécula biológica ou intermediário, incluindo, por exemplo, a síntese de ácidos nucleicos (incluindo todas as formas de ADN e ARN que podem ocorrer nas células) e proteínas, assim como outras moléculas que podem ocorrer nas células. Uma proteína alvo pode, deste modo estar envolvida na replicação de ADN (síntese de ADN), síntese de ARN (e. g., transcrição de ADN em ARNm, tradução de ARNm e síntese de proteínas, assim como em outras reacções e processos celulares ou biológicos. A proteína alvo pode ser a proteína associada com a iniciação de qualquer um desses processos ou reacção celular, e. g., um iniciador de 15 replicação de ADN ou de síntese de proteínas. São preferidos as proteínas iniciadoras de replicação de ADN, particularmente as proteínas iniciadoras de replicação de ADN em procariotas, particularmente bactérias, e especialmente em E. coli.

Neste caso, a mutação letal de sobreactividade no primeiro gene resulta assim no aumento da replicação de ADN, e em particular, no aumento da replicação de ADN a um nível letal. A segunda mutação compensa pela redução ou perda da actividade de replicação de ADN (devido a inibição, pela proteína inibidora sob teste, ao proporcionar um mecanismo ou via alternativa para a replicação de ADN (i. e., a segunda mutação resulta em replicação de ADN aumentada, ou em replicação de ADN que não ocorreria na ausência da segunda mutação). A inibição não é medida directamente, mas é medida de modo funcional, na medida em que liberta a célula mutante do ensaio do efeito da mutação de sobreactividade letal na sua sobrevivência e/ou crescimento. A inibição da proteína alvo pode, deste modo, ser medida pela avaliação (e. g., medindo) do número de células de uma população. Um resultado positive é, i. e., a presença de um inibidor de proteína é indicado através de um aumento mensurável ou detectável no crescimento da célula, e. g., um aumento no crescimento celular estatisticamente significativo, por exemplo, pelo menos em dez vezes, vinte vezes, trinta vezes, cinquenta vezes ou um aumento de cem vezes no crescimento celular, por exemplo, medido através de meios apropriados, e. g., espectrofotometricamente pela determinação de um aumento na absorvência da cultura de células (e. g., meio de crescimento) ou aumento na densidade óptica, e. g. DO450 ou outros ensaios espectrofotométricos ou colorimétricos para proteínas ou outros componentes celulares. 0 crescimento pode 16 ser detectado de qualquer forma conveniente ou desejada. Deste modo, como exemplo, colónias de células (e. g., bacterianas) podem ser contadas ou de outro modo enumeradas.

Por inibidor "especifico" de proteína entende-se que o inibidor actua isoladamente, ou de um modo preferido ou selectivamente numa proteína ou classe de proteínas afectadas por uma mutação de sobreactividade letal, e não afecta a função de outras proteínas ou classes de proteínas estruturalmente ou funcionalmente não relacionadas. Assim, "específico" pode ser entendido como referindo-se a espécie a partir da qual a proteína alvo é derivada, ou à classe de proteínas. Um inibidor específico é, deste modo, capaz de distinguir entre diferentes proteínas e apenas será detectado no ensaio se a função da proteína afectada pela mutação de sobreactividade letal for inibida. 0 inibidor específico de proteína irá, de um modo preferido, reduzir a actividade ou a função da proteína. 0 inibidor de proteína pode ser outra proteína, ou um péptido, uma molécula pequena, e. g., uma molécula orgânica pequena, anticorpo, ribozima, ARN ou ADN anti-sentido, ou um análogo do substrato etc. 0 inibidor de proteína pode, assim, ser qualquer entidade química. De um modo preferido, o inibidor de proteína é um antibiótico. 0 antibiótico pode ser derivado de origem natural ou sintético e pode ser um derivado ou variante sintetizado quimicamente a partir de um antibiótico de origem natural. "Colocar em contacto", como aqui utilizado refere-se a proporcionar contacto adequado entre o inibidor (ou amostra de teste) e a célula (e. g. população de células) de modo a permitir que o inibidor (ou componentes da amostra de teste) 17 entre nas células (e. g., permear a membrana celular e/ou a parede celular) e interactuar e/ou interferir directa ou indirectamente com a proteína alvo. Deste modo, o inibidor/amostra de teste pode simplesmente ser colocado em contacto com a(s) célula (s), por exemplo adicionando-o às células ou a um meio contendo a(s) célula (s) e. g. um meio de cultura ou cultura das células. Convenientemente, as células pode ser crescidas (ou cultivadas ou mantidas) num meio líquido ao qual o inibidor/amostra de teste é introduzido ou adicionado. Alternativamente, as células podem estar contidas em ou sobre um meio sólido (e. g., uma placa ou frasco de cultura) ao qual o inibidor/amostra de teste é introduzido ou adicionado. A "amostra de teste" aplicada à célula pode ser qualquer amostra, por exemplo qualquer amostra consistindo em, ou contendo, a substância inibidora de teste (i. e., o inibidor de proteína a ser testado), e. g., uma amostra pura, ou pode representar uma mistura de amostras puras ou uma biblioteca química e. g., preparada por química combinatória. A amostra pode compreender componentes conhecidas e/ou não caracterizadas. Se uma amostra compreendendo compostos não caracterizados revela conter um inibidor de proteína, então a amostra pode ser fraccionada utilizando técnicas convencionais conhecidas na técnica, tais como cromatografia, (e. g., HPLC, cromatografia de camada fina, FPLC, filtração em gel, dessalinização etc.) e as fracções ou isolados resultantes podem então servir como amostras de teste neste ensaio. Deste modo, é possível fazer o rastreio de misturas grandes de amostras com relativamente poucos ensaios, e adicionalmente fazer o rastreio de amostras que contêm componentes novos ou não caracterizados sem primeiro purificar os componentes. É também possível administrar amostras puras ao ensaio. Deste modo, a amostra de teste pode ser 18 qualquer amostra de material puro ou impuro, fornecido em qualquer modo conveniente e. g., pode ser uma própria substância de teste ou pode ser uma composição contendo uma substância de teste (cuja substância de teste pode, ela própria, ser pura ou impura) e um veiculo ou diluente e. g., um meio apropriado. Pode ser uma preparação bruta ou uma preparação purificada ou parcialmente purificada. A amostra de teste pode compreender componentes sintéticos ou que ocorrem naturalmente. Componentes que ocorrem naturalmente podem, por exemplo, ser segregados por microrganismos, tais como bactérias ou fungos, e proporcionar uma gama grande de diversidade quimica. A substância de teste pode, desse modo, ser qualquer substância que pode entrar na célula. Pode, por isso, ser de qualquer natureza química incluindo tanto moléculas complexas como simples e. g., moléculas orgânicas ou inorgânicas.

Se a substância de teste entra nas células ineficientemente ou é bombeada para fora da célula por bombas de efluxo, então as células de teste podem ser modificadas para compensar este facto. Podem ser criadas e utilizadas estirpes permeáveis ou os genes de bombas de efluxo conhecidas podem ser mutados e/ou removidos, ou funcionalmente inactivados. Isto é realizado utilizando técnicas convencionais. A amostra de teste pode ser aplicada a diferentes fracções das células em paralelo ou sequencialmente em várias concentrações diferentes. Todavia, de um modo preferido, é necessária apenas uma única concentração por amostra de teste para assegurar se um inibidor de proteína está presente, devido à sensibilidade do rastreio. 19

As célula(s) utilizadas no ensaio serão, de um modo preferido, uma população de células, de um modo especialmente preferido uma população derivada por clonagem, cujas células individuais são geneticamente idênticas. A(s) célula(s) conterão os dois genes mutados (i. e., o primeiro gene mutado comportando a mutação de sobreactividade letal e o segundo gene "compensatório" mutado). As mutações podem ser introduzidas nos genes, ou os genes mutantes podem ser introduzido, de qualquer modo conveniente ou desejado. As células podem ter sido transfectadas ou transformadas ou transduzidas com os genes mutados, ou os genes podem ter sido introduzidos utilizando outras técnicas de biologia molecular convencionais conhecidas na técnica. Alternativamente as mutações podem ter sido geradas utilizando mutagénese convencional (que pode ser dirigida ou não dirigida, e. g. aleatória) e técnicas de selecção, e. g. por identificação de revertentes, supressores ou mutantes. Por exemplo, supressores sensíveis ao frio de dnaA(ts), tais como DnaACos podem ser identificados por processos de rastreio. Por exemplo, uma célula mutante sensivel à temperatura, que contém uma mutação numa proteina de modo a que a proteína não pode funcionar normalmente à temperatura mais elevada (restritiva) pode ser utilizada como o ponto de partida. Podem ser criados supressores através de processos normais ou mutagénese utilizando técnicas convencionais. Se esses mutantes são, e. g. sensíveis ao frio, esta propriedade pode, de facto, resultar da sobreactividade da proteína, mais do que pela inactividade. Deste modo, é possível identificar mutantes de sobreactividade letal.

As células podem ser quaisquer células e. g., células procarióticas ou eucarióticas, incluindo células de eubactéria e 20

Archae, assim como células vegetais, de fungos ou animais e. g., células de bactérias, mamífero ou leveduras (e. g.,

Saccharomyces sp. e. g., S. cerevisiae ou S. pombe) . De um modo preferido, as células são bacterianas, de um modo mais preferido as células são E. coli.

Numa forma de realização muito preferida, as células (de um modo preferido células bacterianas) contêm uma mutação de sobreactividade letal em DnaA e uma mutação que inactiva RNaseH (e. g., uma deleção de rnh). Um tal mutante particularmente preferido, DnaA219árnh, é descrito nos Exemplos aqui identificado como estirpe SF53 como depositado na European Collection of Cell Cultures (ECACC), Porton Down, UK, em 6 de Maio de 2003 com o número de acesso 03050701. O depósito foi realizado em nome de The Norwegian Radium Hospital Research Foundation, de P.O. Box 56, Montebello, 0310 Oslo, Noruega.

Noutro exemplo representativo, a mutação de sobreactividade letal está no gene Cdc6 ou num gene Orc. Cdc6 e Orc são genes que codificam proteínas iniciadoras de replicação em eucariotas. O termo "mutação", como aqui utilizado, refere-se a uma ou mais alterações na sequência de nucleótidos de um gene. A alteração pode representar a adição, deleção ou substituição de nucleótidos nas regiões codificantes ou não codificantes do gene e pode afectar a função do produto genético, e. g., proteína codificada pelo referido gene ou pode afectar o controlo de expressão do referido gene. Por exemplo, a mutação pode provocar sobre-expressão i. e., um aumento nos níveis de expressão, quando comparado com um gene (e. g., um gene selvagem ) que não possui esta mutação. Alternativamente, a mutação pode conduzir a alterações na estrutura primária, secundária ou terciária do 21 produto da proteína. Essas alterações podem afectar a função da proteína quando comparadas com a forma não mutada (e. g., selvagem) da proteína. As alterações na função podem estar relacionadas com a actividade aumentada provocada por e. g., alteração da ligação de substratos ou cofactores, mecanismos alterados de regulação ou localização.

Por "mutação de sobreactividade letal" entende-se que a alteração genética ou mutação, como definido acima, provoca um aumento na actividade da proteína alvo, quando comparada com a forma não mutada da proteína i. e., a forma da proteína como produzida antes de ou sem a mutação de sobreactividade letal (e. g., como codificado pelo gene selvagem) e este aumento na actividade diminui a viabilidade das células contendo a mutação. A mutação de sobreactividade letal pode estar em qualquer gene afectando a proteína alvo, embora geralmente esteja no gene que codifica a proteína alvo. Adicionalmente aos genes que codificam uma proteína alvo, um gene afectando a proteína alvo pode incluir qualquer gene que codifica um produto genético que possui um efeito na actividade da proteína alvo e. g., uma molécula reguladora. 0 aumento na actividade da proteína pode resultar de um aumento na expressão da proteína, ou de uma alteração estrutural ou funcional na proteína (ou sua regulação), e pode provocar uma diminuição na taxa de crescimento das células contendo a mutação ou pode provocar a morte das células. A mutação pode afectar a actividade de qualquer proteína da célula e. g., uma enzima ou uma proteína estrutural, um receptor ou proteína de sinalização, ou na verdade qualquer outra proteína funcional ou efectora, desde que a sobreactividade desta proteína diminua o crescimento 22 e/ou viabilidade celular. 0 fenótipo detectável de uma célula contendo tal mutação de sobreactividade letal (i. e., um mutante de sobreactividade letal) é, deste modo, uma redução na capacidade para crescer, dividir e/ou sobreviver.

Como discutido acima, a mutação de sobreactividade letal está, de um modo preferido, num gene envolvido na replicação de ADN, de um modo mais preferido num gene envolvido na iniciação da replicação de ADN, de um modo muito preferido um gene envolvido na iniciação da replicação de ADN procariótica e especialmente bacteriana e. g., o gene dnaA. Mutações no gene dnaA incluem dnaAcos e incluem a mutação dnaA219 da proteína de iniciação de E. coli DnaA, como aqui descrito no Exemplo 1 abaixo. A proteína alvo preferida é, deste modo, um iniciador de replicação de ADN. Pode ser utilizado qualquer iniciador de replicação de ADN, incluindo tanto de fontes procarióticas (incluindo archae) como eucarióticas. Por iniciador de replicação de ADN entende-se uma proteína que se liga à origem de replicação, provocando assim o início do processo de replicação de ADN i. e., uma proteína é responsável pelo primeiro passo, ou inicial, no processo de replicação de ADN. Proteínas de iniciador de replicação eucarióticas incluem proteínas Cdc (e. g., proteínas Cdc6, Cdcl8 e Cdc45, Cdt (e. g., Cdtl), proteínas Orc (e. g., Orcl) e proteínas MCM (Liu et al., 2000, Mol. Cell 6: 637). Também podem ser utilizados homólogos e ortólogos de qualquer dessas proteínas (e. g., noutra espécie).

Em eucariotas, a replicação inicia-se com um complexo ORC de seis sub-unidades ligado à origem, à qual são recrutadas Cdc6, MCMs e Cdc45. Archaea contém ortólogos de várias proteínas de 23 replicação eucariótica, incluindo Cdc6 e MCMs. Pensa-se que a replicação de Archaea funcione analogamente à dos eucariotas, mas com menos complexidade. Archae não contêm quaisquer homólogos óbvios de Orc, mas Orcl possui homologia com Cdc6, por isso pensa-se que em archaea a proteína "Cdc6/0rc" (i. e., o homólogo de Cdc6) pode desempenhar ambos os papéis. Cdc6/0rc de uma espécie de archae e DnaA foram cristalizadas recentemente e demonstraram ser proteínas estruturalmente semelhantes.

Contanto que os iniciadores de replicação de ADN são preferidos como proteínas alvo, como mencionado acima, pode ser utilizada qualquer proteína iniciadora, i. e., qualquer proteína envolvida na iniciação de qualquer processo celular e. g., transcrição, ou tradução no processo de síntese de proteínas.

As versões mutantes dessas proteínas que exibem sobreactividade letal podem ser geradas e/ou identificadas utilizando processos convencionais, como discutido acima. No caso de certas proteínas, mutantes apropriados que podem ser utilizados, são já conhecidos e foram descritos na literatura. Estes incluem mutantes de DnaA (e. g., DnaAcos e DnaA219 mencionados acima) e de proteínas Cdc e. g., Cdc6 em leveduras. Deste modo, por exemplo na levedura Saccharomyces cerevisiae, mutantes de cdc6 (cdc6-3 e cdc6-2) sobre-replicam mesmo a temperatura permissiva e morrem a temperatura não permissiva (Liang e Stillman, 1997, Genes Dev. 11:3375). Na levedura Schizosaccharomyces pombe, Cdc6 é denominado Cdcl8. Células que possuem sobreactividade de Cdcl8, sobre-replicam (Nishitani e Nurse, 1995, Cell 83: 397; Muzi-Falconi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. 93:1566). 24 0 termo "indutível", como aqui utilizado, refere-se à capacidade para ligar e desligar o fenótipo mutante da célula contendo o mutante de sobreactividade letal. Existem, deste modo, dois estados - o estado não induzido em que a célula é capaz de crescer e dividir normalmente, e o estado induzido no qual esta capacidade é comprometida pelo ligar da mutação. Esta "indutibilidade" pode ser conseguida de vários modos. Como um exemplo, para um mutante de sobreactividade letal dominante que é introduzido na célula adicionalmente à existência de um gene selvagem, e que possui um efeito dominante em relação ao gene selvagem, na medida em que o fenótipo mutante é observado apesar da presença do gene selvagem, o gene mutante pode ser colocado sob o controlo de um promotor indutível. De um modo semelhante, quer seja dominante ou não, quando está presente apenas a versão do mutante de sobreactividade letal do gene (ou é activa) na célula (e. g., quando um gene "normal" ou selvagem está ausente ou foi inactivado, e. g., desactivado) , pode ser utilizado um promotor indutível. Este promotor requer a presença de um certo componente (i. e., efector) no meio de crescimento para a transcrição do gene que foi colocado artificialmente sob o seu controlo para ocorrer. Deste modo, não ocorre transcrição do gene mutante (e. g., gene mutante exógeno) na ausência deste componente (efector) e desse modo não é produzida proteína mutante. Na presença do componente/efector, o gene mutado é transcrito e a proteína mutada é, deste modo, produzida. Se o mutante de sobreactividade letal é dominante, a sua presença irá afectar a viabilidade celular, mesmo na presença da proteína "não-mutada" (e. g., selvagem). Na ausência da proteína "não- mutada" (ou na ausência da sua actividade), o efeito de qualquer mutação de sobreactividade letal será, de igual modo, observada. Por exemplo, o gene mutante pode ser colocado sob o controlo do promotor lac, o promotor λ ou o promotor da arabinose. 25

Alternativamente, o fenótipo mutante da proteína pode ser induzido por meios condicionais, í. e., a mutação de sobreactividade letal pode ser uma mutação condicional, em que o fenótipo mutante da proteína alvo é induzido por uma alteração numa ou mais condições (e. g., parâmetros) relativas à célula (e. g., temperatura ou outras condições de cultura, idade, nutrição). As condições restritivas são aquelas em que o fenótipo mutante é observado, enquanto que as condições permissivas são aquelas em que o fenótipo mutante é função do gene suprimida (e. g., resultando numa função de gene não sobreactivo e. g. níveis de actividade selvagem ou normal) (i. e., "não mutado") . Deste modo, o fenótipo mutante da proteína mutante pode ser induzido por uma alteração na temperatura da célula. As mutações sensíveis a temperatura ou ao frio são largamente conhecidas na técnica e resultam das alterações na estrutura primária (i. e., a sequência de aminoácidos) da proteína mutada. Certos aminoácidos em posições chave numa proteína podem conferir sensibilidade à temperatura. A estrutura secundária das alterações de proteína após um desvio na temperatura de crescimento da célula contendo a proteína mutada.

As alterações na conformação da proteína a diferentes temperaturas podem resultar em alterações nas propriedades da proteína. Por exemplo, a proteína pode tornar-se excessivamente activa a uma temperatura, enquanto que se comportam essencialmente do modo normal, selvagem a outra temperatura. Alternativamente, a proteína pode funcionar normalmente, í. e., com níveis de actividade selvagem a uma temperatura e ser tornada inactiva ou possuir actividade reduzida pela alteração na temperatura. A temperatura à qual uma proteína se comporta 26 normalmente é denominada a temperatura permissiva. A temperatura à qual uma proteína apresenta as propriedades de mutante, e. g., actividade reduzida, aumentada ou diferente é denominada a temperatura restritiva.

Estes mutantes sensíveis à temperatura ou sensíveis ao frio demonstraram ser muito úteis para estudar os efeitos de mutações letais. 0 crescimento e a propagação da célula ou organismo à temperatura permissiva permite a expansão e perpetuação de células contendo proteínas com as mutações em questão.

Sujeitando as células ao desvio de temperatura e, desse modo revelando o fenótipo mutante, é possível estudar a função de mutações de outro modo letais. As mutações sensíveis à

temperatura e ao frio são vantajosas na medida em que a alteração na estrutura e função da proteína ocorre no desvio da temperatura, e não tem uma fase de retardamento, como pode ser observado quando são utilizados outros sistemas indutíveis, por exemplo a adição de um indutor de transcrição. É assim preferido que os mutantes de sobreactividade letal da invenção sejam sensíveis à temperatura ou ao frio. De um modo muito preferido, a temperatura restritiva é de 30 °C e a temperatura permissiva é de 42 °C

Por "proteína alvo" entende-se uma proteína que foi identificada como sendo essencial ou crucial para o crescimento e/ou sobrevivência da célula na qual está contida ou é expressa, e para a qual é desejável identificar um inibidor e. g., para utilização como um fármaco candidato contra a proteína alvo. Assim, por exemplo a proteína alvo pode ser crucial ou essencial para um patogénio, ou para a existência continuada de um estado de doença. Como mencionado acima, certas proteínas podem estar associadas a estados de doença particulares e. g., cancro, e 27 podem, por isso representar alvos potenciais para fármacos. Como também discutido acima, os fármacos que interferem com estas proteínas alvo podem ser identificados em rastreios pelos quais o efeito de um fármaco potencial numa proteína alvo é medido através do efeito do fármaco no fenótipo de uma célula que requer essa proteína alvo para o seu crescimento e/ou sobrevivência.

De acordo com a invenção, a proteína alvo é mutada de um modo que é uma mutação sobreactiva letal, i. e., possui actividade aumentada ou excessiva quando comparada com a proteína não mutada ou selvagem. Deste modo, é a redução da sobreactividade da proteína alvo mutante, que é avaliada no ensaio. Isto proporciona um ensaio positivo no sentido em que a redução na actividade da proteína mutante letal sobreactiva é detectada. Se as células contendo a proteína sobrerreactiva mutante sobrevivem, então pode ser observado que a substância de teste compreende um composto que reduz a sobreactividade da proteína alvo mutada. Esse composto possui potencial para utilização como um fármaco para interferir com a actividade normal da proteína alvo, e para, deste modo, reduzir a infecção ou para combater o estado da doença em questão.

Como mencionado acima, a proteína alvo pode ser qualquer proteína funcional, (e. g., qualquer proteína efectora) mas é, de um modo preferido, uma enzima ou uma proteína de ligação, particularmente uma enzima ou proteína de ligação que está envolvida no metabolismo do ADN. Especialmente preferida é uma proteína que está envolvida na replicação de ADN cromossómico, tal como DnaA bacteriano (e. g., E. coli) ou um seu homólogo.

Homólogos de DnaA pode ser encontrados noutras espécies, tais como E. coli, S. enterica, S. marcescens, P. mirabilis, B. 28 aphidicola, Y. pestis, V. harveyi, V. cholerae, P. putida, P. aeruginosa, P. multocida, H. influenzae, S. putrefaciens, C. crescentus, R. melílotí, z. mobilis, R. prowazekii, Wolbachia sp., H. pylori, C. jejuni, B. pertussis, N. meningitidis, T. ferrooxidans, C. difficile, B. subtilis, B. halodurans, B. anthracis, S. aureaus, S. pneumoniae, M. capricolum, M. genitalium, M. pneumoniae, U. urealyticum, S. citri, E. faecalis, M. luteus, C. diphtheriae, M. leprae, M. avium, M. tuberculosis, M. smegmatis, S. coelocolor, S. chrysomallus, P. marinus, Synechocystis sp., C. pneumoniae, C. trachomatis, C. muridarum, B. burgdorferi, T. pallidum, T. denticola, T. marítima, T. thermophilus, D. radiodurans, A. aeolicus, C. tepidum, D. ethenogenes, P. gingivalis. Também podem ser utilizadas outras proteínas envolvidas na replicação de ADN e. g., as proteínas eucarióticas Cdc6/0rc mencionadas acima ou quaisquer outros iniciadores de replicação. A mutação no segundo gene é necessário para permitir a detecção de inibidores de proteína fortes, que normalmente não seriam detectadas no caso de um simples rastreio positivo. Num rastreio positivo normal, de mutante único, positivo em que é utilizada uma célula compreendendo um mutante de sobreactividade letal único, um inibidor de proteína que compromete a actividade do mutante sobreactivo, de modo que a actividade é reduzida, mas não completamente eliminada, pode provocar a sobrevivência da célula, ou apresentar um aumento na sobrevivência ou crescimento na presença de um tal inibidor quando comparada com as células mutantes cultivadas na ausência de um tal inibidor. Todavia, se um inibidor forte, que elimina substancialmente ou completamente a função do mutante de sobreactividade letal está presente (e. g., na amostra de teste), então as células mutante morrerão, independentemente da presença de um tal inibidor. Por esta 29 natureza, a proteína alvo que contém a mutação de sobreactividade letal, é essencial para a sobrevivência continuada e/ou crescimento e propagação da célula e é por esta razão que torna uma proteína alvo adequada, e é através desta propriedade que a inibição da proteína alvo é medida. Todavia, não é possível, num tal sistema diferenciar entre um inibidor forte, que previna a sobrevivência de células contendo o mutante sobreactivo letal por inibição completamente ou significativamente da actividade da proteína alvo mutada, que é essencial para a sobrevivência continuada desta célula, e na ausência de qualquer inibição, em cujas condições as células não podem sobreviver. Deste modo, qualquer rastreio positivo que utiliza uma única mutação de sobreactividade letal está limitado em relação à força das inibições que podem ser detectadas no referido rastreio, na medida em que apenas inibidores fracos, ou inibidores mais fortes utilizados apenas em quantidades pequenas, são detectados.

Os requerentes desenvolveram um novo ensaio no qual uma segunda mutação que também está presente na célula, permite que a célula sobreviva se o inibidor de proteína for suficientemente forte (ou estiver presente em quantidades suficientemente elevadas) para eliminar completamente a função da proteína alvo, ou para a reduzir até um nível abaixo do qual a célula pode sobreviver e/ou crescer. A segunda mutação substitui e compensa à falta de actividade da proteína alvo provocada por qualquer redução na actividade pelo inibidor de proteína e o seu fenótipo é, deste modo, apenas detectável quando a actividade do primeiro mutante de sobreactividade letal é reduzido, na medida em que o mutante de sobreactividade letal é dominante. A segunda mutação pode ser a 30 inserção de um novo gene ou genes, cujo(s) produto (s) podem funcionar para compensar a falta de actividade da proteína alvo. Alternativamente, a mutação pode ser uma mutação que inactiva um gene/produto genético particular, ou reduz substancialmente a sua expressão e/ou actividade e. g., uma mutação sem sentido num gene ou deleção que remove o produto ou o produto funcional do gene da célula. A mutação no segundo gene permite a sobrevivência continuada e o crescimento da célula na presença de um inibidor forte (ou de concentrações ou quantidades elevadas de inibidor), que reduz a actividade da proteína alvo. A mutação no segundo gene pode, assim, actuar ao mesmo nível ou a jusante do mutante de sobreactividade letal. Assim, quando a mutação de sobreactividade letal está num iniciador de um processo celular, a segunda mutação permite que este processo prossiga na ausência de qualquer iniciador funcional deste processo. Por exemplo, quando o mutante de sobreactividade letal está num iniciador de replicação de ADN e. g., em procariotas, e resulta numa proteína iniciadora de replicação de ADN sobreactiva (e. g., DnaA), provocando sobreiniciação de replicação de ADN, a segunda mutação, de um modo preferido, é aquela que permite que a replicação de ADN prossiga na ausência da proteína iniciadora de replicação de ADN funcional (e. g. DnaA), e. g. proporcionando um mecanismo de replicação alternativo. Assim, por exemplo, a referida mutação pode ser qualquer mutação que inactiva o gene rnh que codifica RNase H e é, de um modo muito preferido a deleção de rnh.

Por "compensa funcionalmente" entende-se que uma actividade adicional ou alternativa é introduzida ou removida (ou substancialmente reduzida) numa célula mutante. A compensação 31 reside assim em proporcionar um meio pelo qual a célula pode continuar a funcionar essencialmente de modo normal, apesar da ausência ou redução da actividade de uma proteina alvo chave. A segunda mutação pode, deste modo, compensar funcionalmente qualquer redução na actividade do primeiro produto genético (i. e., uma proteina alvo), abaixo de um nivel sustentável de viabilidade (i. e., se a actividade da proteina alvo cai para abaixo de um nivel no qual a célula pode sobreviver e/ou crescer. A actividade da proteina alvo não é medida directamente e é medida num ensaio funcional.

Por exemplo numa via de sinalização linear, a proteina alvo pode estar "a montante" da actividade alternativa. Ao proporcionar uma proteina activa a jusante da actividade bloqueada, a via de sinalização continua a funcionar e a célula que está dependente desta via sobreviverá na ausência de um sinal funcional a montante. A actividade alternativa pode, deste modo, estar a jusante ou actuar num ponto mais tardio numa via de sinalização. "Grau de sobrevivência", como aqui utilizado, refere-se à avaliação (e. g., medição) do crescimento e proliferação das células utilizadas no ensaio. As células serão mortas (ou serão incapazes de crescer) pela mutação de sobreactividade letal, quando esta é induzida, na ausência de um inibidor de proteina que irá inibir o efeito da proteína alvo. Isto, deste modo, representa um grau de sobrevivência de "zero" i. e., nenhuma célula sobrevive, ou nenhuma célula é capaz de crescer e dividir. Após indução da mutação de sobreactividade letal, pode demorar um certo período de tempo até as células morrerem. Por exemplo, normalmente demora aproximadamente 3 horas após a indução de uma mutação sensível à temperatura letalmente 32 sobreactiva em bactérias até que as células morram. Na presença de um inibidor de proteína especifico que reduz a actividade do mutante de sobreactividade letal, um número aumentado de células sobreviverá e poderá proliferar. Assim, o grau de sobrevivência está correlacionado com o número de células presentes (e. g., no meio de crescimento ou cultura celular) após a indução da mutação de sobreactividade letal e a adição do inibidor (ou amostra de teste). 0 inibidor (ou amostra de teste) pode ser adicionada simultaneamente com a indução da mutação de sobreactividade letal ou subsequentemente. Se a indução da mutação de sobreactividade letal ocorre através de um desvio de temperatura, então é preferível que o inibidor (ou amostra de teste) seja adicionado simultaneamente com a indução da mutação de sobreactividade letal. Se a indução da mutação de sobreactividade letal requer a síntese de proteínas de novo, então o inibidor (ou amostra de teste) deve ser adicionado subsequentemente à indução da mutação de sobreactividade letal, de um modo preferido num momento em que a síntese de proteínas tenha ocorrido e. g., 3-5 horas ou 5-8 horas após a indução da mutação de sobreactividade letal.

Isto pode ser realizado determinando e. g., por estimativa ou avaliação (e. g., por contagem ou medição) o número de células (e. g., células vivas) num ponto de tempo definido na presença e ausência de amostra de teste. As células podem ser enumeradas espectrofotometricamente e. g., por medição da densidade óptica da população de células a um comprimento de onda apropriado e. g., um comprimento de onda de 4 50 nm ou contando directamente as células, ou uma proporção representativa da amostra de células. Se as células forem crescidas em meio sólido, o número de colónias pode ser determinado. 33

Como mencionado acima, se a indução da mutação de sobreactividade letal ocorre num desvio de temperatura, o inibidor ou amostra de teste deve ser colocado em contacto com as células logo após e. g., 1 geração ou simultaneamente com a indução da mutação de sobreactividade letal. Isto representa o tempo zero. A determinação dos números relativos de células pode então ser realizada a intervalos de tempo apropriados, e. g. 3-30, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10, 8-12, 8-10, 3-5 gerações após o tempo zero, ou após um período de incubação apropriado e. g., incubação durante a noite de 8-30 horas, 8-24 horas, 8-18 horas,8-12 horas, 12-30 horas, 12-24 horas, 12-18 horas, 18-30 horas, 18-24 horas, 20-30 horas, 20-24 horas. Nesta altura, o número de células na população de células induzidas na ausência de substância de teste é o valor de controlo. O número de células nesta população de células é comparado com o número de células na população de células induzidas que tenham sido colocadas em contacto com o inibidor/amostra de teste. Por exemplo, um aumento na DO450 de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em relação ao valor na ausência do inibidor/amostra de teste indica a presença de um inibidor de proteína na substância de teste.

Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se a células para utilização no método da invenção. Uma tal célula contém uma mutação de sobreactividade letal indutível, de um modo preferido sensível à temperatura e. g., ao frio, num primeiro gene afectando (e. g., codificando) uma proteína alvo, cuja actividade é essencial para a célula, e uma segunda mutação (e. g., num segundo gene) que compensa funcionalmente qualquer redução da actividade do primeiro produto genético (i. e., da 34 proteína alvo), por exemplo uma redução de actividade provocada por um inibidor de proteína.

Como mencionado acima, a célula pode ser eucariótica ou procariótica incluindo células de Archae e. g., células de leveduras, ou de mamíferos. De um modo preferido, a célula é eubacteriana e. g., E. coli.

De um modo mais preferido, a célula é um mutante dnaA219Arnh, de um modo preferido derivado da estirpe WM2667, e de um modo muito preferido, a célula é depositada como estirpe SF53, como definido acima, contendo a mutação DnaA219cosArnh, com as características apresentadas na Tabela 1.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um kit para realizar o ensaio, compreendendo células para realizar o ensaio. 0 kit pode também compreender meio de crescimento e/ou antibióticos para realizar o ensaio.

Podem ser identificados inibidores de proteína (e. g., novos inibidores de proteína) pelo método de ensaio da invenção, particularmente inibidores de replicação de ADN, especialmente inibidores de replicação de ADN bacteriana, e podem ser utilizados como agentes antimicrobianos. A invenção será agora descrita em maior detalhe nos Exemplos seguintes, não limitantes, com referência aos desenhos em que: A Figura 1 apresenta curvas de crescimento da estirpe de teste SF53 (dnaA219, rnh::cam) e da estirpe SF58 (dnaA219, rnh::cam/pdnaA[1-86]-biotina); 35 A Figura 2 apresenta a análise de viabilidade de células SF58 cultivadas com diferentes quantidades de IPTG (0, 0,25, 0,5 e 1 mM) a 30 °C; A Figura 3 apresenta as curves de crescimento de SF53 e SF58. O inoculo foi uma diluição 1:100 de D06oo a 1,5 de cultura de um dia para o outro. A temperatura de incubação foi de 30 °C, a DO405 foi medida a cada 900 s. Nem SF53 nem SF58 apresentam qualquer crescimento apreciável nestas condições até l,5xl05 s (aproximadamente 42h) ; A Figura 4 apresenta a curva de crescimento de SF58 com IPTG a concentrações de 0 a 10 mM. O inoculo foi uma diluição de 1:100 de cultura de um dia para o outro de D06oo de 1,5. A temperatura de incubação foi de 30 °C, a DO405 foi medida a cada 900 s. Após 18 horas (6,4xl04s) as DOs das culturas induzidas (IPTG a 0,31 mM e superior) são significativamente superiores aos controlos (0 a 0,16 mM de IPTG); A Figura 5 apresenta da Frequência de Distribuição do valor de DO620 de controlos positivos (SF58 + IPTG a 2,5 mM) e negativos (SF53 e SF58). Os valores do controlo positivo são agrupados à volta de 1,1 de D062o e os valores de controlo negativo estão agrupados à volta de 0,1 de D062o; A Figura 6 apresenta a Frequência de Distribuição do valor de DO620 de 4240 extractos Microbianos. A maioria das amostras possui uma D062o próximo de 0,1; e A Figura 7 apresenta o sinal da D062o dos 41 extractos Microbianos positivos. 36

EXEMPLOS

Exemplo 1

Construção da estirpe de teste SF53 WM2667 é um supressor sensível à temperatura de WM2062 (dnaAtS46, Weigel et al., 1999, Mol. Microbial, 34: 53-66). WM2667 é muito idêntico ao mutante dnaAcos (Kellenberger-Gujer et al., supra) na medida em que é um mutante de dnaA sensível ao frio. Os mutantes crescem normalmente a temperatura permissiva (42 °C), todavia após crescimento à temperatura restritiva, 30 °C durante 4 horas, menos de 10% das células permanecem viáveis. A 30 °C, as células acumulam 3-4x mais ADN de OriC do que os marcadores de controlo (dnaB, dnaC e attA). O crescimento pode ser restaurado pela introdução de um plasmídeo OriC ou sobre-expressão moderada da proteína Fis.

Existem três mutações presentes no gene dnaA de WM2667; A184V e H252Y estão ambos presentes no gene dnaA da estirpe parental, enquanto que R342C representa uma mutação adicional apenas encontrada em WM2667. O alelo dnaA é denominado dnaA219 (cos).

De modo a construir uma estirpe que pode sobreviver à condição em que a proteína DnaA219 é completamente inactivada, foi introduzida a deleção do gene rnhA na estirpe WM2667 por transdução com Pl, de acordo com processo convencional (Miller et al. (1992), A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for E. coli and related bactéria (Cold Spring Harbour Press)). 37

Lisado de PI da estirpe SS198:

Uma cultura de um dia para o outro de SS198 (rnh::cam) foi diluído 1:100 em 10 mL de LB + cloranfenicol e crescido até uma DO=0,3. Foi adicionado CaCl2 a 10 mM e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. Foi adicionado 100 pL de stock de PI e incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos. A incubação foi continuada a 37 °C com agitação durante 4 horas. Foi adicionado 1 mL de clorofórmio e incubado a 37 °C durante 15 minutos. O tubo foi centrifugado, o sobrenadante foi transferido para um tubo novo.

Transdução de rnh::cam para WM2667:

Foi adicionado CaCl2 a 15 mM e MgCl2 a 15 mM a uma cultura de um dia para o outro da estirpe WM2667 e incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi adicionado 500 pL de lisado de PI a 1 mL de cultura de um dia para o outro e incubado a 37 °C durante 15 minutos. O tubo foi centrifugado e a cultura foi lavada em LB+citrato de Na a 50 mM. A cultura foi ressuspensa em 150 pL de LB+citrato de Na a 50 mM, e incubado a 37 °C durante 1 hora. Toda a cultura foi plaqueada em placas de LB com antibióticos apropriados. A estirpe resultante, SF53 (dnaA219 rnh::Cam) não tem a proteína RNase H. Esta estirpe cresce normalmente a 42 °C, mas não sobrevive a 30 °C. Caso contrário, possui o mesmo genótipo que WM 2667. 38 A estirpe SF53 não sobrevive a 30 °C. Para investigar a frequência da reversão da sensibilidade ao frio foi realizada a seguinte experiência. Uma cultura de SF53 cultivada de um dia para o outro a 42 °C foi diluida a 1:1000 em meio ABBi glucose CAA fresco e a cultura continuou a 42 °C até que a DO450 tivesse alcançado cerca de 0,15 (i. e., cerca de 4 gerações). 0 tempo de duplicação da cultura foi de cerca de 90 minutos. Foram plaqueadas várias diluições diferentes da estirpe em placas de ABBi glucose CAA e as placas foram incubadas quer a 30 °C ou 42 °C. As colónias foram contadas após 18, 24 e 42 horas. As placas que tinham sido incubadas a 42 °C apresentaram cerca de 107 colónias por mL de cultura plaqueada e indicam que 1 mL de cultura de SF53 com uma DO450 de 0,1 contém 107 células viáveis. As placas incubadas a 30 °C durante 18 e 24 horas apresentaram cerca de 10 colónias por 1 mL de cultura plaqueada. Isto significa que 1 célula em cada 106 já não era sensível ao frio. As placas que foram incubadas durante 42 horas tinham um aumento de 5 a 10 vezes de aumento no número de colónias resistentes ao frio, demonstrando que incubação prolongada provoca um número mais elevado de revertentes.

Exemplo 2

Sobrevivência da estirpe SF53 na ausência de actividade de

DnaA

Foram efectuadas as seguintes experiências para proporcionar evidência de que a estirpe SF53 sobrevive quando um fármaco inactivou a proteína DnaA. Esta evidência pode ser obtida sem um fármaco líder, utilizando a produção do domínio N-terminal

(aminoácidos do Domínio I de 1 até 86) de DnaA selvagem. O 39 domínio I de DnaA é importante para oligomerização e formação de complexos de iniciação apropriados. Se o Domínio I é sintetizado de modo independente, serão formados hetero-oligómeros inactivos de DnaA e Domínio I, levando assim a um "envenenamento" dos complexos de iniciação. A estirpe SF53 foi transformada com um plasmídeo comportando um gene indutível por IPTG que codifica o Domínio I marcado com biotina (pBEX5BA-dnaã[l-86]-biotina), os transformantes foram avaliados, e a estirpe foi denominada SF58 (Tabela 1).

Tabela 1: Estirpes

Estirpe WM2667 SF53 SF58

Genótipo argE3, del(lac-pro),dnaA219(Cos) , galK2, his-4, lacYl, lambda-, leuB6, mtl-1, rpsL31, supE44, thi-1, tsx-33, xyl-5 (derivado de AB1157) WM2667rnh::Cam SF53/pBEX5BA-dnaA[l-86]-biotina

Referência (Weigel et al., 1999) este trabalho este trabalho, (Weigel et al., 1999) 0 crescimento da estirpe SF58 foi testado em três diferentes concentrações de IPTG. Uma cultura de um dia para o outro da estirpe SF58 cultivada a 42 °C foi diluída 1:1000 em meio CAA ABB1 glucose CAA fresco e separada em cinco frascos. As culturas n° 1 a 4 foram cultivadas a 30 °C e a cultura n° 5 a 42 °C. O IPTG foi adicionado à cultura n° 2, 3 e 4 a uma concentração de 0,25, 0,5 e 1 mM, respectivamente, na altura da diluição. As curvas de crescimento foram seguidas através da medição da DO450 40 durante 8 horas. A experiência mostra que a cultura n° 1 cultivada a 30 °C sem IPTG não sobrevive (Figure 1). A DO450 era inferior a 0,03 em todos os pontos. Este resultado confirma que a estirpe dnaA219rnh não sobrevive a 30 °C. A cultura de controlo (n° 5) cultivada a 42 °C apresentava um tempo de duplicação de cerca de 60 min. As três culturas cultivadas a 30 °C com IPTG apresentaram taxas de crescimento aumentadas com uma concentração crescente de IPTG e possuindo assim concentrações da proteína do domínio I (ver abaixo). Este resultado mostra que o crescimento da estirpe a 30 °C foi restaurado através da indução do Domínio I, e que a taxa de crescimento melhorou com quantidades crescentes de Domínio I.

As concentrações de Domínio I presentes após 4 gerações cultivadas na presença das três diferentes concentrações de IPTG, foram avaliadas por transferência de Western. Foi obtida uma diferença de dez vezes na DO450 entre a cultura cultivada sem IPTG (cultura n° 1) e a cultura cultivada com 1 mM de IPTG (cultura n° 4) após cerca de 10 horas. Deste modo, quando se realiza um rastreio de fármaco com a estirpe dnaA219rnh, será detectado um positivo através de uma diferença de dez vezes na DO450 após cerca de 10 horas na presença do fármaco.

Para determinar a robustez do rastreio e, também, a que tempo, num ensaio de elevado desempenho, é óptimo medir a diferença na DO450, realizaram-se as seguintes experiências (Figura 2) . Essencialmente foi realizada a mesma experiência como na Figura 1, mas a DO450 foi medida apenas em três pontos de tempo, 20 h, 27 h e 48 h, em 10 diferentes culturas paralelas. Foi obtida uma diferença 20-40 vezes após 20 h e após 27 h. Após 48 h, um ruído de fundo na cultura não induzida começou a 41 aparecer e a diferença caiu para cerca de 5 vezes. Deste modo, as medições de DO450 em rastreios de elevado desempenho devem ser efectuadas após 10-30 horas de incubação.

Exemplo 3

Processo de rastreio de elevado desempenho

Uma cultura de um dia para o outro da estirpe SF53 cultivada em meio ABBi glucose CAA a 42 °C foi diluida 1:1000 em meio fresco e distribuída num número apropriado de placas de microtitulação de 96 poços. São adicionadas diferentes substâncias de teste, uma para cada poço de microtitulação, excepto em dois poços em cada placa. Estes dois servem como brancos i. e., culturas de referência sem crescimento. As placas de microtitulação foram incubadas a 30 °C durante 20-24 h, depois foi medida a DO450. Os positivos foram encontrados em poços com medições de DO 10-100 vezes superiores às amostras de branco.

Exemplo 4

Validação do ensaio A primeira parte de um ensaio de transferência & processo de validação envolve a reprodução de resultados num formato de microtitulação. Estes resultados estão apresentados na Fig. 3, que indica que nem SF53 nem SF58 apresentam qualquer crescimento apreciável quando incubadas num formato de microtitulação a 30 °C durante até l,5xl05 s (aproximadamente 42 h) . Todas as 42 48 culturas de replicação da mesma microplaca da Fig. 3 se comportaram de modo semelhante. Depois, as curvas de indução de IPTG foram reproduzidas, como apresentado na Fig. 4. 0 SF58 pode apresentar uma DO405 significativamente superior ao controlo, logo após 3xl04 s (aproximadamente 8 h) . Adicionalmente, após 18 h (6,4xl04 s) as DO's das culturas induzidas estão bem acima dos controlos. Estes resultados confirmam o comportamento esperado das estirpes SF53 e SF58-IPTG, e indicam que existe uma janela temporal larga durante a qual o efeito de um hipotético inibidor de DnaA possa ser medido de forma não ambígua.

Foram então realizadas uma série de experiências para avaliar o sinal como uma função do inoculo inicial (i. e. a DO teórica da cultura presente num poço de microplaca de titulação). Os dados (não apresentados) indicam que não existe diferença significativa na curva de crescimento SF58-IPTG se o inoculo é obtido por diluição de uma cultura de um dia para o outro ou de uma cultura em crescimento activo a 42 °C. Consequentemente, o tempo para medir a DO foi marcado para as 18 h, e o processo utilizado foi cultivar 5 pL de SF53 ou SF58 em 30 mL de meio CAA glucose (com selecção de anticorpo) de um dia para o outro a 42 °C até a DOêoo ser 1,2. O stock foi diluído 1:100 em CAA glucose (sem anticorpo). Foram dispensados em cada poço 90 pL disto, com 10 pL de amostra. A D062o foi medida depois de 18 horas de incubação a 30 °C.

Uma vez que não se conhecem moléculas pequenas inibidoras de DnaA, o passo seguinte para validar o ensaio foi registar o ensaio de desempenho na presença de amostras desconhecidas. Para este fim, foi utilizada a biblioteca de extractos microbianos presentes na Vicuron Pharmaceuticals. Note-se que esta biblioteca consiste em extractos de fermentação microbiana 43 processados. Resumidamente, cada estirpe é fermentada sob condições definidas, e o meio de fermentação é processado por extracção em fase sólida e as células são processadas por extracção por solvente. Em qualquer dos casos, o "extracto microbiano" é distribuído em placas de microtitulação e seco. Os extractos microbianos foram armazenados em poços de placas de microtitulação de 96 poços a 80 amostras por placa. Os 16 poços restantes por placa foram utilizados para controlos positivos e negativos. Cada amostra na biblioteca de extractos microbianos deste modo, consiste numa mistura de compostos desconhecidos a concentrações desconhecidas. Avaliar o desempenho do ensaio com uma tal complexa biblioteca de amostras tem o potencial para salientar qualquer possível interferência e testes de desempenho fracos. O ensaio deve identificar a presença de um inibidor de DnaA como uma amostra que produz uma D062o significativamente mais elevada do que os controlos. De um ponto de vista teórico, dever-se-ia esperar que os verdadeiros positivos fossem relativamente raros, uma vez que estes devem conter um inibidor destes a uma concentração suficiente para permitir o crescimento de SF53. Adicionalmente, podem-se identificar teoricamente dois grupos de falsos positivos: um grupo pode provir de todos estes casos em que o aparecimento de uma D062o significativa não depende do crescimento de SF53 (i. e. um micróbio contaminante ou uma amostra turva produz o sinal); outro grupo pode provir de todos os casos em que o poço particular contém um elevado número de estirpes supressoras. Ambos os grupos de falsos positivos podem ser facilmente reconhecidos pela repetição do teste com ou sem SF53. Considerando a natureza das amostras, os possíveis falsos negativos podem consistir em todas as amostras em que um hipotético inibidor de DnaA está presente em conjunto com outro 44 antibiótico activo em SF53. Todavia, sabe-se que a frequência de extractos microbianos activa contra uma estirpe de E. coli é cerca de 1%, de modo que os falsos negativos devem ser bastante raros.

Após o processo delineado acima, foi efectuado um rastreio de 4240 extractos microbianos. Cada placa de microtitulação de 96 poços continha como controlos quatro poços inoculados com SF53, quatro poços inoculados com SF58 e 8 poços inoculados com SF58 na presença de 2,5 mM de IPTG. Foram adicionados a estes poços de controlo 10 pL de DMSO a 10% (o solvente em que os extractos microbianos estão dissolvidos).

Pode observar-se inicialmente a distribuição da frequência dos controlos, como reportado na Fig. 5. Todos os controlos negativos (SF53 e SF58) se agrupam próximo de 0,1 a DC>62<u enquanto que os controlos positivos (SF58-IPTG) apresentam uma curva de distribuição larga próximo de 1,1 de DO620. Uma curva de distribuição larga para controlos positivos como na Fig. 5 não é a ideal num programa de rastreio. Todavia, pode ser devido à distribuição manual do inoculo, e deve melhorar após automatização do inoculo distribuído. Apesar disso, existe uma clara separação entre os controlos negativo e positivo, e este deve permitir a identificação não ambígua de amostras. A distribuição da frequência de 4240 extractos microbianos é apresentada na Fig. 6. Pode ser observado que a maioria das amostras se agrupa à volta de 0,1 de DO620 . Isto indica que a maioria das amostras não resulta numa OD62o significativamente diferente das dos controlos negativos. Adicionalmente, esta distribuição da frequência indica que pode ser utilizado um patamar de frequência de 0,4 de D062o para identificar as 45 amostras positivas verdadeiras. Esta eliminação identificou 41 amostras (representando 0,97% das amostras testadas) com uma DO620 superior a 0,4. Os valores observados para estas amostras positivas são reportados na Fig. 7. Estes resultados foram subsequentemente apresentados como sendo falsos positivos devido à presença de contaminação microbiana a partir de extractos utilizado como as amostras. Esta contaminação pode ser testada, para eficácia utilizando técnicas microbiológicas convencionais:

Neste estádio, pode concluir-se que: a) o ensaio pode ser efectuado num formato de 96 poços; b) o desempenho é adequado para um programa HTS; c) os extractos microbianos positivos são todos falsos positivos.

Lisboa, 20 de Julho de 2007 46

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificar a presença de um inibidor de proteína de uma proteína alvo numa amostra, compreendendo os passos de a) colocar em contacto a referida amostra com uma célula, em que referida célula contém i) uma mutação indutível de sobreactividade letal num gene que afecta a proteína alvo, em que a actividade da proteína alvo é essencial à célula; e ii) uma mutação num segundo gene, em que a mutação no segundo gene compensa funcionalmente qualquer redução na actividade da proteína alvo; b) induzir a mutação de sobreactividade letal; e subsequentemente c) verificar a inibição da proteína comparando o grau de sobrevivência da célula na presença e na ausência da referida amostra.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a célula é uma população de células derivadas de um clone.
3. 3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que a mutação de sobreactividade letal indutível está no gene que codifica uma proteína alvo. 1
4. 4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a referida proteína alvo é uma enzima ou uma proteína de ligação.
5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a referida proteína alvo está associada com a síntese de ácidos nucleicos.
6. 6. Método da reivindicação 5, em que a referida proteína alvo é um iniciador de replicação de ADN.
7. 7. Método da reivindicação 5, em que a referida proteína alvo é um iniciador bacteriano de replicação de ADN.
8. 8. Método da reivindicação 5, em que a referida proteína alvo é DnaA.
9. 9. Método de qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em que a mutação no segundo gene proporciona um mecanismo alternativo para a replicação de ADN na ausência do referido iniciador de replicação de ADN.
10. 10. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o grau de sobrevivência das células é medido por determinação do número de células presentes após a indução da mutação de sobreactividade letal.
11. 11. Método da reivindicação 10, em que o número de células é determinado 8-30 horas após a indução da mutação de sobreactividade letal. 2
12. 12. Método da reivindicação 10 ou 11, em que o número de células é determinado espectrofometricamente.
13. 13. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o inibidor é um inibidor especifico de proteína.
14. 14. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o referido inibidor é um antibiótico.
15. 15. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a célula é E. coli.
16. 16. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a mutação de sobreactividade letal está no DnaA.
17. 17. Método da reivindicação 16, em que o referido mutante de sobreactividade letal é, ou possui, as propriedades de DnaAcos ou DnaA219.
18. 18. Método de qualquer uma das reivindicações 6 a 17, em que a segunda mutação inactiva a RNaseH.
19. 19. Método de qualquer uma das reivindicações 6 a 18, em que a célula é DnaA219Arnh, depositada com o ECACC sob o N° de Acesso 03050701.
20. 20. Célula contendo uma mutação de sobreactividade letal indutível num primeiro gene que afecta uma proteína alvo, em que a actividade da referida proteína alvo é essencial à célula e uma segunda mutação que compensa qualquer redução de actividade da proteína alvo. 3
21. 21. Estirpe de E. coli SF53 (DnaA219Arnh) , depositada com o ECACC sob o N° de Acesso 03050701. das da
22. 22. Kit para efectuar o método de qualquer uma reivindicações 1 a 19, compreendendo a célula reivindicação 20 ou 21. Lisboa, 20 de Julho de 2007 4