DE69937806T2 - Methode zum identifizieren von inhibitoren der ipc-synthase - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen zellbasierten Test (Screen) auf Inhibitoren der fungalen Inositolphosphorylceramid(IPC)-Synthase, einem wichtigen antifungalen Ziel.
- Wie von mehreren Forschungsgruppen und pharmazeutischen Unternehmen identifiziert, sind Inhibitoren der fungalen IPC-Synthase wirksame und selektive antifungale Mittel (beispielsweise Aureobasidin, Khafrefungin und Rustmicin).
- Allerdings handelt es sich bei all solchen Verbindungen um natürliche Produkte, die schwierig herzustellen, zu handhaben und einem Patienten zu verabreichen sind (beispielsweise können sie eine ungeeignete Pharmakokinetik aufweisen). Es ist daher in hohem Maße wünschenswert, andere neuartige chemische Verbindungen zu erhalten, die das gleiche Ziel (eine fungale IPC-Synthase) selektiv hemmen, aber ohne die intrinsischen Nachteile, welche die derzeit bekannten Inhibitoren aufweisen. Das Screening auf solche neuartigen Chemikalien sowie die Optimierung der bereits verfügbaren „Leads" (d. h. die Optimierung eines bekannten Inhibitors in einem strukturbasierten Design bzw. Lead-Optimierung) erfordert einen Test auf IPC-Synthaseaktivität, der mit ausreichend hohem Durchsatz durchgeführt werden kann.
- Alle derzeit verfügbaren biochemischen Tests auf IPC-Synthase sind kompliziert und sehr arbeitsintensiv.
- Nagiec et al. (Journal of Biological Chemistry, Vol 272 Nr. 15, S. 9809–9817 (1997)) beschreiben die Komplementierung eines IPC-Synthasegendefektes in einem mutierten Stamm von S. cerevisiae mit dem AUR1-Gen. Der mutante Stamm weist eine Deletion des LCB1-Gens und eine Punktmutation auf, aus der das Suppressorgen SLC1- 1 hervorgeht. Die lcb1-Mutation verhindert die Sphingolipidsynthese und das SLC1-1-Gen ermöglicht der Zelle, Phospholipide herzustellen und am Leben zu bleiben (die Verwendung von Großbuchstaben impliziert ein funktionelles Gen bzw. eine „Gain-of-Function"-Mutation wie beispielsweise SLC1-1, wohingegen Kleinbuchstaben ein nicht-funktionelles Allel wie lcb1 kennzeichnen). Hiermit waren die Autoren in der Lage, einen mutanten Stamm mit defekter IPC-Synthase zu isolieren und ein Gen, AUR1, zu isolieren, welches den IPC-Synthasedefekt komplementiert und die IPC-Synthaseaktivität wiederherstellt. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass die IPC-Synthase das Ziel für antifungale Mittel wie Aureobasidin ist. Sie postulieren, dass es möglich sein könnte, Tests mit hohem Durchsatz zu entwickeln, um neue Inhibitoren der IPC-Synthase zu identifizieren, um Pilzerkrankungen zu bekämpfen.
- Wir haben jedoch festgestellt, dass ein ähnlicher Stamm von S. cerevisiae (lcb1/SLC1-1) zwar lebensfähig ist, der Stamm aber sehr schlecht wächst und gegenüber Umwelteinflüssen wie beispielsweise Einfrieren sehr empfindlich ist. Dieser Stamm ist für Screening-Zwecke einfach nicht robust genug.
- Wir stellen nun einen robusten zellbasierten Test bereit, um selektive IPC-Synthaseinhibitoren zu identifizieren. Dieser Assay beruht auf unserer Entwicklung eines S. cerevisiae-Stammes, bei dem die Produktion kompensatorischer Phospholipide erhöht ist.
- In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir daher einen Screeningassay für die Identifizierung eines selektiven IPC-Synthaseinhibitors bereit, wobei der Assay das Inberührungbringen einer Testverbindung mit gentechnisch veränderten Zellen aus einem lcb1/SLC1-1-Wirtsstamm umfasst, wobei das SLC-1-Gen unter der Kontrolle des Promotors des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenasegens (GPD3-Gens) steht, und deren Fähigkeit zur Synthese von Sphingolipiden von der Zugabe von exogenem Phytosphingosin abhängt und die zu anhaltendem Wachstum über kompensatorische Phospholipide fähig sind, wobei Phytosphingosin zugegeben wird, und Bestimmung der IPC-Synthasehemmung durch die Testverbindung durch Bezugnahme auf eine etwaige Hemmung des Zellwachstums.
- Es kann jeder geeignete Wirtszellstamm verwendet werden, vorausgesetzt, er kann als Wirt für ein fungales IPC-Synthasegen fungieren. Geeignete Wirte umfassen Pilze, die genetisch manipulierbar sind, wie beispielsweise S. cerevisiae, aber auch andere wie Candida albicans, Candida glabrata, Aspergillus sp. oder Schizosaccharomyces pombe. Geeignete Quellen für das AUR1-Gen sind pathogene (auch phytopathogene) Pilze, wie oben erläutert, und andere wie Ashbya sp., Fusarium sp., Trichoderma sp., Kryptokokken, Blastomyces und Histoplasma.
- Ohne uns an theoretische Überlegungen binden zu möchten, wird davon ausgegangen, dass die kompensatorischen Phospholipide neuartige Glycerophospholipide sind, die mindestens eine für das vegetative Wachstum essenzielle Funktion von Sphingolipiden kompensieren könnten (Lester et al, J. Biol. Chem., 1993, 268, 845–856).
- In einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir gentechnisch veränderte Zellen von einem lcb1/SLC1-1-Wirtsstamm bereit, wobei das SLC-1-Gen unter der Kontrolle des Promotors des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenasegens (GPD3-Gens) steht, deren Fähigkeit zur Synthese von Sphingolipiden von der Zugabe von exogenem Phytosphingosin abhängt und die zu anhaltendem Wachstum über kompensatorische Phospholipide fähig sind.
- Mit „anhaltendem Wachstum" meinen wir keinen signifikanten Rückgang der Anzahl vitaler Zellen wäh rend eines Wachstumszeitraums (d. h. Zelltod ist im Vergleich zu Zellwachstum vernachlässigbar). Der Stamm muss außerdem zu mindestens einem der Folgenden in der Lage sein: er muss für längere Zeiträume aufbewahrbar sein, beispielsweise bis zu drei bzw. sechs Monaten oder länger; er muss in Flüssigmedium aufbewahrbar sein oder eingefroren und wieder belebt werden können. Die gentechnisch veränderten Zellen der Erfindung können routinemäßig in Assayverfahren mit hohem Durchsatz verwendet werden und sind dafür robust genug. Allgemein weisen sie Generationszeiten auf, die mit Wachstumsassays vergleichbar sind (d. h. nicht mehr als 4 Stunden je Verdoppelung), und erreichen letztendlich eine optische Dichte von über 4 OD (bei 600 nm und bei einem Lichtweg der Länge von 1 cm). Diese Parameter gestatten eine vollständige Bestimmung des Wachstums eines Wirtsstammes in weniger als 30 Stunden.
- Der Wirtsstamm zur Verwendung in den Assayverfahren der Erfindung ist ein lcb1/SLC1-1-Stamm. Er weist, was noch praktischer ist, einen Selektionsmarker auf, beispielsweise kann das lcb1-Gen direkt durch ein Aminosäurebiosynthesegen (wie beispielsweise LEU2, TRP1 oder HIS3) oder Antibiotikaresistenz wie Geneticin (G418) ersetzt sein.
- Eine Anpassung der Wirtszellen für anhaltendes Wachstum wird erreicht, indem die Expression des kompensatorischen mutanten SLC1-1-Allels verstärkt wird. Wir haben überraschenderweise festgestellt, dass dies erreicht werden kann, indem das SLC1-1-Gen in ein Multicopy-Plasmid (pYES2-LEU2d-GPD3-SLC1-1 = pNS149) unter die Kontrolle des Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasepromotors kloniert wird. Die Verwendung eines pGPD-SLC1-1-Promotor/-Gen-Multicopy-Konstruktes ergibt einen Stamm mit viel besseren Wachstumseigenschaften, besserer Wachstumsrate, einer besseren abschließenden optischen Dichte sowie Resistenz gegenüber Einfrieren. Insgesamt wurde damit zum ersten Mal ein Wirtsstamm erhalten, der für Screening-Zwecke robust genug ist.
- GPD3 ist ein Beispiel eines sehr starken konstitutiven Promotors in S. cerevisiae. Andere glykolytische Enzyme wie beispielsweise Phosphoglyceratkinase (PGK), Enolase 1 (ENO), Pyruvatkinase (PYK) und Fruktosebisphosphataldolase II (FBA) sind geeignete Quellen anderer solcher Promotoren.
- In einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir einen gentechnisch veränderten Wirtsstamm S. cerevisiae (lcb1/pGPDSLC1-1) bereit.
- Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren veranschaulicht, aber nicht eingeschränkt:
- BEISPIELE
- Beispiel 1 Konstruktion des IPC-Synthasescreeningstammes (lcb1::kanMX, pNS149 (pGPD3-SLC1-1))
- (i) Herstellung eines LCB1-Deletionsstammes
- Da es sich bei LCB1 um ein essenzielles Gen handelt, kann nur ein Allel einer diploiden Zelle ohne Überlebensverlust deletiert werden. Zugefügtes Phytosphingosin kann jedoch ein intaktes LCB1-Gen substituieren. Technisch wurde ein LCB1-Allel eines diploiden S. cerevisiae-Stammes (JK9-3daa – Kunz, J. et al., Cell, 1993, 73, 585–596) unter Verwendung der Kanamycinresistenzkassette deletiert, wie von Wach et al., Yeast, 1996, 12, 259–265, beschrieben.
- Zur Herstellung der LCB1-Deletion verwendete PCR-Primer (lcb1::kanMX)
- Die Unterbrechung von LCB1 und seine Substitution durch kanMX wurde mittels PCR verifiziert (unter Verwendung von Primern 5' von der deletierten Region, die gegen das Gen und innerhalb von kanMX in Richtung auf den Promotor gerichtet sind). Sporulation des heterozygoten Diploids (LCB1/lcb1::KanMX) und Tetradendissektion ergibt 2 Kanamycin-empfindliche Kolonien je Tetrade bei Anzucht auf YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY Media) ohne Phytosphingosin, wenn jedoch der Ascus auf Medium dissektiert wird, das 10 mM Phytosphingosin enthält, führt dies zu 4 Kolonien je Tetrade, von denen zwei gegen Kanamycin resistent (und daher lcb1::kanMX) sind.
- (ii) Herstellung eines in ein Multicopy-Plasmid klonierten SLC1-1-Allels
- Das dominante SLC1-1-Allel wurde durch PCR aus dem Wildtypallel erzeugt, wobei die Sequenz wie von Nagiec et al. (am angeführten Ort) beschrieben regeneriert wurde. Das mutante SLC1-1-Allel unterscheidet sich durch ein einzelnes Nukleotid von dem Wildtypallel, das Glutamin 44 im Wildtypprotein zu Leucin im Suppressorprotein konvertiert. Der Literatur zufolge (Nagiec et al., am angeführten Ort) sollte diese Mutation den lcb1::kanMX-Stamm bewahren, was Wachstum auf Medium ohne zugefügtes Phytosphingosin ermöglicht.
- Das SLC1-1 wurde mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert (wobei die Punktmutation über eine Fehlpaarung im 5'-Primer erzeugt wurde) und unter Verwen dung von BamHI (5') und SphI (3') als Insertionsstellen in Expressionsplasmide kloniert (z. B. pYES2-Leu2 (Invitrogen), modifiziert durch einen eingesetzten Leu2-Selektionsmarkier = pNS144) (um pNS145 zu ergeben). Nach Transformation (5) in lcb1::kanMX (3) (Selektion SGal-Leucin, ohne Zugabe von Phytosphingosin) wurden nach 12-tägiger Inkubation Mikrokolonien etabliert, was die supprimierende Funktion von SLC1-1 bewies und bestätigte. Jedoch war die Vitalität dieser Transformanden äußerst schlecht, und sie konnten nicht in Flüssigkultur gehalten werden. Die Etablierung gefrorener Vorräte (Stocks) aus den Kolonien schlug ebenfalls fehl. Ein ähnlicher Phänotyp wurde auch beobachtet, wenn anstelle von Gall der homologe SLC1-Promotor verwendet wurde (pNS148).
- Primer zur Herstellung von SLC1-1 durch PCR. Die Restriktionsschnittstellen sind fett gedruckt. Die Punktmutation, aus der Leu44 hervorgeht, ist in unterstrichener Kursivschrift gezeigt.
-
- (iii) Erzeugung eines GPD3-gesteuerten SLC1-1-Allels
- Wir postulierten, dass die schlechte Vitalität des lcb1::kanMX pNS145-Stammes auf unzureichende Expression von SLC1-1 zurückzuführen sein könnte, weshalb versucht wurde, die Expression zu erhöhen. Wir platzierten das SLC1-1-Gen unter die Kontrolle des Promotors der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase GPD3 (= TDH3) (Norbeck et al., Yeast, 1997, 16, 1519–1534).
- Der GPD3-Promotor wurde aus chromosomaler DNA von S. cerevisiae durch PCR amplifiziert und in eine HinDIII-Schnittstelle von pNS145 (unmittelbar 5' von dem SLC1-1-Start-ATG) eingefügt, um Plasmid pNS149 zu erzeugen, was einen weiteren unabhängigen Aspekt der Erfindung darstellt.
- PCR-Primer zur Herstellung des GPD3-Promotors. Restriktionsschnittstellen sind fett gedruckt.
-
- Die Transformation (Ito et al., J. Bacteriology, 1983, 153, 163–168) von pNS149 in lcb1::kanMX (siehe 2. oben) lieferte bereitwillig vitale Klone, die auch sehr gut in Flüssigkultur wuchsen und sich von der Lagerung im gefrorenen Zustand erholen konnten.
- Beispiel 2 Test auf IPC-Synthase
- Die Eignung des Stammes lcb1::kanMX pNS149 zur Identifizierung von Inhibitoren der IPC-Synthase wurde mittels Aureobasidin A als Testverbindung evaluiert. Der Stamm lcb1::kanMX pNS149 ist ein weiterer unabhängiger Aspekt der Erfindung. Wie in
1 gezeigt, konnte die Testverbindung, wir vorhergesagt, leicht identifiziert werden. Die Hemmung durch Aureobasidin A war in Gegenwart von Phytosphingosin sehr ausgeprägt, aber nicht vorhanden, wenn kein Phytosphingosin zugegeben wurde. -
1a - Inhibition des Wachstums durch Aureobasidin A in Stamm lcb1::kanMX, pNS149 mit Zugabe von Phytosphingosin.
-
1b - Inhibition des Wachstums durch Aureobasidin A in Stamm lcb1::kanMX, pNS149 ohne Zugabe von Phytosphingosin. SEQUENZLISTE
-
1a - Phytosphingosine
- Phytosphingosin
- no AbA
- kein AbA
- Time hrs
- Zeit in Std.
-
1b - Without Phytosphingosine
- ohne Phytosphingosin
- no AbA
- kein AbA
- Time hrs
- Zeit in Std.
Claims (4)
- Screeningassay für die Identifizierung eines selektiven IPC-Synthaseinhibitors, wobei der Assay das Inberührungbringen einer Testverbindung mit gentechnisch veränderten Zellen aus einem lcb1/SLC1-1-Wirtsstamm umfasst, wobei das SLC-1-Gen unter der Kontrolle des Promotors des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenasegens (GPD3-Gens) steht, und deren Fähigkeit zur Synthese von Sphingolipiden von der Zugabe von exogenem Phytosphingosin abhängt und die zu anhaltendem Wachstum über kompensatorische Phospolipide fähig sind, wobei Phytosphingosin zugegeben wird, und Bestimmung der IPC-Synthasehemmung durch die Testverbindung durch Bezugnahme auf eine etwaige Hemmung des Zellwachstums.
- Gentechnisch veränderte Zellen von einem lcb1/SLC1-1-Wirtsstamm, wobei das SLC-1-Gen unter der Kontrolle des Promotors des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenasegens (GPD3-Gens) steht, deren Fähigkeit zur Synthese von Sphingolipiden von der Zugabe von exogenem Phytosphingosin abhängt und die zu anhaltendem Wachstum über kompensatorische Phospolipide fähig sind.
- Zellen nach Anspruch 2 aus S. cerevisiae.
- Verwendung eines Screeningassays nach Anspruch 1 zur Identifizierung eines selektiven IPC-Synthaseinhibitors.
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