JP3122468B2 - 電気化学発光検定 - Google Patents
電気化学発光検定Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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- C07D277/06—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
-
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼの検
出および定量的測定のための電気化学発光（ECL）に基
づく検定（分析、assay）の開発に関し、この検定は細
菌感染の診断および治療の監視のために適している。
出および定量的測定のための電気化学発光（ECL）に基
づく検定（分析、assay）の開発に関し、この検定は細
菌感染の診断および治療の監視のために適している。
発明の背景 ECLに基づく検定は当業界に周知でありそしてそれら
の正確さ、使用の容易性および放射性物質の不存在の故
に拡大した適用を見出している。
の正確さ、使用の容易性および放射性物質の不存在の故
に拡大した適用を見出している。
特に有用なECLシステムはBio/Technologyに第193頁〜
第194頁（1994年２月）のYang等による論文に記載され
ている。またBiomedical Products1992年10月号におけ
るMasseyによる論文ならびに米国特許第5,235,808号お
よび同第5,310,687号（これらの論文および特許の内容
を参照することにより本明細書に組み入れる）を参照。
第194頁（1994年２月）のYang等による論文に記載され
ている。またBiomedical Products1992年10月号におけ
るMasseyによる論文ならびに米国特許第5,235,808号お
よび同第5,310,687号（これらの論文および特許の内容
を参照することにより本明細書に組み入れる）を参照。
ECL法は、幾つかの異なるメカニズムにより多くの異
なる分子について示されて来た。Blackburn等（1991）
のClin.Chem.37/9第1534頁〜第1539頁において、その技
術を示すためにその著者はトリプロピルアミン（TPA）
とのルテニウム（II）トリス（ビピリジル）（Ru（bp
y）3 2+）のECL反応を使用した（Leland等（1990）のJ.E
lectrochem.Soc.137:3127〜3131）。Ru（bpy）3 2+の塩
はビピリジル配位子の１つの上の反応性基で化学的に変
性されて、たんぱく質、ハプテンおよび核酸が容易に標
識化されることが出来る、活性化種（Species）を形成
することが出来る非常に安定な水溶性化合物である。Bl
ackburn等により使用された（Ru（bpy）3 2+の活性化形
はRu（bpy）3 2+−NHSエステルであった。
なる分子について示されて来た。Blackburn等（1991）
のClin.Chem.37/9第1534頁〜第1539頁において、その技
術を示すためにその著者はトリプロピルアミン（TPA）
とのルテニウム（II）トリス（ビピリジル）（Ru（bp
y）3 2+）のECL反応を使用した（Leland等（1990）のJ.E
lectrochem.Soc.137:3127〜3131）。Ru（bpy）3 2+の塩
はビピリジル配位子の１つの上の反応性基で化学的に変
性されて、たんぱく質、ハプテンおよび核酸が容易に標
識化されることが出来る、活性化種（Species）を形成
することが出来る非常に安定な水溶性化合物である。Bl
ackburn等により使用された（Ru（bpy）3 2+の活性化形
はRu（bpy）3 2+−NHSエステルであった。
感受性のペニシリンおよびセファロスポリンのβ−ラ
クタム環のアミド結合を加水分解するベータ−ラクタマ
ーゼは微生物の中で分布しておりそしてβ−ラクタム抗
生物質に対する微生物耐性においての役割を果してい
る。ベータ−ラクタマーゼは多数の細菌種（species）
によって同化されるがしかし哺乳動物の組織によっては
同化されなくそして基質特異性において変化できる１群
の関連酵素を構成する。一般にPayne D.J.のJ.Med.Micr
o（1993）39第93頁〜第99頁;Coulton,S.およびFrancoi
s,I.のProg.Med.Chem.（1994）31,第297頁〜第349頁;Mo
ellering,R.C.,Jr.のJ.Antimicrob.Chemother.（1993）
31（増補版Ａ）第１頁〜第８頁；およびNeu,H.C.のScie
nce（1992）257第1064頁〜第1072頁参照。
クタム環のアミド結合を加水分解するベータ−ラクタマ
ーゼは微生物の中で分布しておりそしてβ−ラクタム抗
生物質に対する微生物耐性においての役割を果してい
る。ベータ−ラクタマーゼは多数の細菌種（species）
によって同化されるがしかし哺乳動物の組織によっては
同化されなくそして基質特異性において変化できる１群
の関連酵素を構成する。一般にPayne D.J.のJ.Med.Micr
o（1993）39第93頁〜第99頁;Coulton,S.およびFrancoi
s,I.のProg.Med.Chem.（1994）31,第297頁〜第349頁;Mo
ellering,R.C.,Jr.のJ.Antimicrob.Chemother.（1993）
31（増補版Ａ）第１頁〜第８頁；およびNeu,H.C.のScie
nce（1992）257第1064頁〜第1072頁参照。
体液中のβ−ラクタマーゼ活性の検出は最近または現
在の細菌感染の表示であると長い間考えられて来た。
在の細菌感染の表示であると長い間考えられて来た。
ペニシリンおよびセファロスポリンのような抗生物質
に対する発現している微生物の耐性はしばらくの間重要
な問題であった。最近、新しい抗生物質の数がだんだん
少なくなって来ていることおよび既知である抗生物質が
過剰に使用されていることからみて、この問題は徐々に
上昇して来ている。特定の感染を治療するために最適の
抗生物質を選択することそして有効な代用物質が存在す
るときに最も最近の抗生物質を処方することを避けるこ
とが一層絶対に必要になって来ている。最適の抗生物質
を選ぶためのこの能力は抗生物質の耐性が次第に増大し
て問題になっている長期間治療施設を包含する施設にお
いて特に重要である。抗生物質の現在の族群の有効期間
は、最適な抗生物質の選択により延長されることが出来
る。一般にScience Vol.257（1992年８月11日）第1064
頁〜第1072頁のHarold C.Neuの“The Crisis in Antibi
otic Resistance"参照。
に対する発現している微生物の耐性はしばらくの間重要
な問題であった。最近、新しい抗生物質の数がだんだん
少なくなって来ていることおよび既知である抗生物質が
過剰に使用されていることからみて、この問題は徐々に
上昇して来ている。特定の感染を治療するために最適の
抗生物質を選択することそして有効な代用物質が存在す
るときに最も最近の抗生物質を処方することを避けるこ
とが一層絶対に必要になって来ている。最適の抗生物質
を選ぶためのこの能力は抗生物質の耐性が次第に増大し
て問題になっている長期間治療施設を包含する施設にお
いて特に重要である。抗生物質の現在の族群の有効期間
は、最適な抗生物質の選択により延長されることが出来
る。一般にScience Vol.257（1992年８月11日）第1064
頁〜第1072頁のHarold C.Neuの“The Crisis in Antibi
otic Resistance"参照。
抗生物質に対する細菌耐性に対する上昇する抵抗は、
ペニシリンまたはセファロスポリンのような特定のβ−
ラクタム抗生物質に対する耐性の程度を定量的に迅速に
測定することが出来そして次に特定の感染症状のための
最も適当な抗生物質を選択することの出来る試験の必要
性を高めた。
ペニシリンまたはセファロスポリンのような特定のβ−
ラクタム抗生物質に対する耐性の程度を定量的に迅速に
測定することが出来そして次に特定の感染症状のための
最も適当な抗生物質を選択することの出来る試験の必要
性を高めた。
微生物β−ラクタマーゼの検出のために幾つかの方法
が現在存在する。若干の代表的な例は下記のとおりであ
る。
が現在存在する。若干の代表的な例は下記のとおりであ
る。
J.Appl.Bacteriol.（1992）Vol.73,No.1,第14頁〜第2
2頁におけるW.L.Bakerの“Co−existence of β−lacta
mase and Penicillin acylase in bacteria;detection
and quantitative determination of enzyme activitie
s"は、単一の基質上の酵素の作用により下記両方の物質
が生成される場合にペニシロエート類（penicilloate
s）の検出のための銅−減少性検定および６−アミノペ
ニシラン酸濃度を検出するためのフルオレサミン検定を
開示している。
2頁におけるW.L.Bakerの“Co−existence of β−lacta
mase and Penicillin acylase in bacteria;detection
and quantitative determination of enzyme activitie
s"は、単一の基質上の酵素の作用により下記両方の物質
が生成される場合にペニシロエート類（penicilloate
s）の検出のための銅−減少性検定および６−アミノペ
ニシラン酸濃度を検出するためのフルオレサミン検定を
開示している。
米国特許第5,264,346号は種々の適用性を有する、β
−ラクタマーゼについての比色検定を開示している。そ
の検定はｐ−フェニレンジアミンのＮ−アルキル誘導体
またはベンジジンの3,3′,5,5′−テトラアルキル誘導
体のいずれかの酸化により形成された発色団の脱色に基
づいている。その脱色はセファロスポリンまたはペニシ
リンの加水分解から生ずる開いたβ−ラクタム環生成物
の存在に起因している。ペニシリンの開いたβ−ラクタ
ム生成物での脱色は水銀含有化合物のような脱色増進剤
の存在を必要とする。その増進剤はセファロスポリンの
開いたβ−ラクタム生成物での脱色のためには必要とさ
れない。
−ラクタマーゼについての比色検定を開示している。そ
の検定はｐ−フェニレンジアミンのＮ−アルキル誘導体
またはベンジジンの3,3′,5,5′−テトラアルキル誘導
体のいずれかの酸化により形成された発色団の脱色に基
づいている。その脱色はセファロスポリンまたはペニシ
リンの加水分解から生ずる開いたβ−ラクタム環生成物
の存在に起因している。ペニシリンの開いたβ−ラクタ
ム生成物での脱色は水銀含有化合物のような脱色増進剤
の存在を必要とする。その増進剤はセファロスポリンの
開いたβ−ラクタム生成物での脱色のためには必要とさ
れない。
米国特許第4,470,459号は蛍光を発するようにその能
力を反転する、β−ラクタム基質のβ−ラクタマーゼ転
換に基づいている、微生物源からのβ−ラクタマーゼの
存在の検出のための迅速な方法を開示している。この性
質を有するとして述べられた特定のβ−ラクタマーゼ類
はアンピシリン、セファレキシン、アモキシリン、セフ
ァドロキシルおよびセファログリシンを含有する。蛍光
を発するようにその能力の変化はβ−ラクタマーゼの存
在に起因している。
力を反転する、β−ラクタム基質のβ−ラクタマーゼ転
換に基づいている、微生物源からのβ−ラクタマーゼの
存在の検出のための迅速な方法を開示している。この性
質を有するとして述べられた特定のβ−ラクタマーゼ類
はアンピシリン、セファレキシン、アモキシリン、セフ
ァドロキシルおよびセファログリシンを含有する。蛍光
を発するようにその能力の変化はβ−ラクタマーゼの存
在に起因している。
β−ラクタマーゼ生産性物を確認するための微生物学
的試験方法をWO84/03303は開示している。その検定はク
マリンのような指示薬の蛍光に影響する酸性度における
変化に頼っている。酸性度におけるこの変化はβ−ラク
タマーゼの存在により生成された転換生成物に起因して
いる。
的試験方法をWO84/03303は開示している。その検定はク
マリンのような指示薬の蛍光に影響する酸性度における
変化に頼っている。酸性度におけるこの変化はβ−ラク
タマーゼの存在により生成された転換生成物に起因して
いる。
Eur.J.Clim.Microbiol.Infect.Dis（1989）,Vol.8 N
o.11第962頁〜第967頁におけるA.C.Peterson等によるEv
aluation of four qualitative methods for detection
of β−lactamase production in Staphylococcus and
Micrococcus species"はβ−ラクタマーゼについての
定性的検定を評価するのに使用された或る種のファクタ
ーを提供している。
o.11第962頁〜第967頁におけるA.C.Peterson等によるEv
aluation of four qualitative methods for detection
of β−lactamase production in Staphylococcus and
Micrococcus species"はβ−ラクタマーゼについての
定性的検定を評価するのに使用された或る種のファクタ
ーを提供している。
The Journal of Pediatrics,Vol.97,No.5、（1980年1
1月）第715頁〜第720頁におけるRolert H.Yolken等によ
る“Rapid diagnosis of infections caused by β−la
ctamase−producing bacteria by means of anenzyme r
adioisotopic assay"は細菌感染の検出のための迅速な
試験としてβ−ラクタマーゼの測定のための感受性酵素
放射性同位元素検定を開示している。検定の試験結果
（プロトコル;protocol）は溶離された分画の放射能の
測定のまえに、サンプルでのインキュベーション工程、
次の、DEAE−セファセル（DEAE−Sephacel）のような正
に荷電されたカラム上での分離工程を包含する。β−ラ
クタマーゼ転換されたペニシリン系生成物は、正に荷電
されたカラムにペニシリンよりもより強く結合すること
を確実にする追加のカルボキシル基を有する。溶離され
た分画値と元の値との間の放射能の差はβ−ラクタマー
ゼの存在に起因している。
1月）第715頁〜第720頁におけるRolert H.Yolken等によ
る“Rapid diagnosis of infections caused by β−la
ctamase−producing bacteria by means of anenzyme r
adioisotopic assay"は細菌感染の検出のための迅速な
試験としてβ−ラクタマーゼの測定のための感受性酵素
放射性同位元素検定を開示している。検定の試験結果
（プロトコル;protocol）は溶離された分画の放射能の
測定のまえに、サンプルでのインキュベーション工程、
次の、DEAE−セファセル（DEAE−Sephacel）のような正
に荷電されたカラム上での分離工程を包含する。β−ラ
クタマーゼ転換されたペニシリン系生成物は、正に荷電
されたカラムにペニシリンよりもより強く結合すること
を確実にする追加のカルボキシル基を有する。溶離され
た分画値と元の値との間の放射能の差はβ−ラクタマー
ゼの存在に起因している。
本明細書に開示される本発明の以前に、非常に迅速
（10分またはそれ以下）なそしてまた非常に感受性のあ
る両方の性質を有する、β−ラクタムおよびβ−ラクタ
マーゼについての包括的な検定の必要性がある。
（10分またはそれ以下）なそしてまた非常に感受性のあ
る両方の性質を有する、β−ラクタムおよびβ−ラクタ
マーゼについての包括的な検定の必要性がある。
この出願内に開示される本発明はβ−ラクタム類また
はβ−ラクタマーゼ類の測定に電気化学発光方法論を適
合させることによりこれらの必要性を達成する。本発明
の他の目的はまた、次のとおりの本発明の記載から明ら
かとなろう。
はβ−ラクタマーゼ類の測定に電気化学発光方法論を適
合させることによりこれらの必要性を達成する。本発明
の他の目的はまた、次のとおりの本発明の記載から明ら
かとなろう。
発明の概要 広く述べれば、本発明は、β−ラクタマーゼ類または
β−ラクタム部分の検出のための電気化学発光に基づく
検定を意図している。本発明は迅速な（10分またはそれ
以下の）および感受性の高い（抗生物質のマイクロモル
の濃度およびβ−ラクタマーゼのピコモルの濃度という
低い濃度）、β−ラクタム抗生物質ならびにβ−ラクタ
マーゼについての包括的な検定を、その目的の１つとし
て有する。この検定は、β−ラクタム抗生物質およびβ
−ラクタマーゼの検出ならびに定量化に適している。
β−ラクタム部分の検出のための電気化学発光に基づく
検定を意図している。本発明は迅速な（10分またはそれ
以下の）および感受性の高い（抗生物質のマイクロモル
の濃度およびβ−ラクタマーゼのピコモルの濃度という
低い濃度）、β−ラクタム抗生物質ならびにβ−ラクタ
マーゼについての包括的な検定を、その目的の１つとし
て有する。この検定は、β−ラクタム抗生物質およびβ
−ラクタマーゼの検出ならびに定量化に適している。
β−ラクタマーゼ類およびβ−ラクタム類についての
測定用システムとして電気化学発光の方法の使用の中心
をなすものは、β−ラクタム抗生物質および（または）
それらの加水分解生成物がECL機器においてRu（bpy）3
2+に光を発生させることを出願人が認識したことによ
る。さらに、試験されたすべてのβ−ラクタム類に関し
て、この能力に関してもとのままの抗生物質とそれらの
加水分解生成物との間に実質的な差がある。したがっ
て、化学発光における変化はβ−ラクタマーゼ活性の存
在と相関している。
測定用システムとして電気化学発光の方法の使用の中心
をなすものは、β−ラクタム抗生物質および（または）
それらの加水分解生成物がECL機器においてRu（bpy）3
2+に光を発生させることを出願人が認識したことによ
る。さらに、試験されたすべてのβ−ラクタム類に関し
て、この能力に関してもとのままの抗生物質とそれらの
加水分解生成物との間に実質的な差がある。したがっ
て、化学発光における変化はβ−ラクタマーゼ活性の存
在と相関している。
本出願人にとっての等しく驚かされたことは、種々の
β−ラクタム構造の測定に対して従って即ち酵素のβ−
ラクタマーゼ族群の測定に対してこの検定が万能である
ことであった。これに対する重要なことは、もとのまま
の抗生物質構造の第三級アミン構造が加水分解生成物に
おいて第二級アミンの構造に転換することである。加水
分解されたそして（または）加水分解されていない化合
物は先行技術の化学発光検定においてトリプロピルアミ
ンとしての機能を果している。
β−ラクタム構造の測定に対して従って即ち酵素のβ−
ラクタマーゼ族群の測定に対してこの検定が万能である
ことであった。これに対する重要なことは、もとのまま
の抗生物質構造の第三級アミン構造が加水分解生成物に
おいて第二級アミンの構造に転換することである。加水
分解されたそして（または）加水分解されていない化合
物は先行技術の化学発光検定においてトリプロピルアミ
ンとしての機能を果している。
必要とされるすべては興味のあるβ−ラクタム抗生物
質を用いたサンプルをインキュベートしそして確立され
たプロトコルおよび装置を用いて時間経過にわたって化
学発光における変化を測定することである。当時出願人
によってまた予期されなかったことは比較的に短かい時
間（５分〜２時間）に結果が得られることそしてβ−ラ
クタムおよびβ−ラクタマーゼの両方について達成され
た感度であった。Anal.Chem.64（1992）第261頁〜第268
頁におけるDowrey等による“Chemiluminescence Detect
ion Using Regenerable Tris（2,2′bypyridly）ruthen
ium（II）Immobilized in Nafion"の第264頁の表１に示
されるように、本発明以前にはペニシリンの加水分解構
造物が認識出来る量のECLを生成することは、知られて
いなかった。
質を用いたサンプルをインキュベートしそして確立され
たプロトコルおよび装置を用いて時間経過にわたって化
学発光における変化を測定することである。当時出願人
によってまた予期されなかったことは比較的に短かい時
間（５分〜２時間）に結果が得られることそしてβ−ラ
クタムおよびβ−ラクタマーゼの両方について達成され
た感度であった。Anal.Chem.64（1992）第261頁〜第268
頁におけるDowrey等による“Chemiluminescence Detect
ion Using Regenerable Tris（2,2′bypyridly）ruthen
ium（II）Immobilized in Nafion"の第264頁の表１に示
されるように、本発明以前にはペニシリンの加水分解構
造物が認識出来る量のECLを生成することは、知られて
いなかった。
図面の記載 図面説明： 図１はペンジルペニシリンの、β−ラクタマーゼ触媒
作用された加水分解を例示する。
作用された加水分解を例示する。
図２はβ−ラクタム類の若干共通する化学構造を示
す。
す。
図３は分光測光（黒い棒）およびECL（灰色棒）の検
定法を用いての抗生物質加水分解の定量化を示す。本明
細書において詳細に記載されるように、分光測光法は加
水分解されていないおよび加水分解された抗生物質の電
子吸光スペクトルの特有の特性に関係するファクターに
依存して多様であるが、一方、ECL機器法は単一の方法
がすべての抗生物質について用いられた。すべての場合
において、各々の抗生物質の1.0mMを４種の酵素の１つ
を用いて10分間室温でインキュベートした。
定法を用いての抗生物質加水分解の定量化を示す。本明
細書において詳細に記載されるように、分光測光法は加
水分解されていないおよび加水分解された抗生物質の電
子吸光スペクトルの特有の特性に関係するファクターに
依存して多様であるが、一方、ECL機器法は単一の方法
がすべての抗生物質について用いられた。すべての場合
において、各々の抗生物質の1.0mMを４種の酵素の１つ
を用いて10分間室温でインキュベートした。
図3AはB.cereus β−ラクタマーゼＩ（1.3nM）を示
す。
す。
図3BはB.cereus β−ラクタマーゼII（42.6nM）を示
す。
す。
図3CはEnterobacter cloacal P99（1.9nM）を示す。
図3DはE.coli RTEM（0.73nM）を示す。
ECL実験のために、各サンプルの275μを120μM Ru
（bpy）3 2+および0.6％トリトン（Triton）Ｘ−100の25
μと混合した。混合物をECL機器（メリーランド州ロ
ックビルのIGEN,Inc.のOrigenRアナライザー）を用いて
分析した。
（bpy）3 2+および0.6％トリトン（Triton）Ｘ−100の25
μと混合した。混合物をECL機器（メリーランド州ロ
ックビルのIGEN,Inc.のOrigenRアナライザー）を用いて
分析した。
図４はECLに対する加水分解されたおよび加水分解さ
れていないβ−ラクタム濃度の標準曲線である。図Ａは
アンピシリンの酵素触媒作用（B.cereus）β−ラクタマ
ーゼ加水分解を示す。図ＢはセフォキシチンのNaOH加水
分解を示す。Ａ）およびＢ）の両方において閉じた環は
もとのままの抗生物質を表わしそして開いた環は抗生物
質加水分解の生成物を表わす。サンプルは図３について
の説明において記載されているとおりにして処理されそ
して分析された。
れていないβ−ラクタム濃度の標準曲線である。図Ａは
アンピシリンの酵素触媒作用（B.cereus）β−ラクタマ
ーゼ加水分解を示す。図ＢはセフォキシチンのNaOH加水
分解を示す。Ａ）およびＢ）の両方において閉じた環は
もとのままの抗生物質を表わしそして開いた環は抗生物
質加水分解の生成物を表わす。サンプルは図３について
の説明において記載されているとおりにして処理されそ
して分析された。
図５は細菌のβ−ラクタマーゼ活性のECL測定による
菌細胞の定量化を示す。E.coli抽出物（遠心分離ペレッ
ト）の種々の量を1.0mMアンピシリン中で一夜インキュ
ベートした。β−ラクタマーゼ抑制剤６−β−Br−ペニ
シラン酸を加えたものである。インキュベートされた混
合物は1.0mMアンピシリンおよび0.1Mリン酸ナトリウ
ム、pH7.5ならびにAmpS E.coli（低水準のβ−ラクタマ
ーゼ）（開いた三角形）;AmpS E.coliと６−β−Br−ペ
ニシラン酸（閉じた三角形）;AmpS E.coli（高水準のβ
−ラクタマーゼ）（閉じた環）、あるいはAmpR E.coli
と６−β−Br−ペニシラン酸（閉じた環）のいずれかと
からなった。一夜インキュベートされたサンプルを分別
し、Ru（bpy）3 2+およびTriton X−100をそれぞれ、10
μＭおよび0.05％の最終濃度を与えるように加えた。EG
LをIGENのECL機器を用いて測定した。
菌細胞の定量化を示す。E.coli抽出物（遠心分離ペレッ
ト）の種々の量を1.0mMアンピシリン中で一夜インキュ
ベートした。β−ラクタマーゼ抑制剤６−β−Br−ペニ
シラン酸を加えたものである。インキュベートされた混
合物は1.0mMアンピシリンおよび0.1Mリン酸ナトリウ
ム、pH7.5ならびにAmpS E.coli（低水準のβ−ラクタマ
ーゼ）（開いた三角形）;AmpS E.coliと６−β−Br−ペ
ニシラン酸（閉じた三角形）;AmpS E.coli（高水準のβ
−ラクタマーゼ）（閉じた環）、あるいはAmpR E.coli
と６−β−Br−ペニシラン酸（閉じた環）のいずれかと
からなった。一夜インキュベートされたサンプルを分別
し、Ru（bpy）3 2+およびTriton X−100をそれぞれ、10
μＭおよび0.05％の最終濃度を与えるように加えた。EG
LをIGENのECL機器を用いて測定した。
図６に抗生物質についての可能なECL反応メカニズム
を例示した。或る場合において加水分解生成物は、この
反応において光を引き出すように関与する。試験された
すべての場合において、抗生物質とその加水分解生成物
との間には実質的な差がある。
を例示した。或る場合において加水分解生成物は、この
反応において光を引き出すように関与する。試験された
すべての場合において、抗生物質とその加水分解生成物
との間には実質的な差がある。
好ましい態様の記載 ECL励起のメカニズムは次のとおりである。Ru（bpy）
3 2+および（加水分解されたおよび（または）加水分解
されていない）抗生物質は金電極の表面で酸化されて、
それぞれRu（bpy）3 3+および抗生物質を形成する。この
記載において、「抗生物質」はもとのままのものである
かまたは加水分解されているものを示す。抗生物質＋・
は自発的にプロトンを失い、抗生物質・を形成する。強
い還元剤である抗生物質・は強い酸化剤であるRu（bp
y）3 3+と反応して検出されるRu（bpy）３ ２＋＊の励起
状態を形成する。その励起状態は620nmの波長を有する
光量子を発する正規の蛍光メカニズムにより基底状態に
減衰する。
3 2+および（加水分解されたおよび（または）加水分解
されていない）抗生物質は金電極の表面で酸化されて、
それぞれRu（bpy）3 3+および抗生物質を形成する。この
記載において、「抗生物質」はもとのままのものである
かまたは加水分解されているものを示す。抗生物質＋・
は自発的にプロトンを失い、抗生物質・を形成する。強
い還元剤である抗生物質・は強い酸化剤であるRu（bp
y）3 3+と反応して検出されるRu（bpy）３ ２＋＊の励起
状態を形成する。その励起状態は620nmの波長を有する
光量子を発する正規の蛍光メカニズムにより基底状態に
減衰する。
適当な電気化学検出剤である有機化合物は例えばルブ
レン（rubrene）および9,10−ジフェニルアントラセン
を包含する。多くの有機金属化合物は適当な電気化学検
出剤であるが好ましく使用されるものの中にはルテニウ
ムIIトリス−ビピリジンキレートのようなRu−含有化合
物およびOs−含有化合物がある。ここに開示された発明
において有用な検出剤は米国特許第5,310,687号（この
特許の内容を参照することにより本明細書に組み入れ
る）に記載されている。
レン（rubrene）および9,10−ジフェニルアントラセン
を包含する。多くの有機金属化合物は適当な電気化学検
出剤であるが好ましく使用されるものの中にはルテニウ
ムIIトリス−ビピリジンキレートのようなRu−含有化合
物およびOs−含有化合物がある。ここに開示された発明
において有用な検出剤は米国特許第5,310,687号（この
特許の内容を参照することにより本明細書に組み入れ
る）に記載されている。
これらの検出剤は長期間安定である。さらに、これら
の検出剤は安全で比較的に安価である。これらは自然に
は起こらない高度に特徴的なシグナルを与える。このよ
うな検出剤の発光に基づく測定は感度が高く、速く、再
現可能であり簡単な計器装備により実行できる。シグナ
ルは検出剤の各分子により繰り返して生成させされ、こ
れにより検出剤が検出される感度を増大させる。本発明
の好ましい電気化学検出剤は、本明細書において便宜上
Ru（bpy）3 2+として以下記載する。この検出剤またはそ
の均等物質を種々の量使用することが出来る。これらの
検出剤は生物学的サンプルまたは食品サンプルにサンプ
ルを予備処理することなしに、直接に使用することが出
来ることにまた注目すべきである。
の検出剤は安全で比較的に安価である。これらは自然に
は起こらない高度に特徴的なシグナルを与える。このよ
うな検出剤の発光に基づく測定は感度が高く、速く、再
現可能であり簡単な計器装備により実行できる。シグナ
ルは検出剤の各分子により繰り返して生成させされ、こ
れにより検出剤が検出される感度を増大させる。本発明
の好ましい電気化学検出剤は、本明細書において便宜上
Ru（bpy）3 2+として以下記載する。この検出剤またはそ
の均等物質を種々の量使用することが出来る。これらの
検出剤は生物学的サンプルまたは食品サンプルにサンプ
ルを予備処理することなしに、直接に使用することが出
来ることにまた注目すべきである。
励起状態の形成のために必要なエネルギーはRu（bp
y）3 3+と抗生物質・との電気化学的電位における大きな
差から生ずる。励起した状態のRu（bpy）３ ２＋・は620
nmで光量子を発する、正常な蛍光メカニズムにより減衰
する。これによりRu（bpy）3 2+のもとの形を再生し、こ
れは上記の反応順序を複数回繰り返すことが可能であ
る。それ故に各ECL−活性検出剤は各測定サイクル中に
多くの光量子を発することが出来、検出感度を高めるこ
とができる。
y）3 3+と抗生物質・との電気化学的電位における大きな
差から生ずる。励起した状態のRu（bpy）３ ２＋・は620
nmで光量子を発する、正常な蛍光メカニズムにより減衰
する。これによりRu（bpy）3 2+のもとの形を再生し、こ
れは上記の反応順序を複数回繰り返すことが可能であ
る。それ故に各ECL−活性検出剤は各測定サイクル中に
多くの光量子を発することが出来、検出感度を高めるこ
とができる。
Ru（bpy）3 2+検出剤の定量化は比較的に複雑でない計
器装備を用いて容易に自動化することが出来る。機器の
重要部分はECL反応の開始のための作用電極および対電
極を含有する電気化学フロウセルである。両方の電極は
金から造られるがしかし他の材料も使用されて種々の程
度に成功している。ポテンシオスタットは電極に種々の
電圧波形を適用し、単一の光電子増倍管（PMT）はECL反
応中発せられた光を検出する。Ag/AgCl基準電極はフロ
ウセルから下流の流体通路に置かれ、フロウセル中に種
々の流体を引き入れるためにぜんどうポンプが使用され
る。典型的には、検定流体は試験管から流動セル中に引
き入れられ検出剤は、電極に傾斜電圧を適用し発した光
を測定することにより定量化される。測定後に、電気化
学清浄化処理のために、高い−pHの清浄化用溶液が該セ
ル中に引き入れられる。次に調節用溶液が該セル中に引
き入れられ、電圧波形が適用され、電極の表面を高度に
再現可能な状態とし、次の測定サイクルに供される。
器装備を用いて容易に自動化することが出来る。機器の
重要部分はECL反応の開始のための作用電極および対電
極を含有する電気化学フロウセルである。両方の電極は
金から造られるがしかし他の材料も使用されて種々の程
度に成功している。ポテンシオスタットは電極に種々の
電圧波形を適用し、単一の光電子増倍管（PMT）はECL反
応中発せられた光を検出する。Ag/AgCl基準電極はフロ
ウセルから下流の流体通路に置かれ、フロウセル中に種
々の流体を引き入れるためにぜんどうポンプが使用され
る。典型的には、検定流体は試験管から流動セル中に引
き入れられ検出剤は、電極に傾斜電圧を適用し発した光
を測定することにより定量化される。測定後に、電気化
学清浄化処理のために、高い−pHの清浄化用溶液が該セ
ル中に引き入れられる。次に調節用溶液が該セル中に引
き入れられ、電圧波形が適用され、電極の表面を高度に
再現可能な状態とし、次の測定サイクルに供される。
ECL反応は多くの異なる電圧波形により効率よく開始
することが出来る。作用電極電流およびECL強度の測定
は電極に三角波の適用により誘導される。示されるとお
りの適用された電圧は実際に、Ag/AgCl基準電極で測定
された電圧でありそして有意な非補償抵抗の作用を包含
する；したがって、作用電極で適用された実際の電圧は
記述された電圧より実質的に小さい。三角波形は750mV/
秒の割合で565mVから2800mVに上昇しそして次に同じ割
合で1000mVに減少する。セル中を流れる電流は、本質的
に、β−ラクタム抗生物質の酸化および水の加水分解の
結果である。β−ラクタム抗生物質とRu（bpy）3 2+との
両方の酸化は適用された電圧が〜1100mVに達するときに
明白となり発光を生成する。発光の強度は、電極の表面
での抗生物質が激減し、その結果減少した強度を生ずる
までは適用された電圧とともに増大する。観察された発
光の強度は、光量子計数または電流モードのいずれかで
操作する慣用のPMT（複数）（光電子増倍管）を用いて
容易に測定することが出来るのに十分に大きい。
することが出来る。作用電極電流およびECL強度の測定
は電極に三角波の適用により誘導される。示されるとお
りの適用された電圧は実際に、Ag/AgCl基準電極で測定
された電圧でありそして有意な非補償抵抗の作用を包含
する；したがって、作用電極で適用された実際の電圧は
記述された電圧より実質的に小さい。三角波形は750mV/
秒の割合で565mVから2800mVに上昇しそして次に同じ割
合で1000mVに減少する。セル中を流れる電流は、本質的
に、β−ラクタム抗生物質の酸化および水の加水分解の
結果である。β−ラクタム抗生物質とRu（bpy）3 2+との
両方の酸化は適用された電圧が〜1100mVに達するときに
明白となり発光を生成する。発光の強度は、電極の表面
での抗生物質が激減し、その結果減少した強度を生ずる
までは適用された電圧とともに増大する。観察された発
光の強度は、光量子計数または電流モードのいずれかで
操作する慣用のPMT（複数）（光電子増倍管）を用いて
容易に測定することが出来るのに十分に大きい。
興味のあるβ−ラクタムが加えられたサンプルは次
に、初期値を得るために測定用セル中に置かれる。典型
的には、興味のあるβ−ラクタムは10ミクロモル〜1.0
ミリモルの濃度で加えられる。電気化学発光検出剤は典
型的には10-6M濃度（１〜15μＭの範囲）で存在する。
次にサンプル含有セルはもし酵素β−ラクタマーゼが存
在するならばその酵素の触媒作用の加水分解が起り得る
のに十分な時間の間インキュベートされる。この時間期
間は典型的には５分〜２時間である。サンプルおよび試
薬濃度に依存してより長い時間およびより短かい時間の
期間であってもよい。包含されるパラメータはすべては
経験実験的なものであるので、それらの値は慣用技術を
用いて決定することが出来る。
に、初期値を得るために測定用セル中に置かれる。典型
的には、興味のあるβ−ラクタムは10ミクロモル〜1.0
ミリモルの濃度で加えられる。電気化学発光検出剤は典
型的には10-6M濃度（１〜15μＭの範囲）で存在する。
次にサンプル含有セルはもし酵素β−ラクタマーゼが存
在するならばその酵素の触媒作用の加水分解が起り得る
のに十分な時間の間インキュベートされる。この時間期
間は典型的には５分〜２時間である。サンプルおよび試
薬濃度に依存してより長い時間およびより短かい時間の
期間であってもよい。包含されるパラメータはすべては
経験実験的なものであるので、それらの値は慣用技術を
用いて決定することが出来る。
インキュベーションが起こった後に、第２の読み取り
を行う。読み取りにおける差がもし存在するならば、そ
れはサンプル中に存在するβ−ラクタマーゼ活性と相関
する。これに関して図４参照。同様にして、特定のサン
プルを小部分に分けあるいは特定の患者から得た一連の
サンプルを順次一連のβ−ラクタム抗生物質で処理して
サンプルまたは患者についてのプロフィルを作成するこ
とが出来る。このプロフィルは治療のために好ましい抗
生物質を選択するために医者により用いることが出来、
または存在する情報ライブラリーに基づいて含まれる微
生物を同定確認するために用いることが出来る。感染を
治療するのに使用するために好ましい抗生物質はほとん
ど加水分解されない抗生物質である。
を行う。読み取りにおける差がもし存在するならば、そ
れはサンプル中に存在するβ−ラクタマーゼ活性と相関
する。これに関して図４参照。同様にして、特定のサン
プルを小部分に分けあるいは特定の患者から得た一連の
サンプルを順次一連のβ−ラクタム抗生物質で処理して
サンプルまたは患者についてのプロフィルを作成するこ
とが出来る。このプロフィルは治療のために好ましい抗
生物質を選択するために医者により用いることが出来、
または存在する情報ライブラリーに基づいて含まれる微
生物を同定確認するために用いることが出来る。感染を
治療するのに使用するために好ましい抗生物質はほとん
ど加水分解されない抗生物質である。
一連の代表的なβ−ラクタマーゼ類からのβ−ラクタ
マーゼを用いて一連の構成物質について上記の方法を繰
り返すことによって１セットの標準を造ることがまた可
能である。このような代表例が図3a〜図3dに示されてい
る。未知のものについて決定した値を同定確認の目的の
ために、そのようなセットと比較することが出来る。こ
の情報は取り扱いおよび比較を容易にするために電子形
であってよい。
マーゼを用いて一連の構成物質について上記の方法を繰
り返すことによって１セットの標準を造ることがまた可
能である。このような代表例が図3a〜図3dに示されてい
る。未知のものについて決定した値を同定確認の目的の
ために、そのようなセットと比較することが出来る。こ
の情報は取り扱いおよび比較を容易にするために電子形
であってよい。
サンプルをβ−ラクタム抗生物質で処理してそして
（または）インキュベートした後に、作用電極に電位を
適用することによりECL測定が行なわれる。これは発生
光からの特徴的シグナルを与える。サンプルまたは添加
された緩衝剤中に存在する他の物質により提供されたバ
ックグラウンドから生ずる比較的小さな干渉もほとんど
ない。
（または）インキュベートした後に、作用電極に電位を
適用することによりECL測定が行なわれる。これは発生
光からの特徴的シグナルを与える。サンプルまたは添加
された緩衝剤中に存在する他の物質により提供されたバ
ックグラウンドから生ずる比較的小さな干渉もほとんど
ない。
したがって、この発明の方法を行なうために適当な装
置および方法論は、前の方に記載したように、米国特許
第5,068,088号、同第5,061,455号、同第5,093,268号、
同第5,147,806号および同第5,221,605号（これらの特許
を参照することにより本明細書に特に組み入れる）に示
されるものを包含する。また、検出剤として測定用シス
テムにおいて使用するための電気化学発光分子は、米国
特許第5,310,687号（この特許を参照することにより本
明細書中に特に組み入れる）に記載されたルテニウムお
よびオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子を
包含する。
置および方法論は、前の方に記載したように、米国特許
第5,068,088号、同第5,061,455号、同第5,093,268号、
同第5,147,806号および同第5,221,605号（これらの特許
を参照することにより本明細書に特に組み入れる）に示
されるものを包含する。また、検出剤として測定用シス
テムにおいて使用するための電気化学発光分子は、米国
特許第5,310,687号（この特許を参照することにより本
明細書中に特に組み入れる）に記載されたルテニウムお
よびオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子を
包含する。
本検定を行なうために必要な材料を含有する試薬キッ
トを組み合わして取り扱いを容易にし標準化を促進する
ことが出来る。キットに包含されるべき材料は究極の目
的にあわせて変化させてもよい。典型的にはキットは電
気化学発光検出剤、必要な緩衝剤および標準を包含す
る。標準は化学試薬であってもよくあるいは検定を行な
うために必要な較正に必要な印刷された形または電子形
の（経験実験的）データであってもよい。
トを組み合わして取り扱いを容易にし標準化を促進する
ことが出来る。キットに包含されるべき材料は究極の目
的にあわせて変化させてもよい。典型的にはキットは電
気化学発光検出剤、必要な緩衝剤および標準を包含す
る。標準は化学試薬であってもよくあるいは検定を行な
うために必要な較正に必要な印刷された形または電子形
の（経験実験的）データであってもよい。
例 1: β−ラクタマーゼによるβ−ラクタム加水分解のECL検
定 細菌β−ラクタマーゼ酵素はβ−ラクタム抗生物質を
加水分解し不活性化する（図１）。多くの異なる種のグ
ラム陰性菌およびグラム陽性菌（１）により生成された
100以上のβ−ラクタマーゼがある。各β−ラクタマー
ゼは限られた且つ特有の“スペクトル”のβ−ラクタム
抗生物質を加水分解する（若干のβ−ラクタム抗生物質
について、図２参照）。したがってもし、或るβ−ラク
タマーゼ生成性細菌株がそのβ−ラクタマーゼ（単数ま
た複数）の基質でない抗生物質で刺激されたら、その抗
生物質は菌株にとって致死的である可能性がある。逆
に、もし或る細菌株がそのβ−ラクタマーゼ（単数また
は複数）に基質である或るβ−ラクタム抗生物質で刺激
されたら、その菌株はその抗生物質を破壊し、その刺激
に抵抗し生き残る。病原菌がβ−ラクタマーゼを生成す
るかどうか、そしてもし生成するとしてその特定の酵素
が認識し且つ加水分解するのはどの抗生物質から前もっ
て知ることは困難である。もし、医者の決定を行なう方
法の一部として、抗生物質投与の前に、その抗生物質を
加水分解して且つそれを有効なものでないものにするこ
とが出来るβ−ラクタマーゼが存在するかどうか決定す
るために患者の感染組織または生物学的液体のサンプル
を候補抗生物質と混合することが出来るならば、そのよ
うな微生物感染の非常に有益な医療的処置であろう。
定 細菌β−ラクタマーゼ酵素はβ−ラクタム抗生物質を
加水分解し不活性化する（図１）。多くの異なる種のグ
ラム陰性菌およびグラム陽性菌（１）により生成された
100以上のβ−ラクタマーゼがある。各β−ラクタマー
ゼは限られた且つ特有の“スペクトル”のβ−ラクタム
抗生物質を加水分解する（若干のβ−ラクタム抗生物質
について、図２参照）。したがってもし、或るβ−ラク
タマーゼ生成性細菌株がそのβ−ラクタマーゼ（単数ま
た複数）の基質でない抗生物質で刺激されたら、その抗
生物質は菌株にとって致死的である可能性がある。逆
に、もし或る細菌株がそのβ−ラクタマーゼ（単数また
は複数）に基質である或るβ−ラクタム抗生物質で刺激
されたら、その菌株はその抗生物質を破壊し、その刺激
に抵抗し生き残る。病原菌がβ−ラクタマーゼを生成す
るかどうか、そしてもし生成するとしてその特定の酵素
が認識し且つ加水分解するのはどの抗生物質から前もっ
て知ることは困難である。もし、医者の決定を行なう方
法の一部として、抗生物質投与の前に、その抗生物質を
加水分解して且つそれを有効なものでないものにするこ
とが出来るβ−ラクタマーゼが存在するかどうか決定す
るために患者の感染組織または生物学的液体のサンプル
を候補抗生物質と混合することが出来るならば、そのよ
うな微生物感染の非常に有益な医療的処置であろう。
１つの実験として、４種の異なるβ−ラクタマーゼの
１種またはそれ以上による、６種の異なる市販のβ−ラ
クタム抗生物質（ベンジルペニシリン（１）；アンピシ
リン（２）；アモキシリン（３）；モキサラクタム
（４）；セフォキシチン（５）；およびセファロスポリ
ンＣ（６））の加水分解（または、加水分解なし）を電
気化学発光（ECL）に基く方法を用いて検出且つ定量化
した。これらの抗生物質は化学構造においてかなり異な
るけれども、各々は共通して四員のβ−ラクタム環を有
する（図２）。各抗生物質を、10μＭのルテニウム（I
I）トリス（ビピリジル）（Ru（bpy）3 2+として略述さ
れる）および0.05％のトリトンＸ−100を含有する0.1M
リン酸塩（ナトリウム塩）のpH7.5の溶液中に1.0mMの濃
度に溶解した。同様にして４種の市販のβ−ラクタマー
ゼ酵素の１種（Bacillus cereusからのタイプＩの1.3m
M、Bacillus cereusからのタイプIIの42.6nM、E.coliか
らのRTEMの0.73nMまたはEnterobacter cloacae P99の1.
9nMのいずれか）を含有する以外は同一である、抗生物
質の他の溶液を調製した。室温（約22℃）で10分インキ
ュベーションの後に、ECL分析用機器（メリーランド州
ロックビルのIGEN,Inc.のOrigenRアナライザー）を用い
て、（各々の酵素を有するそしてそれを有しない）抗生
物質溶液のECL分析を行なった。ECL強度上への酵素イン
キュベーションの影響を観察した。
１種またはそれ以上による、６種の異なる市販のβ−ラ
クタム抗生物質（ベンジルペニシリン（１）；アンピシ
リン（２）；アモキシリン（３）；モキサラクタム
（４）；セフォキシチン（５）；およびセファロスポリ
ンＣ（６））の加水分解（または、加水分解なし）を電
気化学発光（ECL）に基く方法を用いて検出且つ定量化
した。これらの抗生物質は化学構造においてかなり異な
るけれども、各々は共通して四員のβ−ラクタム環を有
する（図２）。各抗生物質を、10μＭのルテニウム（I
I）トリス（ビピリジル）（Ru（bpy）3 2+として略述さ
れる）および0.05％のトリトンＸ−100を含有する0.1M
リン酸塩（ナトリウム塩）のpH7.5の溶液中に1.0mMの濃
度に溶解した。同様にして４種の市販のβ−ラクタマー
ゼ酵素の１種（Bacillus cereusからのタイプＩの1.3m
M、Bacillus cereusからのタイプIIの42.6nM、E.coliか
らのRTEMの0.73nMまたはEnterobacter cloacae P99の1.
9nMのいずれか）を含有する以外は同一である、抗生物
質の他の溶液を調製した。室温（約22℃）で10分インキ
ュベーションの後に、ECL分析用機器（メリーランド州
ロックビルのIGEN,Inc.のOrigenRアナライザー）を用い
て、（各々の酵素を有するそしてそれを有しない）抗生
物質溶液のECL分析を行なった。ECL強度上への酵素イン
キュベーションの影響を観察した。
発生したECLのソースの確認のために、同じ６種の抗
生物質の加水分解を分光測光的にモニターした（β−ラ
クタム抗生物質の加水分解の際、紫外領域でスペクトル
変化が起こることが知られている）。６種の抗生物質の
UVスペクトル性質が実質的に異なるので、抗生物質加水
分解の分光測光的分析は実際には複数の方法からなっ
た。各検定において監視される波長ならびにキューベッ
ト通路長は各抗生物質について各々最適化を必要とし、
即ち；ベンジルペニシリンおよびアンピシリンは10mmの
キューベットおよび240nmの波長を必要とし；セファロ
スポリンＣ測定は2mmキューベットおよび260nmの波長を
必要とし；セフォキシチンは2mmキューベットおよび270
nmの波長を必要とし；そしてアモキシリンは2mmキュー
ベットおよび240nmの波長を必要とした。対照的に、ECL
測定はすべて、同一のECL機器セットを用いて行なわれ
た。
生物質の加水分解を分光測光的にモニターした（β−ラ
クタム抗生物質の加水分解の際、紫外領域でスペクトル
変化が起こることが知られている）。６種の抗生物質の
UVスペクトル性質が実質的に異なるので、抗生物質加水
分解の分光測光的分析は実際には複数の方法からなっ
た。各検定において監視される波長ならびにキューベッ
ト通路長は各抗生物質について各々最適化を必要とし、
即ち；ベンジルペニシリンおよびアンピシリンは10mmの
キューベットおよび240nmの波長を必要とし；セファロ
スポリンＣ測定は2mmキューベットおよび260nmの波長を
必要とし；セフォキシチンは2mmキューベットおよび270
nmの波長を必要とし；そしてアモキシリンは2mmキュー
ベットおよび240nmの波長を必要とした。対照的に、ECL
測定はすべて、同一のECL機器セットを用いて行なわれ
た。
図3a〜図3dに示されるようにβ−ラクタマーゼの低い
濃度（ナノモル以下）によるβ−ラクタム加水分解は10
分でECLにより検出されることが出来ることがわかる。
抗生物質モキサラクタムおよびセファキシチンの加水分
解は（塩基を用いての処理では、実質的なECL変化がこ
れらの化合物の加水分解に伴なっているけれども：例２
参照）、ECLおよび分光測光法の両方ではそれらが、実
験において使用されたどの酵素によっても触媒作用され
なかったことを示したので、抗生物質モキサラクタムお
よびセフォキシチンは図３に示されていない。図３は分
光測光（黒色棒）およびECL（灰色棒）の検定方法によ
る加水分解の定量化が同様の結果を提供することを示し
ている。これらの結果はまた、試験された該４種の酵素
の各々が、基質特異性の特有の“スペクトル”を有する
ことを示している。臨床的には、治療に有効な抗生物質
は微生物のβ−ラクタマーゼにより有意に加水分解され
ない抗生物質から選択することが有利である。したがっ
てこの実験は４種の“模擬”感染の研究として考えられ
ることが出来る。各模擬感染（酵素）はβ−ラクタマー
ゼ基質特異性、各抗生物質のインビボ有効性を予測する
のに助けとなる情報を得るために６種の候補β−ラクタ
ム抗生物質で刺激された。
濃度（ナノモル以下）によるβ−ラクタム加水分解は10
分でECLにより検出されることが出来ることがわかる。
抗生物質モキサラクタムおよびセファキシチンの加水分
解は（塩基を用いての処理では、実質的なECL変化がこ
れらの化合物の加水分解に伴なっているけれども：例２
参照）、ECLおよび分光測光法の両方ではそれらが、実
験において使用されたどの酵素によっても触媒作用され
なかったことを示したので、抗生物質モキサラクタムお
よびセフォキシチンは図３に示されていない。図３は分
光測光（黒色棒）およびECL（灰色棒）の検定方法によ
る加水分解の定量化が同様の結果を提供することを示し
ている。これらの結果はまた、試験された該４種の酵素
の各々が、基質特異性の特有の“スペクトル”を有する
ことを示している。臨床的には、治療に有効な抗生物質
は微生物のβ−ラクタマーゼにより有意に加水分解され
ない抗生物質から選択することが有利である。したがっ
てこの実験は４種の“模擬”感染の研究として考えられ
ることが出来る。各模擬感染（酵素）はβ−ラクタマー
ゼ基質特異性、各抗生物質のインビボ有効性を予測する
のに助けとなる情報を得るために６種の候補β−ラクタ
ム抗生物質で刺激された。
例2: 塩基によるベータ−ラクタム加水分解のECL検定 β−ラクタム抗生物質は酸類または塩基類によって加
水分解されることが出来る。希釈水酸化ナトリウムを用
いてのβ−ラクタム抗生物質の加水分解は一般に、それ
らがβ−ラクタマーゼにより加水分解されるときと実験
的に同一のECL検定結果を生成する（表１）。特定のβ
−ラクタムが任意の既知のβ−ラクタマーゼによって認
識され得ないかまたは加水分解され得ない或る場合、そ
の抗生物質の塩基加水分解サンプルのECL特性との比較
により抗生物質のECL定量化を行なうことが出来る。
水分解されることが出来る。希釈水酸化ナトリウムを用
いてのβ−ラクタム抗生物質の加水分解は一般に、それ
らがβ−ラクタマーゼにより加水分解されるときと実験
的に同一のECL検定結果を生成する（表１）。特定のβ
−ラクタムが任意の既知のβ−ラクタマーゼによって認
識され得ないかまたは加水分解され得ない或る場合、そ
の抗生物質の塩基加水分解サンプルのECL特性との比較
により抗生物質のECL定量化を行なうことが出来る。
表２は図２において構造が示めされる10種のβ−ラク
タム類により生成されたECL上へのNaOHの影響を示す。
タム類により生成されたECL上へのNaOHの影響を示す。
0.2MのNaOHを用いての一夜の処理はすべての場合にお
いてβ−ラクタム環の完全な加水分解を生じた。すべて
の場合において、種々の程度であるけれども塩基加水分
解はECL性質を変化させることを見ることが出来る。
（ペニシリンＧ、アンピシリンおよびアモキシリンのよ
うな）試験された抗生物質の或るものは加水分解後増大
したECLを与え、一方では（セフォキシチンおよびセフ
ァロスポリンＣのような）他の抗生物質は加水分解後実
質的により低いECLを与えた。この観察についてまたは
各々の化合物が特有的に挙動する事実について明らかな
化学構造的理由がないけれども、ペニシリン類は加水分
解後より高いECLを提供しそしてセファロスポリン類は
加水分解後により低いECLを提供する。ECL挙動における
差についての、下に存在する機械論的理由は、恐らく
は、Ru（bpy）3 3+に電子を有効に移動させることが出来
る安定なラジカルカチオンを形成する基質および反応の
生成物の感受性における変化の結果である（提案された
ECLメカニズムの体系を示す図６参照）。
いてβ−ラクタム環の完全な加水分解を生じた。すべて
の場合において、種々の程度であるけれども塩基加水分
解はECL性質を変化させることを見ることが出来る。
（ペニシリンＧ、アンピシリンおよびアモキシリンのよ
うな）試験された抗生物質の或るものは加水分解後増大
したECLを与え、一方では（セフォキシチンおよびセフ
ァロスポリンＣのような）他の抗生物質は加水分解後実
質的により低いECLを与えた。この観察についてまたは
各々の化合物が特有的に挙動する事実について明らかな
化学構造的理由がないけれども、ペニシリン類は加水分
解後より高いECLを提供しそしてセファロスポリン類は
加水分解後により低いECLを提供する。ECL挙動における
差についての、下に存在する機械論的理由は、恐らく
は、Ru（bpy）3 3+に電子を有効に移動させることが出来
る安定なラジカルカチオンを形成する基質および反応の
生成物の感受性における変化の結果である（提案された
ECLメカニズムの体系を示す図６参照）。
（セファロスポリンＣおよびセファクロールを用いて
の）或る場合において、抗生物質を加水分解するために
用いられたNaOHの濃度および加水分解時間の長さに依存
して結果が変化したことに留意すべきである。これは、
NaOHとこれらの特定の化合物との間で起るβ−ラクタム
加水分解に加えて、他の反応によるものであると信じら
れる。酵素加水分解はβ−ラクタムを加水分解する化学
的に、よりおだやかな方法でありそして或る場合におい
てNaOHの使用より好ましい可能性がある。
の）或る場合において、抗生物質を加水分解するために
用いられたNaOHの濃度および加水分解時間の長さに依存
して結果が変化したことに留意すべきである。これは、
NaOHとこれらの特定の化合物との間で起るβ−ラクタム
加水分解に加えて、他の反応によるものであると信じら
れる。酵素加水分解はβ−ラクタムを加水分解する化学
的に、よりおだやかな方法でありそして或る場合におい
てNaOHの使用より好ましい可能性がある。
例3: ECLによるβ−ラクタム類の定量化 β−ラクタム抗生物質の濃度を測定することは治療薬
剤の監視においてそしてまた抗生物質を投与された牛か
らの食肉およびミルクのような食品の品質の監視におい
て重要である。任意の分析方法において、シグナルが分
析物濃度の関数として変化することが重要である。ECL
を用いたβ−ラクタム類の検出および定量化はそれらの
濃度に依存していることが分かったので、未知のサンプ
ルの濃度を適当な標準曲線との比較によって決定するこ
とが出来る。標準曲線（抗生物質濃度対ECL）をペニシ
リンＧ、アンピシリン、アモキシリン、セファキシチ
ン、セファロスポリンＣおよびモキサラクタムについて
作成した。図４において普通に使用されるペニシリン、
アンピシリンについての標準曲線（図4a）および広く使
用されるセファロスポリン、セフォキシチンについての
標準曲線（図4b）が示される。アンピシリンの場合にお
いて、B.cereusからのβ−ラクタマーゼＩの7nmの、不
存在下または存在下に、室温で10分間、pH7.5の0.1Mの
リン酸ナトリウム中で、種々の濃度の抗生物質（０〜0.
1mM）の275μｌをインキュベートした（アンピシリ
ン）。セフォキシチンについては、抗生物質の1.5mMの
溶液で室温で一夜、0.2MのNaOH中でインキュベートし
た。加水分解されたセフォキシチンの溶液の適当な希釈
液（０〜1.0mMの275μｌ）およびセフォキシチンの比較
できる加水分解されていない溶液の適当な希釈液（０〜
1.0mMの275μｌ）を調製した。（加水分解されたおよび
加水分解されていない）アンピシリンおよびセフォキシ
チン溶液の275μｌに120μＭのRu（bpy）3 2+および0.6
％のトリトン（Triton）Ｘ−100の溶液の25μｌを加え
これらのサンプルをIGENのOrigenRECLアナライザー中で
分析した。表２において提供されたデータと一般的に一
致して、アンピシリン加水分解はECLにおいて増大を生
じ、一方でセフォキシチン加水分解はECLにおいて減少
を生じた。両方の場合において、適当な加水分解の前に
そしてその後に、ECLを測定すればどのくらいの多くの
抗生物質が存在するかを予測することを可能にする一般
的な傾向が見い出された。
剤の監視においてそしてまた抗生物質を投与された牛か
らの食肉およびミルクのような食品の品質の監視におい
て重要である。任意の分析方法において、シグナルが分
析物濃度の関数として変化することが重要である。ECL
を用いたβ−ラクタム類の検出および定量化はそれらの
濃度に依存していることが分かったので、未知のサンプ
ルの濃度を適当な標準曲線との比較によって決定するこ
とが出来る。標準曲線（抗生物質濃度対ECL）をペニシ
リンＧ、アンピシリン、アモキシリン、セファキシチ
ン、セファロスポリンＣおよびモキサラクタムについて
作成した。図４において普通に使用されるペニシリン、
アンピシリンについての標準曲線（図4a）および広く使
用されるセファロスポリン、セフォキシチンについての
標準曲線（図4b）が示される。アンピシリンの場合にお
いて、B.cereusからのβ−ラクタマーゼＩの7nmの、不
存在下または存在下に、室温で10分間、pH7.5の0.1Mの
リン酸ナトリウム中で、種々の濃度の抗生物質（０〜0.
1mM）の275μｌをインキュベートした（アンピシリ
ン）。セフォキシチンについては、抗生物質の1.5mMの
溶液で室温で一夜、0.2MのNaOH中でインキュベートし
た。加水分解されたセフォキシチンの溶液の適当な希釈
液（０〜1.0mMの275μｌ）およびセフォキシチンの比較
できる加水分解されていない溶液の適当な希釈液（０〜
1.0mMの275μｌ）を調製した。（加水分解されたおよび
加水分解されていない）アンピシリンおよびセフォキシ
チン溶液の275μｌに120μＭのRu（bpy）3 2+および0.6
％のトリトン（Triton）Ｘ−100の溶液の25μｌを加え
これらのサンプルをIGENのOrigenRECLアナライザー中で
分析した。表２において提供されたデータと一般的に一
致して、アンピシリン加水分解はECLにおいて増大を生
じ、一方でセフォキシチン加水分解はECLにおいて減少
を生じた。両方の場合において、適当な加水分解の前に
そしてその後に、ECLを測定すればどのくらいの多くの
抗生物質が存在するかを予測することを可能にする一般
的な傾向が見い出された。
例4: ECLによるβ−ラクタマーゼ類の定量化 100以上のタイプのβ−ラクタマーゼ酵素がある。各
々は、pH、濃度、および他のファクターの規定された条
件下、再現可能的に、その特定の酵素に特異的である基
質触媒作用の速動定数（kinetic constant）を有する。
特に重要である１つの速動定数は、酵素の分子当り一定
の基質の触媒作用についての最大速度（Vmax）として定
義されたKcatである（例えば10s -1のKcatは１つの酵素
分子がVmaxにおいて秒当り10の基質分子を触媒作用する
ことを意味する）。したがって酵素が（基質濃度が高い
ときに起る）Vmaxで作用しているときは、酵素濃度を触
媒作用の速度を測定することにより決定することが出来
る。共通のβ−ラクタム基質を有するβ−ラクタマーゼ
の多くのKcat値は既知であるので、β−ラクタマーゼ酵
素の濃度は（単位時間当りに形成された生成物濃度の単
位において）高い基質濃度で基質の触媒作用の速度を測
定することにより決定することが出来る。これらのタイ
プの測定はECLを用いて行なわれることが出来る。
々は、pH、濃度、および他のファクターの規定された条
件下、再現可能的に、その特定の酵素に特異的である基
質触媒作用の速動定数（kinetic constant）を有する。
特に重要である１つの速動定数は、酵素の分子当り一定
の基質の触媒作用についての最大速度（Vmax）として定
義されたKcatである（例えば10s -1のKcatは１つの酵素
分子がVmaxにおいて秒当り10の基質分子を触媒作用する
ことを意味する）。したがって酵素が（基質濃度が高い
ときに起る）Vmaxで作用しているときは、酵素濃度を触
媒作用の速度を測定することにより決定することが出来
る。共通のβ−ラクタム基質を有するβ−ラクタマーゼ
の多くのKcat値は既知であるので、β−ラクタマーゼ酵
素の濃度は（単位時間当りに形成された生成物濃度の単
位において）高い基質濃度で基質の触媒作用の速度を測
定することにより決定することが出来る。これらのタイ
プの測定はECLを用いて行なわれることが出来る。
例えば、規定されたpH、温度および他のファクターの
溶液中のBacillus cereusからのβ−ラクタマーゼＩの
濃度を定量化したいならば、酵素がVmaxで働らくように
十分に高い濃度（例えば1.0mM）を与えるようにペニシ
リンＧを加える。ペニシリンターンオーバーのECL測定
は２つより少なくない時間ポイントで行なわれ： 例えば酵素触媒作用反応の開始後時間＝０、1.0、2.5、
5.0、7.5および10.0分でである。標準曲線（生成したEC
Lに対する加水分解されたペニシリンＧの濃度）におい
て生成されたECLの比較により、触媒作用加水分解の初
期速度を決定することが出来、その値は最大速度であろ
う。この実験的に決定されたVmax（例えば、秒当り加水
分解された2200nMのペニシリンＧ）を、文献に報告され
たKcat値（例えば、Martin,M.TおよびWaley,S.Tの、Bio
chem.J.（1988）254第923頁〜第925頁において確立され
た2200秒-1）により割り算することにより、酵素濃度
（1nM）を提供するだろう。
溶液中のBacillus cereusからのβ−ラクタマーゼＩの
濃度を定量化したいならば、酵素がVmaxで働らくように
十分に高い濃度（例えば1.0mM）を与えるようにペニシ
リンＧを加える。ペニシリンターンオーバーのECL測定
は２つより少なくない時間ポイントで行なわれ： 例えば酵素触媒作用反応の開始後時間＝０、1.0、2.5、
5.0、7.5および10.0分でである。標準曲線（生成したEC
Lに対する加水分解されたペニシリンＧの濃度）におい
て生成されたECLの比較により、触媒作用加水分解の初
期速度を決定することが出来、その値は最大速度であろ
う。この実験的に決定されたVmax（例えば、秒当り加水
分解された2200nMのペニシリンＧ）を、文献に報告され
たKcat値（例えば、Martin,M.TおよびWaley,S.Tの、Bio
chem.J.（1988）254第923頁〜第925頁において確立され
た2200秒-1）により割り算することにより、酵素濃度
（1nM）を提供するだろう。
例5: 血液、血清、尿または咽頭ぬぐい液のような生物学的液
体中のβ−ラクタム抗生物質のECL検出および定量化 生物学的材料中の抗生物質の検出は、ECL法あるいは
測定を妨げる可能性がある、存在しているかもしれない
すべての細胞の除去後、容易行なわれることが出来た。
細胞除去は、濾過または遠心分離のような周知の手段に
よって行うことが出来る。次にこの明細書に記載されて
いるとおりにして、残留液体を抗生物質−促進されたEC
Lについて測定することが出来る。２つのサンプルがECL
について測定され;1つのサンプルは患者の処置された液
体であり、他のサンプルは同じ患者の液体であるがしか
しECLについて測定されるその抗生物質を加水分解する
ことが知られている添加β−ラクタマーゼ酵素を含有す
る液体である（ECLは、存在する可能性があるすべての
抗生物質を完全に加水分解するのに酵素のために十分な
時間インキュベーション後に測定される）。非処理サン
プルと酵素処理サンプルとの間のECLにおける差は抗生
物質の存在の表示でありそしてECL差の程度はその抗生
物質の濃度の表示である。標準曲線は、患者の液体に既
知量の抗生物質を加え酵素触媒作用加水分解の前および
その後にECLを測定することにより作成することが出来
る。患者の液体は、その特定の患者に特有である、ECL
法または測定に影響する物質をその液体中に有する可能
性があるので、既知の濃度の抗生物質が加えられた同じ
患者の液体を用いて標準曲線は造られるべきである。
体中のβ−ラクタム抗生物質のECL検出および定量化 生物学的材料中の抗生物質の検出は、ECL法あるいは
測定を妨げる可能性がある、存在しているかもしれない
すべての細胞の除去後、容易行なわれることが出来た。
細胞除去は、濾過または遠心分離のような周知の手段に
よって行うことが出来る。次にこの明細書に記載されて
いるとおりにして、残留液体を抗生物質−促進されたEC
Lについて測定することが出来る。２つのサンプルがECL
について測定され;1つのサンプルは患者の処置された液
体であり、他のサンプルは同じ患者の液体であるがしか
しECLについて測定されるその抗生物質を加水分解する
ことが知られている添加β−ラクタマーゼ酵素を含有す
る液体である（ECLは、存在する可能性があるすべての
抗生物質を完全に加水分解するのに酵素のために十分な
時間インキュベーション後に測定される）。非処理サン
プルと酵素処理サンプルとの間のECLにおける差は抗生
物質の存在の表示でありそしてECL差の程度はその抗生
物質の濃度の表示である。標準曲線は、患者の液体に既
知量の抗生物質を加え酵素触媒作用加水分解の前および
その後にECLを測定することにより作成することが出来
る。患者の液体は、その特定の患者に特有である、ECL
法または測定に影響する物質をその液体中に有する可能
性があるので、既知の濃度の抗生物質が加えられた同じ
患者の液体を用いて標準曲線は造られるべきである。
例6: ミルクまたは食肉のような食品中のβ−ラクタム抗生物
質のECL検出および定量化 ミルクのような液体食品中の抗生物質の検出は、その
液体について直接に行なってもよいしあるいは、ECL法
または測定の妨げる可能性がある脂質およびたんぱく質
のような成分または他の非抗生物質を除去するための処
理の後に行なってもよい。そのような除去工程は通常の
実験室処理であり高速度遠心分離を包含してもよい（例
えば、30分間標準の実験室遠心分離機中で10,000rp
m）。遠心分離はミルクのような液体の表面上に固体脂
肪の層を形成させる。脂肪の層は例えばへらを用いるこ
とにより手で除くことが出来た。たんぱく質は硫酸アン
モニウムを用いて沈澱させることによるかあるいは好ま
しくは限外ろ過により除去されることが出来た。限外ろ
過は規定された公称の細孔寸法を含有する膜を通しての
加圧ろ過により液体から高分子量物質を除去する方法で
ある（限外ろ過装置および追加の情報についてAmiconカ
タログ（マサチューセッツ州ダンバーズ）参照）。（典
型的には1000Da（ダルトン）より小さい分子量を有す
る）抗生物質の場合において、10,000Daの分子量カット
オフを有する膜は最良であろう。そのような膜は、ろ液
が抗生物質を含む、低分子量（＜10,000Da）物質のみを
含有するように、10,000より高い公称分子量を有する分
子を保持して除去する。より高分子量カットオフ膜（5
0,000〜100,000Da）はより速くろ過するかもしれないが
しかし多くのECLを妨害する可能性がある物質を保持し
ないだろう。
質のECL検出および定量化 ミルクのような液体食品中の抗生物質の検出は、その
液体について直接に行なってもよいしあるいは、ECL法
または測定の妨げる可能性がある脂質およびたんぱく質
のような成分または他の非抗生物質を除去するための処
理の後に行なってもよい。そのような除去工程は通常の
実験室処理であり高速度遠心分離を包含してもよい（例
えば、30分間標準の実験室遠心分離機中で10,000rp
m）。遠心分離はミルクのような液体の表面上に固体脂
肪の層を形成させる。脂肪の層は例えばへらを用いるこ
とにより手で除くことが出来た。たんぱく質は硫酸アン
モニウムを用いて沈澱させることによるかあるいは好ま
しくは限外ろ過により除去されることが出来た。限外ろ
過は規定された公称の細孔寸法を含有する膜を通しての
加圧ろ過により液体から高分子量物質を除去する方法で
ある（限外ろ過装置および追加の情報についてAmiconカ
タログ（マサチューセッツ州ダンバーズ）参照）。（典
型的には1000Da（ダルトン）より小さい分子量を有す
る）抗生物質の場合において、10,000Daの分子量カット
オフを有する膜は最良であろう。そのような膜は、ろ液
が抗生物質を含む、低分子量（＜10,000Da）物質のみを
含有するように、10,000より高い公称分子量を有する分
子を保持して除去する。より高分子量カットオフ膜（5
0,000〜100,000Da）はより速くろ過するかもしれないが
しかし多くのECLを妨害する可能性がある物質を保持し
ないだろう。
遠心分離および限外ろ過のような任意の必要な処理の
後、次に規定量の液体をこの明細書に記載された標準の
方法によりECLについて測定する。同一のサンプルを液
体中に存在すると推測されるβ−ラクタム抗生物質を有
効に加水分解すると知られているβ−ラクタマーゼで処
理した。（温度、pHおよび酵素濃度に依存して）加水分
解のための十分な時間の後に、ECLについて第２のサン
プルを測定する。β−ラクタマーゼはβ−ラクタム抗生
物質を特異的に加水分解するがしかし触媒作用に必要と
される低い濃度（典型的にはナノモル）でECLをほとん
ど提供しないかまたは全く提供しないので、加水分解さ
れたサンプルと加水分解されていないサンプルとの間の
ECLにおける差が液体中のβ−ラクタム抗生物質濃度の
表示となるであろう。検出された抗生物質の濃度を定量
化するための標準曲線は、存在すると推測される抗生物
質（加水分解されたおよび加水分解されていない）の既
知の量を用いて作成することが出来た。標準曲線を作成
するにあたって、ミルクのような食品に既知の抗生物質
を加えそして（例えば遠心分離および限外ろ過により）
未知の溶液と同様に処理することが好ましい。異なる抗
生物質についての試験は同様のサンプルで実験を繰り返
すが各々異なる抗生物質を特異的に加水分解する異なる
β−ラクタマーゼを用いることにより行なった。異なる
抗生物質を用いてのそのような繰り返えしの処理は、液
体中に存在する抗生物質を同定確認するための助けとな
った。
後、次に規定量の液体をこの明細書に記載された標準の
方法によりECLについて測定する。同一のサンプルを液
体中に存在すると推測されるβ−ラクタム抗生物質を有
効に加水分解すると知られているβ−ラクタマーゼで処
理した。（温度、pHおよび酵素濃度に依存して）加水分
解のための十分な時間の後に、ECLについて第２のサン
プルを測定する。β−ラクタマーゼはβ−ラクタム抗生
物質を特異的に加水分解するがしかし触媒作用に必要と
される低い濃度（典型的にはナノモル）でECLをほとん
ど提供しないかまたは全く提供しないので、加水分解さ
れたサンプルと加水分解されていないサンプルとの間の
ECLにおける差が液体中のβ−ラクタム抗生物質濃度の
表示となるであろう。検出された抗生物質の濃度を定量
化するための標準曲線は、存在すると推測される抗生物
質（加水分解されたおよび加水分解されていない）の既
知の量を用いて作成することが出来た。標準曲線を作成
するにあたって、ミルクのような食品に既知の抗生物質
を加えそして（例えば遠心分離および限外ろ過により）
未知の溶液と同様に処理することが好ましい。異なる抗
生物質についての試験は同様のサンプルで実験を繰り返
すが各々異なる抗生物質を特異的に加水分解する異なる
β−ラクタマーゼを用いることにより行なった。異なる
抗生物質を用いてのそのような繰り返えしの処理は、液
体中に存在する抗生物質を同定確認するための助けとな
った。
食肉のような固体食品中の抗生物質の検出は抗生物質
が固体食品から抽出（溶解化）されなければならない以
外は同様に行なうことが出来た。始めに、食品のサンプ
ルを緩衝液（好ましくは0.1Mリン酸塩、pH7.0）中に懸
濁し滑めらかになるまでブレンダー中で細かく刻んだ。
抗生物質は、存在する全ての細胞を破砕し、細胞内に存
在するすべての抗生物質を放出する、氷上音波破砕によ
りさらに抽出されてもよい。細かく刻み音波破砕した後
に、その材料を上記の液体食品と同様に処理した。即
ち、その材料を遠心分離そして（または）限外ろ過し
た。食肉の場合、遠心分離は、（遠心分離が表面脂肪層
を生ずるミルクとは異なって）細胞破片からなるペレッ
トを主として生ずる。標準曲線を作成するにあたって、
既知の抗生物質は本方法の早期に、好ましくは細かく刻
むのに用いられる緩衝液に加えられるべきである。
が固体食品から抽出（溶解化）されなければならない以
外は同様に行なうことが出来た。始めに、食品のサンプ
ルを緩衝液（好ましくは0.1Mリン酸塩、pH7.0）中に懸
濁し滑めらかになるまでブレンダー中で細かく刻んだ。
抗生物質は、存在する全ての細胞を破砕し、細胞内に存
在するすべての抗生物質を放出する、氷上音波破砕によ
りさらに抽出されてもよい。細かく刻み音波破砕した後
に、その材料を上記の液体食品と同様に処理した。即
ち、その材料を遠心分離そして（または）限外ろ過し
た。食肉の場合、遠心分離は、（遠心分離が表面脂肪層
を生ずるミルクとは異なって）細胞破片からなるペレッ
トを主として生ずる。標準曲線を作成するにあたって、
既知の抗生物質は本方法の早期に、好ましくは細かく刻
むのに用いられる緩衝液に加えられるべきである。
ベータ−ラクタム抗生物質がミルク（メリーランド州
ワルドルフのEmbassy Dairy販売の低温殺菌され且つ均
質化された等級ＡのVitamin D Mil）中で検出された。
ベンジルペニシリン（250μｌのミルク、10.0μＭのRu
（bpy）3 2+、1.0mMのペニシリンＧ、＋／−18nMのB.cer
eusからのβ−ラクタマーゼＩを含有する300μｌの合計
容量）についておよびセファロスポリンＣ（250μｌの
ミルク、10.0μＭのRu（bpy）3 2+、1.0mMのセファロス
ポリンＣ、＋／−18nMのE.cloacaeからのβ−ラクタマ
ーゼP99を含有する300μｌの合計容量）について次の結
果が得られた。
ワルドルフのEmbassy Dairy販売の低温殺菌され且つ均
質化された等級ＡのVitamin D Mil）中で検出された。
ベンジルペニシリン（250μｌのミルク、10.0μＭのRu
（bpy）3 2+、1.0mMのペニシリンＧ、＋／−18nMのB.cer
eusからのβ−ラクタマーゼＩを含有する300μｌの合計
容量）についておよびセファロスポリンＣ（250μｌの
ミルク、10.0μＭのRu（bpy）3 2+、1.0mMのセファロス
ポリンＣ、＋／−18nMのE.cloacaeからのβ−ラクタマ
ーゼP99を含有する300μｌの合計容量）について次の結
果が得られた。
ベンジルペニシリンサンプル ECL計数 ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 1880 ペニシリン ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 10,000 ペニシリン＋酵素 セファロスポリンＣサンプル ECL計数 ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 7,960 セファロスポリンＣ ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 9,340 セファロスポリンＣ＋酵素 NaOHで加水分解された、ミルク中の抗生物質を用いて
同様な実験を行なった； ベンジルペニシリンサンプル ECL計数 ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 19,100 ペニシリン ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 64,400 ペニシリン＋NaOH セファロスポリンサンプル ECL計数 ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 41,200 セファロスポリンＣ ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 35,100 セファロスポリンＣ＋NaOH セファロスポリンＣについて上記表において見ること
が出来るように、ECL上への加水分解の影響は加水分解
の方法によって左右される；酵素加水分解は計数を増大
させ、一方ではNaOH加水分解は計数を減少させる。適切
な対照実験はこのことが酵素の存在の結果でないことを
示した。この明細書に記載されているように、この化合
物のNaOH加水分解は例外的に方法依存性であり、この現
象は別のECL活性加水分解生成物の形成によるものと推
測される。これらの結果は加水分解の任意の一定の方法
において再現可能であり、矛盾しない。脂肪を除去する
ためにミルクの遠心分離を用いての他の実験から、ベン
ジルペニシリンおよびセファロスポリンＣの両方につい
ても同様の結果を得た。標準曲線は25μＭ未満のベンジ
ルペニシリンおよび250μＭ未満のセファロスポリンＣ
がECLを用いてミルク中で検出されることが出来たこと
を示した。
同様な実験を行なった； ベンジルペニシリンサンプル ECL計数 ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 19,100 ペニシリン ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 64,400 ペニシリン＋NaOH セファロスポリンサンプル ECL計数 ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 41,200 セファロスポリンＣ ミルク＋Ru（bpy）3 2+＋ 35,100 セファロスポリンＣ＋NaOH セファロスポリンＣについて上記表において見ること
が出来るように、ECL上への加水分解の影響は加水分解
の方法によって左右される；酵素加水分解は計数を増大
させ、一方ではNaOH加水分解は計数を減少させる。適切
な対照実験はこのことが酵素の存在の結果でないことを
示した。この明細書に記載されているように、この化合
物のNaOH加水分解は例外的に方法依存性であり、この現
象は別のECL活性加水分解生成物の形成によるものと推
測される。これらの結果は加水分解の任意の一定の方法
において再現可能であり、矛盾しない。脂肪を除去する
ためにミルクの遠心分離を用いての他の実験から、ベン
ジルペニシリンおよびセファロスポリンＣの両方につい
ても同様の結果を得た。標準曲線は25μＭ未満のベンジ
ルペニシリンおよび250μＭ未満のセファロスポリンＣ
がECLを用いてミルク中で検出されることが出来たこと
を示した。
例7: 血液、尿、血清または咽頭ぬぐい液のような生物学的材
料中のβ−ラクタマーゼのECL検定 生物学的材料中のβ−ラクタマーゼの決定は例４に記
載された方法と同様な方法で行なわれる。本質的に、既
知の抗生物質は既知の濃度（例えば1.0mM）に、生物学
的液体と混合される。即時のECL読み取りが行なわれ或
る時間のあとに他の読み取りが行なわれる（もしβ−ラ
クタマーゼの濃度が高ければ５分であることが出来また
はβ−ラクタマーゼの濃度が低ければ一夜ほどの長さで
あることが出来る）。ECLにおける変化はβ−ラクタマ
ーゼによる抗生物質加水分解を表示する。抗生物質ター
ンオーバーの程度は加水分解された抗生物質濃度対生成
ECLの標準曲線に比較されることが出来た。例５におい
て記載したように生物学的液体中の抗生物質の測定に関
して、ECL法および測定を妨げる可能性があるすべての
非β−ラクタマーゼ基質を除くために既知手段により液
体を処理することが望ましい。咽頭ぬぐい液に存在する
酵素は緩衝液の添加により溶解化されることが必要であ
ろう。
料中のβ−ラクタマーゼのECL検定 生物学的材料中のβ−ラクタマーゼの決定は例４に記
載された方法と同様な方法で行なわれる。本質的に、既
知の抗生物質は既知の濃度（例えば1.0mM）に、生物学
的液体と混合される。即時のECL読み取りが行なわれ或
る時間のあとに他の読み取りが行なわれる（もしβ−ラ
クタマーゼの濃度が高ければ５分であることが出来また
はβ−ラクタマーゼの濃度が低ければ一夜ほどの長さで
あることが出来る）。ECLにおける変化はβ−ラクタマ
ーゼによる抗生物質加水分解を表示する。抗生物質ター
ンオーバーの程度は加水分解された抗生物質濃度対生成
ECLの標準曲線に比較されることが出来た。例５におい
て記載したように生物学的液体中の抗生物質の測定に関
して、ECL法および測定を妨げる可能性があるすべての
非β−ラクタマーゼ基質を除くために既知手段により液
体を処理することが望ましい。咽頭ぬぐい液に存在する
酵素は緩衝液の添加により溶解化されることが必要であ
ろう。
例8: ミルクまたは食肉のような食品中のβ−ラクタマーゼの
ECL検定 （ミルクのような）液体および（食肉のような）固体
の食品中のβ−ラクタマーゼの検出および定量化はECL
を用いて行なわれることが出来る。液体食品の場合にお
いて、ECL法または測定を妨げる可能性がある非β−ラ
クタマーゼ物質を除去するために適当な既知の方法が必
要とされる。例えば普通のろ紙を通過させてのろ過はミ
ルクから粒状物を除くのに有用であろう。またミルクの
遠心分離は測定を妨げる可能性のある脂質を除去する。
食肉のような固体食品の場合において、添加緩衝液（例
えば0.1Mりん酸塩、pH7.0）を有するワリング（Warin
g）ブレンダー中での均質化、次に４℃での音波破砕そ
して遠心分離（30分間10,000×ｇ）は酵素溶解化の助け
となるであろう。これらの処理の後、100,000Da以上の
分子を除くための限外ろ過工程を追加することはまた有
用であろう。限外ろ過のろ液は一般に約30,000Daの分子
量を有する任意のβ−ラクタマーゼを含有する。これら
の食品由来の溶液中のβ−ラクタマーゼのECL検出は最
初に選択された非β−ラクタム抗生物質（例えば1.0mM
の濃度のペニシリンＧ）を加えそして即時のECL測定を
行い、次に遅れた或る時間（その時間は５分ほどの短か
い時間または一夜ほどの長い時間であることが出来る）
に、少なくとも１回以上の測定を行なうことからなる。
ECLの何らかの変化は添加抗生物質のβ−ラクタマーゼ
触媒作用加水分解の存在の表示であろう。加水分解の程
度は、比較出来る条件下で造られた標準曲線（加水分解
された抗生物質の濃度対ECL）との比較により決定され
ることが出来た。
ECL検定 （ミルクのような）液体および（食肉のような）固体
の食品中のβ−ラクタマーゼの検出および定量化はECL
を用いて行なわれることが出来る。液体食品の場合にお
いて、ECL法または測定を妨げる可能性がある非β−ラ
クタマーゼ物質を除去するために適当な既知の方法が必
要とされる。例えば普通のろ紙を通過させてのろ過はミ
ルクから粒状物を除くのに有用であろう。またミルクの
遠心分離は測定を妨げる可能性のある脂質を除去する。
食肉のような固体食品の場合において、添加緩衝液（例
えば0.1Mりん酸塩、pH7.0）を有するワリング（Warin
g）ブレンダー中での均質化、次に４℃での音波破砕そ
して遠心分離（30分間10,000×ｇ）は酵素溶解化の助け
となるであろう。これらの処理の後、100,000Da以上の
分子を除くための限外ろ過工程を追加することはまた有
用であろう。限外ろ過のろ液は一般に約30,000Daの分子
量を有する任意のβ−ラクタマーゼを含有する。これら
の食品由来の溶液中のβ−ラクタマーゼのECL検出は最
初に選択された非β−ラクタム抗生物質（例えば1.0mM
の濃度のペニシリンＧ）を加えそして即時のECL測定を
行い、次に遅れた或る時間（その時間は５分ほどの短か
い時間または一夜ほどの長い時間であることが出来る）
に、少なくとも１回以上の測定を行なうことからなる。
ECLの何らかの変化は添加抗生物質のβ−ラクタマーゼ
触媒作用加水分解の存在の表示であろう。加水分解の程
度は、比較出来る条件下で造られた標準曲線（加水分解
された抗生物質の濃度対ECL）との比較により決定され
ることが出来た。
例9: 細菌培養におけるβ−ラクタマーゼのECL検定 広範な単離工程なしに、（規定された実験室培地にお
けるようなあるいは血液、尿またはミルクにおけるよう
な）細菌培養液中のβ−ラクタマーゼを検出することは
好ましくそしてときには必須である。１つの応用におい
て、病原菌で感染した患者の血液中のβ−ラクタマーゼ
のその場での検出はその個人の医療的治療に関する決定
に有益に影響することが出来る。そのような応用におい
て、β−ラクタマーゼを検出するためにβ−ラクタマー
ゼを精製することは時間を消費するものであり許されな
いかあるいはさもなくば実際的でない。したがって、β
−ラクタマーゼを生成する微生物の存在下にそして細菌
が増殖した培養液体中でβ−ラクタマーゼを検出するこ
とが出来ることが重要である。
けるようなあるいは血液、尿またはミルクにおけるよう
な）細菌培養液中のβ−ラクタマーゼを検出することは
好ましくそしてときには必須である。１つの応用におい
て、病原菌で感染した患者の血液中のβ−ラクタマーゼ
のその場での検出はその個人の医療的治療に関する決定
に有益に影響することが出来る。そのような応用におい
て、β−ラクタマーゼを検出するためにβ−ラクタマー
ゼを精製することは時間を消費するものであり許されな
いかあるいはさもなくば実際的でない。したがって、β
−ラクタマーゼを生成する微生物の存在下にそして細菌
が増殖した培養液体中でβ−ラクタマーゼを検出するこ
とが出来ることが重要である。
ベータ−ラクタマーゼはグラム陰性菌およびグラス陽
性菌の両方により生成される。グラム陰性菌（例えばE.
coli）の場合において、β−ラクタマーゼはペリプラス
ム間隙に隔離される。グラム陽性菌（例えばB.cereus）
において、酵素は細胞を囲む培養液中に分泌される。グ
ラム陰性菌培養およびグラム陽性菌培養の両方において
β−ラクタマーゼ活性を検出することが出来ることは価
値がある。酵素は該２つのタイプの細菌において物理的
に異なる状態（隔離された対分泌された）で存在するの
でβ−ラクタマーゼ検出はある程度異なった実験計画を
必要とするかもしれない（またはそれを必要としないか
もしれない）。
性菌の両方により生成される。グラム陰性菌（例えばE.
coli）の場合において、β−ラクタマーゼはペリプラス
ム間隙に隔離される。グラム陽性菌（例えばB.cereus）
において、酵素は細胞を囲む培養液中に分泌される。グ
ラム陰性菌培養およびグラム陽性菌培養の両方において
β−ラクタマーゼ活性を検出することが出来ることは価
値がある。酵素は該２つのタイプの細菌において物理的
に異なる状態（隔離された対分泌された）で存在するの
でβ−ラクタマーゼ検出はある程度異なった実験計画を
必要とするかもしれない（またはそれを必要としないか
もしれない）。
グラム陰性菌、E.coliの２種の菌株が、各10mlのLB培
養液中の一夜増殖された。１種の菌株は、それがβ−ラ
クタマーゼの生成に起因してアンピシリンに耐性である
ので、E.coli AmpR（ATCC:DH5αＦ′IQpDsubE.F4）と称
される。E.coli AmpS（ATCC:Jm105）と称される他種の
菌株は高水準のβ−ラクタマーゼを生成しないそして対
照（アンピシリン感受性）菌株として使用された。細胞
は、Sorvall RT 6000 D遠心分離機中で2800rpmでの遠心
分離そして次に傾瀉による上澄み液溶液の除去により遠
心分離ペレットとして培養液から単離された。試験は傾
瀉された上澄み液を用いて行なわれたがしかし少なくと
もE.coliに関して、ずっと多くのβ−ラクタマーゼ活性
はペレットに検出された。ペレット化された細胞は、pH
8.0の50mMのTris−アセテート緩衝液の9.5μｌ中に再懸
濁され、次に氷冷ビーカー中で15分間音波破砕された。
典型的には得られた懸濁液の部分（9.5〜10.0μｌ）は5
00μＭのアンピシリン、10.0μＭのRu（bpy）3 2+、およ
び0.05％のTritonX−100を含有するpH7.5の0.1Mリン酸
塩緩衝液の300μｌに加えられた。種々のインキュベー
ション時間（時間なし〜一夜）の後、懸濁液は、IGENの
ECLアナライザーを用いて電気化学発光を生成するそれ
らの能力について試験された。或る場合において、β−
ラクタマーゼ抑制剤、６−β−Br−ペニシラン酸の1.0m
M溶液の5.0μｌが、生成したECLのソースの対照として
加えられた。
養液中の一夜増殖された。１種の菌株は、それがβ−ラ
クタマーゼの生成に起因してアンピシリンに耐性である
ので、E.coli AmpR（ATCC:DH5αＦ′IQpDsubE.F4）と称
される。E.coli AmpS（ATCC:Jm105）と称される他種の
菌株は高水準のβ−ラクタマーゼを生成しないそして対
照（アンピシリン感受性）菌株として使用された。細胞
は、Sorvall RT 6000 D遠心分離機中で2800rpmでの遠心
分離そして次に傾瀉による上澄み液溶液の除去により遠
心分離ペレットとして培養液から単離された。試験は傾
瀉された上澄み液を用いて行なわれたがしかし少なくと
もE.coliに関して、ずっと多くのβ−ラクタマーゼ活性
はペレットに検出された。ペレット化された細胞は、pH
8.0の50mMのTris−アセテート緩衝液の9.5μｌ中に再懸
濁され、次に氷冷ビーカー中で15分間音波破砕された。
典型的には得られた懸濁液の部分（9.5〜10.0μｌ）は5
00μＭのアンピシリン、10.0μＭのRu（bpy）3 2+、およ
び0.05％のTritonX−100を含有するpH7.5の0.1Mリン酸
塩緩衝液の300μｌに加えられた。種々のインキュベー
ション時間（時間なし〜一夜）の後、懸濁液は、IGENの
ECLアナライザーを用いて電気化学発光を生成するそれ
らの能力について試験された。或る場合において、β−
ラクタマーゼ抑制剤、６−β−Br−ペニシラン酸の1.0m
M溶液の5.0μｌが、生成したECLのソースの対照として
加えられた。
同様な実験計画がグラム陽性菌B.cereusで使用され
た。１種の菌株は比較的に高い量のβ−ラクタマーゼを
分泌する（B.cereus AmpRと称される）（ATCC:27348）
そして他種の菌株はほとんどβ−ラクタマーゼを分泌し
ない（B.cereus AmpSと称される）（ATCC:9139）。増殖
の条件および実験方法は、或る場合において、下に記載
されるように、上澄み溶液がECL実験のために用いられ
た以外は、E.coliについて上記したのと同一であった。
た。１種の菌株は比較的に高い量のβ−ラクタマーゼを
分泌する（B.cereus AmpRと称される）（ATCC:27348）
そして他種の菌株はほとんどβ−ラクタマーゼを分泌し
ない（B.cereus AmpSと称される）（ATCC:9139）。増殖
の条件および実験方法は、或る場合において、下に記載
されるように、上澄み溶液がECL実験のために用いられ
た以外は、E.coliについて上記したのと同一であった。
E.coliについての結果は、細胞培養を伴なうβ−ラク
タマーゼ活性が、広範囲の精製なしに、ECLを用いるこ
とにより事実測定されることが出来た。500μＭアンピ
シリン溶液を用いてのE.coliサンプルの1.0時間のイン
キュベーションの後、次のECL結果が得られた。
タマーゼ活性が、広範囲の精製なしに、ECLを用いるこ
とにより事実測定されることが出来た。500μＭアンピ
シリン溶液を用いてのE.coliサンプルの1.0時間のイン
キュベーションの後、次のECL結果が得られた。
表３ E.coliにおけるβ−ラクタマーゼ活性のECL検出サンプル ECL計数 E.coli AmpS＋Ru（bpy）3 2+ 36,400 ＋アンピシリン E.coli AmpR＋Ru（bpy）3 2+ 106,000 ＋アンピシリン E.coli AmpS＋Ru（bpy）3 2+ 35,000 ＋６−β−Br−ペニシラン酸＋ アンピシリン E.coli AmpR＋Ru（bpy）3 2+ 36,700 ＋６−β−Br−ペニシラン酸＋ アンピシリン これらのデータはβ−ラクタマーゼ活性がグラム陰性
菌においてその場で検出されることが出来ることを示し
ている。同様な結果がグラム陽性菌、B.cereusを用いて
だがしかしペレットよりも遠心分離上澄み液を用いて得
られた。もう一度、それらの結果は500μＭのアンピシ
リンを用いての1.0時間インキュベーション後に得られ
た。
菌においてその場で検出されることが出来ることを示し
ている。同様な結果がグラム陽性菌、B.cereusを用いて
だがしかしペレットよりも遠心分離上澄み液を用いて得
られた。もう一度、それらの結果は500μＭのアンピシ
リンを用いての1.0時間インキュベーション後に得られ
た。
表４ B.cereusにおけるβ−ラクタマーゼ活性のECL検出サンプル ECL計数 E.cereus AmpS＋Ru（bpy）3 2+ 33,600 ＋アンピシリン E.cereus AmpR＋Ru（bpy）3 2+ 47,200 ＋アンピシリン E.cereus AmpS＋Ru（bpy）3 2+ 25,600 ＋６−β−Br−ペニシラン酸＋ アンピシリン E.cereus AmpR＋Ru（bpy）3 2+ 22,500 ＋６−β−Br−ペニシラン酸＋ アンピシリン これらの結果はグラム陽性細胞により分泌されたβ−
ラクタマーゼがECLにより１時間で検出されることが出
来ることを示している。
ラクタマーゼがECLにより１時間で検出されることが出
来ることを示している。
或る適用において、β−ラクタマーゼの迅速な検出
は、サンプル中に存在する可能性がある小数の細菌細胞
の検出ほど重要でない。使用される条件下に、それらの
β−ラクタマーゼ活性により検出することが出来る細胞
の最も低い数を決定するために実験が行なわれた。標準
の（LB）増殖媒地中で一夜増殖されたE.coliの培養を用
いて、培養物遠心分離ペレットの徐々に大きくした希釈
液が、上記と同様な方法論でアンピシリンを用いての一
夜インキュベーションにより試験された。細胞培養にお
けるE.coli濃度が600nmでの分光測光的吸光度および次
の平板培養の吸光度に対する比較により決定された。図
５において見られるように、一夜インキュベーションに
おけるE.coli細胞の検出低限は2440であった。
は、サンプル中に存在する可能性がある小数の細菌細胞
の検出ほど重要でない。使用される条件下に、それらの
β−ラクタマーゼ活性により検出することが出来る細胞
の最も低い数を決定するために実験が行なわれた。標準
の（LB）増殖媒地中で一夜増殖されたE.coliの培養を用
いて、培養物遠心分離ペレットの徐々に大きくした希釈
液が、上記と同様な方法論でアンピシリンを用いての一
夜インキュベーションにより試験された。細胞培養にお
けるE.coli濃度が600nmでの分光測光的吸光度および次
の平板培養の吸光度に対する比較により決定された。図
５において見られるように、一夜インキュベーションに
おけるE.coli細胞の検出低限は2440であった。
例10: 細胞のベータ−ラクタマーゼのECL検定による細菌の同
定確認 多くの異なるタイプのβ−ラクタマーゼ酵素がある。
構造（アミノ酸配列）は酵素間でならびにそれらの基質
特異性間で実質的に異なる可能性がある。多くの異なる
β−ラクタム抗生物質および多くの異なるβ−ラクタマ
ーゼがあるので、ほとんどすべてのβ−ラクタマーゼが
一連の異なるβ−ラクタム抗生物質基質の加水分解の相
対的程度により（即ち基質特異性のその個々の“スペク
トル”により）、理論的には同定確認されることが出来
る。一定の細菌菌株がその特有のβ−ラクタマーゼ基質
特異性により同定確認されることが出来た（図3a〜図3d
参照）。提供された未知の細菌株を同定確認するにあた
って、その菌株の適当に処理された分別量（例９におい
て記載された様なペレットまたは上澄み液）は（セファ
ロスポリン類およびペニシリン類の両方を含む）一連の
適当に異なる抗生物質と混合されることが出来た。適当
な長さの時間（５分〜一夜）の後に、異なるインキュベ
ーション混合物のECLが読み取られそして異なる抗生物
質のターンオーバーの相対的速度を決定するために適当
な標準と比較されることが出来た（０〜100％のターン
オーバーが酵素濃度および個々の抗生物質／酵素対に依
存して予測される）。既知の細菌株についての既知の基
質特異性に基づいて、問題になっている細胞種が同定確
認されることが出来た。
定確認 多くの異なるタイプのβ−ラクタマーゼ酵素がある。
構造（アミノ酸配列）は酵素間でならびにそれらの基質
特異性間で実質的に異なる可能性がある。多くの異なる
β−ラクタム抗生物質および多くの異なるβ−ラクタマ
ーゼがあるので、ほとんどすべてのβ−ラクタマーゼが
一連の異なるβ−ラクタム抗生物質基質の加水分解の相
対的程度により（即ち基質特異性のその個々の“スペク
トル”により）、理論的には同定確認されることが出来
る。一定の細菌菌株がその特有のβ−ラクタマーゼ基質
特異性により同定確認されることが出来た（図3a〜図3d
参照）。提供された未知の細菌株を同定確認するにあた
って、その菌株の適当に処理された分別量（例９におい
て記載された様なペレットまたは上澄み液）は（セファ
ロスポリン類およびペニシリン類の両方を含む）一連の
適当に異なる抗生物質と混合されることが出来た。適当
な長さの時間（５分〜一夜）の後に、異なるインキュベ
ーション混合物のECLが読み取られそして異なる抗生物
質のターンオーバーの相対的速度を決定するために適当
な標準と比較されることが出来た（０〜100％のターン
オーバーが酵素濃度および個々の抗生物質／酵素対に依
存して予測される）。既知の細菌株についての既知の基
質特異性に基づいて、問題になっている細胞種が同定確
認されることが出来た。
それらの例は、本発明の種々の変更を例示するけれど
も、他の変更が上記開示から見て、それ自体当業者に示
唆されるだろう。したがって、それらの変化は上記特定
の態様においてなされることが出来、それらは、特許請
求の範囲に規定されるとおりの本発明の完全に意図され
る範囲内にある。
も、他の変更が上記開示から見て、それ自体当業者に示
唆されるだろう。したがって、それらの変化は上記特定
の態様においてなされることが出来、それらは、特許請
求の範囲に規定されるとおりの本発明の完全に意図され
る範囲内にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/34 G01N 33/15 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (19)
- 【請求項１】予め測定された量のルテニウムまたはオス
ミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子試薬および
β−ラクタマーゼを含み、該予め測定された量が単一の
サンプル測定を行なうのに十分である、β−ラクタム抗
生物質を測定するためのキット。 - 【請求項２】予め測定された量のルテニウムまたはオス
ミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子試薬および
β−ラクタムを含み、該予め測定された量が単一のサン
プル測定を行なうのに十分である、β−ラクタマーゼを
測定するためのキット。 - 【請求項３】キットが、中に予め測定された量の試薬を
有する一連の容器を含有する、請求項１または２に記載
のキット。 - 【請求項４】一連の容器が、自動化様式で検定が行なわ
れることが可能にするように造られている、請求項３に
記載のキット。 - 【請求項５】該サンプルに存在する微生物のβ−ラクタ
マーゼの特異性を決定するために１またはそれ以上の追
加のβ−ラクタムをさらに含む、請求項２に記載のキッ
ト。 - 【請求項６】１またはそれ以上の追加のβ−ラクタムを
さらに含む、請求項２に記載のキット。 - 【請求項７】β−ラクタマーゼに対するβ−ラクタムの
基質特異性を明らかにするためのキットであって、１ま
たはそれ以上の追加のβ−ラクタムをさらに含む、請求
項２に記載のキット。 - 【請求項８】ルテニウムの二座芳香族複素環式窒素含有
配位子がRu（bpy）3 2+である、請求項１または２に記載
のキット。 - 【請求項９】（ａ）β−ラクタマーゼを含有すると推測
されるサンプルを、β−ラクタムおよびルテニウムまた
はオスミウムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子試薬
と接触させ； （ｂ）工程（ａ）の接触サンプルを、電気化学発光を生
ずる条件に付し； （ｃ）得られた電気化学発光を測定して読み取りを得； （ｄ）混合物をインキュベートし； （ｅ）工程（ｄ）のインキュベートされた混合物を、電
気化学発光を生ずる条件に付し；そして （ｆ）得られた化学発光を測定しそしてそれを予め測定
された値と比較して、測定値において差が存在するなら
ばその差を決定し、それによりβ−ラクタマーゼの存在
を表示する、ことを含むβ−ラクタマーゼの存在を測定
する方法。 - 【請求項１０】サンプルが尿、膿、分泌物、咽頭ぬぐい
液、血液または血清から選ばれる生物学的材料である、
請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】（ｇ）該差を標準値と比較してサンプル
中に存在するβ−ラクタマーゼの量を決定する、ことを
さらに含む、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】（ａ）β−ラクタムを含有するサンプル
を、β−ラクタマーゼおよびルテニウムまたはオスミウ
ムの二座芳香族複素環式窒素含有配位子試薬と接触さ
せ； （ｂ）工程（ａ）の接触サンプルを、電気化学発光を生
ずる条件に付し； （ｃ）得られた電気化学発光を測定して読み取りを得； （ｄ）混合物をインキュベートし； （ｅ）工程（ｄ）のインキュベートされた混合物を、電
気化学発光を生ずる条件に付し； （ｆ）得られた化学発光を測定しそしてそれを予め測定
された値と比較して測定値における差の存在を決定し；
そして （ｇ）その差を標準値と比較してサンプル中に存在する
β−ラクタムの定量的量を決定する、 このを含むβ−ラクタムの存在を測定する方法。 - 【請求項１３】サンプルが尿、膿、分泌物、食品、血
液、咽頭ぬぐい液または血清から選ばれる生物学的材料
である、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】諸工程が連続様式で行なわれる、請求項
９または12に記載の方法。 - 【請求項１５】諸工程が単一の容器で行なわれる、請求
項12に記載の方法。 - 【請求項１６】本方法が添加ラジカル形成性還元剤試薬
の不存在下に行なわれる、請求項９または12に記載の方
法。 - 【請求項１７】還元剤試薬がTPAである、請求項16に記
載の方法。 - 【請求項１８】標準値が電子記録の形態で保存されたも
のである、請求項11または12に記載の方法。 - 【請求項１９】ルテニウムまたはオスミウムの二座芳香
族複素環式窒素含有配位子がRu（bpy）3 2+試薬またはOs
（bpy）3 2+のそれぞれである、請求項９または12に記載
の方法。
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| US08/368,429 | 1995-01-04 | ||
| PCT/US1996/000120 WO1996021039A1 (en) | 1995-01-04 | 1996-01-04 | Electrochemiluminescence assay |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP08521217A Expired - Fee Related JP3122468B2 (ja) | 1995-01-04 | 1996-01-04 | 電気化学発光検定 |
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| JP (1) | JP3122468B2 (ja) |
| KR (1) | KR100444250B1 (ja) |
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| AU (1) | AU711795B2 (ja) |
| CA (1) | CA2209546A1 (ja) |
| DE (1) | DE69630775T2 (ja) |
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