CN101481729B - 一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗阮病毒药物的方法。采用的技术方案是：将野生型酿酒酵母细胞内的分子伴侣SSA1基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸，得到基因突变型SSA1-YS1酵母细胞；然后经SSA1-YS1酵母细胞的活化；初始OD值的调试；制备筛选待测药物检测溶液；从第一天起，隔天提取适量SSA1-YS1酵母细胞悬液稀释后平板涂布；置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，观察SSA1-YS1酵母细胞的颜色。本发明极大地降低药物筛选过程中的假阴性，不仅待测药物的用量少，而且提高了筛选精确度、降低了筛选成本消耗。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法。特别涉及到的是利用基因定点突变酵母细胞高灵敏度的筛选抗朊病毒药物的方法。
背景技术
朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。目前，全世界的研究者们正致力于寻求建立高通量抗朊病毒药物筛选平台的研究，从而尽快研发出预防和治疗朊病毒引发疾病的药物。
目前，在美国和欧洲有关抗朊病毒药物的研发领域中，主要利用动物细胞模型来筛选抗朊病毒的药物。但是由于这个筛选系统技术上的复杂性，只能局限在少数化合物中进行；更重要的是，由于这个筛选系统的实验成本过于昂贵，又具有哺乳类动物内朊病毒交叉传染的危险性，需要P3级以上的无菌实验室和大量的高级技术人员的工作才能保证药物筛选的进行，使得大规模的在已知化合物的范畴内筛选抗朊病毒药物缺乏实用的可能性。最近的研究表明，建立在野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)上的抗朊病毒药物筛选模型在很大的程度上可以取代动物细胞模型，并且具有经济、简单、安全的特性。但是野生型酵母细胞作为抗朊病毒药物筛选模型仍存在着缺陷和不足：由于对药物的敏感度较低，使得待测药物用量较大，并容易造成药物筛选时假阴性过高，可能漏筛某些温和型的抗朊病毒的药物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明根据野生型酿酒酵母细胞(Saccharomvcescerevisiae)中分子伴侣Ssalp对于朊病毒[PSI+]的调控机理，通过基因定点突变酵母细胞内分子伴侣SSA1基因，提供一个高灵敏度的抗朊病毒药物筛选的酵母细胞模型，从而降低待测药物用量，降低药物筛选时假阴性的比率，使得能在更大的范围内高通量筛选抗朊病毒药物。
本发明选用的菌种是野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为208719。这种酿酒酵母带有[PSI+]朊病毒，固体菌落颜色为白色。
本发明的技术方案是基于分子水平的朊病毒的致病机理，以及细胞内分子伴侣在朊病毒的形成过程中的调控作用原理，使用基因突变技术改造了野生型酵母细胞对抗朊病毒药物敏感度低的缺陷。
本发明采用的技术方案是：一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，步骤如下：
1)SSA1-YS1酵母细胞的制备：
将野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)内的分子伴侣SSA1基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸，得到基因突变型SSA1-YS1酵母细胞，其菌落颜色为粉色；
2)筛选抗朊病毒药物：
SSA1-YS1酵母细胞的活化：取SSA1-YS1酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养；
SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试：调制SSA1-YS1酵母细胞悬液OD600＝0.5；
筛选待测药物：取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1～5天；
检测：从第一天起，隔天提取100μl前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，观察SSA1-YS1酵母细胞的颜色。
通过SSA1-YS1酵母菌落颜色的变化观察待测药物对于朊病毒的治疗效果：菌落(即SSA1-YS1酵母细胞)为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[PSI+]的治愈率：愈率＝变红的菌落数/总的菌落数×100％。
SSA1-YS1酵母细胞的基本生理特征对比原来的野生型酵母细胞进行定量化的评估：测定相同培养条件下的SSA1-YS1酵母细胞与野生型酵母细胞的代时及菌落颜色的指标。结果见表1。
表1 SSA1-YS1酵母细胞与野生型酵母细胞的代时及菌落颜色
*培养条件为1/2YPD，三次测定结果的平均值。
本发明的有益效果是：分子伴侣基因突变型SSA1-YS1酵母细胞会使该酵母对于抗朊病毒药物的敏感性产生巨大的提高，而这个基因突变对酵母细胞的正常生长及生理特征影响极小，因此可以极大地降低药物筛选过程中的假阴性。可以在活体内安全的筛选出温和型的抗朊病毒药物，为在更大范围内的寻找抗朊病毒的药物奠定基础，为寻找抗哺乳动物朊病毒药物提供了依据。同时，不仅大大降低了待测药物的用量，而且提高了筛选精确度、降低筛选成本消耗。
具体实施方式
实施例1
1)SSA1-YS1酵母细胞的制备：
(1)基因突变：取野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为208719，利用分子生物学上的基因操作技术，使用聚合酶链式反应(PCR)，扩增酵母细胞的分子伴侣SSA1基因，并将其分别连接到pRDW10(URA3)质粒和pJ120(LEU2)质粒载体上。利用定点突变试剂盒，将pJ120质粒上的SSA1基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸(UUG密码子→UGG密码子)，突变后的基因启动子仍为SSA1基因的启动子，将突变后的质粒命名为pJ121。然后将突变后的SSA1基因进行DNA测序确认，命名为SSA1-YS1。
(2)基因重组：因为SSA1基因为生长必须基因，首先，将带有SSA1基因的pRDW10(URA3)质粒导入酵母细胞中；其次，利用同源重组技术敲除染色体基因组上的SSA1基因；然后将带有SSA1-YS1基因的pJ121质粒导入酵母细胞；最后，利用质粒替换技术在含有5-FOA的培养基上筛选出丢失pRDW10质粒的酵母细胞，利用标签基因LEU2筛选出含有pJ121质粒的SSA1-YS1酵母细胞，制得SSA1-YS1酵母细胞。
(3)重组细胞(SSA1-YS1酵母细胞)鉴定：采用在基因水平的DNA测序、mRNA逆转录测序，以及蛋白质水平的western blot鉴定，酵母细胞的四分体表现型分析等手段进行鉴定。
(4)保藏SSA1-YS1酵母细胞：使用酵母菌的常规保藏方法，保藏得到SSA1-YS1酵母细胞。
2)模拟筛选抗朊病毒药物盐酸胍：
SSA1-YS1酵母细胞的活化：在无菌操作条件下，挑取3个以上的上述制备的SSA1-YS1酵母细胞放入装有1/2YPD液体培养基的三角瓶中，30℃振荡过夜培养。
SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试：取上述培养的SSA1-YS1酵母细胞悬液放入比色杯中，使用紫外分光光度计，用1/2YPD液体培养基调零，UV设置在600nm，测量酵母细胞悬液的OD值，加入酵母细胞悬液或1/2YPD液体培养基来调节OD值至0.5。
筛选待测药物：取3支无菌冻存管，分别加入含有1/2YPD培养液900μl、897μl、895μl；上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液各100μl以及1mol/L的盐酸胍0μl、3μl、5μl，使其终浓度分别为0mM、3mM、5mM。在24℃的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞100μl放入新的装有和上述同样含量的1/2YPD培养液和盐酸胍的无菌冻存管中。
检测：从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞悬液适量，稀释后，取100μl稀释液在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，观察SSA1-YS1酵母细胞的颜色。菌落为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[PSI+]的治愈率：愈率＝变红的菌落数/总的菌落数×100％。结果见表2。
同时，做对比实验，直接用野生型酵母细胞做盐酸胍对朊病毒的作用效果实验，步骤同SSA1-YS1酵母细胞。结果见表2。
从表2中可以看出：SSA1-YS1酵母细胞中，不论盐酸胍的浓度是3mM还是5mM，对于朊病毒[PSI+]的治愈率都极明显的高于的野生型酵母细胞。另外，不论盐酸胍的浓度是3mM还是5mM，SSA1-YS1酵母细胞中盐酸胍对[PSI+]的治愈率在第3天时就基本超过了野生型酵母细胞中第5天的治愈率。这就说明了SSA1-YS1酵母细胞中朊病毒[PSI+]对药物盐酸胍的灵敏性明显高于野生型酵母细胞。
表2不同浓度盐酸胍对SSA1-YS1酵母细胞和野生型酵母细胞对[PSI+]朊病毒的治愈率*
*数据均为三次测定结果的平均值。
实施例2
1)取实施例1制得的SSA1-YS1酵母细胞。
2)模拟筛选抗朊病毒药物菲啶(phenanthridine，phe)：
SSA1-YS1酵母细胞的活化：同实施例1。
SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试：同实施例1。
筛选待测药物：在该体系中，使用0.5mM盐酸胍作为药物筛选的增效剂。
取7支无菌冻存管，4支分别加入含有0.5mM盐酸胍的1/2YPD培养液900μl、898.75μl、897.5μl、895μl；上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液各100μl；以及40mM菲啶0μl、1.25μl、2.5μl、5μl，使每只冻存管中的药物浓度分别为0.5mM盐酸胍+0mM菲啶、0.5mM盐酸胍+0.05mM菲啶、0.5mM盐酸胍+0.1mM菲啶以及0.5mM盐酸胍+0.2mM菲啶。1支加入1/2YPD培养液895μl、上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液100μl、40mM菲啶5μl使得冻存管中药物浓度为0.2mM菲啶+0mM盐酸胍。2支分别加入1/2YPD培养液900μl、895μl；上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液各100μl；以及1mM的盐酸胍0μl、5μl，使其终浓度分别为0mM(用作阴性对照)、5mM(用作阳性对照)。在24℃的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞100μl放入新的装有和上述同样含量的盐酸胍的1/2YPD培养液、菲啶的无菌冻存管中。
检测：从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞悬液适量，稀释104倍后，取100μl稀释液在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，通过SSA1-YS1酵母细胞的颜色变化，观察加入增效剂盐酸胍的不同浓度菲啶的对于朊病毒的治疗效果。菌落为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[PSI+]的治愈率：愈率＝变红的菌落数/总的菌落数×100％。结果见表3。
同时，做对比实验，直接用野生型酵母细胞做加入增效剂盐酸胍的不同浓度菲啶对朊病毒的作用效果实验，步骤同SSA1-YS1酵母细胞。结果见表3。
从此表中可以看出：在不同浓度下，同样可以看出实施例1中的结果即：SSA1-YS1酵母细胞对于朊病毒[PSI+]的治愈率都极明显的高于的野生型酵母细胞；在各个有效药物浓度下，SSA1-YS1酵母细胞中盐酸胍对[PSI+]的治愈率在第3天时就基本超过了野生型酵母细胞中第5天的治愈率。更重要的是，在不足以治愈[PSI+]的较低浓度的盐酸胍存在时，可以增强菲啶对于[PSI+]的作用效果。
表3加入盐酸胍的不同浓度菲啶对SSA1-YS1和野生型酵母细胞[PSI+]朊病毒的治愈率*
*数据均为三次测定结果的平均值。
实施例3
1)取实施例1制得的SSA1-YS1酵母细胞。
2)筛选待测药物
SSA1-YS1酵母细胞的活化：同实施例1。
SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试：同实施例1。
筛选待测药物：取若干支无菌冻存管，按照实施例1的模式，在总体积为1ml的混合体系中分别加入一定浓度的待测药物、1/2YPD培养液以及占总体积10％的上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液；另取2支无菌冻存管按照实施例2分别加入1/2YPD培养液、上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液以及盐酸胍0mM(用作阴性对照)、5mM(用作阳性对照)。在24℃的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞100μl放入新的装有和上述同样含量的1/2YPD培养液、待测药品的无菌冻存管中。
检测：从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞悬液适量，稀释后，取100μl稀释液在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，通过SSA1-YS1酵母细胞的颜色变化，观察不同浓度的待测药物对于朊病毒的治疗效果。菌落为红色表示在该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[PSI+]的治愈率：愈率＝变红的菌落数/总的菌落数×100％。
实施例4
1)取实施例1制得的SSA1-YS1酵母细胞。
2)筛选待测药物
SSA1-YS1酵母细胞的活化：同实施例1。
SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试：同实施例1。
筛选待测药物：使用0.5mM盐酸胍作为药物筛选的增效剂，检测不同浓度梯度的待测药物对朊病毒[PSI+]的作用效果。
取若干支无菌冻存管，按照实施例2的模式，在总体积为1ml的混合体系中加入一定浓度的待测药物、含有0.5mM盐酸胍的1/2YPD培养液以及占总体积10％的上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液；另取2支无菌冻存管按照实施例2分别加入1/2YPD培养液、上述调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液以及盐酸胍0mM(用作阴性对照)、5mM(用作阳性对照)。在24℃的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞100μl放入新的装有和上述同样含量的含盐酸胍的1/2YPD培养液、待测药物的无菌冻存管中。
检测：从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞悬液，稀释后，取100μl稀释液在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，通过SSA1-YS1酵母细胞的颜色变化，观察在增效剂盐酸胍存在时，不同浓度的待测药物对于朊病毒的治疗效果。菌落为红色表示在该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[PSI+]的治愈率：愈率＝变红的菌落数/总的菌落数×100％。
Claims (1)
1.一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，其特征在于步骤如下：
1）SSA1-YS1酵母细胞的制备：
将野生型酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）内的分子伴侣SSA1基因编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸，得到基因突变型SSA1-YS1酵母细胞，其菌落颜色为粉色；
2）筛选抗朊病毒药物：
SSA1-YS1酵母细胞的活化：取SSA1-YS1酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养；
SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试：调制SSA1-YS1酵母细胞悬液OD600=0.5；
筛选待测药物：取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1~5天；
检测：从第一天起，隔天提取100μl前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，观察SSA1-YS1酵母细胞的颜色；
标准：SSA1-YS1酵母细胞为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，SSA1-YS1酵母细胞仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用；
其中，所述的待测药物是盐酸胍或菲啶。
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| 《朊病毒假说及酵母菌朊病毒假说》;李华玲;《医学综述》;20010315;第7卷(第3期);第131－133页 * |
| 李华玲.《朊病毒假说及酵母菌朊病毒假说》.《医学综述》.2001,第7卷(第3期),第131－133页. |
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