JP2003535597A - 薬剤スクリーニングにおけるトランスフェラーゼ酵素活性検出のためのアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、シンチレーション近接アッセイ方法論を用いて、細菌中のペプチドグリカン生合成に関与する、トランスロカーゼ酵素および／またはトランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイするための方法を提供する。該方法は、潜在的な抗菌薬剤のスループットスクリーニングに適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、細菌中のペプチドグリカン生合成に関与する酵素をアッセイするた
めの方法に関する。

【０００２】 ペプチドグリカンは、細胞壁に形状および強度を与える、細菌細胞壁の主要な
構成要素である。ペプチドグリカンは、細菌に特有であり、そしてグラム陽性お
よびグラム陰性両方のすべての細菌で見られる。ペプチドグリカンは、短いペプ
チド架橋を通じて架橋結合（cross-link）される、グリカン鎖のポリマーである
。これは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ−アセチルムラ
ミル酸（ＭｕｒＮＡｃ）のβ１−４連結残基を交互にすることからなる。ペンタ
ペプチド鎖はＭｕｒＮＡｃに付き（ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド）、そしてこ
れらのペプチド鎖間で架橋結合が起こる。

【０００３】 ペプチドグリカンの生合成は、３つの段階に分割可能である：まず、細胞質で
の前駆体の合成、第二に、脂質キャリアー分子への前駆体の転送、そして第三に
、細胞壁内への前駆体の挿入および存在するペプチドグリカンへのカップリング
である。

【０００４】 細胞質で合成される前駆体は、糖ヌクレオチド：ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グル
コサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタ
ペプチド（ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド）である。

【０００５】 細胞膜で起こる第二段階は、２つの酵素に触媒され、そして脂質キャリアーで
あるウンデカプレニルリン酸上での二糖単位の合成を伴う。脂質キャリアーはま
た、細菌細胞壁の他の構成要素の合成にも関与する。

【０００６】 第一の酵素は、ホスホリル−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドの、ＵＤＰ
−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドからウンデカプレノールリン酸への転送を触媒
し、同時にＵＭＰを放出する。この酵素は、ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペ
ンタペプチドトランスロカーゼ（以後、本明細書において、「トランスロカーゼ
」と称する）と称され、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で
は遺伝子ｍｒａＹの産物である。産物、ウンデカプレノール−ピロリン酸−Ｎ−
アセチルムラミルペンタペプチド（脂質−Ｐ−Ｐ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチ
ド）または脂質Ｉまたは脂質連結前駆体Ｉは、第二の酵素の基質である。

【０００７】 Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
からＮ−アセチルグルコサミンを転送し（同時にＵＤＰを放出して）、ウンデカ
プレノール−ピロホスホリル−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド−Ｎ−アセ
チルグルコサミンまたは脂質ＩＩまたは脂質連結前駆体ＩＩを形成する。この酵
素はまた、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｎ−アセチルムラミル（ペンタ
ペプチド）−Ｐ−Ｐ−ウンデカプレノール−Ｎ−アセチルグルコサミントランス
フェラーゼ（以後、本明細書において、「トランスフェラーゼ」と称する）とも
称される。この酵素は、大腸菌では遺伝子ｍｕｒＧの産物である。

【０００８】 トランスロカーゼ酵素およびトランスフェラーゼ酵素は、細菌生存力に必須で
ある（それぞれ、Ｄ．Ｓ． ＢｏｙｌｅおよびＷ．Ｄ． Ｄｏｎａｃｈｉｅ，
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９８）， １８０， ６４２９−６４３２
、並びにＤ． Ｍｅｎｇｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘ， Ｌ． Ｔｅｘｉｅｒ， Ｍ
． ＲｏｕｓｓｅａｕｅおよびＹ． Ｖａｎ Ｈｅｉｊｅｒｎｏｏｔ， Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９１）， １７３， ４６２５−４６３６を参照
されたい）。

【０００９】 第三段階では、細胞膜（cytoplasmic membrane）の外側で、グリカンの重合が
起こる。二糖−ペンタペプチド単位は、ペプチドグリカントランスグリコシラー
ゼ（ペプチドグリカンポリメラーゼとも称される）（以後、本明細書において、
「トランスグリコシラーゼ」と称する）によって、脂質キャリアーから、存在す
る二糖単位またはポリマーに転送される。ペプチド架橋の連結（joining)は、ペ
プチドグリカントランスペプチダーゼ（以後、本明細書において、「トランスペ
プチダーゼ」と称する）によって、触媒される。必須の両酵素活性は、同一分子
、ペニシリン結合タンパク質（またはＰＢＰ）（大腸菌のＰＢＰ１ａまたは１ｂ
等のような）中にある。これらは、大腸菌では、それぞれ、ｐｏｎＡ遺伝子およ
びｐｏｎＢ遺伝子の産物である。

【００１０】 細菌細胞にはいくつかのＰＢＰがあり、そしてこれらは、２つの種類、低分子
量（ＬＭＭ）ＰＢＰおよび高分子量（ＨＭＭ）ＰＢＰに分けることが可能である
。ＨＭＭ ＰＢＰは、トランスペプチダーゼ活性およびトランスグリコシラーゼ
活性両方を有する、二機能酵素である。これらのうち、大腸菌のＰＢＰ２および
ＰＢＰ３、並びにＰＢＰ１ＡまたはＰＢＰ１Ｂいずれかは、細胞生存力に必須で
あることが示されている。ＬＭＭ ＰＢＰは細胞増殖に重要であるが、必須では
ないようである（例えば大腸菌のＰＢＰ４、５、６は、欠失させると増殖不全を
生じる可能性があるが、細胞は生き残る。Ｓ．Ａ． Ｄｅｎｏｍｅ， Ｐ．Ｋ． Ｅｌｆ， Ｔ．Ａ． Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ｅ． Ｎｅｌｓｏｎおよび
Ｋ．Ｄ． Ｙｏｕｎｇ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９９）， １８
１（１３）， ３９８１−３９９３を参照されたい）。

【００１１】 脂質前駆体から存在するペプチドグリカン鎖への二糖−ペンタペプチド単位の
転送に際して、脂質は、ウンデカプレノールピロリン酸の分子として遊離する。
これは、ウンデカプレノールリン酸を生成するのに、ウンデカプレノールピロホ
スホリラーゼまたはＣ５５−イソプレニルピロホスホリラーゼ（以後、本明細書
において、「脂質ピロホスホリラーゼ」と称する）とも称される、バシトラシン
感受性ウンデカプレニルピロホスホリラーゼによって切断されなければならず、
ウンデカプレノールリン酸はその後、第二段階で、周期に再進入可能である。

【００１２】 トランスロカーゼおよびトランスフェラーゼ（それぞれ、ｍｒａＹおよびｍｕ
ｒＧ遺伝子産物）はどちらも、スループットスクリーニングに受け入れやすい適
切なアッセイが欠けているため活用されてきていない薬剤発見のための、申し分
のない標的に相当する。

【００１３】 トランスロカーゼおよびトランスフェラーゼ反応両方において、糖分子はヌク
レオチド連結前駆体から脂質基質に転送される。トランスロカーゼおよびトラン
スフェラーゼ両方のための慣用的な酵素アッセイは、放射標識糖前駆体を用い、
そして脂質産物への放射標識の取り込みを監視することを伴う。脂質産物は、ペ
ーパークロマトグラフィーによって、またはブタノール：６Ｍ酢酸ピリジニウム
、ｐＨ４．１（２：１ ｖ／ｖ）中での産物の抽出によって、監視する。ペーパ
ークロマトグラムでは、両方の脂質産物、脂質Ｉおよび脂質ＩＩは、Ｒｆ 約０
．９で移動する。

【００１４】 トランスロカーゼ活性のみを監視する別の既知のアッセイは、基質として、蛍
光剤であるダンシル化ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドを用いる。この蛍
光基質は膜中の脂質キャリアーに転送されると、水性から疎水性環境への、環境
の変化を経験する。これが発光スペクトル（５２５ｎｍから４９５ｎｍ）におい
て、青いシフトを引き起こし、このシフトをアッセイ中に監視する。蛍光強度の
変化は、２から３倍でしかなく、そしてしたがって、これはそれほど高感度のア
ッセイではない。

【００１５】 トランスフェラーゼ酵素のためのスループット放射能アッセイが、ＷＯ ９９
／３８９５８に記載されているが、これは、人工的な基質の化学合成を必要とす
る。

【００１６】 スループットスクリーニングに適した、トランスロカーゼ酵素および／または
トランスフェラーゼ酵素の活性をアッセイするための方法を発展させることが望
ましいであろう。

【００１７】 したがって、本発明にしたがい、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｎ−ア
セチルムラミル（ペンタペプチド）−Ｐ−Ｐ−ウンデカプレノール−Ｎ−アセチ
ルグルコサミントランスフェラーゼ酵素活性、および、所望によってまた、ホス
ホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチドトランスロカーゼ酵素活性をアッセ
イするための方法であって： （１） ウンデカプレノール−ピロリン酸−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチ
ド（脂質Ｉ）、放射標識ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮ
Ａｃ）、二価金属イオン供給源およびトランスフェラーゼ酵素供給源を含む反応
混合物を、ウンデカプレノール−ピロホスホリル−Ｎ−アセチルムラミルペンタ
ペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミン（脂質ＩＩ）の合成が起こるのに適した条
件下でインキュベーションし； （２） 工程（１）の反応を停止し； （３） 工程（２）の反応混合物に蛍光剤を添加し；そして （４） 蛍光剤によって放出される光エネルギーを測定する 工程を含む方法を提供する。

【００１８】 本明細書の文脈において、略語「ＵＤＰ」は、ウリジン（５’）−二リン酸を
指すと理解しなければならない。 本発明にしたがった方法は、非常に好適には、９６ウェルマイクロタイタープ
レートを用いて行い、それによって、酵素活性を測定する、迅速で、単純な、そ
して再現可能な方法を可能にする。

【００１９】 トランスフェラーゼ酵素およびトランスロカーゼ酵素両方をアッセイすること
を意図する場合には、工程（１）において、反応混合物中に、ＵＤＰ−Ｎ−アセ
チルムラミルペンタペプチド（ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド）、ウン
デカプレニルリン酸供給源およびトランスロカーゼ酵素供給源を含むことによっ
て、ｉｎ ｓｉｔｕで脂質Ｉを形成する。

【００２０】 使用するＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドは、天然存在ペプチドグリカ
ンに通常存在するもののいずれであってもよく、そして好適には、細菌から精製
するか、または例えばＴ． ｄｅｎ Ｂｌａａｕｗｅｎ， Ｍ． Ａａｒｓｍａ
ｎおよびＮ． Ｎａｎｎｉｎｇａ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９０
）， １７２， ６３−７０に記載されるものに類似の方法によって、細菌由来
の前駆体から酵素的に作成する。使用が好ましいＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタ
ペプチドは、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）由来のＵ
ＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ−ジアミノピメ
リン酸−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンである。使用するＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−
ペンタペプチドの濃度は、典型的には、マイクロタイタープレートのウェルあた
り、５μＭから３００μＭ、好ましくは５μＭから２００μＭ、より好ましくは
５μＭから１００μＭ、そして特に５μＭから５０μＭの範囲、特に１５μＭで
あろう。

【００２１】 放射標識ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンとして、好ましくは、マイクロタ
イタープレートのウェルあたり、０．２５から２５μＭの濃度、例えばウェルあ
たり０．１から０．５μＣｉ、好ましくはマイクロタイタープレートのウェルあ
たり０．２μＣｉの放射能を持つ、２．５μＭの濃度で、トリチウム化ＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−［³Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、ＮＥＮ−Ｄｕｐｏ
ｎｔより商業的に入手可能である）を用いるのが好適である。

【００２２】 使用する二価金属イオンは、好ましくは、マグネシウムイオンである。マグネ
シウムイオンの適切な供給源は、好ましくは１０から３０ｍＭ、好ましくは１０
から２５ｍＭの範囲の濃度の、塩化マグネシウムである。

【００２３】 大腸菌の膜が好適に使用可能であり、そして実際、ウンデカプレニルリン酸、
トランスロカーゼ酵素およびトランスフェラーゼ酵素の供給源として好ましい。
使用する膜の量は、典型的には、マイクロタイタープレートのウェルあたり、１
から２０μｇ、特に４から６μｇタンパク質の範囲であろう。膜は、ＷＯ ９９
／６０１５５の実施例１に記載されるとおりに調製可能である。本発明にしたが
った方法は脂質ＩＩに取り込まれた放射能の量を監視するため、膜調製物を使用
する際は、存在するトランスグリコシラーゼ酵素が無効にされており、したがっ
て、トランスグリコシラーゼ酵素の活性によって、脂質ＩＩ由来の放射標識二糖
が、やはり膜調製物に存在するペプチドグリカンに転送されないことを確実にす
るのが重要である。これは、いくつかの方法で、例えば工程（１）の反応混合物
中にモエノマイシンなどのトランスグリコシラーゼ酵素阻害剤を含むことによる
か、（例えばＷＯ ９６／１６０８２に記載されるように）トランスグリコシラ
ーゼ酵素が欠損している大腸菌突然変異体由来の膜を使用することによるか、ま
たはＹ． ｖａｎ Ｈｅｉｊｅｎｏｏｒｔら， （１９９２）， Ｊ． Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．， １７４， ３５４９−３５５７に記載されるように、大腸菌
細胞をまず、リゾチームで処理することを伴う方法により膜を調製することによ
って、達成可能である。

【００２４】 工程（１）において、例えばＨＥＰＥＳ−アンモニア、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（
ＨＥＰＥＳはＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンス
ルホン酸］）またはＴｒｉｓ［ヒドロキシメチル］アミノメタン塩酸（「Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ」）等の緩衝溶液（ｐＨ約７．５を有する）などの水性媒体を使用す
るのが好適かもしれない。ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌは、Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ．より商業的に入手可能である。

【００２５】 工程（１）の反応混合物は、２から９０分間、例えば５分間、酵素が触媒する
脂質ＩＩ合成が起こるのに適した条件下で、２０℃から３７℃の範囲の温度で維
持する。

【００２６】 本発明の方法を、トランスフェラーゼ酵素のアンタゴニストであり所望により
トランスロカーゼ酵素のアンタゴニストである、抗菌化合物を同定するスクリー
ニングとして使用するよう意図する場合には、工程（１）の反応混合物は、多様
な濃度の１以上の試験化合物をさらに含んでもよい。トランスロカーゼ酵素およ
びトランスフェラーゼ酵素は、細菌増殖に必須であり、そして細胞表面上に位置
するため、これらの酵素は、抗菌薬剤の開発の優れた標的に相当する。こうした
薬剤はいずれも、効果を生じるために細胞壁を通じて細菌生物内に進入する必要
がないという利点を有するであろうし、そしてしたがって、細胞壁浸透性並びに
細胞壁浸透性の変化および流出によって引き起こされる薬剤耐性という通例の困
難が回避されるであろう。

【００２７】 反応は、工程（２）で、適切な手段いずれかによって、例えば失活剤を添加す
ることによって、停止させる（または失活させる）。トランスフェラーゼ酵素の
みをアッセイする場合、好適には、さらなる反応は、過剰の非標識ＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミンを添加することによって停止させる。あるいは、トランス
フェラーゼ酵素およびトランスロカーゼ酵素を共にアッセイする場合、さらなる
反応は、適切な量の二価金属イオンキレーター化合物、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ．より商業的に入手可能なエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）を添加することによって、停止してもよい。キレーター化合物の濃
度は、もちろん、使用する特定のキレーター化合物に依存し、そしてすべての二
価金属イオンをキレートするのに十分でなければならない；ＥＤＴＡの場合、濃
度は、典型的には、マイクロタイタープレートのウェルあたり、約１５ｍＭであ
ろう。

【００２８】 工程（３）において、使用する蛍光剤は、シンチレーション近接アッセイで日
常的に使用するもののいずれであってもよい。蛍光剤は、通常、ビーズ、例えば
すべて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．より商業的に入手可能な、レクチン被覆ビ
ーズ、抗マウス抗体被覆ケイ酸イットリウムビーズ、ポリリジン（例えばポリ（
Ｌ）リジン）被覆ケイ酸イットリウムビーズ、プロテインＡ被覆ケイ酸イットリ
ウムビーズ、抗マウス抗体被覆ＰＶＴ（ポリビニルトルエン）ビーズまたはコム
ギ胚芽凝集素被覆ＰＶＴビーズの中または上に、結びついているか（associated
）または支持されているであろう。選択するビーズは、細菌細胞壁に結合可能で
なければならない。

【００２９】 例えば米国特許第４，５６８，６４９号および欧州特許第１５４，７３４号に
記載されるように、蛍光剤を含浸させたレクチン被覆ビーズを用いるのが好まし
い。該ビーズ（「シンチレーション近接アッセイ」（またはＳＰＡ）ビーズとし
て知られる）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．より商業的に入手可能である。最
も好ましいのは、糖分子、特にＮ−アセチルグルコサミンに結合可能な、コムギ
胚芽凝集素被覆ＳＰＡビーズである。ＳＰＡビーズへのＮ−アセチルグルコサミ
ンの結合を通じて、工程（１）で形成された放射標識脂質ＩＩが蛍光剤に極近接
するようになり、該蛍光剤が放射エネルギーによって活性化されて、光エネルギ
ーの放出を生じると考えられ、続いて、工程（４）でこのエネルギーを測定する
。

【００３０】 好適には水性懸濁物の形で添加されるビーズ（蛍光剤を含む）は、少なくとも
１０分間、好ましくは３時間以上（例えば一晩）、工程（２）の反応混合物と接
触させてから、プレートを工程（４）で、例えば「Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｉｌ
ｕｘ」カウンターで「カウントする」する。

【００３１】 本発明はまた、ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチドトランスロカ
ーゼ酵素活性をアッセイするための方法であって： （Ａ） ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド（ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ
−ペンタペプチド）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドの放射標識
誘導体、二価金属イオン供給源、ウンデカプレニルリン酸供給源、およびトラン
スロカーゼ酵素供給源を含む反応混合物を、放射標識誘導体およびウンデカプレ
ニルリン酸間のカップリング産物の形成に適した条件下でインキュベーションし
； （Ｂ） 工程（Ａ）の反応を停止させ； （Ｃ） 工程（Ｂ）の反応混合物に蛍光剤を添加し；そして （Ｄ） 蛍光剤によって放出される光エネルギーを測定する 工程を含む方法も提供する。

【００３２】 工程（Ａ）において、使用するＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドは、天
然存在ペプチドグリカンに通常存在するもののいずれであってもよく、そして好
適には、細菌から精製するか、または例えばＴ． ｄｅｎ Ｂｌａａｕｗｅｎ， Ｍ． ＡａｒｓｍａｎおよびＮ． Ｎａｎｎｉｎｇａ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，（１９９０）， １７２， ６３−７０に記載されるものに類似の方
法によって、細菌由来の前駆体から酵素的に作成する。使用が好ましいＵＤＰ−
ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドは、バチルス・セレウス由来のＵＤＰ−ＭｕｒＮ
Ａｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ−ジアミノピメリン酸−Ｄ−ア
ラニン−Ｄ−アラニンである。

【００３３】 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドの放射標識誘導体は、好ましく
は、トリチウム［³Ｈ］、³³Ｐまたは¹²⁵Ｉを含む。こうした化合物は、例えばＵ
ＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ−ジアミノピメ
リン酸−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンのメソ−ＤＡＰ残基のε−アミノ基に³Ｈ
−プロピオネートを取り込むことによって、合成可能である。

【００３４】 ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドおよび放射標識誘導体の総量は、典型
的には、マイクロタイタープレートのウェルあたり、４μＭから１５μＭ、好ま
しくは４μＭから１０μＭ、例えば４．５μＭから５．５μＭの範囲であろう。
使用する放射標識誘導体の量は、放射能が、例えばウェルあたり０．１μＣｉか
ら０．６μＣｉ、好ましくはウェルあたり０．１μＣｉから０．４μＣｉ、特に
ウェルあたり０．２μＣｉと測定されるようなものである。

【００３５】 使用する二価金属イオンは、上述のものと同じである。 大腸菌の膜が好適に使用可能であり、そして実際、ウンデカプレニルリン酸お
よびトランスロカーゼ酵素の供給源として好ましい。使用する膜の量は、典型的
には、マイクロタイタープレートのウェルあたり、５から２５μｇ、好ましくは
１０から１５μｇタンパク質の範囲であろう。膜は、ＷＯ ９９／６０１５５の
実施例１に記載されるとおりに調製可能である。

【００３６】 工程（Ａ）においては、緩衝溶液、例えばＨＥＰＥＳ−アンモニア、ＨＥＰＥ
Ｓ−ＫＯＨ（ＨＥＰＥＳはＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［
２−エタンスルホン酸］）またはＴｒｉｓ［ヒドロキシメチル］アミノメタン塩
酸（「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ」）の、約７．５のｐＨを有する緩衝溶液などの水性媒
体を使用するのが好適である可能性がある。ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ
は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ．より商業的に入手可能であ
る。

【００３７】 工程（Ａ）の反応混合物は、２から１５分間、例えば８分間、酵素が触媒する
脂質Ｉ合成が起こるのに適した条件下で、２０℃から３７℃の範囲の温度で維持
する。

【００３８】 好ましい側面において、工程（Ａ）の反応混合物は、本発明の方法の工程（Ｄ
）を行う際に観察されるシグナルを改善するのに適した量の、界面活性剤（例え
ば０．１％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）および塩化カリウムをさらに含
むであろう。

【００３９】 本発明にしたがった方法を、トランスロカーゼ酵素のアンタゴニストである、
抗菌化合物を同定するスクリーニングとして使用するよう意図する場合、工程（
Ａ）の反応混合物は、多様な濃度の１以上の試験化合物をさらに含むことが可能
である。

【００４０】 反応は、工程（Ｂ）で、適切な手段いずれかによって、例えばクエンチング剤
（quenching agent）として、適切な量の二価金属イオンキレーター化合物、例
えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ．より商業的に入手可能なエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することによって、停止させる（また
はクエンチさせる）。キレーター化合物の濃度は、もちろん、使用する特定のキ
レーター化合物に依存し、そしてすべての二価金属イオンをキレートするのに十
分でなければならない；ＥＤＴＡの場合、濃度は、典型的には、マイクロタイタ
ープレートのウェルあたり、約３５ｍＭであろう。

【００４１】 工程（Ｃ）において、使用する蛍光剤は、シンチレーション近接アッセイで日
常的に使用するもののいずれであってもよい。蛍光剤は、通常、ビーズ、例えば
すべて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．より商業的に入手可能な、レクチン被覆ビ
ーズ、抗マウス抗体被覆ケイ酸イットリウムビーズ、ポリリジン（例えばポリ（
Ｌ）リジン）被覆ケイ酸イットリウムビーズ、プロテインＡ被覆ケイ酸イットリ
ウムビーズ、抗マウス抗体被覆ＰＶＴ（ポリビニルトルエン）ビーズまたはコム
ギ胚芽凝集素被覆ＰＶＴビーズの中または上に、結びついているかまたは支持さ
れているであろう。選択するビーズは、細菌細胞壁に結合可能でなければならな
い。

【００４２】 例えば米国特許第４，５６８，６４９号および欧州特許第１５４，７３４号に
記載されるように、蛍光剤を含浸させたレクチン被覆ビーズを用いるのが好まし
い。該ビーズ（「シンチレーション近接アッセイ」（またはＳＰＡ）ビーズとし
て知られる）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．より商業的に入手可能である。最
も好ましいのは、糖分子（特にＮ−アセチルグルコサミン）に結合可能な、コム
ギ胚芽凝集素被覆ＳＰＡビーズである。細菌膜を本発明の方法で用いる場合には
、この膜に付いた細胞壁断片に存在するＮ−アセチルグルコサミンとの結合を通
じて、カップリングした産物がレクチン被覆ビーズ上に捕捉されると考えられる
。カップリング産物の特異的捕捉のため、放射標識が蛍光剤に極めて近接するよ
うになり、該蛍光剤は放射エネルギーによって活性化され、光エネルギーの放出
を生じ、続いて、工程（Ｄ）でこのエネルギーを測定する。

【００４３】 ビーズ（蛍光剤を含む）は好適には水性懸濁物の形で添加され、少なくとも１
０分間、好ましくは３時間以上（例えば一晩）、工程（Ｂ）の反応混合物と接触
させた後、プレートを工程（Ｄ）で、例えば「Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｉｌｕｘ
」カウンターで「カウントする」。

【００４４】 以下の実例を示す実施例に言及することによって、本発明をさらに説明する。

【００４５】

【実施例】

実施例１ （ｉ）マイクロタイタープレートのウェルを、個々に、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
−アンモニア（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタン
スルホン酸］）（ｐＨ７．５）および１０ｍＭ塩化マグネシウムの水性緩衝溶液
、１５μＭ ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ
−ジアミノピメリン酸−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニン、２．５μＭトリチウム化
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ウェルあたり０．２μＣｉ）、３μＭモエ
ノマイシン、大腸菌ＡＭＡ１００４細胞膜４μｇ、並びに多様な濃度の試験化合
物（例えばツニカマイシン、バンコマイシン、ナイシン）の４％ジメチルスルホ
キシド中の溶液を含む、総体積２５μｌの反応混合物で満たした。ツニカマイシ
ンは、トランスロカーゼ酵素の既知のアンタゴニストであり、ナイシンはトラン
スフェラーゼ酵素の既知のアンタゴニストであり、そしてバンコマイシンはトラ
ンスロカーゼ酵素およびトランスフェラーゼ酵素両方の既知のアンタゴニストで
ある（モエノマイシンは、トランスグリコシラーゼ酵素の既知のアンタゴニスト
であり、そして放射標識がペプチドグリカンに取り込まれるのを防ぐため添加す
る）。

【００４６】 マイクロタイタープレートの４ウェルを対照として用いた：２ウェルはＵＤＰ
−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドをまったく含まず（０％反応対照）、そ
してさらなる２ウェルは試験化合物をまったく含まなかった（１００％反応対照
）。

【００４７】 スクリーニングの目的が、トランスフェラーゼ阻害剤またはトランスロカーゼ
阻害剤の影響を研究することである場合、工程（ｉ）の基質と共に、試験化合物
を添加する。

【００４８】 大腸菌膜は、特許出願ＷＯ ９９／６０１５５に記載されるように調製した。 マイクロタイタープレートは、３７℃で５分間インキュベーションし、そして
その後、５μｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加し、最終ＥＤＴＡ
濃度を１５ｍＭにした。

【００４９】 （ｉｉ）ＥＤＴＡ添加後に、ＨＥＰＥＳ−アンモニアｐＨ７．５の溶液中に５
００μｇビーズを含む、１７０μｌのコムギ胚芽凝集素被覆シンチレーション近
接アッセイビーズの水性懸濁物を、ＨＥＰＥＳ−アンモニアの最終濃度が５０ｍ
Ｍになるように、各ウェルに添加した。

【００５０】 プレートは、「Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ」カウンター中でカウント
する前に、室温で３時間／一晩放置した。 図１は、ツニカマイシン濃度に対するトランスロカーゼ（そしてしたがって脂
質ＩＩ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）
を示すグラフである。

【００５１】 図２は、ナイシン濃度に対するトランスフェラーゼ（そしてしたがって脂質Ｉ
Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を示
すグラフである。

【００５２】 図３は、バンコマイシン濃度に対するトランスロカーゼおよびトランスフェラ
ーゼ（そしてしたがって脂質ＩＩ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読
み取り値を引いた後の値）を示すグラフである。

【００５３】 実施例２ 実施例１に記載した方法は、または、Ｓ．Ｙ． Ｙｏｕｓｉｆ， Ｊ．Ｋ．
Ｂｒｏｏｍｅ−ＳｍｉｔｈおよびＢ．Ｇ． Ｓｐｒａｔｔ， Ｊ． Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９８５）， １３１， ２８３９−２８４５に記載
されるように、ＰＢＰ１ｂをコードする遺伝子ｐｏｎＢが不活性化されている大
腸菌突然変異体、ＡＭＡ１００４ΔｐｏｎＢ：：Ｓｐｃ^Rの膜を用いて行うこと
が可能である。これらの膜は、大腸菌における主要なトランスグリコシラーゼで
あるＰＢＰ１ｂ活性を欠き、そしてしたがって、脂質ＩＩに取り込まれた放射標
識は、ペプチドグリカンに転送されない。したがって、反応混合物にモエノマイ
シンを添加する必要がない。

【００５４】 図４は、ナイシン濃度に対するトランスフェラーゼ（そしてしたがって脂質Ｉ
Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を示
すグラフである。

【００５５】 図５は、バンコマイシン濃度に対するトランスロカーゼおよびトランスフェラ
ーゼ（そしてしたがって脂質ＩＩ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読
み取り値を引いた後の値）を示すグラフである。

【００５６】 実施例３ （ｉ）マイクロタイタープレートのウェルを、個々に、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
−アンモニア（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタン
スルホン酸］）（ｐＨ７．５）および１０ｍＭ塩化マグネシウムの水性緩衝溶液
、１５μＭ ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ
−ジアミノピメリン酸−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニン、２．５μＭトリチウム化
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ウェルあたり０．２μＣｉ）、以下に記載
するように調製した大腸菌ＡＭＡ１００４細胞膜６μｇ、並びに、多様な濃度の
試験化合物（例えばツニカマイシン、バンコマイシン）の４％ジメチルスルホキ
シド中溶液を含む、総体積２５μｌの反応混合物で満たした。ツニカマイシンは
、トランスロカーゼ酵素の既知のアンタゴニストであり、そしてバンコマイシン
はトランスロカーゼ酵素およびトランスフェラーゼ酵素両方の既知のアンタゴニ
ストである。

【００５７】 マイクロタイタープレートの４ウェルを対照として用いた：２ウェルはＵＤＰ
−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドをまったく含まず（０％反応対照）、そ
してさらなる２ウェルは試験化合物をまったく含まなかった（１００％反応対照
）。

【００５８】 スクリーニングの目的が、トランスフェラーゼ阻害剤またはトランスロカーゼ
阻害剤の影響を研究することである場合には、工程（ｉ）の基質と共に、試験化
合物を添加する。

【００５９】 大腸菌膜は、以下のように調製した。 ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地）寒天プレートから、４から５の細菌
コロニーを、５ｍｌ ＬＢ−ブロスに接種し、そして日中（６−８時間）、３７
℃で増殖させた。夕方、この培養０．５ｍｌを用いて、２ｌフラスコ中のＬＢ−
ブロス５００ｍｌに接種した。震蘯装置上、３０℃で一晩、フラスコをインキュ
ベーションした；典型的には２．０−２．５のＡ６００に到達した。翌朝早く、
この培養を用いて、出発Ａ６００が０．４−０．６であるように、６ｌのＬＢ−
ブロスに接種した（２ｌフラスコあたり、５００ｍｌのＬＢ−ブロスを使用）。
培養は、勢いよく震蘯／通気しながら、３７℃で２時間増殖させた；到達するＡ
６００は、１．４および２．０の間であった。この時点で、細菌を氷上で冷却し
、そして５０００ｘｇ、１５分間の遠心分離によってペレットにした。細胞ペレ
ットを５００ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．
１ｍＭ ＭｇＣｌ₂）で洗浄した。これらを、（細胞湿重量の７．５倍の体積の
）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の冷２０％スクロースに再懸濁し
た。濃度２００μｇ／ｍｌまでリゾチームを添加し、そして細胞を氷上で１０分
間、穏やかに攪拌した。１時間かけて、最終濃度０．０２ＭまでＥＤＴＡ溶液を
添加した。細胞を１２，０００ｘｇで２０分間回転し、得られたペレットを、１
ｍＭ ＭｇＣｌ₂並びに最終濃度各２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼおよびＤＮアー
ゼを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５に、再懸濁した。懸濁物を、
室温で１時間、穏やかに攪拌した。細胞溶解物を、３，５００ｘｇで４５分間回
転させた。上清を収集し、緩衝液Ａで１００ｍｌに希釈し、そして１５０，００
０ｘｇで４５分間、超遠心した。この回転のペレットは、１００ｍｌの緩衝液Ａ
に再懸濁し、そして１５０，０００ｘｇで３０分間、再度遠心分離することによ
って、洗浄した。このペレットを、緩衝液Ａの最少体積（６ｌ培養の場合、５−
１０ｍｌ）に穏やかに再懸濁し、そしてアリコートにして−７０℃で凍結し保管
した。これを膜調製物と称し、そしてトランスロカーゼ酵素、トランスフェラー
ゼ酵素、およびウンデカプレニルリン酸の供給源として、アッセイに用いた。

【００６０】 マイクロタイタープレートは、３７℃で３０分間インキュベーションし、そし
てその後、５μｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加して、最終ＥＤ
ＴＡ濃度１５ｍＭを生じた。

【００６１】 （ｉｉ）ＥＤＴＡ添加後、ＨＥＰＥＳ−アンモニア溶液（ｐＨ７．５）に５０
０μｇビーズを含むコムギ胚芽凝集素被覆シンチレーション近接アッセイビーズ
の水性懸濁物の１７０μｌを、ＨＥＰＥＳ−アンモニアの最終濃度が５０ｍＭに
なるように、各ウェルに添加した。

【００６２】 プレートは、「Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ」カウンター中でカウント
する前に、室温で３時間／一晩放置した。 以下の表１は、トランスロカーゼ酵素およびトランスフェラーゼ酵素に対する
ツニカマイシンおよびバンコマイシンの阻害効果（対応する０％反応読み取り値
を引いた後の値）を列挙する。

【００６３】

【表１】

【００６４】 実施例４ （ｉ）マイクロタイタープレートのウェルを、個々に、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
−アンモニア（ｐＨ７．５）（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’
−［２−エタンスルホン酸］）および１０ｍＭ塩化マグネシウムの水性緩衝溶液
、１５μＭ ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ
−ジアミノピメリン酸−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニン、並びにＡＭＡ１００４Δ
ｐｏｎＢ：：Ｓｐｃ^R（Ｓ．Ｙ． Ｙｏｕｓｉｆ， Ｊ．Ｋ． Ｂｒｏｏｍｅ−
ＳｍｉｔｈおよびＢ．Ｇ． Ｓｐｒａｔｔ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，（１９８５）， １３１， ２８３９−２８４５に記載されるように、
ＰＢＰ１ｂをコードする遺伝子ｐｏｎＢが不活性化されている大腸菌突然変異体
である）の細胞膜４μｇを含む、総体積１５μｌの反応混合物で満たした。プレ
ートを３７℃で２０分間インキュベーションした。

【００６５】 （ｉｉ）その後、ツニカマイシンを最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加し、その
後、ジメチルスルホキシド中の多様な濃度の試験化合物（例えばバンコマイシン
またはナイシン）を添加した。ナイシンおよびバンコマイシンは、トランスフェ
ラーゼ酵素の既知のアンタゴニストである。

【００６６】 （ｉｉｉ）その後、反応ウェルに、５μｌ体積のトランスフェラーゼ基質：２
．５μＭトリチウム化ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ウェルあたり０．５
μＣｉ）を添加した。マイクロタイタープレートを、３７℃で５分間インキュベ
ーションした。

【００６７】 （ｉｖ）放射標識を希釈することによって、すなわち２００μＭ非標識ＵＤＰ
−ＧｌｃＮＡｃを２５μｌ添加することによって、反応を終結させた。 （ｖ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを添加した後、ＨＥＰＥＳ−アンモニアｐＨ７．
５の溶液中に５００μｇビーズを含むコムギ胚芽凝集素被覆シンチレーション近
接アッセイビーズの水性懸濁物１５０μｌを、ＨＥＰＥＳ−アンモニアの最終濃
度が５０ｍＭになるように、各ウェルに添加した。プレートは、「Ｍｉｃｒｏｂ
ｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ」カウンター中でカウントする前に、室温で３時間放置し
た。

【００６８】 マイクロタイタープレートの４ウェルを対照として用いた：２ウェルはＵＤＰ
−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドをまったく含まず（０％反応対照）、そ
してさらなる２ウェルは試験化合物をまったく含まなかった（１００％反応対照
）。

【００６９】 以下の表２は、トランスフェラーゼ酵素に対するナイシンおよびバンコマイシ
ンの阻害効果（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を列挙する。

【００７０】

【表２】

【００７１】 実施例５ （ｉ）マイクロタイタープレートのウェルを、個々に、１００ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ−アンモニア水性緩衝溶液（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ塩化マグネシウム、５０
ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ｗ／ｖ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、４μＭ ＵＤＰ−Ｍ
ｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドに加えてＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−［³Ｈ］−ペンタ
ペプチド（ウェルあたり０．２μＣｉ）、大腸菌突然変異体であるＡＭＡ１００
４ΔｐｏｎＢ：：Ｓｐｃ^R（Ｓ．Ｙ． Ｙｏｕｓｉｆ， Ｊ．Ｋ． Ｂｒｏｏｍ
ｅ−ＳｍｉｔｈおよびＢ．Ｇ． Ｓｐｒａｔｔ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，（１９８５）， １３１， ２８３９−２８４５に記載されるよう
に、ＰＢＰ１ｂをコードする遺伝子ｐｏｎＢが不活性化されている突然変異体）
の細胞膜１２．５μｇ、および多様な濃度の試験化合物（例えばツニカマイシン
、バンコマイシン）溶液を含む、総体積２５μｌの反応混合物で満たした。ツニ
カマイシンおよびバンコマイシンは、トランスロカーゼ酵素の既知のアンタゴニ
ストである。

【００７２】 大腸菌膜は、特許出願ＷＯ ９９／６０１５５に記載されるように調製した。 ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−［³Ｈ］−ペンタペプチドは、以下のように合成した
。

【００７３】 ２０ナノモルのＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド（Ｂ．セレウスの熱湯
抽出物より精製）を、２０μｌの１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
５）中で、１ｍＣｉの³Ｈ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルプロピオネート（比
活性−９１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と、４℃で２０時間インキュベーションした。８０
μｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて、反応混合物を
総体積１００μｌに希釈し、そして同一緩衝液中で平衡化した５００μｌ ＤＥ
ＡＥセファロースカラム上に装填した。カラムを６から７ｍｌの０．１Ｍ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄して、未結合未反応³Ｈ−ＮＨＳ−プロ
ピオネートを除去した。０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）を用い
て、結合産物、ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−ｍ−ＤＡ
Ｐ（Ｎε−³Ｈ−プロピオネート）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａを溶出した。各０
．５ｍｌの分画を収集し、そして酵素アッセイの基質として用いることによって
、活性をモニターした。活性分画をプールし、そして比活性を決定した。

【００７４】 マイクロタイタープレートの４ウェルを対照として用いた：２ウェルはゼロ時
点で停止溶液を含み（０％反応対照）、そしてさらなる２ウェルは試験化合物を
まったく含まなかった（１００％反応対照）。

【００７５】 （ｉｉ）マイクロタイタープレートは、２２℃で８分間インキュベーションし
た。 （ｉｉｉ）最終濃度３５ｍＭまでＥＤＴＡ（５μｌ）を添加し、そしてその後
、ＨＥＰＥＳアンモニア溶液（ｐＨ７．５）中に２０００μｇビーズを含むコム
ギ胚芽凝集素被覆シンチレーション近接アッセイビーズの水性懸濁物２７０μｌ
とアジ化ナトリウムとを、それぞれ１００ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．０２％ｗ
／ｖアジ化ナトリウムの最終濃度に達するまで、各ウェルに添加した。

【００７６】 プレートは、「Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ」カウンター中でカウント
する前に、室温で１５時間放置した。 図６は、ツニカマイシン濃度に対するトランスロカーゼ（そしてしたがって脂
質Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を
示すグラフである。

【００７７】 図７は、バンコマイシン濃度に対するトランスロカーゼ（そしてしたがって脂
質Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を
示すグラフである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ツニカマイシン濃度に対するトランスロカーゼ（そしてしたがって脂
質ＩＩ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）
を示すグラフである。

【図２】 図２は、ナイシン濃度に対するトランスフェラーゼ（そしてしたがって脂質Ｉ
Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を示
すグラフである。

【図３】 図３は、バンコマイシン濃度に対するトランスロカーゼおよびトランスフェラ
ーゼ（そしてしたがって脂質ＩＩ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読
み取り値を引いた後の値）を示すグラフである。

【図４】 図４は、ナイシン濃度に対するトランスフェラーゼ（そしてしたがって脂質Ｉ
Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を示
すグラフである。

【図５】 図５は、バンコマイシン濃度に対するトランスロカーゼおよびトランスフェラ
ーゼ（そしてしたがって脂質ＩＩ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読
み取り値を引いた後の値）を示すグラフである。

【図６】 図６は、ツニカマイシン濃度に対するトランスロカーゼ（そしてしたがって脂
質Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を
示すグラフである。

【図７】 図７は、バンコマイシン濃度に対するトランスロカーゼ（そしてしたがって脂
質Ｉ合成）の阻害パーセント（対応する０％反応読み取り値を引いた後の値）を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソラプレ，スレシュ インド国バンガロー 56003，マレスマラ ム，ティー・チョウダイア・ロード ナン バー 277，アストラゼネカ・アール・ア ンド・ディー・バンガロー Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ26 QR06 QR43 QR45 QR48 QR58 QR66 QS26 QS36 QX02 QX07

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｎ−アセチルムラミ
   ル（ペンタペプチド）−Ｐ−Ｐ−ウンデカプレノール−Ｎ−アセチルグルコサミ
   ントランスフェラーゼ酵素活性、および、所望によってまた、ホスホ−Ｎ−アセ
   チルムラミル−ペンタペプチドトランスロカーゼ酵素活性をアッセイするための
   方法であって、下記の工程を含む方法： （１） ウンデカプレノール−ピロリン酸−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチ
   ド（脂質Ｉ）、放射標識ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮ
   Ａｃ）、二価金属イオン供給源およびトランスフェラーゼ酵素供給源を含む反応
   混合物を、ウンデカプレノール−ピロホスホリル−Ｎ−アセチルムラミルペンタ
   ペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミン（脂質ＩＩ）の合成が起こるのに適した条
   件下でインキュベーションし； （２） 工程（１）の反応を停止し； （３） 工程（２）の反応混合物に蛍光剤を添加し；そして （４） 蛍光剤によって放出される光エネルギーを測定する。
2. 【請求項２】 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドおよびウン
   デカプレニルリン酸供給源から、ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチ
   ドトランスロカーゼ酵素供給源の存在下で、脂質Ｉをｉｎ ｓｉｔｕで形成する
   、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチドが、ＵＤＰ
   −ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ−ジアミノピメリン
   酸−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンである、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 細菌細胞膜が、ウンデカプレニルリン酸、トランスロカー
   ゼ酵素およびトランスフェラーゼ酵素の１以上の供給源に相当し、そして工程（
   １）の反応混合物が、所望により、ペプチドグリカントランスグリコシラーゼ酵
   素阻害剤をさらに含む、請求項２または３記載の方法。
5. 【請求項５】 細菌細胞膜が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
   ｉ）由来である、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 ペプチドグリカントランスグリコシラーゼ酵素阻害剤が、
   モエノマイシンである、請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 細菌細胞膜を、ペプチドグリカントランスグリコシラーゼ
   酵素が欠損した突然変異体から得る、請求項４または請求項５記載の方法。
8. 【請求項８】 塩化マグネシウムを二価金属イオン供給源として用いる、
   請求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
9. 【請求項９】 工程（１）の反応混合物が、試験化合物をさらに含む、請
   求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
10. 【請求項１０】 試験化合物が、トランスロカーゼ酵素またはトランスフ
    ェラーゼ酵素のアンタゴニストである、請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 工程（２）において、過剰な非標識ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
    ルグルコサミンまたは二価金属イオンキレーター化合物を添加する、請求項１か
    ら１０のいずれか１つに記載の方法。
12. 【請求項１２】 蛍光剤が、レクチン被覆ビーズ、抗マウス抗体被覆ビー
    ズまたはポリリジン被覆ビーズの中または上に、結びついているまたは支持され
    ている、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。