ES2279975T3 - Cribado de moleculas con actividad antiprionica: kits, metodos y moleculas cribadas. - Google Patents
Cribado de moleculas con actividad antiprionica: kits, metodos y moleculas cribadas. Download PDFInfo
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Abstract
Un kit de cribado de moléculas con actividad antipriónica, caracterizado por que conlleva la combinación de una levadura de fenotipo [PSI+], un antibiograma y un agente de limpieza de priones a dosis subóptimas, presentando dicha levadura el alelo ade1-1del gen ADE1 así como un gen ERG6 inactivado.
Description
Cribado de moléculas con actividad antipriónica:
kits, métodos y moléculas cribadas.
El presente invento se refiere al cribado de
moléculas con actividad antipriónica. Alude más en particular a kits
de cribado de moléculas con actividad antipriónica, a métodos de
cribado, y a una familia de moléculas con actividad antipriónica
puesta en evidencia con ayuda del cribado según el invento.
Los priones son proteínas infecciosas
responsables en los mamíferos de ciertas enfermedades
neurodegenerativas del tipo encefalopatías espongiformes como la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en el hombre o
incluso las llamadas enfermedades "de las vacas locas" en los
bóvidos o la "tembladera ovina" o "scrapie" en los
ovinos. Estas diferentes enfermedades son provocadas por agentes
infecciosos no convencionales: a diferencia de los agentes
infecciosos tradicionales (bacterias, virus por ejemplo), no
contienen ácidos nucleicos. El profesor Stanley Prusiner ha
formulado la hipótesis de "la proteína única", según la cual el
agente infeccioso no estaría constituido más que por una proteína.
Estar proteína existe de manera natural en las células bajo una
forma "normal" (o PrP^{c}), es decir soluble, esencialmente
bajo la forma de \alpha hélice y sin agregar de modo que es
funcional. En ciertas condiciones aún desconocidas, esta proteína
puede transformarse en una forma de prión (o PrP^{sc}). Bajo esta
forma prión, la proteína forma agregados insolubles, esencialmente
bajo la forma de láminas b. Del carácter infeccioso de esta
conformación prión PrP^{sc} vendría el hecho que, además de las
características indicadas precedentemente, la proteína bajo la forma
priónica gana igualmente la capacidad de catalizar el pase de la
forma celular normal PrP^{c} hacia la forma priónica PrP^{sc} en
un mecanismo de tipo "bola de nieve".
La levadura del pan Saccharomyces
cerevisiae contiene varias proteínas que se comportan como
priones (Fernandez-Bellot y Cullin, 2001). En los
años sesenta, dos mecanismos genéticos no convencionales son
descritos. En 1994, los fenotipos correspondientes [PSI+] y [URE3]
han sido propuestos como resultantes de la inactivación
autocatalítica de las proteínas Sup35p y Ure2p respectivamente.
Estas proteínas priónicas presentan pues a priori una
analogía mecanística con los sistemas mamíferos nocivos para la
sanidad publica. A semejanza de la proteína PrP, la proteína Sup35p
"normal" pasa de un estado soluble a un estado insoluble y
agregado desde que la proteína está en contacto con otra proteína
Sup35p bajo la forma priónica. Este estado agregado es verificado
tanto por experimentos de centrifugación como por experimentos de
localización intracelular. Los priones de la levadura pueden ser
eliminados ("limpiados") mediante una dosis elevada (1 a 5 mM)
de cloruro de guanidinio. Siguiendo a tal tratamiento (que debe ser
aplicado sobre al menos de seis a diez generaciones), los agregados
proteicos generados por la presencia de los priones desaparecen y la
proteína en cuestión (Sup35p, por ejemplo) se reencuentra bajo una
forma normal, soluble, funcional pero que conserva la
susceptibilidad de ser convertida a la forma priónica si se
encuentra de nuevo en contacto con otra proteína Sup35p en tal
estado.
La proteína Sup35p, en complejo heterodimérico
con la proteína Sup45p, forma un factor de terminación de la
traducción. Este factor reconoce los codones stop opalinos (UGA).
Bajo la forma celular normal (soluble y activa) en las cepas [psi-],
Sup35p, en asociación con Sup45p termina eficazmente la traducción
al nivel del estos codones opalinos. En esta cepa [PSI+]
donde la proteína Sup35p está bajo la forma priónica, está
mayoritariamente presente bajo la forma de agregados insolubles. Si
no se puede ligar a Sup45p, no es funcional durante la terminación
de la traducción. Una pequeña fracción del conjunto de proteínas
Sup35p celulares permanece no obstante soluble en estas células
[PSI+] donde permite en complejo con Sup45p, asegurar una
"función mínima" de terminación de la traducción, función
esencial para la supervivencia de la levadura. Un sistema
colorimétrico que permite detectar, de modo indirecto, la forma bajo
la cual la proteína Sup35p está presente: normal o prión, ha sido
elaborada a partir de estas constataciones. El sistema, descrito
después de mucho tiempo (véase el artículo de la síntesis por
Fernandez- Bellot y Cullin, 2001), está basado sobre la utilización
del alelo ade1-14 del gen ADE1, que codifica
una enzima de la vía de biosíntesis de adenina: la sintetasa SAICAR.
Esta enzima cataliza la formación de 4-(N.
Succinocarboxamida)-5-aminoimidazol
ribonucleótido (SAICAR) a partir de
4-carboxi-5-aminoimidazol
ribonucleótido (CAIR). El alelo ade1-14 contiene un
codon opalino en el marco de lectura del gen ADE1. En una
cepa [psi-], Sup35p en asociación con Sup45p parará por tanto
la traducción del gen ADE1 al nivel de este codon stop. La proteína
ade1-14p así traducida estará truncada y por
tanto no funcional. En consecuencia los sustratos aguas arriba de la
enzima Ade1p se acumularán, notablemente la
5-aminoimidazolribonucleótido (AIR). La AIR se oxida
a un compuesto de color rojo, las colonias formadas por las células
[psi-] serán de color rojo. Además, las células serán
auxótrofas para la adenina. Por el contrario, en una cepa
[PSI+], la proteína Sup35p es presentada esencialmente bajo
la forma de agregados que son por tanto incapaces de asociarse con
Sup45p para parar la traducción al nivel del codon opalino del alelo
aden1-14 del gen ADE1. Por
consiguiente, los ribosomas harán una pausa al nivel de este codon
stop antes de reencontrar su actividad de traducción (translectura).
Una cierta cantidad de proteína Ade1p funcional será por tanto
sintetizada, las células serán autótrofas para adenina y formarán
colonias de color blanco a rosado.
En una artículo publicado en P.N.A.S, el equipo
del Prof. Stanley Prusiner divulga un ensayo de detección de
moléculas con actividad antipriónica (Korth y otros, 2001). Este
ensayo es efectuado sobre un modelo de mamíferos (neuroblastomas
murinos infectados por PrP^{sc} ). Las condiciones de seguridad
(laboratorio P3) y de los cultivos celulares (manipulaciones
bastante intensas) no permiten realizar un cribado de alto
rendimiento.
La solicitud de patente WO98/30909 describe
igualmente un procedimiento de cribado de moléculas con actividad
antipriónica realizada sobre roedores infectados por un agente
transmisible no convencional. Este método de cribado presenta los
mismos límites que el método descrito en P.N.A.S.
Los documentos WO 02/065136 y WO 99/29891
describen los métodos de cribado de moléculas con actividad
antipriónica que pone en marcha una levadura.
Los trabajos de los inventores los han llevado a
realizar un sistema de cribado de alto rendimiento para poner en
evidencia moléculas que poseen una actividad antipriónica, basada
sobre el sistema indicador colorimétirico de la proteína Sup35p,
descrito anteriormente.
El presente invento es por tanto relativo a un
kit de cribado de moléculas con actividad antipriónica,
caracterizada en que conlleva la combinación de una levadura de
fenotipo [PSI+], un antibiograma y un agente de limpieza de priones
a dosis subóptimas, dicha levadura presenta el alelo
ade1-14 del gen ADE1 así como un gen
ERG6 inactivado.
Aunque basado en los priones de la levadura, el
kit según el invento permite aislar las moléculas activas contra los
priones de mamíferos. El ejemplo 7 que sigue muestra que las
moléculas más activas aisladas por el Prof. Prusiner presentan
igualmente una actividad en el cribado según el invento.
Sin embargo, se observan numerosas diferencia
entre los priones de la levadura y los priones de mamíferos. En un
artículo de la revista "Cellular and Molecular Life Sciences",
el profesor C. Cullin propone aún a la vista de estas diferencias
distinguir los priones de las levaduras de los de los mamíferos
empleando el término de "propagones". Como diferencias notables
entre los "priones" (de mamíferos) y los "propagones" (de
las levaduras), se puede citar el carácter citoplásmico de los
propagones mientras que el prión PrP de los mamíferos es una
proteína anclada a la membrana plasmática, el carácter patológico de
los priones de mamíferos, así como un cierto número de diferencias
biofísicas (estructura ternaria y cuaternaria, reversibilidad de la
limpieza...).
Una de las principales ventajas de tal cribado
reside en su perfecta inocuidad, lo que permite realizar en un
laboratorio de biología molecular clásica de nivel L2, y no, como se
requiere en las técnicas anteriores, en un laboratorio de nivel
P3.
Además, la gran facilidad de la utilización y el
bajo coste del kit hacen a éste un cribado de alto rendimiento
realizable. La utilización de pastillas tiene un antibiograma, que
permite la difusión del producto creando un gradiente de
concentración, permite además ensayar en un solo experimento una
multiplicidad de concentraciones, contrarias a los ensayo clásicos,
en los que sólo una concentración ha sido ensayada. Para cada
molécula en la que se ensaya la actividad antipriónica, la
utilización del antibiograma permite tener igualmente información
sobre la toxicidad del producto así como sobre la
actividad/concentración documentada, y determinar así la mejor
concentración
eficaz.
eficaz.
La cepa [PSI+] utilizada en este kit
según el invento lleva una inactivación del gen ERG6. En
efecto las levaduras son de modo natural muy poco permeables. En
particular, la levadura preferida para la puesta en práctica del
invento, Saccharomyces cerevisiae, presenta una
impermeabilidad tal que la realización de un cribado se demuestra
particularmente poco eficaz sin esta inactivación.
El método de análisis del cribado según el
invento es visual gracia a al utilización del alelo
ade1-14. Según la actividad antipriónica de
la molécula ensayada, las colonias de células tendrán una coloración
roja, rosada o blanca. La elección de la cepa de levadura puede
permitir mejorar el contraste entre las colonias. En efecto, ciertas
cepas llamadas "fuertes" facilitan el análisis visual del
cribado. Tales cepas poseen un fuerte nivel de agregación de las
formas priónicas. Al contrario, la cepa será llamada "débil".
Las cepas preferidas para la puesta en práctica del invento son por
tanto las cepas de tipo "fuerte".
Otras levaduras pueden ser igualmente
utilizadas. Se citarán a título de ejemplo: Kluyveromyces lactis,
Pichia methanolica, Saccharomyces ludwigii, Kluyveromyces marxianus,
Pichia pastoris, Zugosaccharomyces rouxi, Schizosaccharomyces
pombe.
Habiéndose dado la letalidad sintética observada
entre la inactivación del gen ERG6 y la inactivación del gen
TRP1, el gen ERG6 podrá estar deleccionado utilizando
el gen TRP1 como marcador de deleción.
Ventajosamente, el kit conlleva además un agente
de limpieza de priones a dosis subóptimas.
Por limpieza, se entiende una eliminación de las
formas priónicas en las células de levadura. Esta eliminación puede
ser temporal o definitiva.
A título de ejemplo, un agente de limpieza para
el prión puede ser agua oxigenada o preferentemente, cloruro de
guanidinio.
Por dosis subóptimas, se entienden dosis que
utilizadas solas no serían suficiente para limpiar los priones de
las levaduras. Los valores de tales dosis son dados, en los ejemplos
que siguen, para el cloruro de guanidinio.
Los intereses de la presencia de un agente de
limpieza en dosis subóptimas son para reforzar la sensibilidad del
cribado y obtener un mejor contraste.
El kit según el invento puede ser puesto en
práctica en un método de cribado de moléculas con actividad
antipriónica. Este método de cribado, abarcado también por el
invento, se caracteriza por que hace uso de una levadura de fenotipo
[PSI+] que presenta el alelo ade1-14
del gen ADE1 así como un gen ERG6 inactivado que
conlleva las etapas siguientes:
- a.
- realización de una cubierta de células in vitro sobre un medio complementado con una dosis subóptima de un agente de limpieza de priones.
- b.
- Depósito de compuestos a ensayar según el método del antibiograma,
- c.
- Incubación durante alrededor de 2-4 horas a alrededor de 20-25ºC, y
- d.
- Análisis de la coloración de las colonias celulares.
Este método posee ventajas análogas a las del
kit del invento. Se trata de un ensayo visual, muy fácil de
analizar. Su puesta en práctica es muy simple y un poco costosa. Las
precauciones relativas a la seguridad son las de un laboratorio
clásico de biología molecular. Permite el cribado masivo: una
persona sólo puede cribar manualmente más de 400 productos por día.
Un cribado de alto rendimiento sería posible mediante automatización
del método. El resultado del cribado se revela al cabo de 7 días,
sin que sea necesario recurrir a manipulaciones pesadas entre el día
J y el día J+7 (eventualmente un cambio de temperatura del
incubador). Finalmente, este método es particularmente
económico.
Una de las levaduras preferidas para la puesta
en práctica de este método es Saccharomyces cerevisiae.
Ventajosamente, el agente de limpieza de la
etapa a es el cloruro de guanidinio.
El método puede igualmente conllevar las
siguientes etapas:
- e.
- incubación durante alrededor de 2-4 días a alrededor de 1-6ºC, y/o,
- f.
- realización de un ensayo de cribado secundario
La incubación a 2-6ºC permite
acentuar el contraste de las coloraciones de las colonias.
Preferiblemente, el ensayo de cribado secundario
podría conllevar las etapas siguientes:
-construcción de una cepa de levadura en al que
el gen ADE2 está bajo el control del promotor génico
DAL5
-realización de las etapas a. hasta e. de los
método descritos a continuación.
Tal cribado secundario permite ensayar muy
rápidamente si las moléculas aisladas tras el cribado primario
pueden tener un efecto general sobre los priones en la levadura. En
efecto, los genes SUP35 (responsables del prión
[PSI+]) y URE2 (responsables del prión [URE3]
codifican para las enzimas que tienen funciones totalmente
diferentes y cuyas secuencias primarias están muy distantes.
El invento cubre igualmente las moléculas
aisladas por el método del cribado según el invento.
En particular, el método del cribado permite
aislar agentes antipriónicos que tiene la fórmula (I) siguiente:
en la que R es un grupo H,
NH_{2}, NHR^{2}, en la que R^{2} es una cadena alquilo o
alquilaminoalquilo de 1 a 10 carbonos, ramificada o
no,
X representa F, Cl, Br, I, CF_{3}, SR^{3},
OR^{3}, OH, NO_{2}, COR^{3}, CONH_{2}, COOH, COOR^{3}, en
la que R^{3} es un grupo alquilo de 1 a 4 carbonos,
preferiblemente CH_{3}.
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó
2,
q igual a 0 ó 1.
El invento abarca en particular los agentes
antipriónicos de fórmula (III):
en la que R' representa un grupo H,
NH_{2}, NH- (CH_{2})_{3}-
N(CH_{3})_{2},
NH-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2}-CH_{3})_{2},
X representa F, Cl, CF_{3},
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó
2.
Esta familia de moléculas, llamada
"Kastellpaolitinas" por los inventores, posee en un grado más o
menos fuerte actividad antipriónica investigada. En particular, los
derivados clorados de esta familia son particularmente eficaces. Las
mejores eficacias son obtenidas cuando el cloro está colocado en
posición 2, 3, 4, preferiblemente, en posición 4 (ver KP1 en los
ejemplos que siguen).
El invento abarca mas particularmente los
compuestos de fórmula (II):
en la que R' representa un grupo H,
NH_{2},
NH-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2})_{2},
NH-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2}-CH_{3})_{2},
X representa F, Cl, CF_{3},
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó
2,
Para una utilización como medicamento, y en
particular, como una agente antipriónico.
Abarca igualmente las composiciones
farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de
al menos un compuesto de fórmula (II) en la que:
R' representa un grupo H, NH_{2},
NH-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2})_{2},
NH-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2}-CH_{3})_{2},
X representa F, Cl, CF_{3},
p y n, identicos o diferentes, igual a 0, 1 ó 2,
en asociación con al menos un vehículo farmacéuticamente
aceptables.
Ciertos compuestos de esta familia son
particularmente activos. Se trata de la fenantridina y de la
6-aminofenantridina, así como de sus derivados
clorados, en particular cuando el cloro está colocado en posición 8,
9, 10, preferentemente, en posición 10 (ver en los ejemplos que
siguen).
Preferentemente, en las fórmulas (II) y (III),
R' representa NH_{2}. En efecto, una actividad muy buena de las
molécula ha sido constatada cuando R representa NH_{2}.
El invento propone igualmente un método para el
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que implican
agregados proteicos, que comportan un etapa de administración para
un animal o para un paciente con una cantidad terapéuticamente
eficaz de al menos un de los compuestos de fórmula (I), (II) o (III)
según el invento.
Los agentes antipriónicos según el invento son
particularmente útiles para la obtención de un médicamente destinado
a prevenir y/o tratar las enfermedades neurodegenerativas, en
particular del tipo de agregación de proteínas, tales como las
encefalopatías espongiformes, las enfermedades de Alzheimer (tau),
Parkinson (sinucleína \alpha) y de Huntington (huntingtina)...
Estos medicamentos pueden tener un objetivo humano o veterinario, en
particular para animales domésticos (vacas, ovejas,...) o salvajes
(linces, cérvidos tales como ciervos, alces, ...).
Otras características y ventajas del invento
aparecerán entre los ejemplos a continuación y se refieren a las
figuras siguientes:
-la figura 1 se refiere a la factibilidad del
cribado,
-la figura 2 ilustra el protocolo de cribado
-la figura 3 es relativa al aislamiento de las
Kastellpaolitinas, de la fenantridina y a su relación
estructura/actividad,
-la figura 4 se refiere a la determinación de la
actividad de los derivados de la fenantridina,
-la figura 5 presenta los resultados de los
ensayos de limpieza líquida,
-la figura 6 se refiere al cribado secundario
basado sobre el prión [URE3],
-la figura 7 demuestra la validación del ensayo
con la clorpromazina, la quinacrina y el verapamil,
-la figura 8 presenta los resultados del efecto
de KP1 sobre el prión mamífero en un modelo in vitro, y,
-la figura 9 es relativa a un estudio
estructura/actividad realizado sobre la molécula de fórmula general
(II).
Organismos (Saccharomyces cerevisiae) y
medios de cultivos de la cepa de levadura haploide [PSI+]
74-D694 (Mat a,
ade-1-14, trpl-289,
his3-d200, ura3-52,
leu2-3, 112) a sido utilizado en la puesta a
punto del método de cribado. La cepa utilizada es llamada
"fuerte" porque presenta un fenotipo bien marcado cuando el
factor de terminación de la traducción Sup35p está bajo una forma
priónica o agregada.
A fin de aumentar la penetración de los
inhibidores, los inventores han modificado genéticamente esta cepa
introduciéndole una mutación en el gen ERG6. Este gen
interviene en la biosíntesis del ergosterol, componente de la pared
celular de las levaduras. La mutación ha sido realizada mediante la
inserción al nivel del sitio cromosómico del gen ERG6 de un
"casete de deleción" correspondiente al gen marcador TRP1
flanqueado por las secuencias en el ADN que se encuentran aguas
arriba y aguas abajo de la fase codificante del gen ERG6.
Este casete ha sido producido mediante PCR utilizando el plásmido
pFA6a-kanMX6 como matriz y los oligonucleótidos
oBM1060 (5') y oBM1061 (3') como cebadores. Las células de levadura
74-D694 "fuerte" que tienen integrado el casete
de deleción (cepa llamada STRg6, depositada en la CNCM el 10
de octubre 2002 bajo el número I-2935) son las que
se desarrollan sobre medio mínimo desprovisto de triptófano. La
mutación \Deltaerg6::TRP1 es verificada enseguida mediante
PCR utilizando el ADN genómico de la cepa STRg6 como matriz y
los oligonucleótidos oBM1030 (5') y oBM1063 (3') como cebadores.
Los cebadores para PCR utilizados presentan las
secuencias nucleotídicas siguientes:
oBM1060 5':
CGATTTAAGTTTTACATAATTTAAAAAAACAAGAATAAAATAATAATATAGTAGGCAGCA
TAAGCGGATCCCCGGGTTAATTAA 3' (SEQ ID Nº 1)
TAAGCGGATCCCCGGGTTAATTAA 3' (SEQ ID Nº 1)
oBM1061 5':
CTGCATATATAGGAAAATAGGTATATATCGTGCGCTTTATTTGAATCTTATTGATCTAGTG
AATGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 3' (SEQ ID Nº 2)
AATGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 3' (SEQ ID Nº 2)
oBM1030 5' GGTACCTCGTTCCCGTAC 3' (SEQ ID Nº
3)
oBM1063 5' CAGTCAGAAATCGAGTTCCA 3' (SEQ ID Nº
2).
Salvo que se indique lo contrario, las cepas de
levadura son cultivadas a 30ºC en un medio rico (YPD\psi) o en un
medio mínimo. Cuando no se especifica explícitamente, los
porcentajes corresponden a una relación masa/volumen. La forma
gelatinosa es obtenida mediante la adición de agar al 2%.
YPD\psi: 1% de extracto de levadura (FISHER®),
2% de peptona (GIBCO®) y 2% de glucosa;
Medio mínimo: 0,175% de base nitrogenada de
levadura sin aminoácidos ni sulfato amónico (DIFCO®), 0,75% de
sulfato de amonio y 2% de glucosa. Este medio es llevado a pH 6. A
fin de compensar las eventuales auxotrofías, este medio puede ser
completado, tras esterilización, mediante la adición de aminoácidos
(0,002% de L-Histidina y/o 0,004% de
L-Leucina y/o 0,003% de
L-Triptófano) o de bases nitrogenadas (0,0025% de
Uracilo y/o 0,008% de Adenina).
El método de cribado elaborado está basado sobre
el principio del antibiograma. En efecto los compuestos a ensayar
son depositados sobre un disco de papel de filtro estéril, el cual
se coloca sobre un placa de medio YPD\psi sólido que contiene 0,2
mM de cloruro de guanidinio previamente sembrado con alrededor de
5.10^{6} células de la cepa STRg6 a modo de realizar una
cubierta de levadura. Esta cantidad de células sembradas (de
10^{6} a 10^{7}) ha sido optimizada a modo de que cada célula
puede dividirse al menos 6 veces (número de generaciones necesarias
para tener un efecto de limpieza eficaz con 3 mM de GuHCl). La
adición de una cantidad pequeña de cloruro de guanidinio (0,2 mM),
dosis subóptima para limpiar los priones de la levadura (siendo la
dosis eficaz del orden del 1 a 5 mM) permite aumentar la
sensibilidad del ensayo (ver la parte de Resultados). Los placas
cuadradas de 12 cm de lado son entonces incubadas durante 3 días a
23,5ºC para permitir la aparición del crecimiento de colonias de
levaduras. Estas placas son enseguida almacenadas durante 3 días a
4ºC a modo de acentuar la coloración roja presente alrededor de los
discos embebidos de sustancias activas sobre la forma de prión de la
proteína Sup35p. La comparación con los testigos negativos (que
contienen los disolventes en que se disuelven los inhibidores) y
positivos (que contienen una disolución de cloruro de guanidinio a
300 nM, provocando una eliminación eficaz de las proteínas Sup35p en
una forma de prión) permite juzgar la eficacia de un compuesto. La
figura 2 ilustra el protocolo del método de cribado: (1) Cultivo de
la cepa STRg6; (2) Presentación y ejemplificación con canicas
de cristal estériles de 3 y 4 mm de diámetro, de alrededor de
10^{6} células en fase exponencial de crecimiento sobre una placa
de medio YPD\psi sólido que contiene 0,2 mM de cloruro de
guanidinio: constituyendo una "cubierta" de células; (3)
presentación de los discos de papel de filtro estériles según una
cuadrícula que permite el análisis de 32 compuestos (testigos
incluidos) y la presentación de 20 \mul máximo de cada uno de los
productos a ser ensayados; (4) incubación; (5) enumeración del
resultado obtenido; (6) Ejemplo que presenta el aislamiento de un
compuesto que presenta una fuerte actividad antipriónica.
Los
11-aminodibenzo[b,f][1,4] tiazepinas.,
llamadas aún Kastellpaolitinas, pueden ser preparadas en una sola
etapa. La síntesis de estos productos ha sido ya descrita en la
publicación de Mettey y otros, 1997.
El cloruro de guanidinio, el único producto
conocido que limpia eficazmente los priones en la levadura
Saccharomyces cerevisiae, ha servido no sólo de testigo
positivo durante todo el cribado, sino también para estudiar la
factibilidad del método así como para ponerlo a punto. El cloruro de
guanidinio limpia eficazmente los diferentes priones de levadura a
una dosis comprendida entre 1 y 5 mM
(Fernandez-Bellot y Cullin, 2001). En estas
condiciones, la limpieza necesita una presencia constante de este
producto durante seis a diez generaciones en fase exponencial de
crecimiento comprometiendo la factibilidad del cribado en una placa
tal y como los inventores desean realizarla.
La figura 1 muestra la factibilidad del
cribado.
Los tres paneles de la izquierda: una cepa
[PSI+] es cultivada durante 48 h en presencia de cloruro de
guanidinio a 5 mM (con 0,2% de DMSO final) o, como control con sólo
0,2% de DMSO final. A T = 0ºC, después durante todas las 24, una
gota de 10 \mul (aproximadamente 10^{4} células) es depositada
sobre una placa de medio rico. La limpieza con cloruro de guanidinio
comienza a tener un efecto tras 24 h de tratamiento, sea después de
aproximadamente 6 generaciones (una coloración roja comienza a
aparecer). Al cabo de 48 h, tras alrededor de aproximadamente 12
generaciones, la gota de células presenta una coloración puramente
roja, signo de una limpieza completa de las células
[PSI+].
El panel del medio: algunas células se levantan
a T = 48 h y son sembradas en estrías sobre un medio fresco. Forman
casi todas las colonias rojas en el caso de la limpieza con cloruro
de guanidinio.
El panel de la derecha: éstas mismas células son
precipitadas sobre el fondo de un tubo Eppendorf tras el cultivo
líquido. En el caso de la limpieza con cloruro de guanidinio, forman
un precipitado rojo.
La primera etapa consistió por tanto en
determinar si el cloruro de guanidinio podía tener un efecto
visualizable sobre la placa de las células [PSI+] con el
sistema de pastillas del antibiograma. Una vez esta etapa fue
realizada, los inventores pusieron a punto las condiciones óptimas
de temperatura, de medio, de densidad así como del tipo celular a
utilizar (figura 2). La cepa que presentó la mejor sensibilidad es
la cepa STRg6 cultivada a 23,5ºC y en presencia de 200 \muM de
cloruro de guanidinio. En efecto, la introducción de una dosis
subóptima de cloruro de guanidino en el medio permite aumentar la
sensibilidad del ensayo.
Los compuestos (alrededor de 1000) han pasado
por el cribado utilizando las condiciones optimizadas por los
inventores (figura 2). Sobre cada placa, 15 \mul de DMSO son
depositados sobre el filtro arriba a la derecha (testigo negativo) y
15 \mul de una disolución de cloruro de guanidinio en disolución a
300 mM en DMSO (testigo positivo) son depositados sobre el filtro
abajo a la derecha. El mismo volumen (15 \mul) de cada uno de los
productos del banco (todos en disolución a 10 mM en DMSO) es
depositado sobre los filtros restantes (treinta por placa grande de
Petri cuadrada). Una señal positiva (visualización de un halo rojo
alrededor del disco de papel de filtro estéril sobre el que el
producto es depositado) fue obtenida para cinco productos. Estos
productos corresponden a cuatro moléculas de una misma familia,
llamadas "Kastellpaolitinas" por los inventores, y a una quinta
bien conocida: la fenantridina.
Las estructuras químicas de las
Kastellpaolitinas y de la fenantridina son presentadas en la figura
3B. El panel 3A muestra un análisis comparativo del tamaño de los
halos rojos obtenidos respectivamente con el conjunto de estas
moléculas (todas depositadas en cantidades equivalentes: 15 \mul
de una disolución 10 mM en DMSO). Este experimento permite comparar
la actividad relativa de cada uno de estos productos. El más activo
es la Kastellpaolitina 1 (o KP1) seguido por la fenantridina.
Un análisis comparativo de la fenantridina de
una parte, y de las Kastellpaolitinas de la otra muestra varios
puntos comunes entre estos dos grupos de moléculas (figura 3). Las
diferentes moléculas son clasificadas de la menos activa a la más
activa y sus fórmulas respectivas indicadas. Todas son tricíclicas,
el ciclo central contiene en todos los casos un nitrógeno en doble
enlace con un carbono adyacente. Por el contrario, en todas las
Kastellpaolitinas, el carbono del ciclo central que está en doble
enlace con este nitrógeno lleva un grupo amino, que no es el caso
para la fenantridina. Esta observación ha llevado a los inventores a
querer ensayar la 6-aminofenantridina.
La 6-aminofenantridina puede ser
preparada según el modo operatorio puesto a punto por Kessar y
otros, 1969.
La 6-aminofenantridina ha por
tanto pasado un cribado según el invento, en comparación con las
Kastellpaolitinas 1 (KP1) y 5 (KP5) así como con la fenantridina. El
resultado es muy claro: la 6-aminofenantridina es
aún más activa que las Kastellpaolitinas y que la fenantridina.
La figura 4 ilustra los resultados de esta
comparación: la actividad de la 6-aminofenantridina
ha sido determinada sobre la placa y comparada con la de la
fenantridina. Para todas las moléculas, la misma cantidad es
depositada (10 \mul de una disolución 10 mM). En el caso del
testigo positivo (cloruro de guanidinio), la disolución utilizada
fue 300 mM.
Por consiguiente, transfiriendo este grupo
amino, característico de las Kastellpaolitinas sobre la
fenantridina, los inventores han aumentado fuertemente la actividad
de esta última.
Siguiendo la misma operación, los inventores
enseguida añadieron un cloro en la posición 8 en la
6-aminofenantridina (6AP) para producir la
6-amino-8-clorofenantridina
(6A-8CP). Esta modificación a aumentado de nuevo la
actividad del compuesto. Finalmente, el cloro en posición 8 ha sido
remplazado por un grupo trifluorometilo para dar la
6-amino-8-trifluorometilfenantridina
(6A-8tFP). Como lo muestra la figura 4, esta última
modificación ha llevado a un aumento suplementario de la actividad y
la 6A-8tFP representa actualmente uno de los
compuestos más activos.
Todas las moléculas activas han sido aisladas en
un medio que contiene una dosis baja de cloruro de guanidinio (200
\muM/dosis eficaz = 4 mM). Esta parte se apoya por tanto de la
puesta a punto del cribado que responde a la necesidad de aumentar
la sensibilidad (y por tanto el umbral de detección del método). El
efecto de las moléculas en el medio que contiene más (500 \muM)
cloruro de guanidinio o que no contiene nada, ha sido por
consiguiente observado. La fenantridina es siempre activa sobre el
medio sin cloruro de guanidinio, pero su actividad aumenta
enormemente en función de la cantidad de cloruro de guanidinio (aún
en dosis netamente subóptimas) en el medio. Este resultado indica
una sinergia de acción entre el cloruro de guanidinio y la
fenantridina: El mismo resultado ha sido obtenido por todas las
otras moléculas aisladas por los inventores (las Kastellpaolitinas,
la 6 aminofenantridina y sus derivados).
Los inventores han querido enseguida determinar
si los halos rojos observados en el ensayo de levadura correspondían
a la limpieza del prión [PSI+] y no a un artefacto (por
ejemplo los halos rojos podrían ser debidos a una inhibición directa
de la cadena de biosíntesis de adenina por estas moléculas, lo que
conduciría a una acumulación de AIR). Si esas moléculas limpian
eficazmente el prión [PSI+], un tratamiento en cultivo
líquido de células [PSI+], seguido de un lavado de dichas
células debería permitirles formar colonias rojas sobre un medio
gelatinoso sin contener más las moléculas. Estos ensayos han sido
realizados con la 6-aminofenantridina sobre la cepa
"fuerte" salvaje 74-D694.
Las condiciones de limpieza en medio líquido son
las siguientes: una cepa [PSI+] es cultivada durante 5 días
en medio líquido en presencia de cantidades indicadas de diferentes
productos (ver figura 5). Cada 24 h, una fracción alicuotada es
lavada en medio virgen de todo producto y dispuesta sobre un medio
gelatinoso sólido (también virgen de todo producto) que es tratado
enseguida como se indica en la figura 2.
Como se muestra en la figura 5, la
6-aminofenantridina es capaz de limpiar parcialmente
el prión [PSI+] en un número significativo de células. La
eficacia de limpieza puede ser notablemente aumentada añadiendo una
dosis subóptima (100 \muM) de cloruro de guanidinio en medio de
cultivo. En tal líquido de limpieza, se encuentra el mismo efecto
sinérgico que el observado en el ensayo en placa.
Otro ensayo rápido sobre placa ha sido
realizado, basado sobre otro prión de la levadura: [URE3]. Este
ensayo constituye un cribado secundario que permite generalizar el
efecto de los productos aislados cuando el cribado primario tiene
otro prión de levadura. De este modo, es posible eliminar las
moléculas activas únicamente contra el prión [PSI+] y por
tanto menos interesantes por un efecto no generalizado.
Para el prión [URE3] la cepa haploide utilizada
es CC34 (Mat a, trp1-1,
ade2-1, leu2-3, 112,
his3-11, 15, ura2:: HIS3).
La cepa NT34 que ha servido para el
cribado secundario ha sido construida a partir de CC34, cepa en la
cual la fase codificante del gen DAL5 ha sido remplazada por
la del gen ADE2 utilizando el mismo método que el utilizado
para la construcción de la cepa STRg6. Efectivamente, un
casete de deleción correspondiente al gen ADE2 flanqueado por
las secuencias en el ADN que se encuentran aguas arriba y aguas
abajo de la fase codificante del gen DAL5 ha sido producido
mediante PCR utilizando ADN genómico de la cepa haploide BY4742
(Mat \alpha, his3\Delta1, leu2 \Delta0, lys2 \DeltaO,
ura3 \DeltaO) como matriz y los oligonucleótidos
ACAACAAAACAAGGATAATCAAATAGTGTTGAAGATGGATTCTAGAACAGTTGG
(SEQ ID Nº 5)(5'), y
TATATTCTTCTCTGATAACAATAATGTCAGTGTATCTCACCACTATTATTACTTGTTTTCTA
GATAAGC
(SEQ IC Nº 6) como cebadores.
La mutación da15::ADE2 fue inmediatamente
verificada mediante PCR utilizando el ADN genómico de la cepa
NT34 como matriz y los oligonucleótidos:
ATAGTCTCTGCTCATAG (SEQ ID Nº 7) (5'), y,
GCTTACAGAAATTCTAC (SEQ ID Nº 8) (3') como
cebadores.
La cepa NT34 (Mat a,
trp1-1, ade2-1,
leu2-3, 112, his3-11, 15, ura2::
HIS3, daI5::ADE2) fue depositada en la CNCM el 10 de octubre de
2002 bajo el número I-2942.
Este cribado se basa en el mismo sistema
colorimétrico que el cribado primario. En la cepa de levadura
NT34, el gen ADE2 no está bajo el control de su propio
promotor, sino que bajo el del gen DAL5. Cuando la proteína
Ure2p está bajo la forma priónica ([URE3]), la transcripción
a partir del promotor del gen dal5 es activado y por tanto el
gen ADE2 se expresa, de modo que las cepas son blancas y
autótrofas para la adenina. Cuando la proteína Ure2p está en la
forma normal ([ure3-0]), la transcripción a partir del
promotor del gen DAL5 es reprimida y por tanto el gen ADE2 no
se expresa, y así las cepas son rojas y auxótrofas para la adenina.
Cuando la cepa NT34 es tratada con 5 mM de cloruro de guanidino
durante una decena de generaciones, forma colonias rojas (como se
esperaba y como lo haría la cepa [PSI+] utilizada para el
cribado primario). Como se puede observar en la figura 6, la
fenantridina y la 6-aminofenantridina provocan la
aparición de un halo rojo cuando son colocadas sobre el pequeño
filtro colocado sobre la cubierta de células previamente extendidas
sobre el medio nutritivo gelatinoso (mismo procedimiento que para el
cribado primario, ver figura 2). Este resultado sugiere que los
productos son igualmente activos sobre el prión [URE3].
Obsérvese, sin embargo, que este cribado secundario es claramente
menos sensible que el cribado primario, es por tanto muy útil para
observar rápidamente si el efecto de las moléculas aisladas durante
el primer cribado es generalizable a otros priones de levadura pero
en ningún caso serviría para sustituir el cribado primario.
A modo de aumentar la permeabilidad celular, la
secuencia codificante del gen ERG6 ha sido igualmente
remplazada por la del gen TRP1. En esta cepa (SB34), la
transcripción de ADE2 depende pues del estado de Ure2p: si
Ure2p es inactivado por un mecanismo priónico (células
[URE3], el gen ADE2 es transcrito activamente mientras
que en las células [ure3-0], no. Así, las células
[URE3] de la cepa SB34 formarán colonias blancas mientras que
las células [ure3-0] formarán colonias rojas. Del
hecho que esta cepa contiene siempre el alelo ade2-1, se ha
considerado que esta cepa podría ser [PSI+], de modo que la
coloración roja podría ser debida a la limpieza de [PSI+] más
que de [URE3]. Además, la secuencia codificante entera del
gen ade2-1 ha sido delecionada para dar la cepa NT35. Esta
cepa forma igualmente colonias blancas, demostrando de nuevo que se
trata de [URE3].
La cepa SB34 ha sido construida remplazando el
gen ERG6 en CC34 mediante amplificación por PCR del marcador
TRP1 y remplazando la región codificante del gen DAL5 por el
gen ADE2 utilizando un método basado en la PCR mediante
deleción del gen ERG6 con los cebadores (5'-
ACAACAAAACAAGGATAATCAAATAGTGTAAAAAAAAAAATTCAAGATGGATTCTAGAACAGTTGG-3')
(SEQ ID Nº 9) y 342 (5'-
TATATTCTTCTCTGATAACAATAATGTCAGTGTATCTCACCACTATTATTACTTGTTTCTAGATAAGC-3)(SEQ
ID Nº 10). Este remplazamiento génico fue inmediatamente confirmado
mediante el crecimiento sobre el medio SD-Ade, en
ausencia del crecimiento sobre el medio USA (como estaba previsto
para una cepa da15\Delta) y por PCR analítica sobre el ADN
genómico. El fenotipo [URE3] de esta cepa ha sido verificado
mediante citoducción: de entre 30 citoductores, 26 han sido capaces
de crecer sobre el medio USA, demostrando que se trata de
[URE3]. La cepa NT35 ha sido construida remplazando el gen
ade2-1 en la cepa SB34 por el marcador KanMX amplificado por
PCR y verificando el remplazamiento conseguido del gen por PCR
analítica sobre el ADN genómico.
Dos tipos de experimentos han sido llevados a
cabo a modo de verificar que el efecto observado sobre la placa con
la cepa NT34 corresponde al de la limpieza. En primer lugar, las
células en las zonas que rodean los filtros han sido recuperadas
para el testigo negativo (DMSO), positivo (cloruro de guanidinio)
por la fenantridina y por la 6-aminofenantridina.
Estas células han sido enseguida sembradas en estrías sobre un medio
fresco exento de todas estas moléculas. Las células recuperadas
alrededor de los filtros forman todas colonias rojas, a excepción de
las recolectadas alrededor del testigo negativo. Este resultado
muestra que la coloración roja observada sobre la placa para la cepa
NT34 corresponde a una limpieza y no a un artefacto unido a una
inhibición de una enzima de la vía biosintética de adenina (en este
caso, la coloración roja se perdería sobre un medio sin inhibidor).
El efecto de limpieza de la fenantridina y de la
6-aminofenantridina ha sido igualmente verificado
directamente sobre el prión [URE3]. Las células [URE3]
de la cepa CC34 crecen sobre un medio llamado USA mientras que las
células limpias ([ure 3-0]) son incapaces de crecer sobre
este medio. Los inventores han examinado la capacidad de las
células [URE3] tratadas por 200 \muM de cloruro de
guanidinio (testigo negativo), por 5 mM de cloruro de guanidinio
(testigo positivo) o por diferentes dosis de
6-aminofenantridina (sola o en combinación con 200
\muM de cloruro de guanidinio) a crecer sobre un medio USA. La
6-aminofenantridina es capaz de limpiar el prión
[URE3] de modo significativo y, al igual que para el prión
[PSI+], este efecto es acentuado por una dosis baja de
cloruro de guanidinio (200 \muM). Estos resultados, además del
hecho que validan el cribado secundario con la cepa NT34, sugieren
que el efecto de los inhibidores puestos en evidencia por dicho
cribado deberían ser generales sobre todos los priones de
levadura.
El laboratorio de Stanley Prusiner, padre de la
hipótesis de "proteína única" y premio Nobel en 1997, ha
aislado un cierto número de moléculas activas sobre el prión del
mamífero PrP gracias a un sistema de células murinas
(neuroblastomas) crónicamente infectadas por el prión PrP^{SC}
(Korth y otros, 2001). Este sistema, por su peso y complejidad, no
permite un cribado masivo como el puesto a punto por los inventores.
También la aproximación del grupo de Stanley Prusiner ha tenido que
ensayar una a una, entre las moléculas ya utilizadas como
medicamentos, las que pasan la barrera hematoencefálica. Ciertas
moléculas, como notablemente la quinacrina (utilizada como
antipalúdico desde hace mucho tiempo) o la clorpromazina (un
antridepresivo) presentan una actividad notable en su sistema. A
modo de validar el cribado, los inventores han ensayado por tanto la
clorpromazina y la quinacrina en sus sistema de levadura. Como se
muestra en la figura 7, estas dos moléculas presentan una cierta
actividad contra el prión [PSI+]. Hace falta sin embargo observar
que sus actividades son claramente inferiores a las de la
6-aminofenantridina. Se puede desvelar igualmente
que la clorpromazina y la quinacrina, como conjunto de moléculas
puesta en evidencia por el invento, presentan una fuerte sinergia de
acción con el cloruro de guanidinio (Sobre la figura 7, el medio
utilizado contiene 200 \muM de cloruro de guanidinio). Este
último resultado sugiere que estas dos moléculas actúan sobre la
misma vía bioquímica que las moléculas aisladas según el
invento.
Por otro lado, es interesante observar que la
quinacrina, cuya actividad es alrededor de diez veces superior a la
de la clorpromazina en el ensayo del Prof. Prusiner, presenta
igualmente una actividad netamente superior a la del cribado puesto
a punto por los inventores. Además como en el ensayo del Prof.
Prusiner, la clorpromazina y la quinacrina necesitan un tratamiento
prolongado (al menos 6 días en el caso del ensayo del Prof.
Prusiner, al menos dos a tres días en el caso del cribado según el
invento) antes de decelerar una actividad.
Además, los inventores han determinado la
actividad, en el ensayo según el invento, de otras moléculas
aisladas gracias al ensayo basado sobre neuroblastomas de ratón,
puesto a punto por el Prof. Prusiner. Este encontró una buena
correlación entre los resultados obtenidos en los dos sistemas: la
acepromazina que ha demostrado ser ligeramente activa en el sistema
mamífero presenta igualmente una débil actividad en el ensayo según
el invento y las moléculas inactivas en los análisis sobre los
mamíferos como la carbamazepina, la imipramina, el haloperidol, el
cloroprotixeno o el azul de metileno han sido igualmente inactivos
en el ensayo.
La quinacrina ha sido igualmente descrita como
inhibidor de la resistencia múltiple a los medicamentos (MDR). Para
ensayar si su efecto anti priónico podría concernir este mecanismo
(que es compatible con el efecto sinérgico del GuHCl), los presentes
inventores han evaluado el efecto curativo putativo de un inhibidor
general de eficacia MDR, el verapamil. Como lo muestra la figura 7,
pese a la alta concentración de este medicamento que ha sido
utilizada, concentración próxima a la toxicidad, no se ha podido
descubrir ningún efecto curativo.
Todas estas correlaciones entre actividad de la
quinacrina y de la clorpromazina según el ensayo o el cribado
utilizado permiten validar la utilización del método según el
invento para realizar cribados de alto rendimiento en vista de
aislar moléculas susceptibles de constituir medicamentos eficaces
(sobre los mamíferos y en particular sobre el hombre) contra
enfermedades neurodegenerativas que implican agregados proteicos, de
tipo encefalopatías espongiformes, enfermedades de Alzheimer, de
Huntington.
Células de neuroblastoma de ratón infectadas por
el prión de la tembladera "scrapie" ovina
(ScN2a-22L) han sido utilizadas. Las células han
sido cultivadas en frascos de 25 cm^{2} en presencia o ausencia de
compuestos durante varios días. Enseguida, las proteínas han sido
extraídas de las células ScN2a-22L mediante lisis
celular en 500 ml de tampón de lisis (50 mM de Tris HCl pH 7,5; 150
mM de NaCl, 0,5% de desoxicolato sódico; 0,5% de Tritón X100). Tras
la normalización de las proteínas con el kit Uptima
Interchim, las cantidades ajustadas de lisados celulares han
sido digeridas por la proteinasa K a 20 \mug/ml (Eurobio) durante
40 min a 37ºC. Los lisados han sido centrifugados enseguida durante
90 min a 20000 x g y el precipitado ha sido resuspendido en 25
\mul de tampón desnaturalizante (1 X Tris-Glicina;
4% de SDS, 2% de \beta-mercaptoetanol; 5% de
sacarosa y de azul de bromofenol) y calentado durante 5 min a 100ºC
antes de analizarlos por transferencia Western según el protocolo
estándar utilizando anticuerpos monoclonales de ratón antiPrP SAF 83
(suministrado por SPI-BIO,
Massy-Palaiseau, Francia). Los porcentajes de
inhibición de la formación de PrP^{SC} que resisten a la
proteinasa K han sido calculados utilizando NIH Image J: La
inhibición de la acumulación de la PrP^{SC} ha sido de 96% para la
clorpromazina (Clor.) y 70% \pm 6% para la KP1.
Dos de los compuestos seleccionados (KP1 y 6AP)
han sido ensayados en este sistema de mamífero. Como lo muestra la
figura 6, la KP1 ha sido capaz de inducir una disminución
significativa de la acumulación del prión de mamífero a una dosis
similar a la utilizada por la clorpromazina (5 \muM). Al cabo de
los 7 días de tratamiento, 70% de la PrP^{SC} resistente a la
proteinasa K ha desaparecido (pocillos 1 a 3) comparado con las
células no tratadas (pocillos 4 y 5). Este efecto significativo ha
sido probablemente subestimado ya que las células tratadas con el
disolvente de los compuestos solo (DMSO 0,01%) han mostrado un alza
significativa y reproducible en PrP^{SC} resistente a la
proteinasa K (pocillos 6). El mismo efecto sobre la eliminación de
la PrP^{SC} ha sido obtenido con la 6AP a 2 y 4 \muM.
Estos resultados validan pues la utilización del
ensayo del cribado según el invento basado sobre la levadura para
aislar los compuestos antipriones puesto que la quinacrina y la
clorpromazina han sido detectados utilizando este análisis y que la
KP1 y 6AP han sido igualmente eficaces para favorecer la eliminación
del prión de mamífero in vitro.
Con el fin de estudiar las diferentes posiciones
de sustitución de las moléculas antipriónicas aisladas, los
inventores han realizado un estudio estructura/actividad sobre la
molécula de 6-aminofenantridina. Las moléculas de
3-fluor-6-aminofenantridina
(2F-6AP),
2-fluor-6-amino-8-cloro-fenantridina
(2f-6A-8ClP) y
6-amino-7-clorofenantridina
(6A-7ClP) han sido así obtenidas mediante síntesis
química y su actividad antipriónica ha sido determinada utilizando
el ensayo según el invento. Los resultados obtenidos están recogidos
en la figura 9. Los diámetros de los halos rojos obtenidos son
proporcionales a la actividad antipriónica de las moléculas
depositadas, los resultados indican que la presencia de un
sustituyente del tipo halógeno al nivel de las posiciones 7 u 8
incrementa la actividad antipriónica de las moléculas de fórmulas
(II) mientras que el mismo tipo de sustituyente en posición 2
tiende a disminuirla.
Fernandez-Bellot y otros,
"The protein-only theory and the yeast
Saccharomyces cerevisiae: the prions and the propagons",
CMLS, 2001, 58: 1857-1878.
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<110> CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES
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\hskip1cmUNIVERSIDAD VICTOR SEGALEN
\hskip1cmUNIVERSIDAD DE POITIERS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> "Cribado de moléculas con
actividad antipriónica: kits, métodos y moléculas cribadas"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CP/BT/61032 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
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<140> PCT/FR03/03101
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-10-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 03 08 289
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-07-07
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<150> FR 02 13 022
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-10-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<401> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatttaagt tttacataat ttaaaaaaac aagaataaaa taataatata gtaggcagca
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaagcggatc cccgggttaa ttaa
\hfill84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
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<121> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipctgcatatat aggaaaatag gtatatatcg tgcgctttat ttgaatctta ttgatctagt
\hfill60
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\hskip-.1em\dddseqskipgaatgaattc gagctcgttt aaac
\hfill84
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<210> 3
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<211> 18
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<121> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacctcgt tcccgtac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<121> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtcagaaa tcgagttcca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
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<121> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaacaaaac aaggataatc aaatagtgta aaaaaaaaaa ttcaagatgg attctagaac
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttgg
\hfill66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<121> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatattcttc tctgataaca ataatgtcag tgtatctcac acttgttttc
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagataagc
\hfill69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<121> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagtctctg ctcatag
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<121> ADN
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<220>
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttacagaa attctac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
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<121> ADN
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<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaacaaaac aaggataatc aaatagtgta aaaaaaaaaa ttcaagatgg attctagaac
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttgg
\hfill66
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<210> 10
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<121> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatattcttc tctgataaca ataatgtcag tgtatctcac cactattatt acttgtttct
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagataagc
\hfill68
Claims (17)
1. Un kit de cribado de
moléculas con actividad antipriónica, caracterizado por que
conlleva la combinación de una levadura de fenotipo [PSI+],
un antibiograma y un agente de limpieza de priones a dosis
subóptimas, presentando dicha levadura el alelo
ade1-14 del gen ADE1 así como un gen
ERG6 inactivado.
2. Un kit según la
reivindicación 1, caracterizado por que la levadura es
Saccharomyces cerevisiae.
3. Un kit según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que el agente de
limpieza de los priones es el cloruro de guanidinio
4. Método de cribado de
moléculas con actividad antipriónica, caracterizado por que
hace uso de una levadura de fenotipo [PSI+] que presenta el
alelo ade1-14 del gen ADE1 así como un
gen ERG6 inactivado y conlleva las etapas siguientes:
- a.
- Realización de una cubierta de células in vitro sobre un medio suplementado con una dosis subóptima de un agente de limpieza de priones
- b.
- Depósito de compuestos a ensayar según el método del antibiograma,
- c.
- Incubación durante alrededor de 2-4 días a alrededor de 20-25ºC, y,
- d.
- Análisis de la coloración de las colonias celulares.
5. Un método de cribado según
la reivindicación 4, caracterizado por que la levadura es
Saccharomyces cerevisiae.
6. Un método de cribado según
una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado
por que el agente de limpieza de la etapa a. es el cloruro de
guanidinio.
7. Un método de cribado según
una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado
por que conlleva además las siguientes etapas:
- e.
- incubación durante alrededor de 2-4 días a alrededor de 2-6ºC, y/o,
- f.
- realización de un ensayo de cribado secundario.
8. Método de cribado según la
reivindicación 7, caracterizado pro que el ensayo del cribado
secundario conlleva las siguientes etapas:
- -
- construcción de una cepa de levadura en la que el gen ADE2 está bajo el control del promotor del gen DAL5
- -
- realización de las etapas a. hasta e. de los métodos según las reivindicaciones 4 y 7.
9. Compuesto de fórmula (II) en la
que:
R' representa un grupo H, NH_{2},
NH-(CH_{2})_{3}, NH-CH
(CH_{3})-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2}-CH_{3})_{2},
X representa F, Cl, CF_{3},
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó
2,
para una utilización como medicamento
10. Compuesto según la reivindicación 9,
de fórmula (II) en la que:
R' representa un grupo NH_{2},
X representa F, Cl, CF_{3},
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó
2,
para una utilización como medicamento
11. Utilización de un compuesto de
fórmula (I):
en la que R' es un grupo H,
NH_{2}, NHR^{2}, en el que R^{2} es una cadena alquilo o
alquilaminoalquilo de 1 a 10 carbonos, ramificada o
no,
X representa F, Cl, Br, I, CF_{3}, SCH_{3},
OCH_{3}, OH, NO_{2}, COCH_{3}, CONH_{2}, COOH, COOR^{3},
en el que R^{3} es un grupo alquilo de 1 a 4 carbonos,
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó
2,
q igual a 0 ó 1,
para la obtención de un medicamento destinado a
tratar las enfermedades neurodegenerativas que implican agregados
proteicos.
12. Utilización del compuesto
de fórmula (II) en la que:
R' representa un grupo H, NH_{2},
NH-(CH_{2})_{3}-N(CH_{3})_{2},
NH-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2}-CH_{3})_{2}
X representa F, Cl, CF^{3},
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó
2,
para la obtención de un medicamento destinado a
tratar las enfermedades neurodegenerativas que implican agregados
proteicos.
13. Utilización
del compuesto de fórmula (II) en la que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R' representa un grupo H, NH_{2},
NH-(CH2)3-N(CH3)2,
NH-CH(CH3)-(CH2)3-N(CH2-CH3)2,
X representa F, Cl, CF^{3}
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó 2,
para la obtención de un medicamento destinado a tratar las
enfermedades neurodegenerativas que implican agregados
proteicos.
14. Utilización
según la reivindicación 13, del compuesto de fórmula (II) en la
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R' representa un grupo NH_{2},
X representa F, Cl, CF^{3}
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó 2,
para la obtención de un medicamento destinado a tratar las
enfermedades neurodegenerativas que implican agregados
proteicos.
15. Utilización según las reivindicaciones 11 a
15, caracterizadas por que las enfermedades
neurodegenerativas son las encefalopatías espongiformes, las
enfermedades de Alzheimer y de Huntington.
\newpage
16. Composición farmacéutica que comprende
una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto de
fórmula (II) en la que:
R' representa un grupo H, NH_{2},
NH-(CH_{2})_{3}-N(CH_{3})_{2},
NH-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{3}-N(CH_{2}-CH_{3})_{2},
X representa F, Cl, CF_{3}
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó 2,
en asociación con al menos un vehículo farmacéutico aceptable.
17. Composición farmacéutica, según la
reivindicación 16, que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de al menos un compuesto de fórmula (II) en la que:
R' representa un grupo NH_{2},
X representa F, Cl, CF_{3}
p y n, idénticos o diferentes, igual a 0, 1 ó 2,
en asociación con al menos un vehículo farmacéutico aceptable.
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