DE69630775T2 - Elektrochemolumineszenz-test - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung eines auf Elektrochemolumineszenz basierenden Testes für den Nachweis und die quantitative Messung von β-Lactamen und β-Lactamasen, wobei der Test geeignet ist für die Diagnose und das Überwachen der Behandlung von bakteriellen Infektionen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Tests, die auf ECL basieren, sind im Stand der Technik wohl bekannt und finden zunehmende Anwendungen wegen ihrer Genauigkeit, der Leichtigkeit der Verwendung und der Abwesenheit radioaktiver Materialien.
  • Ein besonders nützliches ECL-System ist beschrieben in einem Artikel von Yang et al., Bio/Technology, 12, S. 193–194 (Febr. 1994). Siehe auch den Artikel von Massey, Biomedical Products, Oktober 1992, ebenso wie die US-Patente 5,235,808 und 5,310,687.
  • ECL-Vorgänge wurden für viele unterschiedliche Moleküle durch etliche unterschiedliche Mechanismen gezeigt. In Blackburn et al. (1991), Clin. Chem. 37/9, S. 1534–1539, verwendeten die Autoren die ECL-Reaktion von Ruthenium(II)tris(bipyridyl), Ru(bpy)3 2+, mit Tripropylamin (TPA) (Leland et al. (1990), J. Electrochem. Soc., 137: 3127–31), um die Technik zu zeigen. Salze von Ru(bpy)3 2+ sind sehr stabile, wasserlösliche Verbindungen, die chemisch modifiziert werden können mit reaktiven Gruppen an einem der Bipyridylliganden, um aktivierte Arten zu bilden, mit denen Proteine, Haptene und Nukleinsäuren leicht markiert werden können. Die von Blackburn et al. verwendete aktivierte Form von Ru(bpy)3 2+ war der Ru(bpy)3 2+-NHS-Ester:
  • Beta-Lactamasen, die die Amidbindungen des β-Lactamrings von sensitiven Penicillinen und Cephalosporinen hydrolysieren, sind innerhalb von Mikroorganismen weit verbreitet und spielen eine Rolle bei der mikrobiellen Resistenz für β-Lactam-Antibiotika. Beta-Lactamasen bilden eine Gruppe verwandter Enzyme, die ausgebildet werden durch eine große Anzahl an Bakterienarten, aber nicht von Säugergeweben, und können hinsichtlich Substratspezifitäten variieren. Siehe allgemein Payne, D. J., J. Med. Micro (1993), 39, 5.93–99; Coulton, S. & Francois, I., Prog. Med. Chem. (1994), 31, 297–349; Moellering, R. C. Jr., J. Antimicrob. Chemother. (1993), 31, (Suppl. A), S. 1–8; und Neu, H. C., Science (1992), 257, S.1064–1072.
  • Der Nachweis von β-Lactamaseaktivität in einer Körperflüssigkeit wurde lange für als auf eine vergangene oder bestehende bakterielle Infektion hinweisend gehalten.
  • Die sich entwickelnde mikrobielle Resistenz für Antibiotika, wie z. B. Penicillin und Cephalosporin, war schon für eine Weile von Bedeutung. Kürzlich eskalierte diese Bedeutung im Licht der schwindelnden Anzahl neuer Antibiotika und der Überbenutzung jener, die bekannt sind. Es wurde wichtiger, das optimale Antibiotikum für die Behandlung einer bestimmten Infektion auszuwählen, und das Verschreiben des neuesten Antibiotikums zu vermeiden, wenn wirksame Alternativen existieren. Diese Möglichkeit, das optimale Antibiotikum auszuwählen, ist besonders kritisch in jenen Einrichtungen, die in Langzeitpflegeeinrichtungen verwickelt sind, wo Antibiotikaresistenz zunehmend zu einem Problem wird. Die Lebenszeit der gegenwärtigen Antibiotikafamilie kann verlängert werden durch die Auswahl des optimalen Antibiotikums. Siehe allgemein Harold C. Neu "The Crisis in Antibiotic Resistance", Science, Band 257, (11. August 1992), S. 1064–1072.
  • Die zunehmende Resistenz, genauer die zunehmende mikrobielle Resistenz gegen Antibiotika erhöhte den Bedarf für einen Test, der leicht den Grad der Resistenz für ein bestimmtes β-Lactam-Antibiotikum, wie z. B. einem Penicillin oder Cephalosporin, quantitativ bestimmen kann und dann das am besten geeignete Antibiotikum für einen bestimmten infektiösen Zustand auswählen kann.
  • Derzeit existieren etliche Verfahren für den Nachweis mikrobieller β-Lactamasen. Einige repräsentative Beispiele folgen.
  • W. L. Baker "Co-Existence of β-Lactamase and Penicillin Acylase in Bacteria; Detection and Quantitative Determination of Enzyme Activities", J. Appl. Bacteriol. (1992), Band 73, Nr. 1, S. 14–22, offenbart einen Kupfer reduzierenden Test für den Nachweis von Penicilloaten und einen Fluorescamintest, um 6-Aminopenicillansäurekonzentrationen nachzuweisen, wenn beide Substanzen durch die Wirkung der Enzyme auf ein einzelnes Substrat erzeugt werden.
  • Das US-Patent Nr. 5,264,346 offenbart einen kolorimetrischen Test für β-Lactamase, der eine Reihe an Anwendungen hat. Der Test basiert auf der Entfärbung eines Chromophors, gebildet durch die Oxidation von entweder dem N-Alkylderivat von p-Phenylendiamin oder dem 3,3',5,5'-Tetraalkylderivat von Benzidin. Die Entfärbung wird der Anwesenheit eines offenen β-Lactamringproduktes, das aus der Hydrolyse von Cephalosporin oder Penicillin resultiert, zugeschrieben. Die Entfärbung durch das offene β-Lactamprodukt von Penicillin benötigt die Anwesenheit eines die Entfärbung verstärkenden Mittels, wie z. B. Quecksilber enthaltende Verbindungen. Der Verstärker wird für die Entfärbung durch das offene β-Lactamprodukt von Cephalosporin nicht benötigt.
  • Das US-Patent Nr. 4,470,459 offenbart ein schnelles Verfahren für den Nachweis der Anwesenheit von β-Lactamase aus mikrobiellen Quellen, das auf einer β-Lactamaseumsetzung eines β-Lactamsubstrates basiert, das seine Fähigkeit, zu fluoreszieren, umkehrt. Spezifische β-Lactame, von denen gesagt wird, dass sie diese Eigenschaft haben, schließen Ampicillin, Cephalexin, Amoxicillin, Cefadroxil und Cephaloglycin ein. Die Änderung in der Fähigkeit zu fluoreszieren, wird der Anwesenheit von β-Lactamase zugeschrieben.
  • Die WO 84/03303 offenbart ein mikrobiologisches Testvorgehen für die Identifikation von β-Lactamaseherstellern. Der Test beruht auf Änderungen in der Acidität, die die Fluoreszenz des Indikators, wie z. B. Cumarin, angreift. Diese Änderungen der Acidität wird dem durch die Anwesenheit der β-Lactamase hergestellten Umwandlungsprodukt zugeschrieben.
  • A. C. Peterson et al. "Evaluation of Four Qualitative Methods for Detection of β-Lactamase Production in Staphylococcus and Micrococcus Species", Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. (1989), Band 8, Nr. 11, S. 962–7, präsentieren gewisse Faktoren, die bei der Beurteilung qualitativer Tests für β-Lactamase verwendet werden.
  • Robert H. Yolken et al. "Rapid Diagnosis of Infections Caused by β-Lactamase-Producing Bacteria by Means of an Enzyme Radioisotopic Assay", The Journal of Pediatrics, Band 97, Nr. 5 (Nov. 1980), S. 715–720, offenbaren einen empfindlichen enzymatischen Radioisotopentest für die Messung von β-Lactamase als ein schneller Test für den Nachweis bakterielle Infektion. Das Testprotokoll schließt einen Inkubationsschritt mit der Probe ein, gefolgt von dem Abtrennungsschritt auf einer positiv geladenen Säule, wie z. B. DEAE-Sephacel vor der Messung der Radioaktivität eluierter Fraktionen. Das durch β-Lactamase umgewandelte penicillinische Produkt hat eine zusätzliche Carboxylgruppe, die seine stärkere Bindung an die positiv geladene Säule im Vergleich zu dem Penicillin sicherstellt. Unterschiede in der Radioaktivität zwischen den eluierten Fraktionen und den Ursprungswerten werden der Anwesenheit von β-Lactamase zugeschrieben.
  • Vor der hierin offenbarten Erfindung verblieb ein Bedarf für einen universellen Test für β- Lactame und β-Lactamasen, der sowohl sehr schnell (10 Minuten oder kürzer) als auch sehr empfindlich ist.
  • Die in dieser Anmeldung offenbarte Erfindung erreicht diese Bedürfnisse durch die Anpassung von Elektrochemolumineszenzmethodologien an die Messung von β-Lactamen oder β-Lactamasen. Andere Aufgaben der Erfindung werden auch aus der nun folgenden Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Breit festgestellt, umfasst die Erfindung einen auf Elektrochemolumineszenz basierenden Test für den Nachweis von β-Lactamasen oder β-Lactamkomponenten. Die Erfindung hat als eine ihrer Ziele einen universellen Test für β-Lactam-Antibiotika ebenso wie für β-Lactamasen, der sowohl schnell (10 Minuten oder kürzer) als auch empfindlich (geringe mikromolare Konzentration von Antibiotika und pikomolare Konzentration von β-Lactamasen) ist. Der Test wäre geeignet für den Nachweis ebenso wie für die Quantifikation der β-Lactam-Antibiotika und β-Lactamasen.
  • Für die Verwendung der Elektrochemolumineszenzmethodik als ein Messsystem für β-Lactamasen und β-Lactame war die Erkenntnis der Anmelder zentral, dass β-Lactam-Antibiotika und/oder ihre Hydrolyseprodukte einen zweizähnigen, aromatischen, heterocyclischen Stickstoff enthaltenden Liganden von Ruthenium oder Osmium (auf den in der Beschreibung Bezug genommen wird als "Ru/Os-Komplex") dazu bringen werden, Licht in dem ECL-Messgerät zu emittieren. Ferner gibt es bei allen untersuchten β-Lactamen einen wesentlichen Unterschied zwischen vollständigen Antibiotika und deren Hydrolyseprodukten in Bezug auf diese Fähigkeit. Demgemäß korreliert eine Änderung in der Chemolumineszenz mit der Anwesenheit von β-Lactamaseaktivität.
  • Gleichfalls überraschend war für die Anmelder die Vielseitigkeit des Testes für die Messung verschiedener β-Lactamstrukturen und dabei für die β-Lactamasefamilie an Enzymen. Kritisch dafür ist die Umwandlung der tertiären Aminstruktur der vollständigen Antibiotikastruktur zu der Struktur des sekundären Amins in dem hydrolysierten Produkt. Die hydrolysierte und/oder nicht hydrolysierte Verbindung wirkt als Tripropylamin in den chemolumineszenten Tests des Standes der Technik.
  • Alles was benötigt wird, ist, die Probe mit dem interessierenden β-Lactam-Antibiotikum zu inkubieren und die Änderung in der Chemolumineszenz über die Zeit zu messen unter Verwendung von etablierten Protokollen und Geräten. Was zu der Zeit auch nicht von den Anmeldern erwartet worden war, war die Qualität der in einer vergleichsweise kurzen Zeit (5 Minuten bis 2 Stunden) erzielbaren Ergebnisse und die für sowohl das β-Lactam als auch die β-Lactamasen erzielte Empfindlichkeit. Wie belegt in Tabelle I auf S. 264 von Downey et al., "Chemoluminescence Detection Using Regenerable Tris (2, 2'bypyridyl) ruthenium (II) Immobilized in Nafion", Anal. Chem. 64 (1992), S. 261–268, gab es keine Einsicht vor dieser Erfindung, dass die hydrolysierte Struktur von Penicillin nennenswerte Mengen an ECL erzeugt.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • Legenden der Figuren:
  • 1 erläutert die durch β-Lactamase katalysierte Hydrolyse von Benzylpenicillin.
  • 2 zeigt die chemischen Strukturen einiger üblicher β-Lactame.
  • 3 zeigt die Quantifizierung der Antibiotikahydrolyse unter Verwendung von spektrophotometrischen (schwarze Säulen) und ECL-(graue Säulen)-Testverfahren. Wie im Text detailliert ausgeführt, variierten die spektrophotometrischen Verfahren in Abhängigkeit von Faktoren, die sich auf die einzigartigen Eigenschaften der Elektronenextinktionsspektra der unhydrolysierten und unhydrolysierten Antibiotika bezogen, während für sämtliche Antibiotika ein einzelnes ECL-Messgeräteverfahren verwendet wurde. In allen Fällen wurden 1,0 mM jedes Antibiotikums bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit einem von vier Enzymen inkubiert.
  • 3A zeigt B. cereus-β-Lactamase I (1,3 nM).
  • 3B zeigt B. cereus-β-Lactamase II (42,6 nM).
  • 3C zeigt Enterobacter cloacae P99 (1,9 nM).
  • 3D zeigt E. coli RTEM (0,73 nM). Für die ECL-Experimente wurden 275 μl jeder Probe mit 25 μl von 120 μm Ru(bpy)3 2+ und 0,6% Triton® X-100 vermischt. Die Mischungen wurden unter Verwendung eines ECL-Messgerätes (Origen® Analyzer, IGEN, Inc., Rockville, MD) analysiert.
  • 4: Standardkurven von hydrolysierter und unhydrolysierter β-Lactamkonzentration gegen ECL. A zeigt die Enzym-katalysierte (B. cereus) β-Lactamasehydrolyse von Ampicillin. B zeigt die NaOH-Hydrolyse von Cefoxitin. Sowohl in A) als auch in B) stellen die geschlossenen Kreise das intakte Antibiotikum und die offenen Kreise die Produkte der Antibiotikahydrolyse dar. Die Proben wurden behandelt und analysiert, wie beschrieben in der Legende zur 3.
  • 5 zeigt die Quantifizierung bakterieller Zellen durch die ECL-Messung ihrer β-Lactamaseaktivität. Verschiedene Mengen von E. coli-Extrakt (Zentrifugationspellets) wurden über Nacht in 1,0 mM Ampicillin inkubiert. In einigen Fällen wurde auch der β-Lactamaseinhibitor 6-β-Br-Penicillansäure hinzugefügt. Die inkubierten Mischungen bestanden aus 1,0 mM Ampicillin und 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, und entweder AmpS E. coli (niedrige Spiegel von β-Lactamase) (offene Dreiecke), AmpS E. coli mit 6-β-Br-Penicillansäure (geschlossene Dreiecke), AmpR E. coli (hohe Spiegel von β-Lactamase) (geschlossene Kreise) oder AmpR E. coli mit 6-β-Br-Penicillansäure (offene Kreise). Zu Aliquoten der über Nacht inkubierten Proben wurden Ru(bpy)3 2+ und Triton® X-100 hinzugefügt, um Endkonzentration von 10 μM bzw. 0,05% zu ergeben.
  • 6 erläutert einen möglichen ECL-Reaktionsmechanismus für Antibiotika. In einigen Fällen nimmt das Hydrolyseprodukt an dieser Reaktion Teil, um Licht auszulösen. In allen untersuchten Fällen gab es jedoch einen wesentlichen Unterschied zwischen einem gegebenen Antibiotika und seinen Hydrolyseprodukten.
  • Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele
  • Der Mechanismus der ECL-Anregung ist wie folgt. Ru/Os-Komplex und Antibiotikum (hydrolysiert und/oder unhydrolysiert) werden an der Oberfläche einer Goldelektrode oxidiert, wobei [Ru/Os-Komplex]+ bzw. Antibiotikum+• gebildet wird. In dieser Beschreibung ist das Antibiotikum entweder intakt oder hydrolysiert. Das Antibiotikum+• verliert spontan ein Proton, wobei Antibiotikum• gebildet wird. Das Antibiotikum•, ein starkes Reduktionsmittel, reagiert mit [Ru/Os-Komplex]+, einem starken Oxidationsmittel, wobei der Anregungszustand des Detektionsmittels gebildet wird. Der angeregte Zustand zerfällt zum Grundzustand durch einen normalen Fluoreszenzmechanismus, wobei ein Proton mit einer angemessenen Wellenlänge emittiert wird.
  • Organische Verbindungen, die elektrochemische Nachweismittel sind, schließen ein beispielsweise Ruben und 9,10-Diphenylanthracen. Viele organometallische Verbindungen sind elektrochemische Nachweismittel, von Nutzen sind jedoch Ru enthaltende Verbindungen, wie z. B. Ruthenium(II)trisbipyridinchelat und Os enthaltende Verbindungen, wie sie im US-Patent 5,310,687 gefunden werden können.
  • Diese Nachweismittel sind für lange Zeiträume stabil. Zusätzlich sind die Nachweismittel sicher und vergleichsweise kostengünstig. Sie ergeben ein hochcharakteristisches Signal und kommen in der Natur nicht vor. Messungen, die auf der Lumineszenz solcher Nachweismittel basiert werden, sind empfindlich, schnell, reproduzierbar und verwenden einfache Messgeräte. Das Signal wird wiederholt durch jedes Molekül des Nachweismittels erzeugt, wobei die Empfindlichkeit, mit der diese Nachweismittel nachgewiesen werden können, verstärkt wird. Verschiedene Mengen dieses Nachweismittels oder seines Äquivalents können verwendet werden. Es muss auch festgestellt werden, dass diese Nachweismittel direkt in den biologischen Proben oder in den Nahrungsmittelproben verwendet werden können, ohne Vorbehandlung der Probe.
  • Die für die Bildung des Anregungszustandes notwendige Energie stammt aus dem großen Unterschied in den elektrochemischen Potenzialen des [Ru/Os-Komplex]+ und des Antibiotikum•. Der angeregte Zustand zerfällt durch einen normalen Fluoreszenzmechanismus. Dieser Vorgang regeneriert die Ausgangsform des Ru/Os-Komplex, der frei ist, viele Male die Reaktionsfolge zu durchlaufen. Folglich kann jedes ECL-aktive Nachweismittel viele Photonen während jedem Messzyklus emittieren, wobei der Nachweis verstärkt wird.
  • Die Quantifizierung des Ru/Os-Komplex-Nachweismittels kann leicht mit vergleichsweise unkomplizierter Messgeräteanordnung automatisiert werden. Das Herz eines Messgerätes ist die elektrochemische Durchflusszelle, welche die Arbeitselektroden und Gegenelektroden für die Initiierung der ECL-Reaktion enthält. Beide Elektroden werden aus Gold hergestellt, es wurden jedoch auch andere Materialien verwendet mit unterschiedlichen Erfolgsgraden. Ein Potentiostat legt verschiedene Spannungsverläufe an die Elektroden an und eine einzelne Photomultiplierröhre (PMT) detektiert das während der ECL-Reaktion emittierte Licht. Eine Ag/AgCl-Referenzelektrode wird in den Flüssigkeitsweg stromabwärts der Flusszelle platziert und eine peristaltische Pumpe wird verwendet, um verschiedene Flüssigkeiten durch die Durchflusszelle zu saugen. In einer typischen Sequenz wird die Testflüssigkeit aus einem Reagenzglas in die Durchflusszelle gesaugt und das Nachweismittel wird quantifiziert durch Anlegen einer Rampenspannung an die Elektroden und Messen des emittierten Lichts. Nach der Messung wird eine Reinigungslösung mit hohem pH-Wert in die Zelle gesaugt für einen elektrochemischen Reinigungsvorgang. Eine Konditionierlösung wird dann in die Zelle gesaugt und ein Spannungsverlauf wird angelegt, welcher die Oberfläche der Elektroden in einem hoch reproduzierbaren Zustand hinterlässt, fertig für den nächsten Messzyklus.
  • Die ECL-Reaktion kann wirksam durch viele verschiedene Spannungsverläufe initiiert werden. Messungen des Arbeitselektrodenstroms und der ECL-Intensität werden durch das Anlegen einer Dreiecksspannung an die Elektroden induziert. Die angelegte Spannung, wie gezeigt, ist tatsächlich die Spannung, die an der Ag/AgCl-Referenzelektrode gemessen wird, und schließt die Wirkungen eines signifikanten, nicht kompensierten Widerstands ein; demzufolge ist die tatsächliche Spannung, die an der Arbeitselektrode angelegt ist, wesentlich geringer als jene, die dargestellt ist. Die Dreiecksspannung steigt von 565 auf 2800 mV mit einer Geschwindigkeit von 750 mV/s und fällt dann mit derselben Geschwindigkeit auf 1000 mV ab. Der Strom, der in der Zelle fließt, ist primär das Ergebnis der Oxidation des β-Lactam-Antibiotikums und der Hydrolyse von Wasser. Die Oxidation von sowohl dem β-Lactam-Antibiotikum als auch dem Ru/Os-Komplex wird offensichtlich, wenn die angelegte Spannung 1100 mV erreicht und Lumineszenz erzeugt. Die Intensität der Lumineszenz steigt mit der angelegten Spannung, bis das Antibiotikum an der Oberfläche der Elektrode verbraucht ist, was in einer abnehmenden Intensität resultiert. Die Intensität der beobachteten Lumineszenz ist groß genug, dass sie leicht mit gewöhnlichen PMTs gemessen werden kann, die entweder Photonen zählend oder in Strommodi betrieben werden.
  • Die Probe, zu der das β-Lactam von Interesse hinzugefügt worden war, wird dann in eine Messzelle gegeben, um einen Anfangswert zu erhalten. Typischerweise wird das β-Lactam von Interesse in Konzentration zwischen 10 μM und 1,0 mM hinzugefügt. Das elektrochemolumineszente Nachweismittel ist typischerweise in Konzentrationen von 10–6 M (Bereich 1 bis 15 μM) vorhanden. Die Zelle, welche die Probe enthält, wird dann für eine ausreichende Zeitdauer inkubiert, um sicherzustellen, dass die β-Lactamase katalysierte Hydrolyse geschehen kann, falls das Enzym vorhanden ist. Diese Zeitdauer variiert typischerweise zwischen 5 Minuten und 2 Stunden. Längere und kürzere Zeiträume sind möglich in Abhängigkeit von der Probe und den Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer. Da alles, was beteiligt ist, empirische Parameter sind, können ihre Werte unter Verwendung von gewöhnlichen Techniken bestimmt werden.
  • Nachdem die Inkubation geschieht, wird ein zweiter Wert genommen. Der Unterschied in den Messwerten, falls vorhanden, korreliert mit der β-Lactamaseaktivität, die in der Probe vorhanden ist. Siehe 4 diesbezüglich. Auf eine ähnliche Weise kann eine bestimmte Probe unterteilt werden oder eine Reihe an Proben können von einem bestimmten Patienten entnommen werden und nacheinander mit einer Reihe an β-Lactam-Antibiotika behandelt werden, um ein Profil für die Probe oder den Patienten zu erzeugen. Dieses Profil kann verwendet werden von einem Arzt, um ein bevorzugtes Antibiotikum für die Behandlung auszuwählen, oder es kann verwendet werden, um den involvierten Mikroorganismus zu identifizieren, basierend auf einer vorhandenen Informationsbibliothek. Das für die Verwendung bei der Behandlung einer Infektion bevorzugte Antibiotikum ist das am wenigstens hydrolysierte.
  • Ebenfalls möglich ist die Schaffung eines Satzes an Standards, erhalten durch Wiederholen der obigen Verfahren mit einer Reihe an Antibiotika unter Verwendung einer β-Lactamase aus einer Reihe an repräsentativen β-Lactamasen. Solch eine Darstellung ist in den 3a bis d gezeigt. Die für eine Unbekannte bestimmten Werte können mit solch einen Satz für Identifizierungszwecke verglichen werden. Diese Information kann in elektronischer Form sein, um die Handhabung und den Vergleich zu erleichtern.
  • Nachdem die Probe mit β-Lactam-Antibiotikum behandelt und/oder inkubiert wurde, wird die ECL-Messung durchgeführt durch Anlegen eines elektrischen Potenzials an die Arbeitselektrode. Dies ergibt ein charakteristisches Signal von dem emittierten Licht. Vergleichsweise geringe Interferenz resultiert aus dem Hintergrund, der durch die anderen in der Probe oder dem hinzugefügten Puffer vorhandenen Materialien dargebotenen wird.
  • Demgemäß schließen die für die Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung geeigneten Geräte und Methodiken, wie früher festgestellt, jene ein, die in den US-Patenten Nrn. 5,068,088, 5,061,455, 5,093,268 und 5,147,806 und 5,221,605 gezeigt sind. Ferner schließen Elektrochemolumineszenzmoleküle für die Verwendung in dem Messsystem als Nachweismittel jene zweizähnigen, aromatischen, heterocyclischen, Stickstoff enthaltenden Liganden von Ruthenium und Osmium ein, die beschrieben sind in den US-Patenten Nrn. 5,310,687 und 5,310,687.
  • Reagenzienkits, welche die für die Durchführung der Tests notwendigen Materialien enthalten, können zusammengestellt werden, um die Handhabung zu erleichtern und eine Standardisierung zu fördern. In den Kit einzuschließende Materialien können variieren in Abhängigkeit von dem letztlichen Zweck. Typischerweise würde der Kit das elektrochemolumineszente Nachweismittel, notwendige Puffer und Standards einschließen. Die Standards können chemische Reagenzien oder Daten (empirische) in gedruckter oder elektronischer Form sein, notwendig für die Kalibrierung, notwendig für die Durchführung des Tests.
  • Beispiel 1: ECL-Test der β-Lactamhydrolyse durch β-Lactamasen
  • Bakterielle β-Lactamaseenzyme hydrolysieren und inaktivieren β-Lactam-Antibiotikumsubstrate (1). Es werden über 100 β-Lactamasen durch viele unterschiedliche Arten gram-negativer und gram-positiver Bakterien (1) erzeugt. Jede β-Lactamase wird ein begrenztes und einzigartiges "Spektrum" an β-Lactam-Antibiotika (für die Strukturen einiger β-Lactam-Antibiotika siehe 2) hydrolysieren. Folglich kann das Antibiotikum letal sein, falls ein β-lactamaseerzeugender Bakterienstamm mit einem Antibiotikum angegriffen wird, das nicht ein Substrat seiner β-Lactamase(n) ist. Falls ein Bakterienstamm angegriffen wird mit einem β-Lactam-Antibiotikum, das ein Substrat seiner β-Lactamase(n) ist, wird umgekehrt jener Stamm das Antibiotikum zerstören, dem Angriff widerstehen und überleben. Es ist schwierig, im Voraus vorherzusagen, ob eine pathogene Mikrobe eine β-Lactamase herstellt und, falls dem so ist, welches Antibiotikum jenes bestimmte Enzym erkennt und hydrolysiert. Es würde der medizinischen Behandlung solcher mikrobieller Infektionen stark nützen, falls als Teil des Entscheidungsfindungsvorgangs des Arztes eine Probe des infizierten Gewebes oder der biologischen Flüssigkeit eines Patienten mit Kandidatenantibiotika vor der Antibiotikagabe vermischt werden könnte, um zu bestimmen, ob eine β-Lactamase vorhanden ist, die fähig ist, das Antibiotikum zu hydrolysieren und es unwirksam zu machen.
  • In einem Experiment wurde die Hydrolyse (oder deren Fehlen) sechs unterschiedlicher im Handel erhaltener β-Lactam-Antibiotika (Benzylpenicillin, 1; Ampicillin, 2; Amoxycillin, 3; Moxalactam, 4; Cefoxitin, 5; und Cephalosporin C, 6) mittels einer oder mehreren von vier unterschiedlichen β- Lactamasen nachgewiesen und quantifiziert unter Verwendung einer auf Elektrochemolumineszenz (ECL) basierenden Methode. Die Antibiotika unterschieden sich signifikant in der chemischen Struktur, obwohl jedes den viergliedrigen β-Lactamring gemeinsam hat (2). Jedes Antibiotikum wurde auf eine Konzentration von 1,0 mM verdünnt in einer Lösung mit pH 7,5 von 0,1 M Phosphat (Natriumsalz), enthaltend 10 μM Ruthenium(II)tris(bipyridyl) (abgekürzt als Ru(bpy)3 2+) und 0,05% Triton® X-100. Andere Lösungen der Antibiotika wurden hergestellt, die identisch waren, mit der Ausnahme, dass sie auch eines von vier im Handel erhaltenen β-Lactamaseenzymen (entweder 1,3 nM Typ I von Bacillus cereus, 42,6 nM Typ II von Bacillus cereus, 0,73 nM RTEM von E. coli oder 1,9 nM Enterobacter cloacae P99) enthielten. Nach 10-minütigen Inkubationen bei Raumtemperatur (ungefähr 22°C) wurden ECL-Analysen der Antibiotikalösungen (mit und ohne jedes Enzym) durchgeführt unter Verwendung eines ECL-analysierenden Messgerätes (OrigenR-Analyzer, IGEN, Inc., Rockville, MD). Die Wirkungen der Enzyminkubation auf die ECL-Intensität wurden beobachtet.
  • Für die Verifizierung der Quelle der erzeugen ECL wurde die Hydrolyse derselben sechs Antibiotika auch spektrophotometrisch überwacht (es ist bekannt, dass sich spektrale Änderungen im ultravioletten Bereich nach der Hydrolyse von β-Lactam-Antibiotika ereignen). Die spektrophotometrische Analyse der Antibiotikahydrolyse bestand tatsächlich aus vielen Verfahren, da sich die UV-spektralen Eigenschaften der sechs Antibiotika wesentlich unterschieden. Die in jedem Test überprüfte Wellenlänge, ebenso wie die Küvettenweglänge, benötigten eine individuelle Optimierung für jedes Antibiotikum; Benzylpenicillin und Ampicillin benötigten eine 10 mm-Küvette und eine Wellenlänge von 240 nm, Cephalosporin C benötigte die Messung in einer 2 mm-Küvette und eine Wellenlänge von 260 nm, Cefoxitin benötigte eine 2 mm-Küvette und eine Wellenlänge von 265 nm, Moxalactam benötigte eine 2 mm-Küvette und eine Wellenlänge von 270 nm und Amoxycillin benötigte eine 2 mm-Küvette und eine Wellenlänge von 240 nm. Im Gegensatz dazu wurden alle ECL-Messungen durchgeführ unter Verwendung identischer ECL-Messgeräteinstellungen.
  • Die Ergebnisse, gezeigt in den 3a–d, belegten, dass die β-Lactamhydrolyse durch niedrige (nanomolare oder geringere) Konzentrationen von β-Lactamasen durch ECL in 10 Minuten nachgewiesen werden kann. Die Hydrolyse der Antibiotika Moxalactam und Cefoxitin sind in 3 nicht gezeigt, da sowohl ECL als auch spektrophotometrische Verfahren zeigten, dass sie nicht durch irgendeines der in dem Experiment verwendeten Enzyme katalysiert werden (obwohl die Behandlung mit Base zeigte, dass wesentliche ECL-Änderungen die Hydrolyse dieser Verbindungen begleitet, siehe Beispiel 2). 3 zeigt, dass die Quantifizierung der Hydrolyse durch spektrophotometrische (schwarze Säulen) und ECL-(graue Säulen)-Nachweisverfahren ähnliche Ergebnisse ergeben. Die Ergebnisse zeigen auch, dass jedes der vier untersuchten Enzyme ein einzigartiges "Spektrum" an Substratspezifität hat. Die Auswahl eines therapeutisch wirksamen Antibiotikums in einer klinischen Abstimmung würde jenes favorisieren, das nicht durch die β-Lactamase des Mikroorganismus signifikant hydrolysiert wird. Folglich kann dieses Experiment als eine Studie von vier "Schein"-Infektionen angesehen werden. Jede Scheininfektion (Enzym) wurde mit sechs β-Lactam-Kandidatenantibiotika herausgefordert, um die β-Lactamasesubstratspezifität zu bestimmen, eine Information, die bei der Vorhersage der in vivo-Wirksamkeit jedes Antibiotikums zur Seite stehen könnte.
  • Beispiel 2: ECL-Test der β-Lactamhydrolyse durch Base
  • β-Lactam-Antibiotika können durch Säuren oder Basen hydrolysiert werden. Die Hydrolyse von β-Lactam-Antibiotika mit verdünntem Natriumhydroxid ergibt im Allgemeinen experimentell identische ECL-Testergebnisse, als wenn sie durch β-Lactamasen hydrolysiert werden (Tabelle 1). In einigen Fällen, wo ein bestimmtes β-Lactam nicht erkannt oder hydrolysiert werden kann durch irgendeine bekannte β-Lactamase, kann die ECL-Quantifizierung des Antibiotikums durch Vergleich mit den ECL-Charakteristika basenhydrolysierter Proben des Antibiotikums gemacht werden.
  • Tabelle l : Vergleich der ECL von Penicillinen vor und nach der Hydrolyse durch Base (NaOH) oder Enzym (β-Lactamase)
    Figure 00100001
  • Die Tabelle 2 zeigt die Wirkung von NaOH auf die durch die 10 β-Lactame, deren Strukturen in 2 gezeigt sind, erzeugte ECL. Tabelle 2: Wirkung der Basenhydrolyse auf die ECL von β-Lactamen (Antibiotikakonzentrationen betrugen ungefähr 1,0 mM)
    Beta-Lactam Hydrol./Unhydrol. ECL-Verhältnis
    Moxalactam 25,7
    Benzylpenicillin 18,0
    Amoxycillin 7,0
    Ampicillin 5,8
    6-Aminpenicillansäure 5,4
    Cefaclor 2,2
    Cefuroxim 0,82
    Cephalosporin C 0,40
    Cefoxitin 0,38
    7-Aminocephalosporansäure 0,33
  • Die Über-Nacht-Behandlung mit 0,2 M NaOH resultierte in der vollständigen Hydrolyse des β-Lactamrings in jedem Fall. Es kann gesehen werden, dass in allen Fällen die Basenhydrolyse die ECL-Eigenschaften ändert, jedoch in variierendem Ausmaß. Einige der untersuchten Antibiotika (wie z. B. Penicillin G, Ampicillin und Amoxycillin) ergaben einer erhöhte ECL nach der Hydrolyse, während andere (wie z. B. Cefoxitin und Cephalosporin C) eine wesentlich geringere ECL nach der Hydrolyse ergaben. Es gibt eine allgemeine Tendenz, dass Penicilline mehr ECL nach der Hydrolyse ergeben und Cephalosporine weniger ECL nach der Hydrolyse ergeben, obwohl es keine offensichtlichen chemischen strukturellen Gründe für diese Beobachtung oder für die Tatsache, dass jede Verbindung sich einzigartig verhält, gibt. Die zu Grunde liegenden mechanistischen Gründe für die Unterschiede im ECL-Verhalten sind möglicherweise ein Ergebnis von Variationen in den Empfänglichkeiten der Substrate und Produkte der Reaktionen, um stabile radikale Kationen zu bilden, die wirksam ein Elektron auf Ru(bpy)3 3+ übertragen (siehe 6, welche ein Schema eines vorgeschlagenen ECL-Mechanismus zeigt).
  • Es sollte festgestellt werden, dass in einigen Fällen (mit Cephalosporin C und Cefaclor) die Ergebnisse variierten in Abhängigkeit von der Konzentration der NaOH, die verwendet wurde, um das Antibiotikum zu hydrolysieren, und in Abhängigkeit von der Dauer der Hydrolysezeit. Von diesem wird angenommen, dass dies an anderen Reaktionen liegt, zusätzlich zu der β-Lactamhydrolyse, welche zwischen NaOH und diesen spezifischen Verbindungen geschehen. Die enzymatische Hydrolyse ist ein chemisch milderer Weg, β-Lactame zu hydrolysieren, und kann in einigen Fällen der Verwendung von NaOH vorgezogen werden.
  • Beispiel 3: Quantifizierung von β-Lactamen durch ECL
  • Das Bestimmen der Konzentrationen der β-Lactam-Antibiotika ist wichtig bei der therapeutischen Arzneimittelüberwachung und auch beim Überwachen der Nahrungsmittelqualität, wie z. B. Fleisch und Milch von Rindern, denen Antibiotika verabreicht wurden. Für jedes analytische Verfahren ist es kritisch zu zeigen, dass das Signal als eine Funktion der Konzentration des Analyten variiert. Der Nachweis und die Quantifizierung der unter Verwendung von ECL analysierten β-Lactame wurden als abhängig befunden von ihren Konzentrationen, so dass die Konzentration einer unbekannten Probe durch Vergleich mit einer geeigneten Standardkurve bestimmten werden könnte. Standardkurven (Antibiotikakonzentration gegen ECL) wurden für Penicillin G, Ampicillin, Amoxycillin, Cefoxitin, Cephalosporin C und Moxalactam erzeugt. In 4 werden Standardkurven für die gemeinhin verwendeten Antibiotika Penicillin, Ampicillin, (4a) und für die weit verbreitet verwendeten Antibiotika Cephalosporin, Cefoxitin (4b) gezeigt. In den Fällen von Ampicillin wurden 275 μl verschiedener Konzentrationen des Antibiotikums (0–1,0 mM) in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 7 nM β-Lactamase I von B. cereus (Ampicillin) inkubiert. Für Cefoxitin wurde eine 1,5 mM-Lösung des Antibiotikums in 0,2 M NaOH über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Geeignete Verdünnungen (275 μl von 0–1,0 mM) der Lösung an hydrolysiertem Cefoxitin und eine vergleichbare unhydrolysierte Lösung von Cefoxitin wurden hergestellt. Zu 275 μl der Ampicillin- und Cefoxitinlösungen (hydrolysiert und unhydrolysiert) wurden 25 μM einer Lösung aus 120 μM Ru(bpy)3 2+ und 0,6% Triton® X-100 hinzugefügt und die Proben wurden in einem IGEN OriginR-ELC-Analyzer analysiert. In allgemeiner Übereinstimmung mit den in Tabelle 2 präsentierten Daten resultierte die Ampicillinhydrolyse in einem Anstieg der ECL, während die Cefoxitinhydrolyse eine Abnahme der ECL verursachte. In beiden Fällen wurde eine allgemeine Tendenz festgestellt, die es möglich macht, vorherzusagen, wie viel Antibiotikum in einer Probe vorhanden wäre, falls die ECL vor und nach geeigneter Hydrolyse gemessen würde.
  • Beispiel 4: Quantifizierung von β-Lactamasen durch ECL
  • Es gibt über 100 Typen an β-Lactamaseenzymen. Jedes hat, unter definierten Bedingungen von pH-Wert, Temperatur und anderen Faktoren, kinetische Konstanten der Substratkatalyse, die reproduzierbare Charakteristika jenes bestimmten Enzyms sind. Eine kinetische Konstante, die besonders wichtig ist, ist die kcat, definiert als die maximale Geschwindigkeit (Vmax) für die Katalyse eines gegebenen Substrates pro Molekül des Enzyms (z. B. bedeutet ein kcat von 10 s–1, dass ein Enzymmolekül 10 Substratmoleküle pro Sekunde bei Vmax katalysieren wird). Folglich kann, wenn ein Enzym bei Vmax arbeitet (was geschieht, wenn die Substratkonzentration hoch ist), die Enzymkonzentration bestimmt werden durch Messen der Katalysegeschwindigkeit. Da viele kcat-Werte von β-Lactamasen mit üblichen β-Lactamsubstraten bekannt sind, kann die Konzentration eines β-Lactamaseenzyms bestimmt werden durch Messen der Katalysegeschwindigkeit eines Substrates bei hoher Substratkonzentration (in Einheiten der Produktkonzentration, gebildet pro Zeiteinheit). Diese Messtypen können durchgeführt werden unter Verwendung von ECL.
  • Zum Beispiel könnte, falls jemand die Konzentration von β-Lactamase I von Bacillus cereus in einer Lösung mit definiertem pH-Wert, Temperatur und anderen Faktoren quantifizieren wollte, Penicillin G hinzugefügt werden, um eine ausreichend hohe Konzentration zu ergeben (wie z. B. 1,0 mM), so dass das Enzym bei Vmax arbeiten würde. ECL-Messungen der Penicillinumsetzung würden zu nicht weniger als zwei Zeitpunkten durchgeführt werden; z. B. zu den Zeiten = 0, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 und 10,0 Minuten nach Starten der durch Enzym katalysierten Reaktion. Durch Vergleich der in einer Standardkurve erzeugten ECL (Konzentration hydrolysierten Penicillins G gegen erzeugte ECL) könnte die anfängliche Geschwindigkeit der katalytischen Hydrolyse bestimmt werden und dieser Wert würde die Maximalgeschwindigkeit sein. Teilen dieser experimentell bestimmten Vmax (z. B. 2200 nM Penicillin G hydrolysiert pro Sekunde) durch den in der Literatur berichteten kcat-Wert (z. B. 2200 s–1 (festgestellt in Martin, M. T. & Waley, S. G., Biochem. J. (1988), 254, S. 923–925)) würde die Enzymkonzentration ergegeben (1 mM).
  • Beispiel 5: ECL-Nachweis und -Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika in biologischen Fluiden, wie z. B. Blut, Serum, Urin oder Rachenabstrichen.
  • Der Nachweis von Antibiotika in biologischen Materialien könnte leicht durchgeführt werden nach der Entfernung von jeglichen Zellen, die vorhanden sein könnten, welche den ECL-Vorgang oder die -Messung stören könnten. Die Zellentfernung kann durchgeführt werden mit wohl bekannten Mitteln, wie z. B. Filtration oder Zentrifugation. Das verbleibende Fluid kann dann gemessen werden mit Antibiotika erleichterter ECL, wie anderswo in diesem Dokument beschrieben. Zwei Proben werden auf ECL untersucht werden; eine Probe wird das behandelte Fluid des Patienten sein, die andere Probe wird das Fluid desselben Patienten sein, jedoch ein hinzugefügtes β-Lactamaseenzym enthalten, von dem bekannt ist, dass es jenes Antibiotikum hydrolysieren wird, für welches die ECL gemessen wird (ECL wird gemessen werden nach einer ausreichenden Inkubationszeit für das Enzym, um vollständig jegliches Antibiotikum, welches vorhanden sein könnte, zu hydrolysieren). Der Unterschied in der ECL zwischen den unbehandelten und den enzymbehandelten Proben wird kennzeichnend sein für die Anwesenheit des Antibiotikums und das Ausmaß des ECL-Unterschiedes wird die Konzentration jenes Antibiotikums anzeigen. Eine Standardkurve kann erzeugt werden durch Hinzufügen bekannter Mengen des Antibiotikums zu dem Fluid des Patienten und Messen der ECL vor und nach der enzymkatalysierten Hydrolyse. Die Standardkurve sollte erzeugt werden unter Verwendung des Fluids desselben Patienten, zu dem bekannte Konzentrationen des Antibiotikums hinzugefügt worden waren, da das Fluid Substanzen enthalten könnte, welche den ECL-Vorgang oder die -Messung beeinflussen könnten, die einzigartig für jenen bestimmten Patienten sind.
  • Beispiel 6: ECL-Nachweis und -Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika in Lebensmiteln, wie z. B. Milch oder Fleisch
  • Der Nachweis von Antibiotika in flüssigen Lebensmitteln, wie z. B. Milch, kann durchgeführt werden, entweder direkt an der Flüssigkeit oder nach Behandlung, um Bestandteile, wie z. B. Lipide und Proteine oder andere nicht antibiotische Substanzen zu entfernen, welche den ECL-Vorgang oder die -Messung stören könnten. Solche Entfernungsschritte sind übliche Laborvorgänge und können Hochgeschwindigkeitszentrifugation (z. B. 10.000 rpm in einer Standardlaborzentrifuge für 30 Minuten) einschließen. Die Zentrifugation würde die Bildung einer Schicht aus festem Fett auf der Oberfläche von Flüssigkeiten, wie z. B. Milch, bewirken. Die Fettschicht könnte manuell entfernt werden unter Verwendung von z. B. einem Spatel. Protein könnte entweder entfernt werden durch Fällung unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder vorzugsweise durch Ultrafiltration. Ultrafiltration ist ein Vorgang des Entfernens von Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht aus Flüssigkeiten durch Filtration unter Druck durch eine Membrane, die definierte nominelle Porengrößen enthält (siehe Amicon-Katalog (Danvers, MA) für die Ultrafiltrationsausstattung und für weitere Information). In dem Fall von Antibiotika (welche typischerweise Molekulargewichte geringer als 1000 Da haben) könnte eine Membran mit einem Molekulargewichtrückhaltevermögen von 10.000 Da am besten sein. Solche Membranen halten Moleküle zurück mit einem nominellen Molekulargewicht größer als 10.000, so dass das Filtrat nur Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht (< 10.000 Da) enthalten würde, einschließlich Antibiotika. Membranen mit einem höheren Molekulargewichtrückhaltevermögen (50.000–100.000 Da) mögen schneller filtrieren, würden jedoch nicht so viel möglicherweise die ECL beeinflussendes Material zurück halten.
  • Nach irgendwelchen notwendigen Behandlungen, wie z. B. Zentrifugation und Ultrafiltration, wird dann ein definiertes Volumen der Flüssigkeit auf ECL untersucht werden durch Standardvorgänge, die anderswo in diesem Dokument beschrieben sind. Eine identische Probe könnte mit einer β-Lactamase behandelt werden, von der bekannt ist, dass sie das β-Lactam-Antibiotikum wirksam hydrolysiert, von dein angenommen wird, dass es in der Flüssigkeit anwesend ist. Nach einer ausreichenden Zeit für die Hydrolyse (abhängig von Temperatur, pH-Wert und Enzymkonzentration) wird die zweite Probe auf ECL gemessen. Da β-Lactamasen spezifisch β-Lactam-Antibiotika hydrolysieren, jedoch nur eine geringe oder gar keine ECL bei den geringen Konzentrationen (typischerweise nanomolar) abgeben, die für die Katalyse benötigt werden, wird der Unterschied in der ECL zwischen den hydrolysierten und nicht hydrolysierten Proben eine Anzeige der β-Lactam-Antibiotikakonzentration in der Flüssigkeit sein. Um die Konzentration des nachgewiesenen Antibiotikums zu quantifizieren, könnte eine Standardkurve erzeugt werden unter Verwendung von bekannten Mengen des Antibiotikums, von dem angenommen wird, dass es anwesend ist (hydrolysiert und unhydrolysiert). Bei der Erzeugung einer Standardkurve wird bevorzugt, das bekannte Antibiotikum zu dem Lebensmittel, wie z. B. Milch, hinzuzufügen und die Flüssigkeit ebenso zu behandeln wie unbekannte Lösungen (z. B. durch Zentrifugation und Ultrafiltration). Das Untersuchen des analysierten Materials auf unterschiedliche Antibiotika könnte durchgeführt werden durch Wiederholen dieses Experimentes an ähnlichen Proben, jedoch unter Verwendung unterschiedlicher β-Lactamasen, welche jeweils spezifisch unterschiedliche Antibiotika hydrolysieren würden. Solche wiederholte Behandlung mit unterschiedlichen Enzymen könnte helfen, die Antibiotika zu identifizieren, die in der Flüssigkeit vorhanden sind.
  • Der Nachweis von Antibiotika in festen Nahrungsmitteln, wie z. B. Fleisch, könnte ähnlich durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass das Antibiotikum extrahiert (aufgeschlossen) werden müsste aus dem festen Nahrungsmittel. Anfänglich könnte eine Probe des Nahrungsmittels in Puffer (vorzugsweise 0,1 M Phosphat, pH 7,0) suspendiert werden und in einem Mixer zerkleinert werden bis sie glatt ist. Das Antibiotikum könnte weiter durch Beschallung auf Eis extrahiert werden, was jegliche vorhandene Zellen zerstören würde, wobei jegliches innerhalb der Zellen vorhandene Antibiotikum entlassen werden würde. Nach Zerkleinern und Beschallung könnte das Material ähnlich wie flüssige Lebensmittel behandelt werden, wie oben beschrieben. Namentlich könnte das Material zentrifugiert und/oder ultrafiltriert werden. In dem Fall von Fleisch würde die Zentrifugation primär in einem Pellet resultieren, das aus zellulären Bruchstücken bestehen würde (im Gegensatz zu Milch, bei der die Zentrifugation in einer oberflächlichen Fettschicht resultiert). Bei der Herstellung von Standardkurven sollte das bekannte Antibiotikum früh in dem Vorgang zugegeben werden, vorzugsweise zu dem Puffer, der beim Verkleinern verwendet wird.
  • β-Lactam-Antibiotika wurden in Milch nachgewiesen (Vitamin D Mil, Embassy Dairy, Waldorf, Maryland, pasteurisiert und homogenisiert bis zum Grad A). Die folgenden Ergebnisse wurden für Benzylpenicillin (300 μl Gesamtvolumen, enthaltend 250 μl Milch, 10,0 μM Ru(bpy)3 2+, 1,0 mM Penicillin G, +/- 18 nM β-Lactamase I von B. cereus) gewonnen und für Cephalosporin C (300 μl Gesamtvolumen, enthaltend 250 μl Milch, 10,0 μM Ru(bpy)3 2+, 1,0 mM Cephalosporin C, +/- 18 nM β-Lactamase P99 von E. cloacae). Benzylpenicillin
    Probe ECL-Zählimpulse
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Penicillin 1880
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Penicillin + Enzym 10.100
    Cephalosporin C
    Probe ECL-Zählimpulse
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Cephalosporin C 7960
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Ceph. C + Enzym 9340
  • Ähnliche Experimente wurden durchgeführt mit Antibiotika in Milch, die mit NaOH hydrolysiert wurden; Benzylpenicillin
    Probe ECL-Zählimpulse
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Penicillin 19.100
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Penicillin + NaOH 64.400
    Cephalosporin
    Probe ECL-Zählimpulse
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Cephalosporin C 41.200
    Milch + Ru(bpy)3 2+ + Ceph. C + NaOH 35.100
  • Wie in den obigen Tabellen für Cephalosporin C gesehen werden kann, hängt die Wirkung der Hydrolyse auf die ECL von dem Hydrolyseverfahren ab; Enzymhydrolyse bringt die Zählimpulse dazu, anzusteigen, wohingegen die NaOH-Hydrolyse die Zählimpulse dazu bringt, abzufallen. Geeignete Kontrollexperimente zeigten, dass dies nicht ein Ergebnis der Anwesenheit von Enzym ist. Wie anderswo in diesem Dokument beschrieben, ist die NaOH-Hydrolyse dieser Verbindung ungewöhnlich verfahrensabhängig, ein Phänomen, von dem angenommen wird, dass es aus der Bildung alternativer ECL-aktiver Hydrolyseprodukte resultiert. Die Ergebnisse sind reproduzierbar konsistent innerhalb sämtlichen gegebenen Hydrolyseverfahren. Andere Experimente mit Zentrifugation der Milch, um Fett zu entfernen, ergaben ähnliche Ergebnisse für sowohl Benzylpenicillin als auch Cephalosporin C. Standardkurven zeigten, dass weniger als 25 μM Benzylpenicillin und weniger als 250 μM Cephalosporin C in Milch unter Verwendung von ECL nachgewiesen werden könnten.
  • Beispiel 7: ECL-Test von β-Lactamasen in biologischen Materialien, wie z. B. Blut, Urin, Serum oder Rachenabstrichen
  • Die Bestimmung von β-Lactamasen in biologischen Materialien würde mit einem Verfahren, ähnlich zu jenem im Beispiel 4 beschriebenen, durchgeführt werden. Im Wesentlichen würde ein bekanntes Antibiotikum mit der biologischen Flüssigkeit in einer bekannten Konzentration (z. B. 1,0 mM) vermischt werden. Es könnte ein sofortiger ECL-Ablesewert genommen werden und ein weiterer Ablesewert könnte zu irgendeinem späteren Zeitpunkt gemacht werden (es könnten 5 Minuten sein, falls die Konzentration der β-Lactamase vergleichsweise hoch ist, oder so lange wie über Nacht, falls die β-Lactamasekonzentration gering ist). Eine Änderung in der ECL würde die Antibiotikumhydrolyse durch eine β-Lactamase anzeigen. Das Ausmaß der Antibiotikaumsetzung könnte verglichen werden mit einer Standardkurve mit der hydrolysierten Antibiotikakonzentration gegen die erzeugte ECL. Ebenso wie bei der Messung von Antibiotika in biologischen Fluiden, wie in Beispiel 5 beschrieben, kann es ratsam sein, das Fluid mit bekannten Mitteln zu behandeln, um jegliche Substanzen zu entfernen, die nicht β-Lactamasesubstanzen sind, die den ECL-Vorgang oder die -Messung stören könnten. Es könnte nötig sein, das in einem Rachenabstrich vorhandene Enzym durch die Zugabe von Puffer in Lösung zu bringen.
  • Beispiel 8: ECL-Test von β-Lactamasen in Lebensmitteln, wie z. B. Milch und Fleisch
  • Der Nachweis und die Quantifizierung von β-Lactamasen in flüssigen (wie z. B. Milch) oder festen (wie z. B. Fleisch) Lebensmitteln können unter Verwendung von ECL durchgeführt werden. In dem Falle von flüssigen Lebensmitteln können angemessene bekannte Verfahren notwendig sein, um Substanzen zu entfernen, die nicht β-Lactamasesubstanzen sind, die den ECL-Vorgang oder -Messung stören könnten. Zum Beispiel kann die Filtration durch gewöhnliches Filterpapier nützlich sein bei der Entfernung von Teilchen aus Milch. Auch wird die Zentrifugation der Milch Fette entfernen, die Messungen stören könnten. In dem Falle von festen Lebensmitteln, wie z. B. Fleisch, würde die Homogenisierung in einem Waring-Mixer mit hinzugefügtem Puffer (z. B. 0,1 M Phosphat, pH 7,0), gefolgt von der Beschallung bei 4°C und Zentrifugation (10.000 × g für 30 Minuten), bei dem Aufschließen des Enzyms helfen. Nach diesen Vorgängen könnte es auch nützlich sein, einen Ultrafiltrationsschritt hinzuzufügen, um Moleküle mit über 100.000 Da zu entfernen. Das Ultrafiltrationsfiltrat wird jegliche β-Lactamasen enthalten, die im allgemeinen Molekulargewichte von ungefähr 30.000 Da haben. Der ECL-Nachweis von β-Lactamasen in diesem von Lebensmitteln abgeleiteten Lösungen würde zunächst aus dem Hinzufügen eines ausgewählten β-Lactam-Antibiotikums (z. B. Penicillin G in einer Konzentration von 1,0 mM) bestehen und dem Durchführen einer sofortigen ECL-Messung, gefolgt von wenigstens einer weiteren Messung gewisse Zeiten) später (die Zeiten könnten so kurz sein wie 5 Minuten oder so lang wie über Nacht). Jegliche Änderung in der ECL würde die Anwesenheit von β-lactamasekatalysierter Hydrolyse des hinzugefügten Antibiotikums anzeigen. Das Ausmaß der Hydrolyse könnte bestimmt werden durch Vergleich mit einer Standardkurve (Konzentration hydrolysierten Antibiotikums gegen ECL), die unter vergleichbaren Bedingungen erzeugt wurde.
  • Beispiel 9: ECL-Test von β-Lactamasen in Bakterienkultur
  • Es ist bevorzugt und manchmal wichtig, β-Lactamasen in einem bakteriellen Kulturmedium (wie z. B. in definiertem Labormedium oder im Blut, Urin oder in Milch) nachzuweisen, ohne umfassende Isolierungsschritte. In einer Anwendung könnte der in situ-Nachweis von β-Lactamasen in dem Blut eines mit einem pathogenen Mikroben infizierten Patienten Entscheidungen hinsichtlich der medizinischen Behandlung jenes Individuums günstig beeinflussen. In solch einer Anwendung kann es untragbar Zeit verbrauchend oder anderweitig unpraktisch sein, die β-Lactamase aufzureinigen, um sie nachzuweisen. Folglich ist es wichtig, in der Lage zu sein, β-Lactamasen in der Anwesenheit des Mikroben, der sie herstellt, nachzuweisen, und in dem Kulturmedium, in dem das Bakterium gewachsen ist.
  • β-Lactamasen werden sowohl von gram-negativen als auch von gram-positiven Bakterien hergestellt. In dem Fall von gram-negativen Bakterien (z. B. E. coli) werden β-Lactamasen in den periplasmatischen Raum abgesondert. In gram-positiven Bakterien (z. B. B. cereus) wird das Enzym in das Medium, das die Zelle umgibt, sezerniert. Es ist wertvoll, in der Lage zu sein, β-Lactamaseaktivität sowohl in gram-negativen als auch in gram-positiven Bakterienkulturen nachzuweisen. Da die Enzyme in physikalisch unterschiedlichen Zuständen vorhanden sind (abgesondert gegen sezerniert) in den beiden Bakterientypen, kann oder kann nicht der β-Lactamasenachweis etwas unterschiedliche experimentelle Protokolle benötigen.
  • Zwei Stämme des gram-negativen Bakteriums E. coli wurden über Nacht bei 30°C wachsen gelassen. Jedes in 10 ml LB-Kulturmedium. Ein Stamm wird E. coli AmpR (ATCC; DH5αF'IQpDsubE.F4) genannt, da es resistent ist für Ampicillin wegen der Herstellung von β-Lactamasen. Der andere Stamm, bezeichnet als E. coli AmpS (ATCC; Jm105) stellt keine hohen Spiegel an β-Lactamase her und wurde als ein Kontrollstamm (ampicillinempfindlich) verwendet. Die Zellen wurden von dem Kulturmedium als ein Zentrifugationspellet durch Zentrifugation bei 2800 rpm in einer Sorvall RT 6000D Zentrifuge isoliert, gefolgt von der Entfernung der überständigen Lösung durch Dekantieren. Tests wurden durchgeführt mit dem dekantierten Überstand, es wurde jedoch, zumindest mit E. coli, vielmehr β-Lactamaseaktivität in dem Pellet nachgewiesen. Die pelletierten Zellen wurden in 9,5 μl 50 mM Tris-Acetatpuffer, pH 8,0, resuspendiert, dann für 15 Minuten in einem eisgekühlten Becherglas beschallt. Typischerweise wurden Teile der resultierenden Suspension (9,5–10,0 μl) zu 300 μl 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, hinzugefügt, der 500 μM Ampicillin, 10,0 μM Ru(bpy)3 2+ und 0,05% Triton® X-100 enthielt. Nach verschiedenen Inkubationszeiten (keine bis über Nacht) wurden die Suspensionen auf ihre Fähigkeit untersucht, Elektrochemolumineszenz zu erzeugen, unter Verwendung eines IGEN ECL-Analyzer. In einigen Fällen wurden 5,0 μl einer 1,0 mM-Lösung des β-Lactamaseinhibitors 6-β-Br-Penicillansäure als eine Kontrolle der Quelle der erzeugten ECL hinzugefügt.
  • Ein ähnliches Protokoll wurde verwendet mit dem gram-negativen Bakterium B. cereus. Ein Stamm sezerniert eine relativ hohe Menge β-Lactamase (bezeichnet B. cereus AmpR) (ATCC; 27348) und der andere Stamm sezerniert nur wenig β-Lactamase (bezeichnet B. cereus AmpS) (ATCC; 9139). Die Wachstumsbedingungen und experimentellen Vorgänge waren identisch mit jenen, wie oben für E. coli beschrieben, mit der Ausnahme, dass in einigen Fällen, wie unten beschrieben werden wird, die überständige Lösung für die ECL-Experimente verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse für E. coli zeigten, dass die mit Zellkulturen im Zusammenhang stehende β-Lactamaseaktivität in der Tat gemessen werden könnte unter Verwendung von ECL ohne umfangreiche Aufreinigung. Nach einer einstündigen Inkubation der E. coli-Proben mit 500 μM Ampicillinlösungen wurden die folgenden ECL-Ergebnisse erhalten: Tabelle 3: ECL-Nachweis der β-Lactamaseaktivität in E. coli
    Probe ECL-Zählimpulse
    E. coli AmpS + Ru(bpy)3 2+ + Ampicillin 36.400
    E. coli AmpR + Ru(bpy)3 2+ + Ampicillin 106.000
    E. coli AmpS + Ru(bpy)3 2+ + 6-β-Br-Penicillansäure + Ampicillin 35.000
    E. coli AmpR + Ru(bpy)3 2+ + 6-β-Br-Penicillansäure + Ampicillin 36.700
  • Diese Daten zeigen, dass die β-Lactamaseaktivität in situ in gram-negativen Bakterien nachgewiesen werden kann. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten mit dem gram-positiven Bakterium B. cereus, jedoch unter Verwendung des Zentrifugationsüberstandes anstelle des Pellets. Wiederum wurden die Ergebnisse gewonnen nach einer einstündigen Inkubation mit 500 μM Ampicillin. Tabelle 4: ECL-Nachweis der β-Lactamaseaktivität in B. cereus
    Probe ECL-Zählimpulse
    B. cereus AmpS + Ru(bpy)3 2+ + Ampicillin 33.600
    B. cereus AmpR + Ru(bpy)3 2+ + Ampicillin 47.200
    B. cereus AmpS + Ru(bpy)3 2+ + 6-β-Br-Penicillansäure + Ampicillin 25.600
    B. cereus AmpR + Ru(bpy)3 2+ + 6-β-Br-Penicillansäure + Ampicillin 22.500
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch gram-positive Zellen sezernierte β-Lactamase in einer Stunde mittels ECL nachgewiesen werden kann.
  • In einigen Anwendungen mag der schnelle Nachweis von β-Lactamasen nicht so kritisch sein wie der Nachweis einer geringen Anzahl an Bakterienzellen, die in einer Probe vorhanden sein können.
  • Experimente wurden durchgeführt, um die niedrigste, durch ihre β-Lactamaseaktivität unter den verwendeten Bedingungen nachweisbare Zellzahl zu bestimmen. Unter Verwendung von über Nacht in Standard-(LB)-Wachstumsmedium gewachsenen E. coli wurden ansteigend größere Verdünnungen der Kulturzentrifugationspellets untersucht durch Über-Nacht-Inkubationen mit Ampicillin in einer ähnlichen Methodologie, wie oben beschrieben. E. coli-Konzentrationen in Zellkultur wurden bestimmt durch spektrophotometrische Extinktion bei 600 nm und anschließendem Vergleich mit Extinktionen von ausplattierten Kulturen. Wie in 5 gesehen werden kann, lag das untere Nachweislimit von E. coli-Zellen in einer Über-Nacht-Inkubation bei 2440.
  • Beispiel 10: Identifizierung von Bakterien durch ECL-Untersuchung ihrer Beta-Lactamasen
  • Es gibt viele unterschiedliche Arten an β-Lactamaseenzymen. Die Strukturen (Aminosäuresequenzen) können sich wesentlich zwischen den Enzymen unterscheiden, ebenso wie ihre Substratspezifitäten. Da es viele verschiedene β-Lactam-Antibiotika und viele verschiedene β-Lactamasen gibt, können theoretisch sämtliche β-Lactamasen durch das relative Ausmaß der Hydrolyse einer Reihe an unterschiedlichen β-Lactam-Antibiotikasubstraten identifiziert werden (das heißt durch ihr individuelles "Spektrum" der Substratspezifität). Ein gegebener Bakterienstamm könnte identifiziert werden durch seine einzigartige β-Lactamasesubstratspezifität (siehe 3a–d). Bei der Identifizierung eines gegebenen unbekannten Bakterienstammes könnten angemessen behandelte Aliquoten jenes Stammes (Pellet oder Überstand, wie im Beispiel 9 beschrieben) mit einer Reihe an dementsprechend unterschiedlichen Antibiotika (einschließend sowohl Cephalosporine als auch Penicilline) vermischt werden. Nach einer angemessenen Zeitdauer (von 5 Minuten bis über Nacht) könnte die ECL der unterschiedlichen Inkubationsmischungen abgelesen und mit geeigneten Standards verglichen werden, um die relativen Umsetzungsgeschwindigkeiten der unterschiedlichen Antibiotika zu bestimmen, wobei 0–100% Umsetzung erwartet wird in Abhängigkeit von Enzymkonzentration und dem einzelnen Antibiotikum/Enzympaar. Basierend auf bekannten Substratspezifitäten für bekannte Bakterienstämme könnte die fragliche Bakterienart identifiziert werden.

Claims (21)

  1. Kit zum Messen von β-Lactam-Antibiotika oder β-Lactamasen, umfassend vorbestimmte Mengen eines zweizähnigen, aromatischen, heterozyklischen Stickstoff-enthaltenden Liganden von Ruthenium oder Osmium als Reagenz und einen β-Lactam- oder Lactamase-Standard, worin die vorbestimmten Mengen ausreichend sind, um die Messung einer einzelnen Probe durchzuführen.
  2. Kit gemäß Anspruch 1, worin der Kit eine Serie von Behältern mit den vorbestimmten Mengen an Reagenzien in denselben enthält.
  3. Kit gemäß Anspruch 2, worin die Serie an Behältern vorbereitet ist, um Durchführung des Tests in automatisierter Weise zu gestatten.
  4. Kit gemäß Anspruch 1, worin der Standard ein β-Lactam-Standard ist.
  5. Kit gemäß Anspruch 1, worin der Standard ein β-Lactamase-Standard ist.
  6. Kit gemäß Anspruch 4 oder 5, worin der Standard ein chemisches Reagenz ist.
  7. Kit gemäß Anspruch 1, worin der Standard ein Profil von Mikrobenresistenz gegenüber β-Lactam-Antibiotika ist.
  8. Kit gemäß Anspruch 1, worin der Standard ein Profil an spezifischen β-Lactam-Substratspezifitäten für β-Lactamasen darstellt.
  9. Kit gemäß Anspruch 1, worin der zweizähnige, aromatische, heterozyklische, Stickstoff-enthaltende Ligand des Rutheniums Ru(bpy)3 2+ ist.
  10. Verfahren zum Messen der Anwesenheit einer β-Lactamase, umfassend (a) das In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der man annimmt, dass sie β-Lactamase enthält, mit einem β-Lactam und einem zweizähnigen, aromatischen, heterozyklischen, Stickstoff-enthaltenden Liganden des Rutheniums oder Osmiums als Reagenz; (b) Unterwerfen der in Kontakt gebrachten Probe aus Schritt (a) unter Bedingungen, die zur Elektrochemolumineszenz führen; (c) Messen der resultierenden Elektrochemolumineszenz zum Erhalt einer Ablesung; (d) Inkubieren der Mischung; (e) Unterwerfen der inkubierten Mischung aus Schritt (d) unter Bedingungen, die zur Elektrochemolumineszenz führen; und (f) Messen der resultierenden Chemolumineszenz und Vergleichen derselben mit dem zuvor gemessenen Wert, um den Unterschied, falls vorhanden, in den gemessenen Werten zu bestimmen, wodurch die Anwesenheit einer β-Lactamase angezeigt wird.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die Probe ein biologisches Material ist, ausgewählt unter Urin, Eiter, Sekretionen, (Hals)Schleim, Blut oder Serum.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 10, zusätzlich umfassend (g) Vergleichen der Differenz mit einem Standardwert, um die Menge der in der Probe vorhandenen β-Lactamase zu bestimmen.
  13. Verfahren zum Messen der Anwesenheit eines β-Lactams, umfassend (a) In-Kontakt-Bringen einer β-Lactam enthaltenden Probe mit einer β-Lactamase und einem zweizähnigen, aromatischen, heterozyklischen, Stickstoff-enthaltenden Liganden des Rutheniums oder Osmiums als Reagenz; (b) Unterwerfen der in Kontakt gebrachten Probe aus Schritt (a) unter Bedingungen, die zur Elektrochemolumineszenz führen; (c) Messen der resultierenden Elektrochemolumineszenz, um eine Ablesung zu erhalten; (d) Inkubieren der Mischung; (e) Unterwerfen der inkubierten Mischung aus Schritt (d) unter Bedingungen, die zur Elektrochemolumineszenz führen; (f) Messen der resultierenden Chemolumineszenz und Vergleichen derselben mit dem zuvor gemessenen Wert, um das Vorhandensein eines Unterschieds bei den gemessenen Werten zu bestimmen; und (g) Vergleichen des Unterschiedes mit einem Standardwert, um die quantitative Menge an in der Probe vorhandenem β-Lactam zu ermitteln.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, worin die Probe ein biologisches Material ist, ausgewählt unter Urin, Eiter, Sekretionen, Nahrungsmitteln, Blut, (Hals)Schleim oder Serum.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 13, worin die Schritte auf kontinuierliche Weise durchgeführt werden.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 13, worin die Schritte in einem einzelnen Behälter durchgeführt werden.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 13, worin der Prozess in Abwesenheit eines zugesetzten Radikal-bildenden Reduktionsmittels durchgeführt wird.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin das Reduktionsmittel TPA ist.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 13, worin der Standard ein chemisches Reagenz ist.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 13, worin der Standard eine elektronische Aufzeichnung ist.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 13, worin der zweizähnige, aromatische, heterozyklische, Stickstoff-enthaltende Ligand des Rutheniums oder Osmiums Ru(bpy)3 2+ als Reagenz bzw. Os(bpy)3 2+ ist.
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