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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Screening von Molekülen auf
Antiprion-Aktivität.
Sie betrifft insbesondere Kits zum Screening auf Antiprion-Aktivität, die Verfahren
zum Screening und eine Molekülfamilie
mit Antiprion-Aktivität,
die mithilfe des erfindungsgemäßen Screenings
nachgewiesen wird.
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Prionen
sind infektiöse
Proteine, die bei Säugetieren
für bestimmte
neurodegenerative Krankheiten vom Typ spongiforme Enzephalopathien
wie die Creutzfeld-Jakob-Krankheit beim Menschen oder auch den als „Rinderwahnsinn" bei Rindern oder
als „Traberkrankheit
der Schafe" bei
Schafen bezeichnete Krankheit verantwortlich sind. Diese unterschiedlichen
Krankheiten werden von nicht konventionellen infektiösen Substanzen
hervorgerufen: im Gegensatz zu herkömmlichen infektiösen Substanzen
(z. B. Bakterien, Viren), enthalten sie keine Nukleinsäure. Professor
Stanley Prusiner hat die Hypothese des „einzigen Proteins" aufgestellt, nach
der die infektiöse
Substanz nur aus einem einzigen Protein bestehen würde. Dieses
Protein ist auf natürliche
Weise in den Zellen in einer „normalen„ Form
(oder PrPc) vorhanden, d. h. in löslicher,
im Wesentlichen in Spiralform α und
nicht aggregierter, daher funktionaler Form. Unter bestimmten, bisher
noch unbekannten Umständen,
kann dieses Protein sich in eine Prionenform (PrPSC)
umwandeln. In dieser Prionenform bildet das Protein lösliche Aggregate,
im Wesentlichen in Form von Blättern β. Das infektiöse Merkmal
dieser Prionen-Konformation PrPsc soll auf
den Umstand zurückzuführen sein,
dass das Protein in Prionenform neben den zuvor genannten Merkmalen
ebenfalls die Fähigkeit
erhält,
in einem Mechanismus vom Typ „Schneeballsystem" den Übergang
von der normalen zellulären
Form PrPc zur Prionenform PrPsc zu
katalysieren.
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Bäckerhefe
Saccharomyces cerevisiae enthält
mehrere sich wie Prione verhaltende Proteine (Fernandez-Bellot und
Cullin, 2001). Darin werden bereits in den sechziger Jahren zwei
nicht konventionelle genetische Mechanismen beschrieben. Im Jahre
1994 werden die entsprechenden Phänotypen [PSI+] und [URE3] als
Ergebnisse der auto-katalytischen Inaktivierung jeweils der Proteine
Sup35p und Ure2p vorgeschlagen. Diese Prionenproteine weisen daher
a priori eine mechanistische Analogie mit den für die Volksgesundheit todbringenden
Säugetiersystemen
auf. Ebenso wie das Protein PrP geht das „normale" Protein Sup35p von einem löslichen
Zustand in einen nicht löslichen
und aggregierten Zustand über,
sobald das Protein mit einem anderen Protein Sup35p in Prionenform
in Kontakt kommt. Dieser aggregierte Zustand wird sowohl durch Versuche
in der Zentrifuge als auch durch intrazelluläre Lokalisations-Versuche überprüft. Die
Prionen der Hefe können
durch eine hohe Dosis (1 bis 5 mM) Guanidiumchlorid entfernt („ausgeschlämmt") werden. Im Anschluss
an eine derartige Behandlung (die über wenigstens sechs bis zehn
Generationen angewendet werden muss) verschwinden die von dem Vorhandensein
von Prionen generierten Protein-Aggregate, und das fragliche Protein
(z. B. Sup35p) weist wieder eine normale, lösliche, funktionale Form auf,
die jedoch die Möglichkeit beibehalten
hat, in eine Prionenform konvertiert zu werden, wenn sie erneut
in Kontakt mit einem anderen Protein Sup35p in einem derartigen
Zustand kommt.
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Das
sich mit dem Protein Sup45p in einem heterodimerischen Komplex befindende
Protein Sup35p bildet einen Abschlussfaktor der Übersetzung. Dieser Faktor erkennt
die opalen Stopp-Kodone (UGA). Sup35p beendet in seiner normalen
zellulären
(löslichen
und aktiven) Form in den Stämmen
([psi–]
in Verbindung mit Sip45 wirksam die Übersetzung bei diesen opalen
Kodonen. In einem Stamm [PSI+], in dem das Protein Sup35p sich in
Prionenform befindet, ist es mehrheitlich in Form von nicht löslichen
Aggregaten vorhanden. Da es sich nicht mit Sup45p verbinden kann,
ist es daher im Abschluss der Übersetzung
nicht funktional. Eine kleine Fraktion der Struktur der zellulären Proteine
Sup35p bleibt jedoch in diesen Zellen [PSI+] löslich, wo sie im Komplex mit
Sup45p die Ge währleistung
eines „Mindestdienstes" zum Abschluss der Übersetzung
gewährleistet,
dem zum Überleben
der Hefe wesentlichen Dienst. Ein die Feststellung auf indirekte
Weise der Form, in der das Protein Sup35p vorhanden ist, erlaubendes
kolorimetrisches System: normal oder in Prionenform, wurde ausgehend
von diesen Feststellungen ausgearbeitet. Dieses vor langer Zeit
beschriebene System (siehe den Syntheseartikel von Fernandez-Bellot
und Cullin, 2001) basiert auf der Verwendung des Allels Ade1-14 des
Gens ADE1, das für
ein Enzym für
den Biosyntheseweg des Adenins kodiert: die Synthease SAICAR. Dieses
Enzym katalysiert die Bildung von 4-(N-Succinocarboxamid)-5-Aminoimidazol
Ribonucleotid(SAICAR) ausgehend von 4-Carboxy-5-Inoimidazol Ribonucleotid
(CAIR). Das Allel Ade1-14 enthält
ein opales Kodon im Rahmen der Lektüre des Gens ADE1. In einem
Stamm [psi–]
wird Sup35p in Verbindung mit Sup45p daher die Übersetzung des Gens ADE1 bei
diesem Stopp-Kodon beenden. Das somit übersetzte Protein Ade1-14p wird
verstümmelt
und damit nicht funktional. Infolgedessen werden sich die Substrate
oberhalb des Enzyms Ade1p anhäufen,
insbesondere das 5-Minoimidazol Ribonucleotid (AIR). Da das AIR
in einer Verbindung roter Farbe oxidiert wird, werden die von den
Zellen [psi–]
gebildeten Kolonien die rote Farbe aufweisen. Darüber hinaus
sind diese Zellen auxotroph für
Adenin. Umgekehrt ist das Protein Sup35p in einem Stamm [PSI+] im Wesentlichen
in Form von Aggregaten vorhanden und daher unfähig, sich mit Sup45p zu verbinden,
um die Übersetzung
bei dem opalen Kodon des Allels Ade1-14 des Gens ADE1 zu stoppen.
Infolgedessen werden die Ribosomen bei diesem Stopp-Kodon eine Pause
einlegen, bevor sie ihre Übersetzungs-/(Translektions-)Aktivität fortsetzen.
Eine gewisse Menge an funktionalem Protein Ade1p wird daher synthetisiert,
die Zellen werden für
das Adenin autotroph sein und Kolonien weißer bis blassrosa Farbe bilden.
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In
einem im P.N.A.S erschienenen Artikel legt das Team von Professor
Stanley Prusiner einen Test zur Feststellung von Molekülen mit
Antiprion-Aktivität
offen (Korth et al., 2001). Dieser Test wird auf einem Säugetiermodell
durchgeführt
(mit PrPsc infizierten Mäuse-Neuroblastomen). Die Sicherheitsbedingungen
(Labor P3) und die Bedingungen der Zellkulturen (recht aufwändige Handhabungen)
lassen die Durchführung
des Screening mit hohem Durchsatz nicht zu.
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Der
Patentantrag WO 98/30909 beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum
Screening auf Moleküle
mit Antiprion-Aktivität,
das an von einer nicht konventionellen übertragbaren Substanz infizierten
Nagetieren durchgeführt
wird. Dieses Verfahren zum Screening weist dieselben Einschränkungen
auf wie das im P.N.A.S. beschriebene Verfahren.
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Die
Patentschriften WO 02/065136 und WO 99/29891 beschreiben eine Hefe
umsetzende Verfahren zum Screening von Molekülen auf Antiprion-Aktivität.
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Die
Arbeiten der Erfinder haben sie zur Realisierung eines Systems zum
Screening mit hohem Durchsatz zum Nachweis von eine Antiprio-Aktivität besitzenden
Molekülen
veranlasst, das auf dem oben beschriebenen kolorimetrischen Meldesystem
des Proteins Sup35p basiert.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf ein Kit zum Screening
von Molekülen
auf Antiprion-Aktivität,
dadurch gekennzeichnet, das es in Kombination eine Hefe des Phänotyps [PSI+],
ein Antibiogramm und ein Prionen-Reinigungsmittel in subeffizienten
Dosen umfasst, wobei die genannte Hefe des Allels Ade1-14 des Gens
ADE1 sowie ein inaktiviertes Gen ERG6 aufweist.
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Obwohl
es auf den Prionen der Hefen basiert, erlaubt das erfindungsgemäße Kit die
Isolation der aktiven Moleküle
gegen die Säugetierprionen.
Das folgende Beispiel 7 zeigt, dass die von Professor Prusiner isolierten
aktivsten Moleküle
ebenfalls eine Aktivität
im erfindungsgemäßen Screening
aufweisen.
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Dennoch
sind zahlreiche Unterschiede zwischen den Hefeprionen und den Säugetierprionen
festzustellen. In einem Artikel der Zeitschrift „Cellular and Molecular Life
Sciences" schlägt Professor
C. Cullin angesichts dieser Unterschiede sogar vor, die Hefeprionen
von denen der Säugetiere
unter Verwendung des Begriffs „Propagonen" zu unterscheiden.
Als wesentliche Unterschiede zwischen den „Prionen" (Säugetiere)
und den „Propagonen" (Hefe) können das
zytoplasmische Merkmal der Propagonen genannt werden, währen das Prion
PrP der Säugetiere
ein in der Plasmamembran verankertes Protein ist, das pathologische
Merkmal der Säugetierprionen
sowie eine ganze Reihe von biophysischen Unterschieden (ternäre und quaternäre Strukturen,
Reversibilität
der Reinigung, usw.)
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Einer
der wichtigsten Vorteile eines derartigen Screenings liegt in seiner
absoluten Unschädlichkeit, was
seine Durchführung
in einem klassischen Labor der Molekularbiologie des Niveaus L2
zulässt
und nicht, wie bei den bisherigen Techniken erforderlich, in einem
Labor des Niveaus P3.
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Darüber hinaus
erlauben die große
Einfachheit bei der Benutzung und die sehr niedrigen Kosten dieses
Kits die Realisierung des Screenings mit hohem Durchsatz. Die Verwendung
von Pastillen mit Antibiogramm, die die Verbreitung des Produkts
unter Herstellung eines Konzentrations-Gradienten zulassen, ermöglicht darüber hinaus
im Gegensatz zu den klassischen Tests, in denen nur eine Konzentration
getestet wird, das Testen einer Vielzahl von Konzentrationen in
einem einzigen Versuch. Für
jedes Molekül,
dessen Antiprion-Aktivität
getestet wird, erlaubt die Verwendung des Antibiogramms ebenfalls
das Vorliegen von Informationen über
die Toxizität
des Produkts sowie über
das Verhältnis
Aktivität/Konzentration
und somit die Feststellung der besten wirksamen Konzentration.
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Der
in dem erfindungsgemäßen Kit
verwendete Stamm [PSI+] trägt
eine Inaktivierung des Gens ERG6. Die Hefen sind in der Tat natürlicherweise
recht schwach permeabel. Insbesondere weist die für die Umsetzung
der Erfindung bevorzugte Hefe Saccharomyces Cerevisiae eine derartige
Impermeabilität
auf, dass die Realisierung eines Screenings sich in dieser Inaktivierung
als besonders wenig wirksam erweist.
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Das
erfindungsgemäße Analyseverfahren
des Screenings ist dank der Verwendung des Allels Ade1-14 sichtbar.
Je nach der Antiprion-Aktivität
des getesteten Moleküls
werden die Zellkolonien eine rote, rosafarbene oder weiße Färbung haben.
Die Wahl des Hefestamms kann die Verbesserung des Kontrasts zwischen
den Kolonien ermöglichen.
Einige als „strong" bezeichnete Stämme erleichtern
nämlich
die visuelle Analyse des Screenings. Derartige Stämme besitzen
ein hohes Aggregationsniveau der Prionenformen. Andernfalls wird
der Stamm als „weak" bezeichnet. Die
für die
Umsetzung der Erfindung bevorzugten Stämme sind daher die Stämme vom
Typ „strong".
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Weitere
Hefen können
ebenfalls verwendet werden. Genannt werden z. B.: Kluyveromyces
lactis, Pichia methanolica, Saccharomyces ludwigii, Kluyveromyces
marxianus, Pichia pastoris, Zygosaccharomyces rouxi, Schizo-saccharomyces pombe.
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In
Anbetracht der zwischen der Inaktivierung des Gens ERG6 und der
Inaktivierung des Gens TRP1 beobachteten synthetischen Letalität kann das
Gen ERG6 unter Verwendung des Gens TRP1 als Deletions-Markierer
deletiert werden.
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Das
Kit umfasst darüber
hinaus vorteilhaft ein Reinigungs-Mittel der Prionen in subeffizienten
Dosen.
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Unter
Reinigung wird eine Entfernung der Prionenformen in den Hefezellen
verstanden. Diese Entfernung kann vorübergehend oder endgültig sein.
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Beispielhaft
kann eine Reinigungs-Mittel für
das Prion Wasserstoffperoxid oder bevorzugt Guanidiumchlorid sein.
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Unter
subeffizienten Dosen werden Dosen verstanden, die allein verwendet
nicht ausreichen würden, um
die Prionen der Hefen auszuschlämmen.
Die Werte derartiger Dosen werden in den nachfolgenden Beispielen
für Guanidiumchlorid
angegeben.
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Die
Vorteile des Vorhandenseins einer Reinigungs-Substanz in subeffizienten
Dosen bestehen in der Erhöhung
der Sensibilität
des Screenings und dem Erhalt eines besseren Kontrastes.
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Das
erfindungsgemäße Kit kann
in einem Verfahren zum Screening von Molekülen auf Antiprion-Aktivität umgesetzt
werden. Dieses ebenfalls von der Erfindung betroffene Verfahren
zum Screening wird dadurch gekennzeichnet, dass es eine Hefe mit
dem Phänotyp
[PSI+] umsetzt, die das Allel Ade1-14 des Gens ADE1 sowie ein inaktiviertes
Gen ERG6 aufweist und die folgenden Stufen umfasst:
- a. Herstellung eines Zellteppichs in vitro auf einem Medium,
das mit einer subeffizienten Dosis eines Prionen-Reinigungsmittels
versetzt ist,
- b. Aufbringen der zu testenden Verbindungen gemäß der Methode
des Antibiogramms,
- c. Inkubation während
ungefähr
2–4 Tagen
bei ungefähr
20–25°C, und
- d. Analyse der Färbung
der Zellkolonien.
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Dieses
Verfahren besitzt analoge Vorteile zu denen des erfindungsgemäßen Kits.
Es handelt sich um einem visuellen, sehr leicht zu analysierenden
Test. Seine Umsetzung ist sehr einfach und wenig kostspielig. Die
Vorsichtsmaßnahmen
bezüglich
der Sicherheit sind die eines klassischen Labors für Molekularbiologie.
Es erlaubt ein massives Screening: Eine einzige Person kann manuell
mehr als 400 Produkte pro Tag screenen. Ein Screening mit sehr hohem
Durchsatz wäre
durch Automatisierung des Verfahrens möglich. Das Ergebnis des Screening
wird nach 7 Tagen bekannt gegeben, ohne dass es notwendig wäre, aufwändige Handhabungen
zwischen dem Tag T und dem Tag T+7 durchzuführen (eventuell eine Änderung
der Temperatur des Inkubators). Schließlich ist dieses Verfahren
ganz besonders wirtschaftlich.
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Eine
der bevorzugten Hefen für
die Umsetzung dieses Verfahrens ist Saccharomyces cerevisiae.
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Das
Reinigungsmittel der Stufe a. ist vorteilhaft Guanidiumchlorid.
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Das
Verfahren kann ebenfalls die folgenden Stufen umfassen:
- e. Inkubation während
ungefähr
2–4 Tagen
bei ungefähr
2–6°C, und/oder,
- f. Durchführung
eines sekundären
Screening-Test.
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Die
Inkubation bei 2–6°C lässt die
Verstärkung
des Kontrasts der Einfärbungen
der Kolonien zu.
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Der
sekundäre
Screening-Test kann bevorzugt die folgenden Stufen umfassen:
- – Aufbau
eines Hefestamms, in dem das Gen ADEZ sich unter der Kontrolle des
Promoters des Gens DALS befindet.
- – Durchführung der
Stufen a. bis e. der vorstehend beschriebenen Verfahren.
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Ein
derartiges sekundäres
Screening erlaubt den sehr raschen Test, ob die beim primären Screening isolierten
Moleküle
eine allgemeine Wirkung auf den Prionen bei der Hefe haben. Die
(für das
Prion [PSI+] verantwortlichen) Gene SUP35 und (für das Prion [URE3] verantwortlichen)
URE2 kodieren für
Enzyme mit völlig unterschiedlichen
Funktionen und deren primäre
Sequenzen sehr weit entfernt sind. Die Erfindung deckt ebenfalls
die durch das erfindungsgemäße Verfahren
zum Screening isolierten Moleküle
ab.
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Insbesondere
hat das Verfahren zum Screening die Isolation der Antiprionen-Substanzen
mit der folgenden Formel (I) ermöglicht:
in der
R' eine Gruppe H,
NH
2, NHR
2 ist, in
der R
2 eine Alkyl- oder eine Alkylaminoalkyl-Kette
aus 1 bis 10 verzweigten oder nicht verzweigten Kohlenstoffen ist,
X
für F,
Cl, Br, I, CF
3, SR
3,
OR
3, OH, NO
2, COR
3, CONH
2, COOH, COOR
3 steht, in der R
3 eine
Alkylgruppe aus 1 bis 4 Kohlenstoffen, bevorzugt CH
3 ist.
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p
und n identisch oder unterschiedlich sind und gleich 0, 1 oder 2
sind,
q gleich 0 oder 1 ist.
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Die
Erfindung deckt insbesondere die Antiprion-Substanzen der Formel
(III) ab:
in der
R' für eine Gruppe
H, NH
2, NH-(CH
2)
3-N(CH
3)
2, NH-CH(CH
3)-(CH
2)
3-N(CH
2-CH
3)
2 steht,
X
für F,
Cl, CF
3 steht
p und n identisch oder
unterschiedlich sind und gleich 0, 1 oder 2 sind.
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Diese
von den Erfindern als „Kastellpaolitine" bezeichnete Molekülfamilie
besitzt einen mehr oder weniger stark ausgeprägten Grad der gewünschten
Antiprion-Aktivität.
Insbesondere sind die Chlorderivate dieser Familie besonders wirksam.
Die besten Wirksamkeiten werden erhalten, wenn das Chlor in Position
2, 3, 4, bevorzugt in Position 4 platziert wird (siehe KP1 in den
folgenden Beispielen).
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Die
Erfindung betrifft insbesondere die Verbindungen der Formel (II):
in der R' für
eine Gruppe H, NH
2, NH-(CH
2)
3-N(CH
3)
2,
NH-CH(CH
3)-(CH
2)
3-N(CH
2-CH
3)
2 steht,
X
für F,
Cl, CF
3 steht,
p und n, die identisch
oder verschieden sind, gleich 0, 1 oder 2 sind,
für eine Verwendung
als Medikament und insbesondere als Antiprion-Substanz.
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Sie
betrifft ebenfalls pharmazeutische Verbindungen mit einer therapeutisch
wirksamen Menge wenigsten einer der Verbindungen der Formel (III),
in der:
R' für eine Gruppe
H, NH
2, NH-(CH
2)
3-N(CH
3)
2,
NH-CH(CH3)-(CH
2)
3-N(CH
2-CH
3)
2 steht,
X
für F,
Cl, CF
3 steht
p und n, die identisch
oder unterschiedlich sind, gleich 0, 1 oder 2 sind, in Verbindung
mit wenigstens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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Einige
Verbindungen dieser Familie sind ganz besonders aktiv. Es handelt
sich um Phenanthridin und um 6-Amino-Phenanthridin sowie um deren
gechlorte Derivate, insbesondere, wenn das Chlor in Position 8, 9,
10, bevorzugt in Position 10 platziert wird (siehe in den folgenden
Beispielen).
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In
den Formeln (II) und (III) steht R' bevorzugt für NH2.
In der Tat wurde eine sehr gute Aktivität der Moleküle festgestellt, wenn R' für NH2 steht.
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Die
Erfindung schlägt
ebenfalls ein eine Verabreichungsstufe einer therapeutisch wirksame
Menge von wenigstens einer der Verbindungen der Formel erfindungsgemäßen (I),
(II) oder (III) an ein Tier oder einen Patienten umfassendes Verfahren
zur Behandlung von Proteinaggregate implizierenden neurodegenerativen Krankheiten
vor.
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Die
erfindungsgemäßen Antiprion-Substanzen
sind insbesondere sinnvoll für
den Erhalt eines zur Prävention
und/oder Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere
vom Typ mit Proteinenaggregation, wie z. B. spongiforme Enzephalopathien,
der Alzheimer-Krankheit (Tau), Parkinson (Synuklein α) und Huntington
(Huntingtine) bestimmten Medikamenten ... Diese Medikamente können zu
human- oder veterinärmedizinischen
Zwecken dienen, insbesondere für
Haustiere (Rinder, Schafe, usw.) oder für Wildtiere (Luchs, für Haustiere
(Rinder, Schafe, usw.) oder für
Wildtiere (Luchs, Hirsche wie z. B. Hirschkühe, Elche, usw.)
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in den nachstehenden
Beispielen und unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren deutlich:
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1 bezieht
sich auf die Machbarkeit des Screenings,
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2 stellt
das Screening-Protokoll dar,
-
3 bezieht
sich auf die Isolierung der Kastellpaolitine, des Phenanthridins
und ihres Verhältnisses Struktur/Aktivität,
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4 bezieht
sich auf die Bestimmung der Aktivität der Derivate des Phenanthridins,
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5 stellt
die Ergebnisse der flüssigen
Reinigungstests dar,
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6 bezieht
sich auf das auf dem Prion [URE3] basierende sekundäre Screening,
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7 zeigt
die Validierung des Tests mit Chlorpromazin, Quinakrin und Verapamil,
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8 stellt
die Ergebnisse der Wirkung von KP1 auf das Säugetierprion in einem Modell
in vitro dar und
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9 bezieht
sich auf eine auf dem Molekül
der allgemeinen Formel (II) durchgeführte Studie Struktur/Aktivität.
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Beispiel 1: Durchführung des
Screenings.
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1. Material und Verfahren
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Organismus
(Saccharomyces cerevisiae) und Kulturmedien. Der haploide Hefestamm
[PSI+] 74-D694, (Mat a, Ade1-14, Trpl-289, His3-d200, Ura3-52, Leu2-3,
112) wurde bei der Ausarbeitung des Verfahrens zum Screening verwendet.
Der verwendete Stamm wird als „strong" bezeichnet, denn
er weist einen stark ausgeprägten
Phänotyp
auf, wenn der Abschlussfaktor der Übersetzung Sup35 sich in Prionen-
oder aggregierter Form darstellt.
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Zwecks
Erhöhung
des Eindringens der Hemmstoffe haben die Erfinder diesen Stamm durch
Einführung
einer Mutation des Gens ERG6 modifiziert. Dieses Gen interveniert
in der Biosynthese des Ergosterol, einer Komponente der Zellwand
von Hefen. Die Mutation wurde durch Einführen einer dem Markierungsgen TRP1
entsprechenden „Deletionskassette" bei dem Chromosomensitus
des Gens ERG6, flankiert durch sich oberhalb in der DNA und unterhalb
der kodierenden Phase des Gens ERG6 befindende Sequenzen durchgeführt. Diese
Kassette wurde von PCR unter Verwendung des Plasmids pFA6 α-kanMX6 als
Matrix und der Oligonukleotide oBM1060 (5') und oBM1061 (3') als Initiatoren produziert. Die Hefezellen
74-D694 „Strong", die die (als STRg6
bezeichnete, am 10. Oktober 2002 unter der Nummer 1-2943 bei der
CNAM angemeldete Stämme)
Deletionskassette integriert haben, sind Zellen, die sich auf Mindest-Medien
ohne Tryptophan entwickeln. Die Mutation Δerg6: TRP1 wurde anschließend durch
PCR unter Verwendung des Stamms STRg6 als Matrix und der Oligonukleotide
oBM1030 (5') und
oBM1063 (3') als
Initiatoren überprüft.
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Die
verwendeten Initiatoren PCR weisen die folgenden Nukleotidsequenzen
auf:
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Soweit
nichts Gegenteiliges angegeben wird, werden die Hefestämme bei
30°C in
einem reichen Medium (YPDΨ)
oder in einem Mindestmedium gezüchtet.
Wenn es nicht ausdrücklich
spezifiziert wird, entsprechen die Prozentsätre einem Verhältnis Masse/Volumen.
Die Agar-Agar-Form wird durch Hinzufügen von 2 %igem Agar-Agar erhalten.
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YPDΨ: 1 % Hefeextrakt
(FISHER®),
2 % Pepton (GIBCO®) und 2 % Glukose;
Mindestmedium:
0,175 % Basis-Nitrogenhefe ohne Aminosäure und Ammoni umsulfat (DIFCO®),
0,75 % Ammoniumsulfat und 2 % Glukose. Dieses Medium wird auf einen
pH von 6 gebracht. Um die eventuellen Auxotrophien auszugleichen,
kann dieses Medium nach der Sterilisation durch Hinzufügen von
Aminosäuren
(0,002 % L-Nistidin und/oder 0,004 % L-Leucin und/oder 0,00 3% L-Tryptophan)
oder mit Stickstoff angereicherten Basen (0,0025 % Uracil und/oder
0,008 % Aenin) vervollständigt
werden.
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Verfahren zum Screening
von Substanzen mit Antiprion-Aktivität („Prion Halo Assay")
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Das
entwickelte Verfahren zum Screening basiert auf dem Prinzip des
Antibiogramms. Die zu testenden Verbindungen werden in der Tat auf
einer sterilen Papierfilterscheibe aufgebracht, die ihrerseits auf
einer Schale mit festem, 0,2 mM Guanidiumchlorid enthaltendem YPDΨ aufgebracht
wurde, die vorher mit rund 5,106 Zellen
des Stamms STRg6 geimpft wurde, um einen Hefeteppich zu realisieren.
Diese Menge an geimpften Zellen (von 106 bis
107) wurde optimiert, damit jede Zelle sich
wenigstens 6 Mal teilen kann (Anzahl der notwendigen Generationen,
um eine mit 3 mM GuHCl wirksame Reinigungswirkung zu erzielen).
Das Hinzufügen
einer geringen Menge an Guanidiumchlorid (0,2 mM), einer subeffizienten
Dosis zum Reinigen der Prionen bei der Hefe (wobei die wirksame
Dosis in der Größenordnung
von 1 bis 5 mM liegt) erlaubt die Erhöhung der Sensibilität des Tests
(siehe den Teil Ergebnisse). Die quadratischen Schalen mit einer
Seitenlänge
von 12 cm werden anschließend
bei 23,5°C
inkubiert, um das Auftreten und das Wachstum von Hefekulturen zu
ermöglichen.
Diese Schalen werden anschließend
3 Tage lang bei 4°C
gelagert, um die um die mit in der Prionenform des Proteins Sup35p
aktiven Substanzen getränkten
Scheiben vorhandene rote Färbung
zu verstärken.
Der Vergleich mit den negativen (Ablagerung des Lösungsmittels
der getesteten Hemmstoffe) und positiven Bezugsgrößen (Ablagerung
einer Guanidiumchlorid-Lösung
zu 300 mM, was eine wirkungsvolle Entfernung der Proteine Sup35p
in einer Prionenform hervorruft) lässt die Beurteilung der Wirksamkeit
einer Verbindung zu. 2 stellt das Protokoll des Verfahrens
zum Screening dar: (1) Kultur des Stamms STRg6; (2) Ablagerung und
Verteilen mit sterilen Glaskügelchen
mit einem Durchmesser von 3 & 4
mm von rund 106 Zellen in exponentieller
Wachstumsphase in einer Schale mit festem Medium YPDΨ mit 0,2
mM Guanidiumchlorid: Bildung eines „Zellteppichs"; (3) Ablagerung
der sterilen Papierfilterscheiben gemäß eines Rasters, das die Analyse
von 32 Verbindungen (unter Einschluss von Bezugsgrößen) erlaubt
und Ablagerung von maximal 20 PI jedes zu testenden Produkts; (4)
Inkubation; (5) Benummerung des Testergebnisses; (6) die Isolation
einer eine starke Antiprion-Aktivität aufweisenden Verbindung aufweisendes
Beispiel.
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Synthese von 11-Aminodibenzo[b,f][1,4]Thiazepinen
und des 6-Aminophenanthridins
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Die
auch als Kastellpaolitine bezeichneten 11-Aminodibenzo[b,f][1,4]Thiazepine
können
in einer einzigen Stufe zubereitet werden. Die Synthese dieser Produkte
wurde bereits in der Veröffentlichung
von Mettey et al., 1997 beschrieben.
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2. Ergebnisse
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Prinzip und
Machbarkeit des Screening
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Das
Guanidiumchlorid, das einzige Produkt, von dem bekannt ist, dass
es die Prionen in Saccharomyces cerevisiae wirksam ausschlämmt, hat
nicht nur als positive Bezugsgröße während des
gesamten Screening gedient, sondern auch zur Untersuchung der Machbarkeit
des Verfahrens sowie zu dessen Ausarbeitung. Guanidiumchlorid reinigt
wirksam die unterschiedlichen Hefeprionen in einer zwischen 1 und
5 mM (Fernandez-Bellot und Cullin, 2001) inbegriffenen Dosis. Unter
diesen Bedingungen erfordert die Reinigung ein ständiges Vorhandensein
dieses Produkt über
sechs bis zehn Generationen in der exponentiellen Wachstumsphase,
was die Machbarkeit des Screening in der Schale so, wie die Erfinder
sie realisieren möchten,
in Frage stellt.
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1 zeigt
die Machbarkeit des Screenings.
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Die
drei Tafeln links: Ein Stamm [PSI+] wird 48 Std. lang bei Vorhandensein
von Guanidiumchlorid mit 5 mM (mit 0,2 % finalem DMSO) kultiviert
oder zur Kontrolle mit nur 0,2 % finalem DMSO. A T = 0, dann wird alle
24 Std. ein Tropfen von 10 PL (rund 104 Zellen)
auf einer Schale mit reichem Medium aufgebracht. Die Reinigung mit
Guanidiumchlorid beginnt nach 24-stündiger Behandlung eine Wirkung
zu zeigen, d. h. nach ungefähr
6 Generationen (es zeigt sich langsam eine rosafarbene Färbung).
Nach Ablauf von 48 Std., d. h. nach ungefähr 12 farbene Färbung).
Nach Ablauf von 48 Std., d. h. nach ungefähr 12 Generationen, weist der
Zelltropfen eine deutlich rote Färbung
auf, das Zeichen einer vollständigen
Reinigung der Zellen [PSI+].
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Die
Tafel in der Mitte: Einige Zellen werden bei T = 48 Std. entnommen
und auf einem frischen Medium in Streifen aufgebracht. Sie bilden
im Falle der Reinigung mit Guanidiumchlorid fast alle rote Kolonien.
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Die
Tafel rechts: Diese selben Zellen werden nach der flüssigen Kultur
auf dem Boden eines Eppendorf-Röhrchens
verstrichen. In dem Fall der Reinigung mit Guanidiumchlorid bilden
sie einen roten Rückstand.
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Die
erste Stufe besteht daher in der Bestimmung, ob das Guanidiumchlorid
eine auf der Schale auf den Zellen [PSI+] mit dem Pastillensystem
mit Antibiogramm sichtbare Wirkung haben konnte. Nachdem diese Stufe
durchgeführt
worden ist, haben die Erfinder die optimalen Temperatur-, Medium,-,
Dichte- sowie die Bedingungen des zu verwendenden zellulären Typs
festgelegt (2). Der die beste Sensibilität aufweisende Stamm
ist der bei 23,5°C
und bei Vorhandensein von 200 μM
Guanidiumchlorid gezüchtete
Stamm STRg6. Die Einführung
einer subeffizienten Dosis Guanidiumchlorid in das Medium erlaubt
in der Tat die Erhöhung
der Sensibilität
des Tests.
-
Screening
einer Chemothek
-
Es
wurden (rund 1000) Verbindungen unter Hinzuziehung der von den Erfindern
optimierten Bedingungen gescreent (2). Auf
jeder Schale werden 15 μl
DMSO auf dem Filter oben links aufgebracht (negative Bezugsgröße), und
15 μl einer
Guanidiumchloridlösung
als Lösung
zu 300 mM im DMSO (positive Bezugsgröße) werden auf dem Filter unten
rechts aufgebracht. Dasselbe Volumen (15 μl) jedes der Produkte der Bank (alle
in einer Lösung
zu 10 mM im DMSO) wird auf den verbliebenen Filtern aufgebracht
(dreißig
pro großer quadratischer
Petrischale). Ein positives Signal (Sichtbarkeit eines roten Halos
um die sterile Papierfilterscheibe, auf der das Produkt aufgebracht
wird) wurde für
fünf Produkte
erhalten. Diese Produkte entsprechen vier Molekülen einer und derselben Familie,
die von den Erfindern „Katellpaolitine" genannt werden,
und einer fünften,
bekannten Familie: dem Phenanthridin.
-
Beispiel 2: Identifizierung
der Kastellpaolitine und des Phenanthridin.
-
Die
chemischen Strukturen der Kastellpaolitine und des Phenanthridins
werden in 3B dargestellt. Tafel 3A
zeigt eine vergleichende Analyse der Größe der jeweils mit allen diesen
Molekülen
erhaltenen roten Halos (die alle in äquivalenten Mengen aufgebracht
wurden: 15 μl
einer Lösung
zu 10 mM im DMSO). Diese Erfahrung erlaubt den Vergleich der relativen
Aktivität
jedes dieser Produkte. Das aktivste ist das Kastellpaolitin 1 (oder
KP1), gefolgt vom PHenanthridin.
-
Synthese und Test des
6-Aminophenanthridin
-
Eine
vergleichende Analyse des Phenanthridins einerseits und der Kastellpaolitine
andererseits zeigt mehrere gemeinsame Punkte zwischen diesen beiden
Molekülgruppen
(3). Die unterschiedlichen Moleküle werden
dort vom am wenigsten aktiven bis zum aktivsten klassifiziert und
ihre jeweiligen Formeln angegeben. Alle sind dreizyklisch, wobei
der zentrale Zyklus in allen Fällen
einen Stickstoff in doppelter Verbindung mit einem anliegenden Kohlenstoff
enthält.
Allerdings trägt
der Kohlenstoff des zentralen Zyklus, das mit diesem Stickstoff
in doppelter Verbindung steht, bei allen Katellpaolitinen eine Amino-Gruppe,
was beim Phenanthridin nicht der Fall ist. Diese Beobachtung hat
die Erfinder dazu veranlasst, das 6-Aminophenanthridin testen zu
wollen.
-
Das
6-Aminophenanthridin kann gemäß dem von
Kessar et al, 1969, ausgearbeiteten Betriebsmodus zubereitet werden.
-
Das
6-Aminophenanthridin wurde daher erfindungsgemäß im Vergleich mit den Kastellpaolitinen
1 (KP1) und 5 (KP5) sowie mit dem Phenanthridin gescreent. Das Ergebnis
ist ganz eindeutig: Das 6-Aminophenanthridin ist noch aktiver als
die Kastellpaolitine und das Phenanthridin.
-
4 stellt
die Ergebnisse dieses Vergleichs dar: Die Aktivität des 6-Aminophenanthridin
wurde auf der Schale bestimmt und mit der des Phenanthridins verglichen.
Bei allen Molekülen
wird dieselbe Menge aufgebracht (10 μl einer Lösung zu 10 mM). In dem Fall
einer positiven Bezugsgröße (Guanidiumchlorid)
war die verwendete Lösung
zu 300 mM.
-
Infolgedessen
haben die Erfinder durch das Aufsetzen dieser für die Kastellpaoli tine charakteristischen
Aminogruppe auf das Phenanthridin die Aktivität desselben stark erhöht.
-
Unter
Weiterverfolgung desselben Ansatzes haben die Erfinder anschließend ein
Chlor in Position 8 in das 6-Aminopha 6-Amino-Nanthridin (6AP) hinzugefügt, um 18Chlorophenanthridin
(6A8CP) zu produzieren. Diese Änderung
hat erneut die Aktivität
der Verbindung erhöht.
Schließlich
wurde das Chlor in Position 8 durch eine Trifluoromethyl-Gruppe
ersetzt, um das Amino-8-6-Trifluoromethylphenanthridin
(6A8tFP) zu ergeben. Wie in 4 gezeigt,
hat dieses letzte Änderung
zu einer zusätzlichen
Erhöhung
der Aktivität
geführt,
und das 6A-8tFP steht derzeitig für eine der aktivsten Verbindungen.
-
Beispiel 3: Synergie zwischen
den isolierten Produkten mithilfe des Screenings und des Guanidiumchlors
-
Alle
aktiven Moleküle
wurden in einem eine schwache Dosis Guanidiumchlorid enthaltendes
Medium isoliert (200 μM/effiziente
Dosis = 4 mM). Diese bei der Ausarbeitung des Screening getroffene
Entscheidung entsprach dem Bestreben nach einer Erhöhung der
Sensibilität
(und damit des Feststellungsschwellenwertes des Verfahrens). Anschließend wurde
die Wirkung der Moleküle
in mehr als (500 μM)
Guanidiumchlorid oder überhaupt
keines enthaltenden Medien beobachtet. Das Phenanthridin ist immer
noch auf einem Medium ohne Guanidiumchlorid aktiv, aber seine Aktivität steigt
erheblich in Abhängigkeit
von der Guanidiumchloridmenge (trotz einer deutlich subeffizienten
Dosis) in dem Medium. Dieses Ergebnis zeigt eine Wirkungssynergie
zwischen dem Guanidiumchlorid und dem Phenanthridin an. Dasselbe
Ergebnis wurde für
alle anderen von den Erfindern isolierten Moleküle erhalten (die Kastellpaolitine,
das 6-Aminophenanthridin und seine Derivate).
-
Beispiel 4: Überprüfung der
Reinigung im flüssigen
Medium
-
Anschließend wollten
die Erfinder bestimmen, ob die im Hefetest beobachteten roten Halos
effektiv der Ausschlämmung
des Prions [PSI+] entsprachen und nicht einem Artefakt (z. B. könnten diese
roten Halos auf eine direkte Inhibition der Biosynthesekette des
Adenins durch diese Moleküle
zurückzuführen sein,
was zu einer Anhäufung
des AIR führen
würde).
Wenn diese Moleküle
effektiv das Prion [PSI+] ausschlämmen, muss ihnen eine Behandlung
in flüssiger
Zellkultur [PSI+] gefolgt von einer Waschung der genannten Zellen
die Bildung von roten Kolonien auf einem keine Moleküle mehr
enthaltendem Agar-Agar-Medium erlauben. Diese Tests wurden mit dem
6-Aminophenanthridin auf dem wilden „strong" Stamm 74-D694 durchgeführt.
-
Die
Reinigungsbedingungen im flüssigen
Medium sind wie folgt: Ein Stamm [PSI+] wird 5 Tage lang im flüssigen Medium
bei Vorhandensein der angegebenen Mengen der unterschiedlichen Produkte
gezüchtet (siehe 5).
Alle 24 Std. wird eine aliquote Fraktion im unberührten Medium
von jedem Produkt gewaschen und auf einem festen Agar-Agar-Medium
aufgebracht (das seinerseits ebenfalls von jedem Produkt unberührt ist),
das anschließend
wie in 2 angegeben behandelt wird.
-
Wie
in 5 gezeigt, ist das 6-Aminophenanthridin fähig, das
Prion [PSI+] in einer erheblichen Anzahl von Zellen teilweise auszuschlämmen. Die
Wirksamkeit der Reinigung kann durch Hinzufügen einer subeffizienten Dosis
(100 μM)
an Guanidiumchlorid im Kulturmedium erheblich erhöht werden.
In einer derartigen flüssigen
Reinigung findet sich ebenfalls dieselbe Synergiewirkung wie die,
die im Test in der Schale beobachtet wird.
-
Beispiel 5: Ausarbeitung
und Verwendung eines sekundären,
auf der Verwendung von [URE3], einem anderen Hefeprion, basierenden
kolorimetrischen Screeningt
-
Es
wurde ein anderer, auf einem anderen Hefeprion basierender schneller
Test in der Schale durchgeführt:
[URE3]. Dieser Test besteht aus einem sekundären Screening, das die Generalisierung
der Wirkung der isolierten Produkte beim primären Screening auf ein anderes
Hefeprion erlaubt.
-
Auf
diese Weise ist es möglich,
die aktiven und damit weniger interessanten, da mit einer nicht
allgemeinen Wirkung versehenen Moleküle ausschließlich gegen
das Prion [PSI+] auszuschließen.
-
Der
für das
Prion verwendete haploide Stamm [URE3] ist CC34 (Mat a, trp1-1,
ade2-1, leu2-3, 112, his3-11, 15, ura2::HIS3).
-
Der
Stamm NT34, der zum sekundären
Screening gedient hat, wurde ausgehend von CC34 aufgebaut, ein Stamm,
in dem die kodierende Phase des Gens DAL5 durch die des Gens ADE2
ersetzt wurde, indem dasselbe Verfahren verwendet wurde wie das
für den
Aufbau des Stamms STRg6 verwendete Verfahren. Dafür wurde
eine dem von den sich oberhalb und unterhalb der kodierenden Phase
des Gens DALS befindenden Sequenzen in der DNA flanierten Gen ADE2
entsprechende Deletionskassette durch PCR unter Verwendung der genomischen
DNA des haploiden Stamms BY4742 Mat α, his3Δ1, leu2Δ0, lys2ΔO, ura3ΔO) als Matrix und den folgenden
Oligonukleotiden produziert:
ACAACAAAACAAGGATAATCAAATAGTGTTCAAGATGGATTCTAGAACAGTTGG
(SEQ ID Nr.5) (5'),
und,
TATATTCTTCTCTGATAACAATAATGTCAGTGTATCTCACCACTATTATTACTTGTTTTCTA
GATAAGC (SEQ ID Nr.6) (3')
als Initiatoren.
-
Die
Mutation dal5: ADE2 wurde anschließend von PCR unter Verwendung
der genomischen DNA des Stamms NT34 als Matrix und der folgenden
Oligonukleotiden überprüft:
ATAGTCTCTGCTCATAG
(SEQ ID Nr. 7) (5'),
und,
GCTTACAGAAATTCTAC (SEQ ID Nr.8) (3') als Initiatoren.
-
Der
Stamm NT34 (Mat a, trp1-1, ade2-1, leu2-3, 112, his3-11, 15, ura2::HIS3,
dal5::ADE2) wurde bei der CNCM am 10. Oktober 2002 unter der Nummer
1-2942 angemeldet.
-
Das
Screening basiert auf demselben kolorimetrischen System wie das
primäre
Screening. In dem Hefestamm NT34 ist das Gen ADE2 nicht mehr unter
der Kontrolle seines eigenen Promoters, sondern unter der des Gens
DAL5. Wenn das Protein Ure2p eine Prionenform ([URE3]) aufweist,
wird die Transkription ausgehend von dem Promoter des Gens DAL5
aktiviert, das Gen ADE2 wird daher ausgedrückt, damit sind die Stämme weiß und für das Adenin
autotroph. Wenn das Protein Ure2p die normale Form ([ure3-0]) aufweist,
wird die Transkription ausgehend vom Promoter des Gens DALS unterdrückt, das
Gen ADE2 wird daher nicht ausgedrückt, damit sind die Stämme rot
und für
das Adenin auxotroph. Wenn der Stamm NT34 ungefähr zehn Generationen lang mit
5 mM Guanidiumchlorid behandelt wird, bildet er rote Kolonien (wie
erwartet und wie der für
das primäre Screening
verwendete Stamm [PSI+] dies tun würde). Wie in 6 beobachtet
werden kann, rufen das Phenanthridin und das 6-Aminophenanthridin
das Auftreten eines roten Halos hervor, wenn sie auf dem kleinen
Filter aufgebracht werden, der seinerseits auf dem zuvor auf dem
Agar-Agar-Nährmedium
verstrichenen Zellteppich aufgebracht wurde (dasselbe Verfahren
wie bei dem primären
Screening, siehe 2). Dieses Ergebnis lässt vermuten,
dass diese Produkte ebenfalls auf dem Prion [URE3] aktiv sind. Es
ist jedoch anzumerken, dass das sekundäre Screening deutlich weniger
sensibel ist als das primäre
Screening. Es ist daher sehr sinnvoll, um rasch zu beobachten, ob
die Wirkung der beim ersten Screening isolierten Moleküle auf andere
Hefeprionen generalisierbar ist, aber auf keinen Fall kann es das
primäre
Screening ersetzen.
-
Um
die zelluläre
Permeabilität
zu erhöhen,
wurde die kodierende Sequenz des Gens ERG6 ebenfalls durch die Zelle
des Gens TRP1 ersetzt. In diesem Stamm (SB34) hängt die Transkription von ADE2
daher von dem Zustand von Ure2p ab: Wenn Ure2p durch einen Prionenmechanismus
inaktiviert wird (Zellen [URE3]), transkribiert das Gen ADE2 aktiv,
während
dies in den Zellen [ure3-0] nicht der Fall ist. Daher werden die
Zellen [URE3] des Stamms SB34 weiße Kolonien bilden, während die
Zellen [ure3-0] rote Kolonien bilden werden. Aufgrund der Tatsache,
dass dieser Stamm immer noch das Allel ade2-1 enthält, wurde
daran gedacht, dass dieser Stamm [PSI+] sein könnte, so dass die rote Färbung auf
die Reinigung [PSI+] zurückzuführen sein
könnte
anstatt von [URE3]. Diese Möglichkeit
wurde unter Überprüfung durch
Zytoduktion und Konjugation, dass der Stamm effektiv [URE3] ist,
ausgeschlossen. Darüber
hinaus wurde die vollständige
kodierende Sequenz des Gens ade2-1 deletiert, um den Stamm NT35
zu ergeben. Dieser Stamm wurde ebenfalls aus weißen Kolonien gebildet, was
aufzeigt, dass es sich effektiv um [URE3] handelt.
-
Der
Stamm SB34 wurde durch Ersatz des Gens ERG6 in CC34 durch Amplifikation
PCR des Markierers TRP1 und durch Ersatz der kodierenden Region
des Gens DAL5 durch das Gen ADE2 unter Verwendung einer auf der
PCR durch Deletion des Gens ERG6 mit den Initiatoren
(5'-ACAACAAAACAAGGATAATCAAATAGTGTAAAAAAA
AAAATTCAAGATGGATTCTAGAACAGTTGG-3') (SEQ
ID Nr. 9) und 342
(5'-ACAACAAAACAAGGATAATCAAATAGTGTAAAAAAA
AAAATT CAA-TATATTCTTCTCTGATAACAATAATGTCAGTGTATCT-CACCACTATTATTACTTGTTTCTAG
ATAAGC-3') (SEQ
ID Nr. 10) aufgebaut. Dieser Genersatz wurde anschließend durch
Wachstum auf dem Medium SD-Ade bei fehlendem Wachstum auf dem Medium
USA (wie für
einen Stamm da15Δ vorgesehen)
und durch analytisches PCR auf der genomischen DNA bestätigt. Der
Phänotyp
[URE3] dieses Stammes wurde per Zytoduktion überprüft: Von 30 Zytoduktoren waren
26 zum Wachsen auf dem Medium USA fähig und zeigten, dass es sich
um [URE3] handelte. Der Stamm NT35 wurde unter Ersatz des Gens ade2-1
in dem Stamm SB34 durch den durch PCR amplifizierten Markierer KanMX
und durch Überprüfung des
erfolgreichen Ersatzes des Gens durch analytisches PCR auf der genomischen
DNA aufgebaut.
-
Beispiel 6: Überprüfung der
Reinigung von [URE3] im flüssigen
Medium
-
Es
wurden zwei Typen von Versuchen durchgeführt, um zu überprüfen, dass die in der Schale
mit dem Stamm NT34 beobachtete Wirkung effektiv der Reinigung entspricht.
Zunächst
wurden Zellen in den benachbarten Bereichen der Filter für die negative
Bezugsgröße (DMSO),
die positive Bezugsgröße (Guanidiumchlorid),
für das
Phenanthridin und für
das 6-Aminophenanthridin aufgefangen. Diese Zellen wurden anschließend auf
einem frischen Medium ohne alle diese Moleküle in Streifen angeordnet.
Diese um Filter aufgefangenen Zellen bilden alle rote Kolonien,
mit Ausnahme derer, die um die negative Bezugsgröße herum geerntet wurden. Dieses
Ergebnis zeigt, dass die auf der Schale für den Stamm NT34 beobachtete
rote Färbung
effektiv einer Reinigung entspricht und nicht einem mit einer Inhibition
eines Enzyms des Biosynthesewegs des Adenins verbundenen Artefakt
(In diesem Fall wäre
die rote Färbung
auf einem Medium ohne Hemmstoff verloren gegangen). Die Reinigungswirkung
des Phenanthridins und des 6-Aminophenanthridins wurde ebenfalls
direkt auf dem Prion [URE3) überprüft. Zellen
[URE3] des Stamms CC34 wachsen auf einem als USA bezeichneten Medium,
während
gereinigte Zellen ([ure3-0)) zum Wachsen auf diesem Milieu nicht
fähig sind.
Die Erfinder haben die Fähigkeit
der mit 200 μM
Guanidiumchlorid (negative Bezugsgröße), mit 5 mM Guanidiumchlorid (positive
Bezugsgröße) oder
mit unterschiedlichen Dosen an 6-Aminophenanthridin (allein oder
in Kombination mit 200 μM
Guanidiumchlorid) behandelten Zellen [URE3] zum Wachsen auf ei nem
Medium USA geprüft.
Das 6-Aminophenanthridin ist fähig,
das Prion [URE3] auf erhebliche Weise zu reinigen, und ebenso wie
beim Prion [PSI+] wird diese Wirkung durch eine geringe Dosis Guanidiumchlorid
(200 μM)
verstärkt.
Diese Ergebnisse deuten neben der Tatsache, dass sie das sekundäre Screening
mit dem Stamm NT34 validieren, darauf hin, dass die durch das genannte
Screening aufgezeigte Wirkung der Hemmstoffe auf allen Hefeprionen
allgemein sein dürfte.
-
Beispiel 7: Validierung
des Screenings mit zwei aktiven Molekülen auf dem Prion der Säugetiere
PrP: Chlorpromazin und Quinakrin
-
Das
Labor von Stanley Prusiner, dem Vater der Hypothese des „einzigen
Proteins" und Nobelpreisträger 1997,
hat dank eines Systems aus chronisch mit dem Prion PrPSC infizierten
Mäusezellen
(Neuroblastomen) eine ganze Reihe von aktiven Molekülen auf
dem Säugetierprion
PrP isoliert ((Korth et al., 2001). Dieses System erlaubt aufgrund
seiner Umständlichkeit
und seiner Komplexität
kein massives Screening wie das, das von den Erfindern ausgearbeitet
wurde. Daher bestand der Ansatz der Gruppe von Stanley Prusiner
in dem individuellen sukzessiven Testen derjenigen bereits als Medikamente
verwendeten Moleküle,
die die hemato-enzephalische Barriere durchbrechen. Bestimmte Moleküle, wie
insbesondere Quinakrin (das seit langem als Malariamittel verwendet
wird) oder Chlorpromazin (ein Antidepressivum) weisen eine in ihrem
System erhebliche Aktivität
auf. Zwecks Validierung des Screenings haben die Erfinder daher
Chlorpromazin und Quinakrin in ihrem Hefesystem getestet. Wie in 7 aufgezeigt,
weisen diese beiden Moleküle
eine gewisse Aktivität
gegen das Prion [PSI+] auf. Es ist jedoch anzumerken, dass ihre
Aktivitäten
deutlich geringer sind als die des 6-Aminophenanthridins. Es ist
ebenfalls festzustellen, dass Chlorpromazin und Quinakrin, ebenso
wie alle von der Erfindung nachgewiesenen Moleküle, eine starke Aktionssynergie
mit Guanidiumchlorid aufweisen (Das in 7 verwendete
Medium enthält
200 μM Guanidiumchlorid).
Dieses letzte Ergebnis deutet darauf hin, dass diese beiden Moleküle auf einem
und demselben biochemischen Weg agieren wie die erfindungsgemäß isolierten
Moleküle.
-
Darüber hinaus
ist es interessant festzustellen, dass Quinakrin, dessen Aktivität ungefähr zehn
Mal höher
ist als die des Chlopromazins in dem Test von Professor Prusiner,
ebenfalls eine deutlich höhere
Aktivität aufweist
als die in dem von den Erfindern ausgearbeiteten Screening. Darüber hinaus
erfordern Chlorpromazin und Quinakrin ebenso wie in dem Test von
Professor Prusiner vor der Feststellung einer Aktivität eine längere Behandlung
(im Falle des Tests von Professor Prusiner wenigstens 6 Tage, im
Falle des erfindungsgemäßen Screening
wenigstens zwei bis drei Tage).
-
Darüber hinaus
haben die Erfinder die Aktivität
von anderen, dank des auf den Neuroblastomen von Mäusen basierenden,
von Professor Prusiner ausgearbeiteten isolierten Molekülen in dem
erfindungsgemäßen Test
bestimmt. Es wurde eine gute Korrelation zwischen den in den beiden
Systemen erhaltenen Ergebnissen festgestellt: Acepromazin, das sich
in dem Säugetiersystem
als leicht aktiv erwiesen hat, hat ebenfalls eine geringe Aktivität in dem
erfindungsgemäßen Test
gezeigt, und die in der Analyse mit den Säugetieren inaktiven Moleküle wie Karbamazepin,
Imipramin, Haloperidol, Chloroprothixen oder Methylenblau waren
in den Test ebenfalls inaktiv.
-
Quinakrin
wird ebenfalls als Hemmstoff der multiplen Medikamentenresistenz
beschrieben (MMR). Um zu testen, ob seine Antiprionen-Wirkung diesen
Mechanismus betreffen könnte
(der mit der Synergiewirkung des GuHCl kompatibel ist), haben wir
die angenommene Reinigungswirkung eines wirksamen allgemeinen Hemmstoffs
von MMR, Verapamil, bewertet. Wie in 7 aufgezeigt,
konnte keinerlei Heilungswirkung nachgewiesen werden, obwohl eine
starke Konzentration dieses Medikaments eingesetzt wurde, die nahe
an der Toxizität
lag.
-
Alle
diese Korrelationen zwischen der Aktivität des Quinakrins und des Chlorpromazins
gemäß dem Test
oder dem durchgeführten
Screening erlauben die Validierung der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Realisierung des Screenings mit hohem Durchsatz zwecks Isolation
der Moleküle,
die wirksame Medikamente (für
Säugetiere
und insbesondere den Menschen) gegen neurodegenerative, Proteinaggregate
implizierende Krankheiten vom Typ spongiforme Enzephalopathien,
Alzheimer-Krankheit, Huntington-Krankheit, usw. bilden können.
-
Beispiel 8: Analyse der
Inhibition des PrPSC in den Zellen ScN2a-22L
-
Es
wurden mit dem Prion der Traberkrankheit bei Schafen (ScN2a-22L)
infizierte Zellen von Mäuse-Neuroblastomen
verwendet. Die Zellen wurden in Flakons von 25 cm2 bei
Vorhandensein oder Fehlen der Verbindungen mehrere Tage lang gezüchtet. Anschließend wurden
die Proteine der Zellen ScN2a-22L per Zell-Lyse in 500 μl des Lysepuffers
(50 mM Tris NCl pH 7,5; 150 mM NaCl, 0,5 % Natrium-Desoxycholat;
0,5 % Triton X100) extrahiert. Nach der Normalisierung der Proteine
mit dem Kit Uptima Interchim wurden die angepassten Mengen des Zell-Lysats
durch die Proteinase K zu 20 μg/ml
(Eurobio) 40 Min. lang bei 37°C
aufgelöst.
Die Lysate wurden anschließend
90 Min. lang zu 20.000 × g
zentrifugiert, und der Rückstand
wurde in 25 μl
denaturierendem Puffer (1 X Tris-Glycin; 4 % SDS, 2 % β-Mercaptoethanol;
5 % Saccharose und Bromophenol-Blau) zentrifugiert und 5 Min. lang
bei 100°C
vor der Analyse per Western Blot nach dem Standardprotokoll unter
Verwendung des monoklonalen Mäuse-Antikörpers Anti-PrP
SAF83 (geliefert von SPI-IO, Massy-Palaiseau, Frankreich) erhitzt.
Die Inhibitions-Prozentsätze
der Bildung von der Proteinase K widerstehenden PrPSC wurden
unter Verwendung des NIH Image J berechnet: Die Inhibition der Anhäufung von
PrPSC betraf beim Chlorpromazin (Chlor.)
96 % und beim KP1 70 % +/– 6
%.
-
Zwei
der ausgewählten
Verbindungen (KP1 und 6AP) wurden in diesem Säugetiersystem getestet. Wie
in 8 aufgezeigt 8, war das KP1 fähig, eine erhebliche Verringerung
der Anhäufung
von Säugetier-Prionen
in einer ähnlichen
Dosis zu induzieren wie der, die für das Chlorprimzin (5 μM) verwendet
wurde. Nach 7-tägiger
Behandlung waren 70 % der der Proteinase K widerstehenden PrPSC (Schälchen
1 bis 3) im Vergleich zu den nicht behandelten Zellen (Schälchen 4
und 5) verschwunden. Diese erhebliche Wirkung wurde vermutlich unterschätzt, da
nur die mit dem Lösungsmittel
der Verbindungen behandelten Zellen eine erhebliche und eine der
Proteinase K widerstehende PrPSC reproduzierbare
Erhöhung
(DMSO 0,01 %) (Schälchen
6) aufgezeigt haben. Dieselbe Wirkung bei der Entfernung der PrPSC wurde mit dem 6AP zu 2 und 4 μM erzielt.
-
Diese
Ergebnisse validieren damit die Verwendung des erfindungsgemäßen, auf
der Hefe zur Isolation der Antiprionen-Verbindungen basierenden
Tests zum Screening, da das Quinakrin und das Chlorpromazin unter
Verwendung dieser Analyse festgestellt wurden und das KP1 und 6AP
ebenfalls zur Begünstigung
der Entfernung des Säugetierprions
in vitro wirksam waren.
-
Beispiel 9: Studie der
Strukturaktivität/
-
Die
Erfinder haben mit dem Ziel, die unterschiedlichen Substitutionspositionen
der isolierten Antiprionen-Moleküle
zu untersuchen, eine Struktur-/Aktivitäts-Studie auf dem Molekül 6-Aminophenanthridin
durchgeführt.
Die Moleküle
des 2-Fluoro-6-Amino-Phenanthridins
(2f-6AP), 2-Fluoro-6-Amino-8-Chloro-Phenanthridins)
(2f-6A-8CIP) und 6-7-Amino-Chlorophenanthridins (6A-7CIP) wurden
somit per chemischer Synthese gewonnen, und ihre Anti-(6A-Prionen-Aktivität wurde
unter Verwendung des erfindungsgemäßen Tests bestimmt. Die erzielten
Ergebnisse werden in 9 aufgeführt. Da die Durchmesser der
erhaltenen roten Halos proportional zur Antiprionen-Aktivität der aufgebrachten
Moleküle
sind, zeigen die Ergebnisse an, dass das Vorhandensein eines Substituanten
vom Typ Halogen bei den Positionen 7 oder 8 die Antiprionen-Aktivität der Moleküle der Formeln
(II) erhöht,
während
derselbe Substituantentyp in Position 2 dazu neigt, sie zu verringern.
-
Bibliographische
Referenzen
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- Fernandez-Bellot et al., "The protein-only theory and the yeast
Saccharomyces cerevisiae: the prions and the propagons", C M LS, 2001, 58:1857–1878.
- Korth C. et al., "Acridine
and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion
disease", PNAS, 2001,
98(17): 9836–9841.
- Mettey Y. et al., "Synthesis
of 11-Aminodibenzo[b,f][1,4]thiazepines and Fluoro derivatives", J. Hetero cyclic
C hem., 1997, 34:465–467.
- Kessar S.V. et al., Tetra hedron Letters, 1969, 1151.
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