DE2249165C2 - 3-Styryl-ceph-3-em-4-carbonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
3-Styryl-ceph-3-em-4-carbonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungInfo
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Description
10
worin R eine Formamido- oder Naphthoylamidogruppe oder eine Gruppe der allgemeinen Formel
R-CH2CONH, R-OCH2CONH, R-CONH,
R-CH(NH2)CONH oder R-Q=NOH)CONH
R-CH(NH2)CONH oder R-Q=NOH)CONH
ist, wobei R- Thienyl oder Phenyl darstellt, Ar eine
Phenylgmppe, die in ortho und/oder para-Stellung
durch Nitro- oder Cyanogruppen substituiert ist, bedeutet, wobei Ar keine 4-Nitrophenylgrüppe
darstellt und X die Bedeutung von -S— oder — SO— (« oder ß) hat und deren Salze oder
wasserlösliche Ester.
2. 3-(2,4-Dinitrostyryl)-(6R7R)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure,
E Isomeres und die Salze und wasserlöslichen Ester davon.
3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in
an sich bekannter Weise
(a) eine Verbindung der allgemeinen Formel
CH=P(R3),
(HD
15
20
25
worin R und X die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, R2 Wasserstoff oder eine
übliche Carboxylgruppen-blockierende Gruppe ist und R3 einen üblichen organischen Substituenten
darstellt, mit einer Aldehydverbindung der allgemeinen Formel ArCHO, worin Ar wie
in Anspruch I definiert ist, umgesetzt wird oder daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel
CHO
QV)
0OR2
worin R, X und R2 wie vorstehend unter (a) definiert sind, mit einem Phosphoran-ylid der
allgemeinen Formel
(RJ)5P-CHAr
worin R3 und Ar wie vorstehend unter (a) definiert sind, umsetzt oder daß man
eine Verbindung der allgemeinen Formel
eine Verbindung der allgemeinen Formel
HjN~i—( \
T
COOR2
worin R2 die oben angegebene Bedeutung besitzt, mit einem Reagens umsetzt, das dazu
dient, die freie Aminogruppe in eine blockierte Aminogruppe R, wie in Anspruch 1 definiert,
umzuwandeln und darauf gegebenenfalls
(d) (i) ein 42-Isomeres in das gewünschte .^-Isomere umwandelt;
(d) (i) ein 42-Isomeres in das gewünschte .^-Isomere umwandelt;
(ii) eine Verbindung, worin X die Bedeutung
von —SO— besitzt, zu einer Verbindung reduziert, worin X die Bedeutung von
-S-besitzt;
(iii) eine Verbindung, worin X die Bedeutung von — S— besitzt, zu einer Verbindung,
worin X die Bedeutung von —SO — besitzt, oxydiert;
(iv) die exocyclische -CH=C1F -Doppelbindung
isomerisiert;
(v) eine Carboxylgruppen-blockierende Gruppe von der 4-Carboxylgruppe entfernt
und/oder
(vi) ein Salz oder wasserlöslichen Ester der
(vi) ein Salz oder wasserlöslichen Ester der
4-Carboxylgruppe bildet.
4. Verwendung der S-Styryl-ceph-S-em^-carbonsäuren
der allgemeinen Formel
CH=CH-Ar
worin R eine Formamido- oder Naphthoyiamidogruppe oder eine Gruppe d τ allgemeinen Formel
R-CH2CONH. R-OCH2CONH, R-CONH.
R-CH(NH2)CONH oder R-Q = NOH)CONH
R-CH(NH2)CONH oder R-Q = NOH)CONH
1,St1 wobei Ru die aromatische Gruppe Thienyl oder
Phenyl darstellt, Ar eine Phenylgruppe, die in ortho- und/oder para-Stellung durch Nitro- oder Cyanogruppen
substituiert ist, bedeutet und X die Bedeutung von — S— oder —SO— (α oder ß) hat
und deren Salze oder wasserlösliche Ester als Reagens zum Test von biologischen Proben auf die
0-Lactamase-Aktivität.
Die Erfindung betrifft 3-Styryl-ceph-3-em-4-carbonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre
Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung chromogene Cephalosporinverbindungen, die als Testreagentien
auf den Gebieten der Pathologie, der Biochemie und der analytischen Chemie interessant
sind.
Die hierin erwähnten Cephalosporinverbindungen werden im allgemeinen unter Bezugnahme auf Cepham
(vgl. J. Amer. Chem. Soc. 1962,84,3400) bezeichnet.
Es ist bekannt, daß der 0-Lactamring in Cephalosporinverbindupgen
entweder biochemisch durch j3-Lactamasen
(beispielsweise durch Stämme gewisser gegen v Cephalosporin resistenter Bakterien erzeugt) oder
( ' chemisch, z. B. durch Basen oder Säuren, geöffnet
werden kann. Es wurde nun eine Gruppe von Cephalosporinverbindungen gefunden, die bei öffnung
des ß-Lactamringes gefärbte Produkte ergeben. Diese
Veifeindungen sind daher zur Verwendung als empfindliche
Testreagentien für Agenden geeignet, die eine Öffnung des /ϊ-Lactamrings verursachen.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Schaffung einer Methode zum Test einer biologischen Probe,
insbesondere einer Bakterienkultur, auf die 0-Lactamaseaktivität,
die darin besteht, diese Probe in der Abwesenheit von Wasser mit einer Verbindung der
allgemeinen Formel
CH=CH-Ar (la)
CO2H
worin R eine FormaEido- oder Naphthoylamidogruppe
-CH2CONH-I
/
COOH
oder eine Gruppe der allgemeinen Formel
R-CH2CONH, R-OCH2CONH, R-CONH,
R1CH(NH2)CONH oder R«C(=NOH)CONH
R1CH(NH2)CONH oder R«C(=NOH)CONH
ist, wobei Ru die aromatische Gruppe Thienyl oder
Phenyl darstellt, Ar eine Phenylgruppe, die in ortho-
und/oder para-Stellung durch Nitro- oder Cyanogruppen
substituiert ist, bedeutet und X die Bedeutung von —S— oder —SO— (α oder ß) hat und deren Salze od^r
ίο wasserlösliche Ester in Kontakt zu bringen. Allgemein
interessante Salze der Verbindung Ia schließen Alkalimetallsalze ein, z. B. Natrium- und Kaliumsalze und
Ammoniumsalze.
Alle diese Verbindungen ergeben eine orangefarbene oder rote Farbe, wenn der 0-Lactamring geöffnet wird. Die 2,4-Dinitrophenylverbindungen ergeben eine besonders starke and charakteristische rote Farbe. Eine Verbindung von besonderem Interesse ist die, worin Ar 2,4-Dtnitrophenyl und R Thienylacetamido darstellen,
Alle diese Verbindungen ergeben eine orangefarbene oder rote Farbe, wenn der 0-Lactamring geöffnet wird. Die 2,4-Dinitrophenylverbindungen ergeben eine besonders starke and charakteristische rote Farbe. Eine Verbindung von besonderem Interesse ist die, worin Ar 2,4-Dtnitrophenyl und R Thienylacetamido darstellen,
z. B.iöR.ZRVa-iE^^-DinitrostyryO-y
do)-ceph-3-em-4-carbonsäure der Formel
do)-ceph-3-em-4-carbonsäure der Formel
NO2
NO2
(Π)
30
und deren Salze.
Verbindungen, worin Ar 4-CyanophenyI ist, können
verwendet werden, wenn aus irgende'iR.'m Grund eine
grüne Farbe bevorzugt wird.
Verbindungen angegeben.
Verdünnte Lösungen (ca. 0,1%) der Verbindung in O1IM - pH 7 Phosphatpuffer/Dimethylsulfoxid (9:1)
ergaben die folgenden Farbumschläge, wenn man mit
Im folgenden wird eine Zusammensteht ig bezüglich 35 /J-Lactamase-erzeugenden Organismen, beispielsweise
verschiedener Farbreaktionen der erfindungsgemäßen E cloacae P99, S. aureus (peniciliinrssistent) inkubierte.
RCO-NH-O
-N J-CH=CH-Ar COOH
Beispiel RCO-Nr.
-CH-CHAr
l(B) 2-Tbjenyl*cety1 S
2(C) 2-Amino-2-pheojrUc«tyl S
3(B) 2-Thienylacetyl S
3(C) deigj. 9
4(B) 2-Aauno-2-*henylacetyi S
2-Thieaylacetyl S
desgl. S
Nphoy S
(Z)2-Hydrexyüntio-2.prienyI- S
Formyl S
2,4-Dieitroftyiyi
4-Nilroetyryl (Ε-ΙνοιηβκΜ)
4-Nitrwtyry! (ZAwmmm}
4-Nitrottyryl
4-C)WKMtyiyl
4-Cy»ng»tyryl (l
3,4-Dinilnwtyryl
in nt
FarbwMcfcJi» beobechtet,
j«4<x* !»iac DeUili
i
gelb in cmnge
gelb in annge
FarbuintchUf beobachtet,
je*>cfa Mm Ol
refillrieft
leibingnln
gaib in rat
fejb in rot
gelb in rot
gelb in rot
22 4SI
Verbindungen der aligemeinen Formel Ia fallen unter die allgemeine Verbindungsklasse, die in der belgischen
Patentschrift 7 61 597 beschrieben ist, jedoch sind die (c) einzigen darin speziell beschriebenen Verbindungen,
worin Ar eine aromatische Gruppe ist, die mindestens eine elektronenziehende Gruppe trägt, solche Verbindungen
worin Ar eine 4-NitrophenyIgruppe ist
So stellen ein weiteres Merkmal der Erfindung neue Verbindungen dar, 3-Styryl-ceph-3-em-4~carbonsäuren
der allgemeinen Formel I worin R3 und Ar wie vorstehend unter (a) definiert
sind, umsetzt oder daß man
eine Verbindung der allgemeinen Formel
CH=CH-Ar (V)
COOR2
CH=CH-Ar
O)
CO2H
und Salze und wasserlösliche Ester d?_von, wie sie vorstehend definiert wurden, wobei jedoch Ar nicht die
4-NitrophenyIgruppe bedeutet. Vorteilhafte Verbindungen gemäß der Erfindung sind Verbindungen, worin Ar
die 2,4-Dinitrophenylgruppe darstellt.
Die neuen Verbindungen können nach den allgemeinen Methoden hergestellt werden, die in d:r vorstehend
aufgeführten belgischen Patentschrift enthalten sind.
Die Erfindung betrifft daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß in an sich bekannter Weise
(a) eine Verbindung der allgemeinen Formel
(ΠΙ)
worin R und X die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, R2 Wasserstoff oder eine
übliche Carboxylgruppen-blockierende Gruppe ist und R3 einen üblichen organischen Substituenten
darstellt, mit einer Aldehydverbindung der allgemeinen Formel ArCHO, worin Ar wie in Anspruch
1 definiert ist, umgesetzt wird oder daß man
(b) eine Verbindung der allgemeinen Formel
(b) eine Verbindung der allgemeinen Formel
CHO
(IV)
COOR2
worin R1 X und R2 wie vorstehend unter (a)
definiert sind, mit einem Phosphoran-ylid der allgemeinen Formel
(RJ)3P = CHAr
15 (d)
25
3C worin R2 die oben angegebene Bedeutung besitzt,
mit einem Reagens umsetzt, das dazu dient, die freie Aminogruppe in eine blockierte Aminogruppe
R, wie in Anspruch 1 definiert, umzuwandeln und darauf gegebenenfalls
(i) ein 42-Isomeres in das gewünschte zP-Isomere
(i) ein 42-Isomeres in das gewünschte zP-Isomere
umwandelt;
(ii) είπε Verbindung, worin X die Bedeutung von
(ii) είπε Verbindung, worin X die Bedeutung von
— SO — besitzt, zu einer Verbindung reduziert, worin X die Bedeutung von — S — besitzt;
eine Verbindung, worin X die Bedeutung von
eine Verbindung, worin X die Bedeutung von
— S— besitzt, zu einer Verbindung, worin X die Bedeutung von —SO— besitzt, oxydiert;
(iv) die exocyclische —CH=CH-Doppelbindung
isomerisiert;
eine Carboxylgruppen-hlockierende Gruppe von der4-Carboxylgruppe entfernt und/oder
ein Salz oder wasserlöslichen Ester der
ein Salz oder wasserlöslichen Ester der
(iii)
(ν)
(vi)
4-Carboxylgruppe bildet.
In Abhängigkeit von der Art und der Natur der Substitution in der Gruppe Ar in der Formel (I) können
entweder das eis- oder trans-lsomere im Sinne der Bildung einer etwas tieferen und intensiveren Farbe
vorteilhafter sein als das andere Isomere oder alternativ
im Hinblick auf eine verbesserte Wasserlöslichkeit. Im allgemeinen sind jedoch die trans isomeren bevorzugt.
4C Die Isomerisierung kann durch eine geeignete chemische
Behandlung, z. B. mit Trifluoressigsäure und Anisol, oder durch Bestrahlung bewirkt werden.
Die Methode zum Test einer biologischen Probe, die ein Merkmal der Erfindung darstellt, ist besonders zum
Test auf die 0-Lactamaseaktivität, insbesondere in Bakterienkulturen, von Interesse. Es ist bekannt, daß die
Widerstandsfähigkeit einiget· Bakterienstämme gegen die antibakterielle Wirkung von Cephalosporin- und
Penicillinverbindungen durch die von den Bakterien erzeugten jS-Lactamaseenzyme bewirkt wird, wobei die
Enzyme ausreichen, um bei normalen Dosierungen die Tephalosporine und Penicilline zu zerstören und
inaktivieren. Bisher war die Identifizierung solcher Bakterienstäm.ne sehr schwierig unJ erforderte im
allgemeinen die Aufzucht einer Kultur, Inkubation mit einer j3-Lactamverbindung und schließlich den Zusatz
eines weiteren Reagens, um eine Farbanzeige für die Anwesenheit des im Ring geöffneten Lactams zu
ergeben,
Im Gegensatz dazu wird durch die Erfindung eine schnelle und positive Anzeige der jS-Lactamaseaktivität
ermöglicht. Hierzu ist es lediglich notwendig, die Bakterienkultur mit einer Verbindung der allgemeinen
Formel I oder einem Salz oder wasserlöslichem Ester davon in Kontakt zu bringen. Im Falle einer Kultur, die
eine hohe Konzentration einer aktiven /J-Lactamase
enthält, kann man fast unmittelbar eine Färbung feststellen; wenn nach einer Inkubation von 30 Minuten
bei 37° C mit der Testverbimiung keine Farbe auftritt,
kann daraus geschlossen wenden, daß die ß-Lactamaseaktivität sehr gering oder nicht vorhanden ist.
Der elektronenziehende Substituent oder die elektronenziehenden Substituenten in der Gruppe Ar machen
den /J-Lactamring besonders labil, und es ist daher nicht
wahrscheinlich, daß ein Baklerienstamm, der mit der Testverbindung keine positive Anzeige der /?-Lactamaseaktivität
ergibt, eine Ringöffnung bei einer chemotherapeutisch bedeutsamen Cephalosporin- oder Penicillinverbindung
bewirkt.
Die Erzeugung einer F.jrbe ist ein wertvolles Merkmal der Erfindung, da die 0-Lactamaseaktivität
qualitativ bestimmt werden kann, ohne daß dabei auf Spektrophotometer oder andere optische Instrumente
zurückgegriffen werden muß.
Die Anwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (la) auf die Prob« kann verschiedenartig
organisches Lösungsmittel, z. B. Dimethylformamid, entweder allein oder in wäßriger Lösung verwendet
werden. Die Konzentration einer Imprägnierungslösung, die zur Erzielung einer ausreichenden Farbänderung
mit irgendeinem Reagens nötig ist, kann leicht experimentell bestimmt werden. Im allgemeinen sind
Konzentrationen in der Größenordnung von 1 mg/ml ausreichend. Schließlich wird das Lösungsmittel durch
leichtes Erwärmen, gegebenenfalls unter vermindertem Druck, verdampft.
Die Absorptionsmittel sollten weiß oder hell sein, so
daß die beim Test erzeugte Farbe nicht undeutlich wird. Es ist zweckmäßig, eine übermäßige Lichteinwirkung
vor dem Gebrauch durch eine geeignete Verpackung zu vermeiden.
Dementsprechend besteht ein Testmateriai zur Anwendung für Tests auf die 0-Lactamaseaktivität aus
einem weißen oder hellen Absorbiermittel, z. B. Papier,
durchgeführt werden, !rn Fsüs von Bakterisnkulturen dss mit einer Verbindung der 3ϋσρΓΠΡ*πρπ Forni?'
können ein oder mehrere Tropfen der Testlösung (das Lösungsmittel ist gewöhnlich Wasser, gegebenenfalls
vermischt mit einer geringeren Menge eines organischen Lösungsmittels, z. B. Dimethylformamid oder
Dimethylsulfoxid) zu einer Probe der Kulturbrühe oder auf eine Agar-Platte getropft werden.
Der Test kann durch Standardisierung der Konzentrationen
und Volumen von Probe und Testreagens sowie der Inkubationsperiode quantitativ gestaltet
werden, wobei die Intensität der Farbe entweder mit einem Spektrophotometer oder einer anderen Art von
optischem Vergleichsgerät gemessen wird.
Die auf einer Agar-Platte entwickelte Farbe ist nicht stabil und beginnt bei 37° in etwa drei Stunden zu
verblassen. Durch Kulturbrühen erhaltene Farben bleiben normalerweise für mirdestens 24 Stunden stabil.
Es ist empfehlenswert, den Test nach 30 Minuten und vor Ablauf von 3 Stunden, beginnend mit der Zeit der
Zugabe des Reagens, abzulesen.
Es sollte in Betracht gezogen werden, daß die Verbindungen der Formel la eine antibakterielle
Wirkung besitzen und daß daher ein Versuch, einen Organismus in Anwesenheit der Testverbindung zu
kultivieren, nicht zu einem befriedigenden Test der ,3-Lactamaseaktivität führt, irsbesondere im Falle von
grarr.positiven Bakterien; im allgemeinen wird die Kultur aufgezogen und anschließend mit der Testverbindung
behandelt Diese Behandlungsmethode ist insbesondere für den Fall von Agar-Kulturen zweckmäßig.
Sehr häufig wird lediglich eine qualitative Anzeige für die /J-Lactamaseaktivität erforderlich, und hierfür ist es
zweckmäßig, die Testverbindung, imprägniert in ein Absorptionsmittel jeglicher geeigneter Größe oder
Form, das z. B. aus einem absorbierenden Cellulosematerial, z. B. Papier, besteht, zu verwenden. Zweckmäßig
kann dieses Mittel in der Form einer Scheibe dicken Papiers vorliegen, das auf eine Agar-Kultur gelegt
werden kann, wodurch die Verwendung einer Lösung des Testreagens vermieden werden kann. Zur Anwendung
in Kulturbrühen oder iinderen flüssigen Proben liegt das Absorptionsmittel zweckmäßig in länglicher
Form vor, um ein Eintauchen in die Probe zu ermöglichen. Die Herstellung von Testreagentien, die in
Scheiben oder Stäbchen imprägniert sind, ist per se bekannt Die Imprägnierung wird im allgemeinen mit
einer wäßrigen Lösung der Testverbindung oder
vorzugsweise eines Salzes dadurch durchgeführt Wenn die Wasserlöslichkeit nicht ausreicht, so kann ein
oder einem wasserlöslichen Ester oder Salz davon, imprägniert ist.
Weiter wird durch die Erfindung ein analytisches Reagens zum Test auf die /J-Lactamaseaktivität
geschaffen, welches in einer Lösung einer Verbindung der allgemeinen Formel Ia oder eines Salzes oder
wasserlöslichen Esters davon mit einer Konzentration von 10 — 2000 μg/ml, z. B. 50 — 250 μg/ml, vorzugsweise
in Wasser odc" Wasser, das eine geringe Menge, z. B.
0,1 - 10% VoIVVoI., eines organischen Lösungsmittels,
wie Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid, enthält, besteht.
Die Erfindung ist für die Pathologie interessant, wenn
es häufig erwünscht ist, herauszufinden, ob ein Bakterienstamm befäigt ist, /J-Lactamase zu produzieren.
Diese Information beeinflußt die Wahl des zur Bekämpfung eines besonderen Stammes zu verwendenden
Antibiotikums, ohne daß es nötig ist, den Stamm präzise zu identifizieren. Eine Vielzahl von Bakterien,
grampositive wie gram-negative, von denen es bekannt
ist, daß sie 0-Lactamasen produzieren, haben sich als auf
den erfindungsgemäßen Testvorgang positiv reagierend erwiesen. Beispiele umfassen Enterobacter cloacae P 99,
E. coli TEM, Klebsiella aerogenes Kl, Staph. aureaus, Pseudomonas aeruginosa und Bacillus licheniforrnis.
Gram-positive Organismen neigen zu einer Empfindlichkeit gegen die antibakterielle Wirkung zu Testverbindungen
und sollten immer vor dem Test kultiviert werden.
Eine weitere wichtige Anwendung der Erfindung liegt auf dem Gebiet der mikrobiologischen Forschung,
insbesondere der übertragbaren R-Faktoren, die die /Ϊ-Lactamaseproduktion vermitteln. R-Faktoren sind
extrachromosome genetische Elemente, die für die Übertragung von antibiotischer Resistenz von resistenten
Bakterien auf bisher beeinflußbare Stämme verantwortlich sind. Die Existenz dieser Übertragungsmechanismen findet gegenwärtig wegen der weit
verbreiteten Anwendung von Antibiotika für relativ geringfügige Leiden und in tierischen Futterstoffen
große Beachtung. Wenn die Übertragung der Resistenz die Fähigkeit /J-Lactamase zu erzeugen, einschließt so
wird durch die Erfindung eine einfache Methode dafür geschaffen aufzuzeigen, ob der R-Faktor vorhanden ist
oder nicht
Eine andere mögliche Anwendung der Erfindung liegt darin, im Urin von Patienten mit Infektionen im
Harntrakt die durch /}-Lactamase erzeugende Organismen verursacht wurden, anzuzeigen.
Neben der Möglichkeit für einen empfindlichen Test auf 0-Lactamasen ergeben die Verbindungen der
allgemeinen Formel Ia und ihre Salze auch mit gewissen anderen organischen Materialien wie Eiweiß und
Serumalbumin eine positive Anzeige. Dies ist zu beachten, wenn auch die 0-Lactamaseaktivität getestet
v'rd. Es wird angenommen, daß die positive Reaktion aufgrund von Thiolgruppen in diesen Materialien
erfolgt. Einen positiven Test ergeben auch Glutathion und Mercaptoäthanol. Thioglykolsäure ergibt eine
schwach positive Reaktion. Von 20 getesteten Aminosäuren ergab lediglich Cystein eine positive Reaktion.
Verbindungen, die Thiomethyl- oder Disulfidgruppen enthalten, ergaben keinen positiven Test.
Wegen dieser Empfindlichkeit der Testverbindungen für Materialien wie Serumalbumin kann es vorteilhaft
sein, beim Test auf die /J-Lactamaseaktivität zuerst eine
Blirid^rcbe ZM machen, d.h. daß keine ^-LsctErn?.??
enthaltende Medium zu testen, um sicherzugehen, daß kein solches störendes Material vorhanden ist, das
möglicherweise gefälschte Ergebnisse erzeugen könnte.
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Testreagentien wird vorzugsweise ein fast neutraler pH angewendet,
z. B. im Bereich von 5.5 bis 8,5. Extreme pH-Werte zerstören das Reagens und inaktivieren bei einem Test
auf die 0-Lactamaseaktivität auch das Enzym.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Die folgenden allgemeinen Informationen gelten für .!Ie Beispiele, so weit nicht anders ausgeführt.
Bei Petroläther wurde die Fraktion mit Kp. 40 bis 6O0C verwendet. Protonenmagnetische Resonanzspektren
(PMR) wurden bei 100 MHz gemessen. Signale für die Kopplungskonstanten wurden nicht zugeordnet. Die
Integrale stimmten mit den zugeordneten Strukturen überein.
Elektrophorese wurde an Elektrophorese-Papier beim pH 1.9 und einem Spannungsgradienten von etwa
25 Volt/cm durchgeführt. Die Beweglichkeiten (M) (gegen die Kathode) beziehen sich auf Dextranblau.
Säulenchromatographie wurde an Silicagel, Teilchengröße 0,05 — 0,2 mm durchgeführt.
Dünnschichtchromatographie wurde aufwärts an Siliciumdioxyd-Gipsplatten, enthaltend einen Indikator,
der bei 254 mm und 366 mm fluoresziert, durchgeführt, zur Entwicklung wurden die folgenden Lösungsmittel
verwendet:
System A Obere Phase aus n-Butanol/Äthanol/
Wasser=4 :1 :5,bei Raumtemperaturins Gleichgewicht gebracht.
System D Benzol/Äthylacetat = 5 :1.
System E Benzol/Äthylacetat = 2 :1.
System F Chloroform/Petroläther/Aceton
= 20:5:1.
Papierchromatographie wurde in folgenden Systemen durchgeführt:
System B Chromatographie-Papier, gepuffert auf pH 6, abwärts entwickelt bei ca. 25° mit
einer oberen Phase von n-Butanol/Äthanol/Wasser=4 :1 :5, im Gleichgewicht
mit der Bodenphase.
System C Chromatographie-Papier, gepuffert auf pH 5m abwärts entwickelt bei 37° C mit
der oberen Phase aus n-Butanol/Äthylacetat/0.1m-Natriumacetat=l
:8 :8, ' im Gleichgewicht mit der unteren Phase. System B n-Butanol/Äthanol/Wasser = 4 :1 :5, bei
Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht, die obere Phase wurde als Entwickler der abwärts wandernden Art
verwendet, im Gleichgewicht mit der unteren Phase, auf Elektrophorese-Papier,
gepuffert auf pH 6 mit 0,05 m-Natriumdihydrogenphosphat.
System C Äthylacetat/n-Butanol/O.lm-Natriumacetat
vom oH 5 = 8: 1:8, bei 38°C ins Gleichgewicht gebracht, die obere Phase
wurde in absteigender Art als Entwickler verwendet, im Gleichgewicht mit der unteren Phase bei 38°C, auf Chromatographie-Papier,
gepuffert auf pH 5 mit O.lm-Natriumacetat.
Die folgenden Abkürzungen wurden für das Aussehen der "Flecken verwendet: s = stark, m = mittel,
f = schwach.
PMR- und IR-Spektren standen in Einklang mit den zugeordneten Strukturen.
Die in den Beispielen l(a) und l(b) als Ausgangsmaterialien verwendeten Cephalosporinderivate wurden,
wie in der vorstehend genannten belgischen Patentschrift 7 61 897 beschrieben, hergestellt.
(A)Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2.4-dinitrostyryl)-
7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-carboxylat,
Z-Isomeres(mite-Isomerem)
(a) Eine Lösung von 9,8 g (50 mMol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd
in 500 ml trockenem Methylenchlorid wurde bei etwa 230C gerührt und 7,6^ g (10 mMol) Diphenylmethyl-(6R.7R)-3-(triphenylphosphoranylidenmethyl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxyiat
wurden portionsweise während 45 Minuten zugefügt. Nach weiterem 40minütigem Rühren wurde die Lösung durch
Filtration durch einen Kieselgurpfropfen geklärt, auf etwa 50 ml konzentriert und durch Chromatographie an
300 g Kieselgel mit Chloroform als Eluiermittel gereinigt.
Eindampfen des Eluates ergab 15,326 g eines Gels, das
in 15 ml Benzol gelöst wurde: diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 300 g Kieselgel mit
Benzol/Äthylacetat= 10 :1 als Eluiermittel gereinigt.
Fraktionen mit Rf-Werten von etwa 0,5 (System D) wurden vereint und im Vakuum eingedampft, und der
erhaltene Schaum (4,226 g, 613%) mit 25 ml Äther angerieben, wobei sich 3.493 g (51,2%) des Titelesters in
Form von gelben Schuppen ergaben. F. = 88 bis 108° (Zers.); [λ] I0=-443° (c=O98, CHCl3), Xmx (ÄtOH)
287 nm (ε 11 300) und 375 nm (ε 11 800), Inflexion bei
235 nm (ε24 700); das PMR-Spektrum (CDCl3)
zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 85 :15) der Z- und Ε-Isomeren war.
(b) Eine Lösung von 29,4 g (0,15 Mol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd
in 250 ml Methylenchlorid wurde heftig mit 750 ml gesättigtem Natriumbicarbonat: Wasser= 1 :1
gerührt und eine Lösung von 42,2 g (0,05 Mol)
(6R,7R)-[4-DiphenylmethoxycarbonyI-7(2-thienylacetamido^ceph-S-em-S-ylmethylJ-triphenylphosphoniumbromid
in 250 ml Methylenchlorid wurde während 30 Minuten zugetropfL
Nach weiterem 30minütigen Rühren wurde die organische Phase abgetrennt, auf etwa 100 ml konzentriert
und durch Chromatographie an 1,4 kg Kieselgel
mit etwa 51 Methylenchlorid, gefolgt von etwa 131
Chloroform als Eluiermittel, gereinigt. Eindampfen des Chloroformeluats ergab 40,8 g eines Schaums, der in
40 ml Benzol gelöst wurde; diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 600 g Kieselgel mit Benzol/
Äthylacetat= 10 :1 als eluiermittel chromatographiert.
Fraktionen mit Ri-Werten von etwa 0,5 (System D)
wurden vereint und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Schaum (19,7 g, 58%) wurde mit 100 ml Äther
angerieben und die Suspension unter Bildung von 15,765 g (46,3%) des Titelesters in Form von orangefarbenen
Schuppen filtriert; F. 104 bis 116° (Zers.); [Oi]1O0- -409° (C=I. 12, CHCl3), Am„. (ÄtOH) 287 nm
(ε 10 450) und 375 nm (e 17 000), Inflexion bei 235 nm ί 24 000); das PMR-Spektrum (CDCl3) zeigte an, daß
diese Probe eine Mischung (etwa 4:1) der Z- und E-Isomeren war.
Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Äthyiacetat geiöst und die Lösung in
Petroläther eingegossen, wobei sich ein zweiter Kristallanschluß von 1,344 g (4%) des Titelesters als
amorpher organfarbener Feststoff ergab, F. = 86-91° (Zers.); [<x]'D 0= -416° (c-\,\, CHCl3); Xn,,,. (ÄtOH)
280 nm (ε 11 300) und 363 nm (ε 10 600), Inflexion bei
235 nm (ε 23 900); das PMR-Spektrum (CDCl3) zeigte an, daß dieses Material hauptsächlich aus dem
Z-Isomeren bestand.
Das IR-Spektrum und chromatographische Charakteristika
dieser beiden Proben waren denen vorstehend unter (a) beschriebenen ähnlich.
(B) 3-(2,4-Dinitrostyryl)-(6R,7R)-
7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure,
E-lsomeres
Eine Lösung von 11,0 g (16,1 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-
ceph-3-crn-4-carboxy!ai (Z-Isomereo mit etwa 20%
Ε-Isomerem) in einer Mischung von 44 ml Trifluoressigsäure und 11 ml Anisol wurde 7 Minuten bei 23°
gehalten und anschließend die Lösungsmittel bei 40" (2 mm) entfernt.
10 ml Äthylacetat wurden zugefügt, die Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 75 ml
Äther angerieben, wobei sich 7359 g (88,6%) der Titelsäure in Form eines orangefarbenen Feststoffes
ergaben, F. 103 bis 113° (Zers.), [ä]^=-224° Cc=I1O,
Dioxan), Amax (ÄtOH) 231 nm (ε 24 300), 28S nm
(ε 10 300) und 386 nm (ε 18 000), Xmax. (0,1m-pH 6
Phosphatpuffer) 233ynm (ε 22 200), 290 nm (ε 12 200)
und 391 nm (ε 17 400); das PMR-Spektrum (DMSO-de) umfaßt die τ-Werte: 2,37 und 2,72 (CH = CH, zwei
Dubletts, J 16 Hz), 4,73 (Qe)-H, Dublett, J 5 Hz) und
534 und 6,26 (Q3J-H, AB-Quartett, JAb18 Hz). Rf 0,42
(System B) und 032 (System C).
(A)Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-jodmethyl-
7-(2'-t-butoxycarbonylamino-2'-phenylacetamido)-
ceph-3-em-4-carboxylat
Eine Lösung von 43,7 g piphenylmehlßRRJWtolpbbl
amino^'-phenylacetamidoVceph-S-ein^carboxylat in
250 ml Aceton wurde mit einer Lösung von 45 g Natriumiodid in 250 ml Aceton behandelt Die Mischung
wurde zwei Stunden in der Dunkelheit gerührt, dann in 2 I verdünnte Kochsalzlösung gegossen und
alles zusammen mit 2 χ 500 ml Äthylacetat extrahiert.
Die Extrakte wurden mit Wasser und wäßriger l%iger Natriumthiosulfatlösung und mit weiteren Wassermengen
gewaschen, getrocknet und im Vakuum auf etwa 150 ml eingedampft.
Diese Lösung wurde in 2,51 kräftig gerührten Petroläther (Kp. 40 bis 60°) gegossen, wobei sich 44,4 g
(89%) der Jodmethylverbindung in Form eines amorphen sahnefarbenen Feststoffes ergaben, F. 110 bis 127°
(Zers.); [>]»= -53,5° (c=l,0, CHCU), Am„. (ÄtOH)
282 nm (ε 7850).
(B)Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-(2,4-dinitro-
styryl)-7-(2'-t-butoxycarbonylamino-2'-phenyl-
acetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat,
Z-lsomeres(mit E-lsomerem)
Eine Lösung von 2,958 g (4 mMo!) Diphenylmethy!
(2'R,6R,7R)-3-jodmethyl-7-(2'-t-butoxycarbonylamino-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat
in 50 ml trockenem Methylenchlorid wurde in der Dunkelheit bei 23° gerührt, und eine Lösung von 1,574 g (6 mMol)
Triphenylphosphin in 25 ml Methylenchlorid wurde während 5 Minuten zugetropft. Die Lösung wurde eine
weitere Stunde gerührt und anschließend tropfenweise während 15 Minuten zu einer heftig gerührten Mischung
von 2,353 g (12 mMol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd in 50 ml Methylenchlorid und 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat/Wasser=
1 :1 getropft. Nach weiterem 40minütigem Rühren wurde die organische Phase abgetrennt,
mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, auf etwa 25 ml konzentriert und durch Chromatographie an 100 g
Kieselgel mit etwa 1 1 Methylenchlorid, gefolgt von etwa 1 1 Chloroform, als Eluiermittel gereinigt.
Durch Eindampfen des Chloroformeluats ergaben sich 2.43 g eines Schaums, der in 10 ml Benzol gelöst
wurde. Diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 80g Kieselgel mit Benzol/Äthylacetat-= 10 :1
als Eluiermittel gereinigt. Fraktionen mit Rr-Werten von
etwa O^ (System D) wurden vereinigt und im ViAuum
eingedampft. Der erhaltene Schaum (1,74 g, 55%) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther
eingegossen, wobei sich 1,489 g (47%) des Titelesters in Form eines amorphen gelben Farbstoffs vom F. 112 bis
119° (Zers.) ergaben; [α]?« -316° (c= 1,08, CHCl3);
Am«. (ÄtOH) 282 nm (ε 11 200) und 368 nm (ε 12 100);
das PMR-Spektrum (CDCI3) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 85:15) der Z- und
Ε-Isomeren war. Rf 0,51 (System D) und 035 (System F).
(C)(2'R,6R,7R)-7-(2'-Amino-2'-phenylacetamido)-
3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carbonsäure,
Trifluoressigsäuresalz, E-Isomeres
Eine Lösung von 130 g (1,64 mMol) Diphenylmethyl-
(2'R,6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2'-t-butoxycarbonylamino-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat,
Z-lsomeres (mit etwa 15% Ε-Isomerem) in einer Mischung von 10 ml Trifluoressigsäure und 23 ml
Anisol wurde 5 Minuten bei 25° gehalten und die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt
20 ml Äthyiacetat wurden zugesetzt, die Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 20 ml
Äther angerieben, wobei sich 998 mg (95%) des
Trifitforessigsäuresalzes in Form eines gelben Feststoffs
vom F. 156 bis 163° (Zers.) ergaben. A1^(AtOH) 280 nm
(ε 10000) und 387 nm (ε 13 100); das PMR-Spektrum (DMSO-de) umfaßte die r-Werte 233 und
(CH-CH, zwei Dubletts, I 16 Hz), 4,80 (Q6)--H,
Dublett, J 5 Hz) und 6,07 und 6,37 (Qj)-H, AB-Quartett, Jab18Hz).
(A)Dipheny!methyl-(6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat,
Z-und E-Isomere
(a) Eine Lösung von 1,2 g (16 mMol)4-Nitrobenzaldehyd
in 100 ml Methylenchlorid wurde in der Dunkelheit bei 23° mit 100 ml gesättigtem Natriumbicarbonat/
Wasser= 1 :1 gerührt und 1.786 g (2 mMol) (6R,7R)-[4-Diphei.ylmethoxycarbonyl^-^-thienylacetamido)-
ceph-3-em-4-ylmethyl]-triphenylphosphoniumjodid wurden portionsweise während 20 Minuten zugefügt.
Nach weiterem 40minütigen Rühren wurde die organische Schicht getrennt, mit 100 ml Kochsalzlösung
gewasch°ii, getrocknet, auf etwa 20 ml konzentriert und
durch Chromatographie an 120 g Kieselgel mit 11 Methylenchlorid, gefolgt von 1 I Chloroform als
Eluiermittel, gereinigt. Eindampfen des Chloroformeluats ergab 1,46 g eines Schaums, der in 10 ml Benzol
gelöst wurde; diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 30 g Kieselgel mit Benzol/Äthylacetat=10
:1 als Eluiermittel gereinigt.
Fraktionen mit Rf-Werten von etwa 0,5 (System D) wurden vereint und im Vakuum verdampft, wobei sich
900 mg (70,6%) eines öligen Feststoffs ergeben. Dieser Feststoff wurde mit 50 ml Methanol digeriert, wobei
sich 175 mg(13,7%)des Ε-Isomeren in Form von gelben Nadeln, vom F. 239 bis 242° (Zers.) ergaben;
Wo--177° (c=0,94. CHC|3), ;,„„,. (ÄtOH) 368 η m
(ε 27 300), inflexionen bei 295 nm (e 8300) und 235 nm
(s 20 300), Rf 0.52 (System D). 0,70 (System E) und 0.60
(System F).
Die Mutterlauge wurde im Vakuum eingedampfi, der
Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther eingegossen, wobei sich 480 mg (37.6%) des
Z-Isomeren in Form eines blaßgelben, amorphen Feststoffs vom F. 85 bis 9Γ (Zers.) ergaben:
[«]£==-435° (c=0,81. CHCI3), λ™,. (ÄtOH) 344 nm
(ε 13 500) und 283 ηm (ε 10 800), Inflexion bei 235 ηm
(ε 18 600). R, 0,52 (System D). 0.70 (System E) und 0.60
(System F). «
(b) Eine Lösung von 3,0 g (20 mMol) 4-Nitrobenzaldehyd
in 100 ml trockenem Methylenchlorid wurde bei 23"
gerührt und 3,83 g (5 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-triphenylphosphoranyliden-methyl-7-(2-thienylacetami-
do)-ceph-3-em-4-carboxylat wurden portionsweise während einer Stunde zugesetzt. Nach weiterem
einstündigem Rühren wurde die Lösung auf etwa 25 ml konzentriert und durch Chromatographie an 100 g
Kieselgel mit Chloroform als Eluiermittel gereinigt.
Das Eluat wurde im Vakuum eingedampft, der
Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 χ 100 ml). Wasser
(2 χ 100 ml) und 100 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und unter Bildung von 731 g eines öligen
Feststoffs eingedampft Dieser Feststoff wurde in 80 ml Benzol gelöst und die Lösung weiter durch Chromatographie
an 160 160 g Kieseigel mit Benzol/Äthylacetat= 10 : 1 als Eluiermittel gereinigt.
Durch Vereinigung der Fraktionen mit Rf-Werten von etwa 03 (System D) erhielt man 2,05 g (64%) eines
Schaums, der in Äthylacetat gelöst wurde. Die Lösung wurde in Petroläther eingegossen, wobei sich 1,64 g
(51^%) des Titelesters in Form eines gelben, amorphen Feststoffs vom F. 90 bis 95° (Zers.) ergaben,
[α]»--425° (t=0,69, CHCI3); Am„. (ÄtOH) 361 nm
(ε 18 700), Inflexionen bei 283 nm (ε 18 900) und 235 nm
(ε 18 700); das PMR-Spektrum (CDCl3) zeigte an, daß
das Material eine Mischung (etwa Γ : ; der Z- und
Ε-Isomeren mit Signalen bei τ 3,40 (CH = CH) und 6,68 und 7,01 (Q2)- H) für das Z-Isomere und bei ν 2,48 und
3,35 (CH = CH) und 6,29 und 6,50 (Qj)-H) für das Ε-Isomere war.
(B)3-(4-Nitrostyryl)-(6R.7R)-
7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure,
E-Isomeres
303 mg (0,475 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxy-
lat, Ε-Isomeres, wurden mit 1,2 ml Trifluoressigsäure und 0,3 ml Anisol behandelt und nach 5 Minuten wurden
die Reagentien bei 40° (2 mm) eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst, die
Lösung mit wäßriger Natriumbicarbnnatlösung (300 ml, 2 χ 50 ml) extrahiert, der Extrakt mit 200 ml Äthylacetat
überschichtet und auf pH 2 mit 2n-Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt,
mit 50 ml Wasser und 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und zu 145 mg (65%) eines Feststoffs
eingedampft.
Anreiben dieses Feststoffs mit 20 ml Äther ergaben 95 mg (42%) der Säure in Form von gelben Plättchen
vom F. 173 bis 19Γ (Zers.). [>]2 D 3=-42° (c=0J5,
Aceton), λ,,,.Μ (0,1m —pH 6 Phosphatpuffer) 233 ηm
(ε 16 200) und 375 nm (ε 21 600). Inflexion bei 300 ηm
(ε 10 100), λ,,,31. (ÄtOH) 232 nm (ε 16 100) und 372,5 nm
(ε 22 600), Inflexion bei 291 nm (ε 8200); das PMR-Spektrum (DMSO-db) zeigte die r-Werte 2,32 und 2,84
(CH = CH. zwei Dubletts.] 16 Hz), 4.76 (Q6)- H, Dublett
J 5 Hz) und 5.88 und 6.26 (Cp)-H, AB-Quartett, Jab 18 H^); Rf 0,55 (SysieiVi B), ümuO.81 \Systcm C;.
(C)(6R.7R)-3-(4-Nitrostyryl)-
7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure,
Z-Isomeres(mit E-Isomeren)
Eine Lösung von 1.27 g (1.99 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-7-(2-thienylaceta.rido)-ceph-3-
em-4-carboxylat, Z-Isomeres. in einer Mischung von 5 ml Trifluoressigsäure und 1,3 ml Anisol wurde 5
Minuten bei etwa 230C gehalten, die Lösungsmittel
wurden bei 40° (2 mm) entfernt und der Rückstand zwischen 100 ml Äthylacetat und 100 ml gestättigtem
Natriumbicarbonat/Wasser= 1 :1 aufgeteilt. Die wäC:' ge Phase wurde abgetrennt, mit 2 n-ChlorwaEserstoffsäure
auf den pH 2 angesäuert, mit 150 ml Äthylacetat extrahiert; der Extrakt wurde mit 100 ml Wasser und
100 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Der zurückbleibende Schaum (875 mg. 93%) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther
gegossen, wobei sich 715 mg (76%) der Säure als blaßgelber, amorpher Feststoff vom F. 95 bis 110'C
(Zers.) ergaben. [a]£3=-307° fc= 1.15, Dioxan); Xmax_
(ÄtOH) 232,5 nm (ε 16 700), 288 ηm (ε 11 100) und
371 nm (ε 17 600), Amat. (0,lm-pH6 Phosphatpuffer)
231.5 nm (ε 18 300), 284,5 nm (ε 13 100) und 355 nm (ε 12 400); das PMR-Spektrum (DMSO-d6) zeigte an,
daß dieses Material eine Mischung (etwa 1:1) der Z- und Ε-isomeren mit Signalen bei r 3,26 (CH=CH,
Singulett), 4,76 (Qe)-H, Dublett. J 5 Hz) und 6,37 und
6,80(Q2)—H, AB-Quartett, Jab 18 Hz) für das Z-Isomere
und bei τ 232 und 2,84 (CH = CH) und 5.88 und 6.26
(Q2)- H) für das Ε-Isomere, war. Rf 0,55 (System B) und
0,81 (SystemC).
(A)Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-
7-(2'-t-butoxycarbonylamino-2'-phenyl·
acetamido)-ceph-3-em-4-carfaoxylat,Z-Isomeres
(mit Ε-Isomerem)
Eine Lösung von 1,479 g (2 mMol) (2'R,6R,7R)-3-Jodmethyl-7-(2'-t-butoxycarbonylaniino-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat in 20 ml trockenem Methy-
lenchlorid wurde bei 23° in der Dunkelheit gerührt und eine Lösung von 7S7 mg (3 mMol) Triphenylphosphin in
10 ml Methylenchlorid wurde während 5 Minuten zugetropft Die Lösung wurde während weiterer 90
Minuten gerührt und tropfenweise zu einer heftig M genährten Mischung von 1,2 g (8 mMol) 4-Nitrobenzaldehyd in 50 ml Methylenchlorid und 50 ml gesättigtem
Natriumbicarbonat/Wasser = 1:1 gefügt Nach weiterem 40minütigem Rühren wurde die organische Phase
abgetrennt mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und zu 333 g eines öligen Feststoffs
eingedampft
Eine Lösung dieses Feststoffs in 10 ml Methylenchlorid wurde durch Chromatographie an 100 g Kieselgel
mit etwa 1 1 Methylenchlorid, gefolgt von etwa 131
Chloroform als Eluiermittel, gereinigt Durch Eindampfen des Chloroformeluats erhielt man 1,65 g eines
Schaums, der in 10 ml Benzol gelöst wurde. Diese
Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 32 g Kieselgel mit Benzol: Äthylacetat= 10 :1, als Eluiermittel, gereinigt
Durch Vereinigung der Fraktionen mit Rf-Werten von etwa 0,5 (System D) ergaben sich 669 mg (45%)
eines Schaums, der in Äthylacetat gelöst wurde. Die Lösung wurde in Petroläther eingegossen, wobei sich *<>
570 mg (38%) des Esters als blaßgelber, amorpher Feststoff vom F. 111 bis 118° (Zers.) ergaben,
[α] £"=-329° (c=0$2, CHCI3; An,,,. (ÄtOH) 285 nm
(ε 9000) und 359 nm (ε 18 600); das PMR-Spektrum (CDCb) zeigte an, daß dieses Produkt eine Mischung «
(etwa 7 :3) der Z- und Ε-Isomeren war. Rf 0,52 (System D) und 0,40 (System F).
(B) 3-(4-Nitrostyryl)-(2'R,6R.7R)-7-(2'-amino-2-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, Trifluzoressigsäuresalz (E-Isomeres)
Eine Lösung von 500 mg (0,67 mMol) Diphenylmethyl-(2'R,6R,7R)-3-(4-nitrostyryl)-7-(2'-t-butoxycarbo-S5
nyIamino-2'-phenylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat (Z : E - 7 :3) in einer Mischung von 4 ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol wurde 5 Minuten bei 23' gehalten,
die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt und der Rückstand mit 20 ml Äther angetrieben, wobei sich
350 mg (88%) des Trifluoressigsäuresalzes in Form eines gelben Feststoffs vom F. 153 bis 156° (Zers.)
ergaben. [«]J,J--2I2O ^=0,9, Dioxan), Xn^ (AtOH)
290 nm (ε 9450) und 372,5 um (ε 18 400); das PMR-Spektrum (DMSO-de) umfaßte die r-Werte 2,48 und 2,90
(CH - CH, zwei Dubletts, J 16 Hz), 483 (Q61 - H, Dublett.
J 5 Hz) und 6,02 und 6.40 (Qj)-H. AB-Quartett,
JabI8 Hz).
(A) DiphenyImethyl-(6R,7R)-3-(4-cyanostyryl)-
Eine Lösung von 636 g (50 mMol) 4-Cyanobenzaldehyd in 250 ml trockenem Methylenchlorid wurde bei 23°
gerührt und 3,825 g (5 mMol) Diphenylme-
thyl-(6R,7R)-3-triphenylphosphoranylideninelhyi)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat wurden
portionsweise während zwei Stunden zugesetzt Die Lösung wurde weitere 16 Stunden gerührt, auf etwa
25 ml konzentriert und durch Chromatographie an 120 g Kieselgel mit etwa 21 Methylenchlorid, gefolgt
von etwa 21 Chloroform, als Eluiermittel, gereinigt
Durch Eindampfen des Chloroformeluats ergaben sich 4,15 g eines Schaums, der in 20 ml Benzol gelöst
wurde. Diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 90 g Kieselgel mit Benzol/Äthylacetat= 10 :1
als Eluiermittel gereinigt Fraktionen mit Rr-Werten von
etwa 0,45 (System D) warden vereint und ins Vakuum
unter Bildung von 2,016 g (65%) eines blaßgelben Feststoffs eingedampft Dieser Feststoff wurde mit 50 nl
warmem Methanol digeriert die Suspension wurde auf etwa 23° gekohlt und die Feststoffe abfiltriert und im
Vakuum unter Bildung von 615 mg (20%) des Ε-Isomeren in Form von farblosen Nadeln vom F. 235
bis 237° (Zers.) getrocknet [a]^=-194° (c=0,83,
CHCl3); ληαχ. (ÄtOH) 3463 nm (ε 33 100), Inflexionen bei
257 nm (ε 11 200) und 235 nm (ε 19 200). Rf 0,46 (System
D) und 038 (System F).
Die Mutterlauge wurde im Vakuum eingedampft der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung in
Petroläther gegossen, wobei sich 1,15 g (38%) des Z-Isomeren in Form eines amorphen, farblosen
Feststoffs vom F. 91 bis 97° (Zers.) ergaben. M?--47.2· (c=0,91, CHCl3); Am„ (ÄtOH) 326 nm
(ε 14 800) und 258 nm (ε 12 900), Inflexion bei 235 nm (ε 19 100). Rf 0,46 (System D) und 038 (System F).
(B)(6R,7R)-3-(4-Cyanostyryl)-7-(2-thienyI-acetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, E-Isomeres
Eine Lösung von 534 mg (0,864 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(4-cyanostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, E-Isomeres, in 2 ml Trifluoressigsäure und 03 ml Anisol wurde 5 Minuten bei
etwa 23° gehalten, die Lösungsmittel wurden bei 40° (2 mm) eingedampft, 10 ml Äthylacetat wurden zugesetzt und die resultierende Suspension im Vakuum
eingedampft.
Der Rückstand wurde mit 25 ml Äther angerieben, wobei sich 368 mg (94%) der Säure in Form von gelben
Nadeln vom F. 118 bis 129° (Zers.) ergaben. Wo --38° (c-1.05, Aceton), Xmix. (ÄtOH) 2343 nm
(ε 16 800) und 347 nm (ε 29 300). Inflexion bei 256 mm (ε 10 100); das PMR-Spektrum (DMSO-d6) zeigte die
τ-Werte 2,38 und 2,86 (CH-CH. zwei Dubletts, J 16 Hz)
und 530 und 6,28 (Qj)-H, AB-Quartett, Jab 18 Hz).
Rr 0,41 (System B) und 0,86 (System C).
(C)(6R.7R)-3-(4-Cyanostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäurc. Z- Isomeres
Eine Lösung von 1.0 g (1,62 mMol) Diphenylmcthyl-(6R,7R)-3-(4-cyanostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph·
3-em-4-carboxylat, Z-Isomeres, in einer Mischung von
4 ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol wurde zwei Minuten bei etwa 23" gehalten und die Lösungsmittel
bei 40° (2 mm) entfernt. Der Rückstand wurde zwischen
50 ml Äthylacetat und 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat/Wasser=l
:1 aufgeteilt Die wäßrige Phase wurde abgetrennt, mit to-Chlorwasserstoffsäure auf
den pH 2 angesäuert und mit Äthylacetat (100 mL 25 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde mit 50 ml Wasser und
50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum verdampft
Der zurückbleibende Schaum (763 mg) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther
gegossen, wobei sich 594 mg (81%) der Säure in Form ι ο
eines blaßgelben, amorphen Feststoffs vom F. 89 bis 102° (Zers.) ergaben, [α]*"=-354° (c= 1,18, Dioxan);
λ „αχ. (0,1 m - pH 6 Phosphatpuffer) 233 nm (ε 18 800) und
320 nm (ε 14 100), Inflexion bei 255 nm (ε 14 000), Xn^
(ÄtOH) 234 nm (ε 17 900) und 3223 nm (ε 14 400), is
Inflexion bei 260 nm (ε 10 400); das PMR-Spektrum (DMSO-de) zeigte die r-Werte 332 (CH=CH, Singulett),
4,76 (Qe)-H, Dublett J 5 Hz) und 6,40 und 6,82 (Q2)-H, AB-Quartett Jab 18 Hz). Rf 0,41 (System B)
und 0,86 (System C).
(A)Diphenylmethyl-(6R,7R)-7-amino-
3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carboxylat,
Z-Isomeres (mit E-lsomerem)
Eine Lösung von 038 ml (7,2 mMol) Pyridin in 5 ml
trockenem Methylenchlorid wurde während 5 Minuten zu einer gerührten Lösung von 1,5 g (7,2 mMol)
Phosphorpentachiorid in 20 ml trockenem Methylenchlorid zugefügt. Nach weiterem fünfminütigem Rühren
wurde die arme Suspension gekühlt und eine Lösung von 2^ g (3,66 mMol) Diphenyimethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carb-
oxylat (Z-lsomeres mit etwa 20% Ε-Isomerem) in 25 ml
Methylenchlorid wurde während 10 Minuten zugetropft, wobei die Temperatur bei etwa 0° gehalten
wurde.
Es wurde weitere zwei Stunden gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 23° ansteigen konnte. Die Lösung
wurde in eine auf etwa 10° gekühlte Mischung von 15 m! Methanol und 20 ml Methylenchlorid gegossen, die
resultierende Lösung 15 Minuten gerührt und mit 50 ml In-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und 30 Minuten
mit gesättigtem Natriumbicarbonat (100 ml) gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 50 ml
gesättigtem Natriumbicarbonat und 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Das zurückbleibende öl wurde in Chloroform gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen, wobei sich
1332 g (653%) des Amins in Form eines orangefarbener Feststoffes vom F. 117 bis 127° (Zers.) ergaben,
[α] ^= -356° (c= 1.11, CHCI3): Am„. (CHCI3) 2863 nm
(e 10 800) und 375 nm (ε 12 000); das PMR-Spektrum
(DMSOd6) zeigte an. daß dieses Material eine Mischung (etwa 3:1) von Z- und Ε-Isomeren war.
R( 0.43 (System E), M 5.2 cm.
(B)Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(
1 -naphthoyiaminoj-ceph-S-em^-carboxylat.
Z-Isomeres (mit E-lsomerem)
Eine Lösung von 1,117 g (2 mMol) Diphenylmethyl-(6R.7R)-7-amino-3-(2.4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-
carboxylat (mit etwa 25% E-lsomerem), Z-Isomeres, in 20 ml trockenem Ν,Ν-Dimethylformamid wurde bei 23"
gerührt und während 10 Minuten mit einer Lösung von 420 mg (2.2 mMol) I-Naphthoylchlorid in 10 ml trocke
25
30
35
40
45
50
60 nem Acetonitril behandelt Nach einer Stunde weiterem Rühren wurden die Lösungsmittel bei 40° (2 mm)
entfernt, der Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst die Lösung mit 2 χ 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat
50 ml Wasser und 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und zu 1365 g eines Schaums eingedampft
Dieses Material wurde in 10 ml Benzol gelöst und die Lösung durch Chromatographie an 32 g Kieselgel mit
Benzol/Äthylacetat=10 :1 als Eluiermittel gereinigt
Fraktionen mit Rr-Werten von etwa 0,6 und 03 (System
D) wurden vereint und im Vakuum eingedampft Der zurückbleibende Feststoff (900 rng, 63%) wurde mit
25 ml Äther angerieben, wobei sich 725 mg (51%) des Esters in Form von orangefarbenen Prismen vom F. 124
bis 148° (Zers.) ergaben.[λ] £= -331° (c= 1,12, CHCI3);
Am« (ÄtOH) 2813 nm (ε 16 600) und 373 nm (ε 15 000);
das PMR-Spektrum (CDCI3) zeigte, daß dieses Material
eine Mischung (etwa 7 :3) von Z- und Ε-Isomeren war. Rf 038 und 031 (Z- bzw. Ε-Isomere) (System D) und Rf
031 (System F).
(C)(6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-(l-naphthoylamino)-ceph-3-em-4-carbonsäure,
E-Isomeres
Eine Lösung von 600 mg (0,84 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(l-naphtoylamino)-ceph-3-em-4-carboxylat,
Z-Isomeres (mit etwa 25% E-lsomerem) in einem Gemisch von 2,4 ml Trifluoressigsäure
und 0,6 ml Anisol wurde 5 Minuten bei 23° gehalten und die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt.
20 ml Äthylacetat wurden zugefügt, die erhaltene Lösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit
20 ml Äther angerieben, wobei sich 325 mg (703%) der Säure in Form eines dunklen orangefarbenen Feststoffs
vom F. 136 bis 145° (Zers.) ergaben. [a]2 D 3=312°
(c=0,49, Aceton); Ama,. (ÄtOH) 282 ηm (ε 15 700) und
390 nm (ε 14 200): das PMR-Spektrum (DMSO-d6)
umfaßte 2,72 (CH = CH. Dublett, ] 16 Hz), 438 (Q6)- H.
Dublett, J 5 Hz) und 5,91 und 6,21 (C(2)- H, AB-Quartett,
Jab 18 Hz). Rf 0,55 (System B) und 0,78 (System C).
(A) Diphenylmethyl-(6R,7 R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-
7-[(Z)-2-hydroxyimino-2-phenylacetamido]-ceph-3-em-4-carboxylat,
Z-Isomeres (mit E-lsomerem)
Eine Lösung von 1,117 g (2 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-7-amino-3-(2.4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-
carboxylat, Z-Isomeres (mit etwa 25% E-lsomerem), hergestellt wie im Beispiel 6/A) und 0,57 ml
Propylenoxid in 10 ml trockenem Äthylacetat wurde bei
23° gerührt und während IO Minuten mit einer Im-Lösung von (Z)-2-Dichloracetoxyimino-phenylacetylchlorid
in Äthylacetat (2x4 ml. etwa 1,2 Äquivalente)
behandelt. Nach weiterem 45minütigem Rühren wurde die Lösung mit 20 ml 2n-Chlorwasserstoffsäure und
20 ml gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen, getrocknet und zu 1,892 g eines Schaumes eingedampft.
Dieses Material wurde in 5 ml Benzol gelöst und die Lösung durch Chromatographie an 60 g Kieselgel mit
Benzol/Äthylacetat= 10 : 1 als Eluiermittel gereinigt. Fraktionen mit Rf-Werten von etwa 0.4 (System D)
wurden vereint und im Vakuum eingedampft. Der zurückbleibende Schaum (999 mg. 70,7%) wurde in
Äthylacetat gelöst und die Lösung in Petroläther gegossen, wobei sich 886 mg (67%) des Esters in Form
eines amorphen, orangefarbenen Feststoffs vom F. 114
bis 122° (Zers.) ergaben, [a] J0= -343° Cc=OSe1CHCIj):
λ,,,.Μ. (ÄtOH) 372 nm (ε 13 200), Inflexion bei 240 ηm
(ε 23 600); das PMR-Spektrum (CDCl3) zeigte an, daß
dieses Material eine Mischung (etwa 4:1) der Z- und
E-lsomeren war. Rf 036 (System D) und 0,12 (System F).
(B)(6RJR)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-
7-[(Z)-2-hydroxyimino-2-phenyIacetamido]-
ceph-3-em-4-carbonsäure, E-Isomeres
Eine Lösung von 715 mg (1,01 mMol) des vorstehend
unter (A) beschriebenen Esters in 2,88 ml Trifluoressigsäure und 0,72 ml Anisol wurde 4 Minuten bei 23°
gehalten und die Lösungsmittel bei 40° (2 mm) entfernt Der Rückstand wurde in 20 ml Äthylacetat gelöst, die
Lösung mit 15 ml 2n-Chlorwasserstoffsäure, 15 ml Wasser und 20 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft Der Rückstand wurde
mit 50 ml Äther angerieben und ergab 242 mg (443%) der Säure in Form eines dunkelorangefarbenen
Feststoffs vom F. 165 bis 173° (Zers.). [«]*>=-236,5
fc=0,9, Dioxan); Xmla. (ÄtOH) 244 nm (ε 24 700) und
389 nm (ε 14 100); das PMR-Spektrum (DMSO-de) umfaßte die τ-Werte 2,72 (CH=CH, Dublett 116 Hz),
4,64 (C{6)-H, Dublett, J 5 Hz) und 536, 6,25 (Cp)-H,
AB-Quartett JAB18Hz). Rf 0,54 (System B) und 0,78
(System C). Diese Probe enthielt eine geringe Menge einer sauren Verunreinigung, die als roter Fleck
wanderte, Rf etwa 0,10 (System C).
(A)Diphenylmethyl-(lS,6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-
7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat-1-oxid,
Eine Lösung von 610 mg (etws 2 mM- Ί) meta-Chlorperbenzoesäure in 25 ml trockenem Methylendichlorid
wurde während 5 Minuten zu einer gerübien Lösung
von 1356 g (2 mMol) DiphenyImethyl-(6R,7R)-3-(2,4-di-
nitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido-ceph-3-em-4-carboxylat (Z-lsomeres, mit etwa 15% E-Isomerem,
hergestellt wie in Beispiel 1 (AXb) beschrieben) in 25 ml Methylendichlorid gefügt. Nach weiterem 15minütigern
Rühren wurde die Lösung mit 2 χ 25 ml gesättigtem Natriumbicarbonat, 2 χ 25 ml Wasser und 25 ml Kochsalzlösung gewaschen und mit etwas Aktivkohle
behandelt. Die Suspension wurde durch einen Kieselgurpfropfen filtriert, das Filtrat getrocknet und das
Lösungsmittel im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Feststoff (1,42 g) wurde mit 25 ml Äther angerieben,
wobei sich 1,25 g (89,5%) des Titeloxids in Form von
gelben Prismen vom F. 125 bis 132° (Zers.) ergaben. [«] g>_ -428° (C= 1,23, CHCl3); Am„. (ÄtOH) 276 nm
(ε 11 700) und 360 nm (ε 12 700), Inflexion bei 235 nm (ε 24 000); das PMR-Spektmm (DMSO-d6) zeigte an,
daß dieses Material eine Mischung (etwa 85 :15) der Z- und Ε-Isomeren war. Rf 0,44 (System E).
(B)(lS,6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-(2-lhienyl
acetainidoJ-ceph-S-em^-carbonsäure-1 -oxid,
E-Isomeres
Eine Lösung von 1,0 g (1,43 mMol) Diphenylmethyl-(lS,6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-cärböxylät-l-öxid (Z-Isömeres) mit etwa
15% Ε-Isomerem) in einer Mischung von 4 ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol wurde 5 Minuten bei
23° gehalten und die Lösungsmittel wurden bei 40° (2 mm) entfernt. 20 ml Äthylacetat wurden zugesetzt,
die erhaltene Suspension zur Trockne im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 25 ml Äther
angerieben, wobei sich 690 mg (90,5%) der Säure in
Form eines gelben Feststoffs vom F. 144 bis 150° (Zers.)
ergaben. [«]£= -300° £=0,94, Aceton); In^. (AtOH)
230 nm (ε 24 200), 285 nm (ε 9700) und 376 nm (ε 19 900); das PMR-Spektrum (DMSO-de) umfaßte die r-Werte
2^2 und 2,73 (CH=CH, zwei Dubletts, J 16Hz), 4,94
(CfJS)-H, Dublstt J 5 Hz) und 5,56 und 633 (Q2J-H2),
AB-Quartett, JAB18Hz). Rf 0,46 (System B) und
(SystemC).
(A) Diphenylmethyl-(6R,7R)- 3-(2,4-dinitrostyryl)-
7-formamido-ceph-3-em-4-carboxylat
(a) Eine Lösung von 975 mg (2 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7 R)-3-brommethyl-7-formamido-
ceph-3-em-4-carboxylat und 800 mg (3 mMol) Triphenylphosphin in 30 ml Methylendichlorid wurde drei
Stunden in der Dunkelheit bei 23° gerührt und wurde dann während 10 Minuten zu einer heftig gerührten
Lösung von 1,177 g (6 mMol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd in
einer Mischung von 50 ml Methylendichlorid und 50 ml
gesättigtem Natriumbicarbonat/Wasser = l :1 gefügt Nach weiterem 30minütigem Rühren wurde die
organische Phase abgetrennt, mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, auf etwa 25 ml konzentriert und durch
Chromatographie an 80 g Kieselgel mit etwa 11 Methylendichlorid, gefolgt von etwa 1 I Methylendichlorid/Aceton = 1:1 als Eluiermittel, gereinigt. Durch
Verdampfen des letzteren Teiles des Eluats ergaben sich 132 g eines Schaums, der in 5 ml Benzol gelöst wurde.
Diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie an 30 g Kieselgel mit Benzol/Äthylacetat=5 :1 als Eluiermittel gereinigt Fraktionen mit Rf-Werten von etwa 0,4
(System E) wurden vereint und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der erhaltene Schaum (640 mg, 54,5%)
wurde mit 20 ml Äther angerieben, wobei sich 485 mg (41%) des Titelesters in Form eines orangefarbenen,
granulären Feststoffs vom F. 118 bis 124° (Zers.) ei gaben, [a] J2--350° (c=0,8, CHCl3); Xn^. (ÄtOH)
279 nm (ε 11 700) und 365 nm (ε 12 700) [ε-Werte
berechnet für C29H22N4O8S (586,6), 1/2 At2O]; das
PMR-Spektrum (CDCI3) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung (etwa 9 :1) der Z- und E-lsomeren war.
Rt 0,40 (System E).
(b) Eine Suspension von 503 mg (1 mMol) Diphenylmethyl-(lS,6R,7R)-3-brommethyl-7-formamidoceph-3-
em-4-carboxylat-l-oxid, in 25 ml trockenem Methylendichlorid wurde in der Dunkelheit bei 23° gerührt, und
eine Lösung von 525 mg (2 mMol) Triphenylphosphin in 5 ml Methylendichlorid wurde zugesetzt Nach 4stündi
gern Rühren wurde die Lösung während 5 Minuten zu
einer heftig gerührten Lösung von 589 mg (3 mMol) 2,4-Dinitrobenzaldehyd in einer Mischung von 50 ml
Methylendichlorid und 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat/Wasser -1:1 gefügt. Die Mischung wurde
weitere 30 Minuten gerührt und die organische Phase abgetrennt, mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen, auf
etwa 50 ml konzentriert und durch Chromatographie an 40 g Kieselgel mit etwa 1 1 Methylendichlorid, gefolgt
von etwa 500 ml Methylendichlorid/Aceton -1 :1, als
Eluiermittel, gereinigt. Durch Verdampfen des letzteren Teils des Eluiermitiels ergaben sich 880 mg eines
Schaums, der in 5 ml Methylendichlorid gelöst wurde, und diese Lösung wurde weiter durch Chromatographie
an 35 g Kieselgel mit Methylendichlorid : Aceton=8 :1
als Eluiermittel gereinigt Fraktionen mit Rf-Werten von
etwa 0,4 (Merck-Kieselgel® F^-Dünnschichtchromatographie-Platten,
entwickelt mit Methylendichlorid/Aceton=4 :1) wurden vereint und im Vakuum zur Trockne
eingedampft Der erhaltene Feststoff (720) mg wurde mit 30 ml Äther angerieben, wobei sich 445 mg
(74%) Diphenylmethyi-(1 S,6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryI)-7-formamidoceph-3-em-4-carboxyIat-l-oxid,
in Form eines gelben Feststoffs vom F. 115 bis 125° (Zers.) ergaben, [aß2=-383° (c=0,82, CHCl3); A^ (AtOH)
2643 nm (ε 10400), 271.5 nm (ε 10 200) und 363 nm
(ε 13 100); das PMR-Spektrum (DMSOd6) zeigte an,
daß dieses Materia! eine Mischung (etwa 4:1) der Z- und Ε-Isomeren war. Eine Lösung von 302 mg
(0,5 mMol) des Oxids in 20 ml trockenem Methylendichlorid
wurde bei —20° gerührt und während 5 Minuten mit einer Lösung von 0,12 ml (etwa 23 Äquivalente)
Phosphortribromid in 5 ml Methylendichlorid behandelt.
Die Lösung wurde eine weitere Stunde bei —10 bis -15" gerührt und anschließend während 5 Minuten zu
25 ml gekühltem (0°) gesättigtem Na;?iumbicarbonat gefügt. Die Mischung wurde weitere 30 Minuten
gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 23° ansteigen konnte, und die organische Phase wurde abgetrennt mit
gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser und Kochsalzlösung (jeweils 25 ml) gewaschen, mit Aktivkohle
behandelt, durch einen Kieselgurpfropfen filtriert, getrocknet und unter Bildung von 240 mg eines
Feststoffs eingedampft. Eine Lösung dieses Feststoffs in Äthylacetat wurde in Petroläther eingegossen, wobei
sich 200 mg (68%) des Titelesters als gelber, amorpher Feststoff vom F. 90 bis 100° (Zers.) ergaben.
[«]J D :=-278° (C= 035, CHCI3); Am„. (ÄtOH) 285 πm
(ε 9800) und 372 nm (ε 14 500); das PMR-Spektrum (CDCI3) zeigte an, daß dieses Material eine Mischung
(etwa 2:1) der Z- und Ε-Isomeren war. Das IR-Spektrum und chromatographische Charakteristika
dieser Probe waren der vorstehend unter (a) beschriebenen ähiiiich.
(B)(6R,7R)-3-(2,4-Dinitrostyryl)-7-formamidoceph-3-em-4-carbonsäure,
E-Isomeres
Eine Lösung von 1,5 g (2,56 mMol) Diphenylmethyl-(5R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-formamidoceph-3-env4-carboxylat,
Z-Isomerss (mit etwa 15% E-Isomerem), in
einer Mischung von 6 ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol wurde 5 Minuten bei 23° gehalten und die
Lösungsmittel wurden bei 40° (2 mm) entfernt. 10 ml Äthyiacetat wurden zugefügt, die erhaltene Suspension
im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 50 ml Aceton gelöst und mit etwa 1 g Aktivkohle
zersetzt. Die Mischung wurde 10 Minuten gerührt und durch einen Kieselgurpfropfen filtriert und das Filtrat
wurde getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 50 ml Äther
angerieben, wobei sich 854 mg (79,5%) der Säure in Form von orangefarbenen Prismen vom F, 163 bis 169°
(Zers.) ergaben. [«]£'=-95° (c= 1,14, Aceton); Xmlx
(ÄtOH) 290 nm (ε 10 400) und 384 nm (ε 18 500), Am„.
(0,1m-pH 6 Phosphatpuffer) 290,5 nm (ε 12 300) und
388 nm (ε 18 800); das PMR-Spektrum (DMSO-d6)
umfaßte die τ-Werte 2,38 und 2,72 (CH = CH, zwei Dubletts, J 16Hz), 4,72 (Q6)-H, Dublett. J 5 Hz) und
5,92 und 6,26 (C<2)- H2, AB-Quartett, Jab 18 Hz). R, 0.31
(System B) und 0,36 (System C).
DiphenyImethyI-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryI)
7-(2-thienyiacetamido)-ceph-3-em-4-carboxyIat
Z-Isomeres (mit E-Isomerem)
Eine Suspension von 391 mg (0,66 mMol) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-7-formamidoceph-3-em-4-carboxylat,
Z-Isomeres (mit etwa 15% E-Isomerem), in 10 ml Methanol wurde bei 0° gerührt und
ίο 0,13 ml (etwa 2 Äquivalente) Phosphoroxychiorid
wurden während zwei Minuten zugefügt Die Mischung wurde weitere drei Stunden gerührt wobei die
Temperatur auf etwa 23° ansteigen konnte, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen ent-
fernt 10 ml Äthylacetat wurden zugesetzt und die erhaltene Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wurde in Methylendichlorid gelöst und die Lösung in Äther eingegossen, wobei sich 351 mg
(88,5%) DiphenyImethyl-(6R,7R)-7-amino-3-(2,4-dinitrostyryl)-ceph-3-em-4-carboxy';,t-hydrochlorid,
in Form eines orangefarbenen Feuts'offs vom F. !28 bis
136° (Zers.) ergaben. [a]<,:=-279° (c=0,95, CHCI3);
λ«,». (ÄtOH) 283^ nm (ε 11 000) und 370 nm (ε 14 700);
das PMR-Spektrum (DMSO-dc) zeigte an, daß dieses
Material haptsächlich das Z-Isomere war.
Eine Lösung von 238 mg (0,4 mMol) des Atninhydrochlorids in 20 ml Methylendichlorid wurde 20
Minuten mit 20 ml gesättigtem Natriumbicarbonat gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit
10 ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und 104 mg (0,5 m mol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden
zugefügt. Die erhaltene Lösung wurde bei etwa 23° gerührt und während 5 Minuten mit einer Lösung von
121 mg (0,5 mMol) 2-Thienylessigsäure in 15 ml Methylenchlorid
behandelt. Nach weiterem 30minütigem Rühren wurde der Feststoff abfiltriert und das Filtrat
während 30 Minuten mit 50 ml gesättigtem Natriumbicarbonat/Wasser = 1 :1 gerührt. Die orga.nsche Phase
wurde abgetrennt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung (jeweils 25 m!) gewaschen, getrocknet
und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit 20 ml Allylacetat extrahiert und der Extrakt durch
eine Säule mit 20 g Kieselge! mit Äthylacetat als Eluiermittel geleitet. Das Eluat wurde im Vakuum zur
Trockne eingedampft; der feste Rückstand (290 mg) wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung in
Petroläther gegossen, wobei sich 216 mg (82,5%) des Titelesters in Form eines blaßorangefarbenen amorphen
Feststoffs vom F. 90 bis 96° (Zers.) ergaben.
i«]2 D 2=-350° (c=0,89, CHCI3); Am„. (ÄtOH) 282 nm
(ε 11 400) und 372 nm (ε 14 200); das PMR-Spektrum
(CDCI3) zeigte an, daß dieses Material hauptsächlich aus
icm Z-isomeren bestand.
a) Diphenylmethyl-(6R,7R)-3-(2,4-dinitrostyryl)-
7-phenoxy-acetamidoceph-3-em-4-carboxylat.
Z-Isomeres (mit E-lsomerem)(I)
EinfcLöSUrigvQn5,637g(6R,7R)-(4-Diphenylmethoxycarbonyl-l'-phenoxy-acetamidoceph-S-rm-S-ylmethyl)triphenylphosphonium-bromid
(hergestellt wie in dem britischen Patent 1342 241 beschrieben) in 100 ml
Dichlormethan wurde tropfenweise während 10 Minuten zu einer kräftig gerührten Mischung von 300 ml
wäßrigem Natriumbicarbonat und 300 ml Dichlormethan, die 2,58 g 2,4-Dinitrobenzaldehyd enthielten,
gegeben. Das Zwei-Phasen-System wurde während
20
weiterer 30 Minuten gerührt und die organische Phase wurde abgetrennt und mit 100 ml Salzlösung gewaschen,
getrocknet und zu einem Schaum eingedampft, 7,87 g. Dieser Schaum wurde in 10 ml Dichlormethan
gelöst und die Lösung wurde durch Säulenchromatographie
an Kieselgel (Merck 0,05 -0,2 mm, 250 g) gereinigt. Die Säule wurde mit etwa 1,51 Dichlormethan eluiert,
um restlichen 2,4-Dinitrobenzaldehyd zu entfernen, und dann mit Dichlormethan/Aceton = 50 :1; die Fraktionen
mit Rf etwa 0,3 (Dünnschichtchromatographie, Merck Kieselgel« F545-Plättchen entwickelt mit Toluol/Äthylacetat
= 5:l) wurden vereinigt und in Vakuum zur Trockne eingedampft, so daß man 3,26 g des Titelesters
als Schaum erhielt. Dieses Material wurde mit 30 ml Äther behandelt, um 2,677 g einer reineren Probe als
hellorangefarbenen körnigen Feststoff vom F= 103-1120C (Zers.) zu erhalten. [«]£'=-355°
(c= 1.05 in Chloroform).
b)(bK./R)-J-(2.4-Dinitrosiyryi)-7-phenoxyacetamidocephO-em^-carbonsäure.
E-Isomeres (II)
2r0 g des gemäß obigem Beispiel a) erhaltenen
Produktes wurde in einer Mischung aus 8 ml Trifluor-Essigsäure und 2 ml Anisol gelöst. Die Lösung wurde 10
Minuten lang bei etwa 23°C gehalten und die Lösungsmittel wurden bei 40°C unter 2 mm entfernt;
restliche Trifluor-Essigsäure wurde durch Zugabe und Eindampfen von 2 χ 10 ml Toluol und 2 χ 10 ml Äthylacetat
entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 500 mg Aktivkohle behandelt und
die Mischung durch Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft und man erhielt 2,63 g eines Schaums, der
15 Minuten lang mit 25 ml Äther verrührt wurde. Das unlösliche Material wurde abfiltriert und mit 2x5 ml
Äther gewaschen und dann bei 400C im Vakuum getrocknet und ergab 1.25 g der Titelsäure als gelben
körnigen Feststoff vom F= 103-1200C (Zers.),
[*]i5= -56.21 fc=0.107 in Me2SO).
Formulierung der Testreagentien
A. (a) 50 mg (6R.7R)-3-(E-2,4-Dinitrostyryl)-7-(2-thienylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure
wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit einem Phosphatpuffer, der einen pH von etwa 7,0 ergab, auf 100 ml
aufgefüllt.
(b) Die Lösung von (a) wurde in Scheiben von reinem Cellulosepapier der zur Papierchromatographie geeigneten
Art imprägniert. Die Scheiben wurden in einem Ofen bei 50°C an der Luft getrocknet. Stäbchen von
reiner Cellulose wurden ebenfalls imprägniert und in der
gleichen Weise getrocknet. Die Scheiben und Stäbchen wurden in Exsiccatoren unter Ausschluß von Licht
gelagert.
B. Ein penicillinresistenter Stamm vom Staph. aureus wurde in einer Kulturbrühe 18 Stunden bei 37°C
aufgezogen. Anschließend wurde eine ausreichende Menge der Lösung von Beispiel A(a) zugefügt, so daO
sich eine Konzentration des Reagens von 100ng/ml ergab.
Es entwickelte sich rasch eine tiefrote Farbe, und die spektroskopische Untersuchung, zeigte das Auftreter
einer breiten Absorptionsbande bei 485 nm. Gleichzeitig wurde eine Absorptionsbande bei 388 nm in ihrei
Intensität herabgemindert.
Die Farbe blieb zumindest 24 Stunden stabil.
Wurde der Test mit einer Lösung des Produkts vor Beispiel 5(B), hergestellt wie in Beispiel A(a). so trat eine
grüne Färbung auf.
C. Die gram-negativen Organismen Enterobactei cloacae P 99 urH ihre Mutante P 99 (M) wurden auf agai
in Petri-Schalen kultiviert.
Wenn die Kolonien voll entwickelt waren, wurder einige Tropfen der Lösung A(a) auf jede Platte gefügt
Die Kolonien von P 99 ergaben eine sofortige deutliche rote Farbe, wohingegen die Kolonien von P 99 (M;
keine Reaktion zeigten. Es ist bekannt, daß P 99 eir jS-Lactamase-produzierender Stamm ist, wohingeger
dies nicht für P 99 (M) gilt. Die Farbe verblaßte nach : Stunden.
D. Staph. aureus (penicülinresistent) wurde auf einei
Agar-Platte kultiviert. Wenn die Kolonie voll entwickeli
war, wurde eine der imprägnierten Scheiben vor Beispiel A(b) auf die Kolonien gelegt. Sie nahm rasch
eine rote Farbe an.
45
50
55
60
65
Claims (1)
1. S-Styrylceph-S-em-^carbonsäuren der allgemeinen
Formel
-N J-CH=CH-CO2H
Ar
G)
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