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Die Erfindung bezieht sich auf die
Verwendung von speziellen Proteinen und dafür kodierende Nukleinsäuren zum
Testen von Substanzen auf antifungale Wirkungen, einen Testkit dafür, die speziellen
Proteine und dafür
kodierende DNA sowie diese enthaltende Expressesionsplasmide und
Transformanten, die diese Expressionsplasmide aufweisen.
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Das Ansteigen der Zahlen von Patienten
mit einem geschwächten
bzw. geschädigten
Immunsystem führt
gleichzeitig zu einem epidemieartigen Ansteigen von Erkrankungen,
deren Ursache opportunistische pathogene Pilze sind. Die Imperfekte
Hefe Candida albicans ist dabei der Haupterreger invasiver Pilzerkrankungen.
Das von ihr verursachte Krankheitsbild wird als Candidosis bezeichnet.
Ursprünglich
als harmloser Kommensale der menschlichen Schleimhäute vorkommend,
ist C. albicans bei AIDS-Kranken, nach Immunsuppression bei Organtransplantationen
oder chemotherapeutisch behandelten Patienten wie auch bei anderen immungeschwächten Menschen
oder Diabetiker in der Lage, systemische Mykosen hervorzurufen.
Solche Systemmykosen, bei denen sich der Keim im gesamten Körper ausbreitet
und die inneren Organe befällt,
sind schwierig zu behandeln und weisen eine hohe Mortalitätsrate auf.
Das Angebot der derzeit auf dem Arzneimittelmarkt befindlichen antifungalen
Medikamente ist völlig
unzureichend, da diese unerwünschte
Nebenwirkungen hervorrufen, eine zu hohe Toxizität und mangelnde Spezifität aufweisen.
Außerdem
werden bei den gegenwärtig
verwendeten antifungalen Pharmaka Resistenzentwicklungen beobachtet.
Ein wichtiges Forschungsziel besteht deshalb darin, neue antifungal
wirksame Substanzen zu finden. Die Schlüsselvoraussetzung für eine schnelle
und effektive Suche nach solchen Antimykotika ist die Identifizierung
und Charakterisierung neuer molekularer Targets insbesondere in
C. albicans. Daneben spielen natürlich
auch andere humanpathogene Pilze eine Rolle, auf die sich eine solche
Vorgehensweise gleichermaßen
anwenden läßt. Ausgehend von
potentiellen Targets für
antifungale Substanzen können
effektive Testsysteme für
das Primärscreening
entwickelt werden, die einen hohen Probendruchsatz ermöglichen.
Einige potentielle Targets für
die Suche nach neuen Leitstrukturen antifungal wirksamer Substanzen
sind bereits identifiziert (Groll et al. (1998), Trends in Mircrobiology
6, 3: 117-124). Für
eine erfolgreiche Suche nach neuen Antimykotika steht die Identifizierung
weiterer potentieller Targets und die davon abgeleitete Entwicklung
Target-orientierter Testsysteme im Mittelpunkt des Interesses.
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Ein wichtiges Merkmal eines pathogenen
Keimes ist seine Virulenz. Darunter versteht man die Gesamtheit
der Faktoren die die krankmachende Wirkung des Keimes im Verlauf
der Infektion bewirken. Bei C. albicans sind z.B. die Adhärenz an
epitheliale und endotheliale Zellen des Wirtes und die Sekretion
von sauren Aspartylproteasen Virulenzfaktoren. Auch die Bildung
von Hyphen wird als wichtige Voraussetzung für die Virulenz von C. albicans
angesehen. Die Einschränkung
bzw. Aufhebung der Virulenz von C. albicans oder eines anderen pilzlichen
Pathogens durch Antimykotika ist eine wichtige Varaussetzung für die erfolgreiche
Bekämpfung
einer Mykose.
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Der vorliegenden Erfindung liegt
somit die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Testen von Substanzen
auf ihre antifungale Wirkung zu ermöglichen sowie hierfür geeignete
Mittel bereitzustellen, um in einfacher, schneller und kostengünstiger
Weise spezifisch wirkende Antimykotika zu finden.
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Erfindungsgemäß wir dies erreicht durch die
Verwendung von pilzlichen Proteinen mit Homologie zum Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein
(WASP) und für
diese pilzlichen Proteine kodierenden Nukleinsäuren zum Testen von Substanzen
auf antifungale Wirkungen.
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Unter dem Ausdruck „Homologie" im Sinne der vorliegenden
Erfindung wird der Grad der Übereinstimmung
von zwei Nukleinsäuren-
oder Protein-Sequenzen bezeichnet. WASP-Homologe zeichnen sich durch eine gleiche
Domänenstruktur
der Proteine aus. Am aminoterminalen Ende befindet sich eine WH1
Domäne (WASP-Homologie
1), im zentralen Teil eine prolinreiche Domäne und am carboxyterminalen
Ende eine VCA-Domäne.
Dem Fachmann sind diese Domänen
bekannt. Im Bezug auf die prozentuale Identität auf Aminosäure- bzw.
Nukleotidebene bedeutet dies: Die vordere und die hinteren Domänen sind
gut konserviert, während
die zentrale prolinreiche Domäne
nur schwach konserviert ist. Insgesamt führt das zu einer recht niedrigen
Gesamtidentität
auf Aminosäure-
bzw. Nukleotidebene, die unter 40% liegen kann. In den konservierten
Bereichen beträgt
sie jedoch mindestens 50%.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren können RNA
oder DNA sein. Letztere können
genomische DNA oder cDNA sein.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verwendung
stammt das pilzliche Protein oder die dafür kodierende Nukleinsäure aus
Candida albicans. Gegen C. albicans wirkende Antimykotika sind von
besonderer Bedeutung, da dieser Pilz 95% der Candida-Mykosen verursacht,
bei denen es sich um tiefe (endogene) Mykose (Pilzkrankheiten) handelt,
d.h. eine Infektion im Körperinneren.
Endogene Mykosen können
gefährlich
sein, weil sie zur Ausbreitung im Körper neigen.
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Vorzugsweise ist das pilzliche Protein,
das aus C. albicans stammt, das Protein Candida albicans Wal1p (CaWal1p)
mit der in SEQ 1D No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz, dessen Derivate
oder dafür
kodierende Nukleinsäuren.
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Unter dem Ausdruck „Derivat" im Sinne der vorliegenden
Erfindung werden Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen
und Additionen enthaltende Varianten verstanden, die die gleichen
funktionellen Eigenschaften wie die Wildtyp-Proteine oder -Nukleinsäuren besitzen.
Die Derivate können
auch eingeschränkte
funktionelle Eigenschaften besitzen.
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Die vorliegende Erfindung basiert
auf der vollkommen überraschenden
Erkenntnis, daß vorstehend beschriebene
pilzliche Proteine und Nukleinsäuren
sich bestens als Zielmoleküle
zum Einsatz in Testsystemen eigenen, um die antifungle Wirkung von
Substanzen zu untersuchen, wobei diese Untersuchungen in besonders
einfacher, schneller und kostengünstiger
Weise erfolgen. Da für
das Testen von Substanzen auf ihre antifungale Wirkung ein spezielles
Molekül
der Pilze verwendet wird, können
spezifisch wirkende Antimykotika gefunden werden.
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Für
die Virulenz von insbesondere C. albicans ist das Hyphenwachstum
entscheidend. Ist das Hyphenwachstum vermindert, nimmt die Virulenz
von C. albicans ab. Für
das Hyphenwachstum in C. albicans sind einige Proteine von Bedeutung
die an der Organisation des Aktinzytoskeletts beteiligt sind. Werden
diese Proteine inaktiviert, wird kein intaktes kortikales Aktinzytoskelett
ausgebildet, da Defekte in der Aktinpolymerisierung auftreten und
somit letztendlich das Hyphenwachstum inhibiert wird.
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Analyse der Candida albicans Genomsequenz
zeigte, daß dort
nur ein Genort vorkommt, der für
ein WASP-Homolog kodiert. Dieses WASP-Gen wurde mit CaWal1p bezeichnet,
da des bisher nicht annotiert worden ist. Dies bedeutet, daß in C.
albicans vom Wildtyp das Gen CaWAL1 im Genom vorkommt und mit den üblichen,
dem Fachmann bekannten Verfahren, insbesondere im Hinblick auf die
Offenbarung in der vorliegenden Anmeldung, charakterisiert und kloniert
werden kann. C. albicans ist ein diploider Organismus, besitzt also für jeden
Genort zwei Allele. Voraussetzung für die funktionelles Charakterisierung
von CaWAL1 war die Herstellung von Disruptionsmutanten. Dazu wurden
Disruptioskassetten kloniert, in denen verschiedene Selektionsmarker
von Sequenzen des CaWAL1 Gens flankiert wurden. Sequentielle Transformationen
mit je einer dieser Kassetten und homologe Rekombination führten zur
Disruption beider Allele, so daß homozygote Cawal1
Mutanten entstand. Mindestens zwei unabhängige Mutanten wurden erzeugt
und korrektes Gen-Replacement mit PCR (Polymerase Kettenreaktion)
nachgewiesen. Die Lebensfähigkeit
der homozygoten Mutanten zeigt, daß das CaWAL1 Gen nicht essentiell
ist.
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Im folgenden wurde eine phänotypische
Charakterisierung der Cawal1 Mutante durchgeführt. Da C. albicans ein dimorpher
Pilz ist wurden zunächst
Hefezellstadien untersucht. Durch Wachstumsversuche und Messungen
der Zellzykluslängen
zeigte sich, daß die
CaWal1p Mutante eine etwas längere
Zellzyklusdauer aufweist als der Wildtyp.
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Morphologisch lässt sich die Cawal1-Mutante
von länglich,
ovalen Wildtypzellen durch ihre abgerundete, kugelige Form unterscheiden.
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Da die Ausbildung der Zellform eine
Aufgabe des Aktinzytoskeletts ist, wurden fixierte Zellen auf die Verteilung
des kortikalen Aktins (cortical actin patches) untersucht. Dabei
zeigte sich, daß im
Gegensatz zur phasenspezifischen Lokalisierung des kortikalen Aktins
im Wildtyp in den Cawal1 Mutanten keine gerichtete Lokalisierung
der cortical actin patches erfolgte.
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Diese Defekte im Aufbau des Aktinzytoskeletts
führten
darüber
hinaus zu einem veränderten
Knospungsmuster bei Cawal1 Zellen. Während der Wildtyp ein bipolares
Knospungsmuster zeigt, d.h. es können Tochterzellen
durch Knospung an den beiden Zellpolen entstehen, knospen Cawal1-Mutanten
ungerichtet über
die gesamte Zelloberfläche.
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Zusätzlich dazu zeigte sich ein
Zytokinesedefekt in Cawal1-Mutanten, der durch in vivo Zeitraffer
Mikroskopie belegt werden konnte. Es zeigte sich, daß die Trennung
von Cawal1 Mutter- und Tochterzellen eine deutlich längere Zeit
benötigt
als im Wildtyp und es zur Ausbildung von Zellketten kommt.
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Ferner wurden nun der Wechsel zwischen
Hefephase und Hyphenphase (dimorphic switch) und das polare Hyphenwachstum
der Cawal1-Mutante untersucht.
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Die Fähigkeit von C. albicans, Hyphen
zu bilden, wird als ein wichtiger Faktor für die Virulenz dieses Pilzes
angesehen. Insbesondere kann die Hypheninduktion als Streßantwort
auf die zelluläre
Immunantwort des Wirtes gesehen werden.
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Unter verschiedenen Induktionsbedingungen
konnte gezeigt werden, daß Cawal1-Mutanten
eine erheblich gestörte
Fähigkeit
zu polarisiertem Hyphenwachstum aufweisen. Selbst unter stärksten Induktionsbedingungen,
zeigten Cawal1-Mutanten zwar eine zelluläre Antwort, jedoch führte dies
zur Bildung von Pseudohyphen und echte Filamente wurden nicht beobachtet.
Diese Ergebnisse ließen
den Schuß zu,
daß Cawal1-Mutanten
eine verringerte Pathogenität
im Wirt aufweisen.
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Dies wurde im Tiermodell durch Infektion
von Mäusen
mittels Schwanzvenen-Injektion von C. albicans Zellen in den Blutstrom
untersucht. Über
einen Zeitraum von vier Wochen wurde die Überlebensrate von Mäusen beobachtet,
denen drei verschiedene Keimkonzentrationen intravenös verabreicht
wurden. Dabei wurden folgende Stämme
getestet: a.) Wildtyp, b.) benutzter Ausgangsstamm für die Disruption
des CaWAL1-Gens (dieser ist aufgrund seiner URA3 Defizienz avirulent,
c.) heterozygote CaWAL1/wal1 Mutante, sowie d.) homozygote Cawal1-Mutante.
Dabei zeigte sich, daß der
Wildtypstamm sowie die heterozygote Mutante voll virulent waren,
während
der Ausgangsstamm wie erwartet avirulent war. Die homozygote Mutante
zeigte eine stark reduzierte Virulenz und erst bei erhöhten Keimzahlen
von 5·106 Keimen/Maus konnte eine deutliche Virulenz beobachtet
werden.
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Aus vorstehenden Versuchen ergibt
sich, daß pilzliche
WASP-Homologe als Targets für
antifungale Substanzen in geeigneten Testsystemen eingesetzt werden
können,
wobei der Schwerpunkt auf C. albicans liegt.
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Insbesondere die Fähigkeit
von CaWal1p den Aufbau des Aktinzytoskeletts zu beeinflussen eignet sich
hervorragend für
die Entwicklung von Testsystemen im Hochdurchsatzverfahren. Dabei
können
sowohl zellbasierende wie auch zellfreie Assays zum Einsatz kommen.
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Ein pilzliches WASP-Homolog im Sinne
der vorliegenden Erfindung ist z.B. das CaWal1-Protein aus Candida
albicans oder ein Funktionshomologes in einem anderen pilzlichen
Organismus. Dieses kann aus humanpathogenen Arten wie Candida dublinensis,
C. tropicalis, C. glabrata, Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger,
Cryptococcus neoformans und anderen stammen oder zu nicht pathogenen
Pilzen wie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oder
Ashbya gossypii gehören.
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Eine Anwendung der vorliegenden Erfindung
ist z.B. die Testung von reinen Substanzen oder Substangemischen
auf ihre inhibitorische Wirkung auf CaWal1p von C. Albicans oder
anderen Pilzen. Die Aktinpolymerisierungsraten können durch Messung der Fluoreszenz
im wesentlichen nach dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden.
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Der Test sollte die für die Testdurchführung benötigten Proteine
und Reagenzien enthalten, die dem Fachmann bekannt sind oder aufgrund
der vorliegenden Offenbarung ermittelt werden können. Die Reaktion kann mit
der entsprechenden zu testenden Substanz präinkubiert werden; durch Zugabe
von Aktinmonomeren kann sie gestartet und nach kurzer Zeit gestoppt
werden. Es handelt sich hierbei um einen dem Fachmann bekannten
Aktin-Assembly-Assay.
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In solchen Testsystemen kommen als
mögliche
Ausführungsform
der Erfindung Proteinextrakte insbesondere aus C. albicans, rekombinant
erzeugtes erfindungsgemäß verwendetes
pilzliches Protein, insbesondere CaWal1p, oder aufgereinigtes z.B.
immunpräzipitiertes
pilzliches Protein, insbesondere CaWal1p, zum Einsatz. Daneben können günstigerweise
die Komponenten des Arp2/3-Komplexes sowie Profilin zugesetzt werden.
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Das Testen der Substanzen auf ihre
antifungale Wirkung kann in zellulären Testsystemen erfolgen.
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Vorzugsweise kann beim Testen in
zellulären
Testsystemen die Expression des pilzlichen Proteins in Gegenwart
der Substanz untersucht werden. Dazu können Promotorfusionen z.B.
des WAL1-Promotors aus Candida albicans mit dem beta-Galaktosidasegen,
z.B. aus Streptococcus thermophilus, hergestellt und diese über homologe
Rekombination in den Teststamm eingebracht werden. Als Teststamm
kann sowohl BWP17 (ura3/ura3 his1/his1 arg4/arg4) als auch die homozygote
Mutante Cawal1 dienen. Der Vorteil bei der Verwendung der Mutante
liegt darin, daß bei
der Herstellung der Deletion auch der WAL1-Promotor entfernt wurde.
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Grundlage dieses Tests ist, daß Zellen,
deren LacZ-Expression durch die Testsubstanz verringert wurde, in
nachfolgenden photometrischen Messungen einen geringere enzymatische
Beta-Galaktosidase-Aktivität
aufweisen als der unbehandelte Kontrollstamm. Die Beta-Galaktosidase-Aktiviät wird in
bekannter Weise bestimmt, indem Proteinrohextrakte der Testkulturen
hergesellt werden. Dabei werden Zellen, die sich günstigerweise
in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, aufgeschlossen und
die Zellhomogenate durch Zentrifugation von den Zelltrümmern abgetrennt.
Bestimmung der Beta-Galaktosidase-Aktivität erfolgt durch Zugabe der
chromogenen Substanz o-Nitrophenyl-β-.D-Galactosid (ONPG), die enzymatisch
umgesetzt wird in den gelben Farbstoff o-Nitrophenyl, der photometrisch
quantifiziert werden kann.
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Im speziellen werden 3μl einer 100 × Mg2+ Lösung
(0.1 M MgCl2, 4.5 M β-Mercaptoethanol) gemischt mit
30 μl Zellextrakt
und 201 μl
0.1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7.5. Dazu werden 66 μl 1×ONPG Lösung zupipetiert
(1××ONPG: 4mg/ml
ONPG in 0.1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7.5). Die Inkubationsdauer
dieser Reaktion beträgt
mindestens 30 Minuten bei 37°C
oder bis eine gelbliche Verfärbung
einsetzt (bis zu 8 Stunden). Anschließend wird die Reaktion durch
Zugabe von 0.5 ml 1 M NA2CO3 beendet.
Die optische Dichte wird bei 420nm gemessen. Die durch diesen Test
gefundenen Substanzen mit antifungaler Wirkung führen in Wildtypstämmen zu
den charakterisierten Wachstumsdefekten und zu einem stark herabgesetzten
Hyphenwachstum und sind damit spezifisch für die Expression von CaWAL1
verantwortlich.
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Des weiteren kann beim Testen in
einem zellulären
Testsystem die Wirkung der Substanz auf einen das pilzliche Protein überexprimierenden
Pilzstamm im Vergleich zu einem Referenzstamm untersucht werden.
Basis dieses Tests ist, daß Zellen,
die durch Überexpression
von CaWal1p, z.B. mittels der Verwendung des CATEF1-Promoteors,
eine wesentlich erhöhte
Proteinmenge von CaWal1p exprimieren. Die spezifische Wirksamkeit
einer Substanz ist dann gezeigt, wenn der Stamm, der CaWal1p überexprimiert,
unter sonst gleichen Bedingungen ein deutlich besseres Wachstum
als der Kontrollstamm aufweist.
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Zur Durchführung dieses Tests wird CatWAL1
in bekannter Weise in einen Überexpressionsvektor
kloniert und in Candida albicans transformiert. Parallel dazu erfolgt
die Transformation mit dem Ausgangsvektor als Kontrolle. Die beiden
Versuchsstämme
werden nachfolgend in Vollmedien (YPD: 20 g/l Yeast extract, 10g/l Pepton;
20 g/l Dextrose) jeweils mit den zu testenden Substanzen oder Substanzgemischen
kultiviert. Wachstum der Zellen des Überexpressionsstammes wird
nach abgelaufener Inkubationszeit mit dem Wachstum der Zellen des
Kontrollstammes verglichen. Das Testsystem wird vorzugsweise in
96er Mikrotiterplatten durchgeführt.
Damit können
Zelldichtemessungen durch automatisierte turbidimetrische Verfahren
verwendet werden. Die zu testende Substanz besitzt dann eine inhibitorische
Wirkung, wenn die optisch Dichte der Zellen (gemessen bei 600 nm)
des Kontrollstammes nach der Inkubationszeit deutlich geringer ist
als die der Zellen des Überexpressionsstammes.
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Bei einem anderen Test im einem zellulären Testsystems
kann die Wirkung der Substanz auf das polare Zellwachstum der Pilze
untersucht werden. Dabei wird die Erkenntnis ausgenutzt, daß Einflüsse auf
die Organisation des Aktinzytoskelettes zu einem isotropen Zellwachstum
führen
und abgerundete Zellen entstehen lassen. Dies konnte für die homozygote
Cawal1- Mutante belegt
werden. Es können
als Testsystem Hochdurchsatzverfahren zum Einsatz kommen, die Zellformen
anhand der Ermittlung des Länge-Breite
Indexes (LBI) in einem automatisierten mikroskopischen Prozeß erfassen.
Eine Kugelgestalt nähert
sich einem solchen Index an den Wert 1 an, während der Wildtyp einen Wert
von 1.3 bis 1.4 aufweist.
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Zur Durchführung dieses Tests werden Multititerplatten
(96er Format) mit YPD-Festmedium bestückt. Auf diese werden die jeweiligen
Testsubstanzen appliziert und geringe Zellmengen aufgetropft. Nach
einer Inkubationszeit von wenigstens 8 Stunden werden die LBIs von
etwa 20 Zellen pro Test gemessen und gemittelt. Eine getestete Substanz
besitzt dann Wirkung auf die Zellmorphologie und das polare Wachstum
und somit antifungale Wirkung, wenn sich für die untersuchte Probe ein
LBI von weniger als 1.15 ergibt.
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Des weiteren kann bei einem Test
in einem zellulären
Testsystem die inhibierende Wirkung der Substanz auf die Protein-Protein-Interaktion
des pilzlichen Proteins auf andere Proteine untersucht werden, z.B. durch
den Einsatz des Zwei-Hybrid-Systems in Saccharomyces cerevisiae.
Dabei kann ein pilzliches WASP-Homolog, z.B. das für CaWal1p
kodierende Gen mit der DNA-Bindedomäne (oder der Transkriptionsaktivierungsdomäne) des
Transkriptionsfaktors Gal4p fusioniert werden. Das interagierende
Protein, z.B. Rvs167p oder Arp2p, wird mit der Transkriptionsaktivierungsdomäne (oder
der DNA-Bindedomäne)
fusionier und beide Fusionsprodukte auf Plasmiden in Saccharomyces
cerevisiae als zelluläres
System durch Transformation etabliert. Durch die stattfindende Interaktion
kommt es zur Transaktivierung und damit zur Aktivierung eines ebenfalls
in diesem Testsystem befindlichen Reportergens. Als Reportergene
eignen sich Auxotrophiemarker, z.B. HIS3, oder das LacZ-Gen, dessen Aktivierung über einen
Farbassay nachgewiesen werden kann. Eine Hemmung der Protein-Protein-Interaktion
bewirkt eine Inhibition oder zumindest eine Reduktion der Expression
des Reportergens.
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
kann das Testen in zellfreien Testsystemen erfolgen.
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Dazu kann vorzugsweise die inhibierende
Wirkung der Substanz auf die Interaktion des pilzlichen Proteins
mit anderen Proteinen mittels Affinitätssensor untersucht werden,
wobei das pilzliche Protein auf der Sensoroberfläche immobilisiert ist. Insbesondere
kann die inhibitorische Wirkung der zu testenden Substanz auf die
Interaktion von CaWal1p mit CaRvs167p oder von CaWal1p mit CaArp2p
mit Hilfe eines Affinitätssensors, wobei
CaWal1p auf der entsprechenden Sensoroberfläche immobilisiert wurde. Dann
werden Substanzen mit den entsprechenden Interaktionspartnern zugesetzt.
Dabei kann die Stärke
der Interaktion als Indiz für
die inhibitorische Wirkung der Testsubstanz gewertet werden.
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Die entsprechenden Epitop-markierten
Proteine werden entweder direkt Candida albicans oder aber in E.
coli hergestellt. Als Epitope eignen sich kleine Epitope wie der
6-His-Tag oder das HA-Tag. Die Aufreinigung der Proteine erfolgt über Affinitätschromatographie
aus den Proteinrohextrakten.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ferner ein Testkit zum Test der antifungalen Wirkung von Substanzen,
enthaltend pilzliche Proteine mit Homologie zu WASP, dafür kodierende
Nukleinsäure
oder einen das Protein exprimierenden Microorganismus. Dieser Testkit
kann des weiteren die für
die vorstehend beschriebenen zellulären Testsysteme bzw. die vorstehend
beschriebenen zellfreien Testsysteme erforderlichen Komponenten,
die dem Fachmann an sich bekannt sind oder von diesem basierend
auf der vorliegenden Offenbarung leicht ermittelt werden können, enthalten.
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Diese Testkits sind besonders dazu
geeignet, in Testverfahren zur Bestimmung der antifungalen Wirkung
von Substanzen eingesetzt zu werden, wobei pilzliche Proteine mit
Homologie zum WASP und für
diese pilzlichen Proteine kodierenden Nukleinsäuren eingesetzt werden.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ferner ein pilzliches Protein mit Homologie zu WASP, wobei das
pilzliche Protein die Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr. 2 (CaWal1p) oder ein Derivat davon umfaßt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ferner eine für
ein vorstehendes Protein CaWal1p kodierende Nukleinsäure. Diese
kann ein RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z.B. eine genomische
DNA oder ein cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
- (a) die DNA von SEQ ID Nr. 1 oder ein Homologes
davon;
- (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
- (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen
Code verwandte DNA.
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Bezüglich des Begriffs Homologes" wird auf vorstehende
Ausführungen
verwiesen.
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Der Ausdruck „hybridisierende DNA" weist auf eine DNA
hin, die unter üblichen
Bedingungen, insbesondere bei 20°C
unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA (a) hybridisiert.
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Das Herstellen der erfindungsgemäßen DNA
wurde bereits vorstehend erläutert
und ist in den folgenden Ausführungsbeispielen
näher dargestellt.
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Eine erfindungsgemäße DNA kann
in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher
sind dem Fachmann bekannt und können
in Abhängigkeit
des Mikroorganismus, in dem die DNA exprimiert werden soll, gewählt werden.
Der Fachmann weiß ferner,
wie eine erfindungsgemäße DNA in
einen Expressionsvektor inseriert werden muß oder kann die Bedingungen
dafür in
einfachen Tests ermitteln. Er kennt dazu insbesondere geeignete
Restriktionsenzyme. Dem Fachmann ist ferner bekannt, daß die erfindungsgemäße DNA auch
in Verbindung mit einer für
ein anderes Protein kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in
Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
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Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen,
transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind
ihm Verfahren bekannt, das expremierte Protein zu isolieren und
zu reinigen.
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Ausführungsbeispiele
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Funktionale Analyse des
CaWal1p-Gens
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Das C. albicans WAL1 Gen wurde in
der Genomsequenz von C. albicans (http://wwwseguence.stanford.edu/group/candida/)
identifiziert. Das entsprechende Gen wurde mit anderen WASP-Homologen
verglichen und es zeigten sich Übereinstimmungen
in den funktionelles Domänen.
Darüber
hinaus wurde ebenso wie in anderen pilzlichen WASP-Homologen das
Fehlen einer G-Protein-Bindedomäne
(GBD) festgestellt.
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Anhand der Genomsequenzen wurden
zwei Oligonukleotidprimer abgeleitet mit denen ein 1551 bp großes Fragment
des CaWal1p-Gens amplifiziert wurde. Dieses Fragment wurde mittels
der Restriktionserkennungsstellen Xbal und Kpn1, die in den Oligonukleotidprimern
enthalten waren verdaut und als 1517bp großes Fragment in den entsprechend
geschnittenen Vektor pBluescript SK + kloniert. So entstand pSK+-CaWal1p.
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Um beide genomischen Kopien des CaWal1p-Gens
deletieren zu können
wurden aufbauend auf diesem Plasmid Disruptionskassetten kloniert.
Dazu wurde das Plasmid pSK+-CaWAL1 mit den Enzymen HincII und ClaI
geschnitten. Damit wurde eine interne Region des Inserts zwischen
235 und 695 herausgetrennt. Dafür
wurde zum einen der Selektionsmarker URA3 als 1397 bp großes PvuII-ClaI
Fragment aus pFA-URA3 und zum anderen der Selektionsmarker HIS1
als 1591 by großes
HincII-ClaI Fragment eingefügt.
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Herstellung einer homozygoten
Disruoptionsmutante
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Die beiden erzeugte Disruptionskassetten
wurden für
die Konstruktion einer homozygoten Cawal1-Mutante benutzt. Dazu
wurde die Cawal1::URA3-Kassette mit den Enzymen Xbal und Kpn1 aus
dem Vektor herausgeschnitten und in den C. albicans Stamm BWP17
transformiert. Transformanten konnte auf Minimalagrarplatten ohne
Uridin erhalten werden. Korrektes Gene Replacement wurde mittels
PCR überprüft. Dieser
CaWAL1/wal1::URA3 heterozygote Stamm wurde in einer zweiten Transformation
mit der Cawal1::HIS1 Disruptionskassette transformiert, nachdem
diese ebenfalls mittels XbalI und Kpn1 aus dem pBluescript Vektoranteil
herausgeschnitten worden war. Homozygote Cawal1::URA3/wal1::HIS1
Transformanten konnten auf Minimalagrarplatten ohne Uridin und ohne
Histidin erhalten werden. Auch für
die homozygoten Mutanten wurde das PCR-Verfahren zur Verifikation
der Deletion herangezogen.
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Morophologische Charakterisierung
der Cawal1-Mutanten
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Um die Cawal1-Mutante phänotypisch
zu charakterisieren, wurde zunächst
ein Wachstumsversuch unter drei definierten Temperaturbedingungen
(25°C, 30°C, 37°C) durchgeführt. Dazu
wurden Einzelkolonien verschiedener Stämme auf YPD-Platten ausgestrichen
und drei Tage inkubiert. Der Vergleich des Wachstums der Stämme ließ unter
den gewählten
Bedingungen keine Wachstumsdefekte in den C. albicans wal1-Mutanten
erkennen. Vergleicht man das Wachstum von Cawal1 und C. albicans
Wildtyp SC5314 miteinander, so sind beide etwa gleich stark auf
den Platten aufgewachsen. Nur bei 37°C läßt sich ein Unterschied in
der Stärke der
gewachsenen Kultur erkennen, hier sind beide CaWal1p-Mutanten etwas schwächer als
SC5314 gewachsen. Im Unterschied dazu ist das Wachstum von BWP17
bei allen Temperaturen deutlich schwächer ausgeprägt.
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Vergleicht man Zellen des C. albicans
Wildtyps SC5314 mit denen der Cawal1-Mutante so läßt sich ein
deutlicher morphologischer Unterschied zwischen diesen Zellen feststellen.
Wildtypzellen haben bei 20 bis 34°C
ein länglich
ovale Form. Eine ähnliche
Gestalt wurde bei den heterozygoten CaWAL1/wal1::His1-Stämmen bzw.
CaWAL1/wal1::URA3-Stämmen
beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen die homozygoten Cawal1-Mutanten
eine sphärische
Form. Zudem sind die Zellen in ihrer Größe sehr heterogen und verklumpen häufig.
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Mit Hilfe einer Calofluor-Färbung und
der Fluoreszenzmikroskopie kann die Verteilung von Chitin in der Zellwand
sichtbar gemacht werden. Dadurch wurden insbesondere die Knospungsringe
der Zellen gefärbt,
die Aufschluß über das
Knospungsmutter in Wildtyp und der Cawal1 Mutante ergaben. Wildtypzellen
von C. albicans sind durch ein bipolares Knospungsmuster gekennzeichnet,
d.h. beide Zellpole werden für
die Bindung von Tochterzellen benutzt. Dieses Knospungsmuster wurde
in Cawal1-Zellen nicht gefunden. Bei diesen Zellen sind die Knospungsstellen
zufällig über die
Zelloberfläche
verteilt, es läßt sich
kein bestimmtes Muster bei der Auswahl der nächsten Knospungsstelle erkennen.
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Die Aktinpolymerisierung an einem
Zellpol ist ein wesentlicher Prozeß für die Knospenbildung und damit
die Ausbildung der Zellpolarität.
Um die Organisation der Aktinfilamente in C. albicans Wildtyp und Cawal1-Zellen
darzustellen, wurden Rhodamin-Phalloidin-Färbungen an fixierten Zellen
durchgeführt.
Mit Hilfe dieser Färbung
wurde das kortikale Aktin der Zellen aufgezeigt. In Wildtyp-Zellen
ist das kortikale Aktin während
des polaren Wachstums an der Knospungsstelle lokalisiert, wenn die
Tochterzelle lichtmikroskopisch noch nicht erkennbar ist. Weiterhin
ist das kortikale Aktin während
des polaren Wachstums in der neuen Tochterzelle konzentriert oder
während
der Zytokinese am Septum. Vergleicht man diese Beobachtungen mit Cawal1-Zellen,
so erkennt man auch hier kortikales Aktin. Allerdings wurde eine
polare Lokalisierung in die entstehende Tochterzelle bzw. an eine
Knospungsstelle nicht beobachtet. Statt dessen ist hier das kortikale
Aktin verstreut über
die gesamte Zelloberfläche
verteilt.
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Vergleich
von Hypheninduktion zwischen Wildtyp und Mutanten
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Ein entscheidender Pathogenitätsfaktor
von C. albicans ist die Ausbildung von Hyphen. Der Wechsel von der
einzelligen Form zum vielzelligen Myzel erlaubt dem Pilz das invasive
Wachstum im Wirt und die Anheftung an wirtsspezifische Gewebe. Um
im Labor die Ausbildung von Hyphen in einer C. albicans Kultur zu induzieren,
sind zwei wesentliche Faktoren nötig.
Zunächst
wird dem Medium Serum (hier: Kälberserum)
zugegeben. Zudem erfolgt ein Temperaturwechsel der Kulturen von
30°C auf
37°C, die
der Temperatur im Wirt entspricht.
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Hypheninduktion durch Serum: Dazu
wurden YPD-Platten mit einer Serumkonzentration von 25% hergestellt,
die Zellen in einem frationierten Ausstrich ausplattiert und 4-5
Tage inkubiert. Neben der Cawal1-Mutante werden der C. albicans
Wildtyp SC5314 und Cawal1/WAL1 in seiner Hyphenbildung untersucht.
Für die heterozygote
Mutante wurden dem Medium zusätzlich
100 μl Uridin
(20mg/ml) zugesetzt, da diese Mutante auxotroph für URA3 ist.
Weiterhin wurde die Hypheninduktion auf einern Mangelmedium (CSM)
mit 25% Serum getestet. Für
SC5314 und CAT4 wurden stark gefurchte Kolonieformen beobachtet,
die ein Merkmal für die
Ausbildung von Hyphen darstellen. Die homozygote Mutante wächst unter
hypheninduzierenden Bedingungen als glatte Kolonien, sowohl auf
YPD-Serum-Platten als auch auf CSM-Serum-Platten und läßt keine Hyphenbildung
erkennen. Mikroskopische Untersuchungen der Stämme, die in CSM-Flüssigmedium
mit 25% Serum 20h angezogen wurden, zeigten einen filamentösen Phänotyp für SC5314
und CAT4. Für
CAT6 wurden die Beobachtungen der Serumplatten mikroskopisch bestätigt, auch
in Flüssigkultur
konnten keine Hyphen gefunden werden. Allerdings wurden in einigen
Fällen
Pseudohyphen gefunden, die durch Einschnürungen an den Septen gekennzeichnet
sind. In echten Hyphen ist der Hyphendurchmesser am Septum nicht
verengt.
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Hypheninduktion durch Spider-Medium:
Neben der seruminduzierten Hyphenbildung sind auch einige synthetische
Medien bekannt, die bei 37°C
die Bildung von Hyphen bei C. albicans induzieren, z.B. das sogenannte
Spider-Medium, so daß neben
der Induktion durch Serum auch die auf Spider-Medium überprüft wurde.
Es wurden dieselben Stämme
verwendet, die bereits für
die Induktion durch Serum benutzt wurden (SC5314, CAT4, CAT6) und
in gleicher Weise ausplattiert. Die Resultate dieses Versuches sind
mit denen der Seruminduktion vergleichbar. Auch hier wurde deutlich
gefurchte Kolonien mit gefransten Rändern bei SC5314 und heterozygoter
Wal1p-Mutante beobachtet. Die Koloniemorphologie der homozygoten
Cawal1-Mutante unterscheidet sich von beiden, indem hier glatte
Kolonien mit glatten Rändern
auftreten. Dieses Ergebnis wurde durch lichtmikroskopische Untersuchungen
bestätigt.
Die Kolonien des Wildtyps zeigen deutliche Hyphenbildung, im Gegensatz
dazu lassen sich keine Hyphen bei Cawal1 erkennen.
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Virulenztestes
mit Wildtyp und Mutanten
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Zur Untersuchung der Bedeutung von
CaWal1p für
die Virulenz von C. albicans wurde ein in vivo Maus-Assay angewandt.
Dabei wurden C. albicans Keime direkt in die Schwanzvene der Mäuse injiziert.
Es wurden jeweils 5 Mäuse
pro Ansatz verwendet. Die untersuchten Keimkonzentrationen lagen
bei 5×104, 2×105, 5×105, 1×106 und 5×106. Für
diese Versuche wurden folgende Stämme verwendet: a) der Wildtypstamm SC5314,
b) die homozygote Mutante (Cawal1::HIS1/Cawal1::URA3), c) die heterozygote
Mutante (Cawal1::URA3) und d) der Ausgangsstamm für die CaWal1p-Deletion
BWP17 (ura3/ura3, his1/his1, arg4/arg4). Die Versuche wurden unabhängig voneinander
durchgeführt
und die Überlebensrate
im zeitlichen Verlauf über
insgesamt 5 Wochen ermittelt. Bei der niedrigsten Keimzahl kam es
zu einem langsamen Krankheitsverlauf, bei dem alle Mäuse, die
mit dem Wildtypstamm infiziert worden waren, innerhalb von 15 Tagen starben,
während
der Stamm BWP17 und die homozygote Cawal1-Mutante keinerlei Virulenz
aufwiesen. Bei einer Keimkonzentration von 2×105 C.
albicans Zellen starben innerhalb von 15 Tagen alle Mäuse, die
mit dem Wildtyp oder heterozygoten Mutante infiziert worden waren.
Der Ausgangsstamm war hier wie in allen Fällen avirulent, was auf die
URA3-Defizienz zurückzuführen ist.
Die homozygote Mutante war ebenfalls avirulent. Bei steigenden Keimkonzentrationen
ließ sich
ein Ansteigen der Virulenz der Cawal1 Mutante beobachten, die jedoch
auch bei der höchsten
Keimkonzentration nur 80% der Versuchstiere abtötete.
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Die heterozygote Mutante erwies sich
in diesen Versuchen als stark virulent und damit dem Wildtyp vergleichbar,
auch wenn der Krankheitsverlauf etwas verzögert war.
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Demnach stellt CaWal1p ein Schlüsselprotein
dar, das in die Morphogenese eingreift, damit einen wesentlichen
Einfluß auf
den Hefe-Hyphe Dimorphismus und die Virulenz von C. albicans besitzt. SEQUENZPROTOKOLL
