JP4637357B2 - Ａｔｐを検出する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＡＴＰを検出する方法およびこの方法に使用するキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を検出する公知の方法は生物ルミネセンスを利用するものである。ルシフェラーゼ／ルシフェリン有機物の生物ルミネセンスは公知であり、ここでルシフェリンはオキシルシフェリンに変換される。この変換では酵素ルシフェラーゼが触媒的に作用する。
【０００３】
公知のルシフェラーゼは蛍、ホチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）から生成する。このルシフェラーゼは約６０，０００ダルトンの分子量を有し、約５５０のアミノ酸を含む酵素である。この酵素の基質はルシフェリンであり、これもまた蛍から生成する。これはポリヘテロ環有機酸、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸である。
【０００４】
ルシフェラーゼが触媒的に作用する生物ルミネセンス反応は次のように進行するものと推定される。
【０００５】
【化１】
【０００６】
ここで、ＰＰはピロホスフェートであり、ＡＭＰはアデノシン一リン酸である。オキシルシフェリンは最初励起された状態で製造され、基底状態に戻るときに、光が放出される。
【０００７】
ＡＴＰが培地に存在するとき、ＡＴＰの量はルシフェリン・ルシフェラーゼ反応によって決定することができる。ＡＴＰまたはＡＴＰ含有培地をルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウムイオンおよび酸素を含む組成物に添加すると、試薬の選択された組成に応じて、短くて、強い光信号が得られる。２、３秒間は、比較的安定した光ということができる。反応速度の低下は生成物の阻害によるものと推定される。
【０００８】
注入システムによって、ＡＴＰ含有サンプルをルシフェリン・ルシフェラーゼ反応用の試薬を含む組成物に添加すると、サンプル中のＡＴＰの濃度を決定することができる。この測定システムの欠点は、ミクロ滴定プレートを用いると、各ウェル（ｗｅｌｌ）を別々に、すなわちウェル毎に測定しなければならないことである。これは時間のかかる仕事である。ＡＴＰ含有サンプルを多くの反応容器、あるいはミクロ滴定プレートのウェルに添加して測定すると、測定される最後の容器あるいはウェルの光信号は既に全くあるいは大幅に消えてしまっているであろう。
【０００９】
したがって、比較的安定した光信号がルシフェリン・ルシフェラーゼ反応において得られることが好ましい。光信号がより長い間安定であると、注入システムを必要としないプレート・ルミノメータを使用することができる。さらに、ほんの僅かな時間の後で光信号を測定するために、多数の反応容器あるいはミクロ滴定プレートを用意することができる。光信号は種々のサンプル中のＡＴＰの量の基準となる。
【００１０】
本発明の目的は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によりＡＴＰを決定する方法であって、反応中の光放出の持続時間が著しく延長された方法を提供することにある。
【００１１】
文献には、ルシフェラーゼ反応における光信号の持続時間に影響を及ぼし、また延長させるための多くの試みが記載されている。
【００１２】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に影響を及ぼし、光放出の時間を延長する一つの方法は、ルシフェラーゼ酵素の阻害剤を利用する。大いに注目されている阻害剤の例はヒ酸塩である。ヒ酸塩はフラッシュの強度を低下させ、またその長さを延長する。しかし、ＡＴＰを検出する反応の感度もまた低下する。また、ヒ酸塩の使用は環境の面から望ましいものではない。さらに、光信号の強度の低下は、特にミクロ滴定プレート、あるいはストリップ（ｓｔｒｉｐ）を読み出すことのできる装置を用いるときに、望ましくないと考えられる。
【００１３】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の速度はデルカ（ＤｅＬｕｃａ）などにより、分析化学（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９５巻，１９４〜１９８頁，１９７９年で研究されている。ヒ酸塩およびその他のイオンの添加効果が著者により示されている。しかし、提案された方法の欠点は、光強度の減少が、ＡＴＰの決定の広範囲の濃度にわたり非線形関係にあることである。
【００１４】
米国特許第５，６１８，６８２号明細書には、ルシフェラーゼを検出する方法が開示されているが、ここではＡＴＰを含む反応混合物が用いられている。この反応混合物は、ＡＴＰに加えて、アデノシン一リン酸、ラジカル捕捉剤（ＤＴＴ）、ジチオトレイトール、およびキレート化剤（ＥＤＴＡ）を含有している。プロテアーゼ阻害剤、例えば、フェニル酢酸もまた用いられる。
【００１５】
もう一つの方法は、共酵素Ａ（ＣｏＡ）の使用を選択するものである。
「ビオチミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ」（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、２７巻（１９５８年）、５１９〜５３２頁では、エールス（Ａｉｒｔｈ）等が、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応混合物へのＣｏＡの添加は光フラッシュへの効果はないが、フラッシュ後の光信号の強度はより長時間より高いレベルにとどまると述べている。
【００１６】
この方法は米国特許第５，６５０，２８９号明細書にも記載されており、ここではルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の速度に影響を及ぼす技術および反応混合物の組成が提案されている。ここに述べられた技術はＣｏＡおよびＤＴＴの使用に基づくものである。光信号の半減期、すなわち元の光信号が５０％となる時間が３００〜５００秒に決められている。
【００１７】
米国特許第４，２４６，３４０号明細書もまた２、３分の、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応における光信号の半減期を得る方法を提案している。ここに述べられた方法は、阻害剤、例えば、Ｄ−ルシフェリン類似体の使用に基づくものである。その一例はＬ−ルシフェリンである。
【００１８】
【発明の課題および課題を解決するための手段】
既に述べたように、本発明の目的は、従来技術で述べられているよりも著しく長く続く光信号が得られる、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によりＡＴＰを検出する改良された方法を提供することにある。さらに、簡単で、ミクロ滴定プレートのウェルで行うことのできる方法を提供することが本発明の目的の一つである。
【００１９】
驚くべきことに、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を、添加した塩から生成する比較的多量のアニオン類およびカチオン類の存在下に、行うことにより上記目的が達成できることがわかった。アニオン類およびカチオン類はルシフェラーゼ酵素の非競合的阻害を行い、これにより光信号の持続時間が少なくとも３０分、８時間を超えるまでに延長される。
【００２０】
かくして、本発明は、サンプルを、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つまたはそれ以上の水溶性塩類を含み、全塩濃度が少なくとも０．０５モル／リットルである反応混合物と接触させて光信号を生じせしめ、この光信号を測定する、サンプル中のＡＴＰを検出する方法に関する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明によるＡＴＰの検出においては、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応で生成する光信号は、ＡＴＰが存在するとき、３０分から８時間以上の半減期を有することがわかった。本発明の方法によれば、ＡＴＰをいかなる適当なタイプの容器のなかでも正確かつ簡単に測定することができるが、この方法は、ミクロ滴定プレートのウェル、あるいは液体シンチレーション計測器において特に適当に用いられる。
【００２２】
ルシフェラーゼとは、ルシフェリンの酸化を触媒的に進める酵素を意味し、この酸化は光信号の生成をもたらす。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼを生産する生物から単離することができる。ルシフェラーゼはまたルシフェラーゼをコード化するポリヌクレオチドで形質転換もしくは形質変換された細胞から回収することができる。好ましくは、蛍、ホチヌス・ピラリスのルシフェラーゼが用いられる。
【００２３】
ルシフェリンとは、物質、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−△2−チアゾリン−４−カルボン酸を意味する。ルシフェリンもまた自然から単離することができる。しかし、化学的に合成したルシフェリンを使用するのが、入手の容易さおよび高純度のために、好ましい。
【００２４】
既に述べたように、本発明によれば、ＡＴＰの存在を評価すべきサンプルをルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つ以上の水溶性塩類を含む反応混合物と接触させる。
【００２５】
この反応混合物においては、ルシフェリンは通常０．０１〜１ｍＭ、好ましくは０．０５〜０．５ｍＭの量で存在する。酵素ルシフェラーゼは通常反応混合物のリットル当たり、０．０００３〜０．０５、好ましくは０．００１〜０．０３ｇの量で存在する。
【００２６】
好ましくは、反応混合物はマグネシウムイオンを含むとよい。マグネシウムイオンはリットル当たり少なくとも０．０００５モルの量で存在する。通常、マグネシウムイオンの量はリットル当たり０．２モルより多くはない。
【００２７】
反応混合物中の塩類の合計量は少なくとも０．０５モル／リットル、好ましくはリットル当たり少なくとも０．１０モルである。多量の塩類が存在すると、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応で生成する光信号が半時間あるいはそれ以上まで延長されることがわかった。
【００２８】
反応混合物中の塩類の量は、もちろん、塩類のイオンがルシフェラーゼの阻害を引き起こすことのできる程度に依存する。さらに、塩類が反応混合物中に全部溶解することが重要である。したがって、用いられる塩類の最大量は、特に、選択した塩類の溶解度によって決定される。
【００２９】
原則として、全ての水溶性塩類を選べる。適当な塩類の例は、Ｃｌ-、Ｂｒ-、ＳＯ4 2-、ＨＳＯ4 -、ＨＰＯ4 2-、Ｈ2ＰＯ4 -、ＮＯ3 -およびＨＣＯ3 -のアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩金属である。Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4およびＮａＣｌの塩溶液を用いるとよい結果が得られる。好ましくは、反応混合物中のＮａＣｌの濃度は約１００ｍＭである。
【００３０】
既に述べた物質とは別に、反応混合物はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に用いられる全ての通常の物質を含んでいてもよい。
反応混合物は、適当な緩衝剤、例えば、トリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＨＡＰＳ、あるいはリン酸塩を含むのが好ましい。好ましくは、ＨＥＰＥＳ、またはこれら緩衝剤の混合物が用いられる。このような緩衝剤はｐＨを適当な値に維持することができる。好ましくは、ｐＨを６．５と８．２の間に維持する。緩衝剤の量は当業者によって適宜選択することができ、通常、２５ｍＭないし１Ｍの範囲にある。
【００３１】
さらに、反応混合物はルシフェラーゼの安定剤を含むのが好ましい。安定剤の適当な例としては、ほ乳動物の血清アルブミン、ラクトアルブミンおよびオバルブミンがある。好ましくは、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が用いられる。安定剤の量は、反応混合物の質量に基づいて、１質量％以下である。
【００３２】
さらに、反応混合物は、ＥＤＴＡあるいはＣＤＴＡなどの金属イオン封鎖剤を含むのが好ましい。このような物質は０．１〜１０ｍＭの量で存在するのが好ましい。
【００３３】
上述の反応混合物と接触させるサンプルは、原則として、ＡＴＰの存在を評価すべきサンプルであればいずれでもよい。ＡＴＰは、例えば、緩衝溶液に溶解した状態で存在する。
【００３４】
特殊なケースにおいては、サンプルは、例えば、細胞培養から生成する、生物学的性質のものである。生きた細胞は、知られているように、ＡＴＰを含んでいる。もしサンプルが細胞を含んでいるならば、予め細胞中に存在するＡＴＰを放出し、検出できるように、サンプルを細胞溶解に供さなければならない。
【００３５】
細胞を含むサンプル中のＡＴＰを検出する際の問題は、細胞は、通常、検出すべきＡＴＰを分解し、そのため測定に支障を来すＡＴＰ消費酵素、例えば、ＡＴＰアーゼを含むことである。本発明によれば、ＡＴＰアーゼのかく乱効果は、細胞溶解をアルカリ性培地で、好ましくは非イオン洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を利用して、行うことにより取り除くことができることがわかった。特に好適な溶解洗浄剤はノニルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１−米国登録商標））およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であった。
【００３６】
本発明が完成される前では、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応によるＡＴＰの決定の間の光信号の減少は、分当たりかなりのパーセントから１分以内に元の光信号の半分までの減少まで変動した。ＡＴＰを検出するための生物ルミネセンス反応の光放出の急速な減少の結果として、例えば、細胞数を測るためにＡＴＰの検出を用いるのは限定的であった。その理由は、光信号が急速に減少するだけではなく、ＡＴＰ消費酵素がまた光放出パターンに影響を及ぼし、光放出の一層急速な減少を引き起こすからである。この細胞溶解によって、本発明はこの問題に対しても同様に回答を出すものである。
【００３７】
細胞溶解を行うためには、サンプルを溶解溶液と接触させる。この溶液は、好ましくは、リットル当たり０．１〜１０グラムの量の溶解洗浄剤を含有する。溶液のｐＨは好ましくは９．５を超え、特に好ましくは１０を超えるものであり、水酸化ナトリウムなどの塩基で適宜調整することができる。細胞溶解を行うに必要なインキュベーション期間は当業者によりその職業的知識に基づいて適宜決定することができる。
【００３８】
細胞溶解の後、サンプルを上記の反応混合物と接触させる。この工程は酸素の存在下に、例えば、空気中で行う。細胞溶解、もしあれば、およびルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の両方をミクロ滴定プレートのウェルで行うのが好ましい。このためには、好ましくは、１００μｌの溶解されたサンプルおよび５０μｌの細胞溶解混合物、それに続いて５０μｌの反応混合物を一緒にする。
【００３９】
サンプルが反応混合物と接触させられると直ちに、ＡＴＰがサンプルに存在する場合には、光信号が放出される。この光信号がサンプル中のＡＴＰ量の尺度となる。もし、サンプルが細胞を含んでいると、ＡＴＰの量は、サンプル中に存在した、生きた細胞の量の尺度と考えることができる。
【００４０】
光信号を測定すること、およびそれに基づいて、ＡＴＰの量を測ることは、公知の方法によって行うことができる。このためには、パッカード社（Ｐａｃｋａｒｄ）製のトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）、あるいはパッカード社製のルミカウント（Ｌｕｍｉｃｏｕｎｔ）、あるいはミクロ滴定プレートを測定するに用いる他のプレートルミノメータなどの装置を用いることができる。また、いわゆるストリップルミノメータ、あるいは注入システムを備えたルミノメータを用いてもよい。また、液体シンチレータや生成する光信号のレベルを測定することのできる他の装置を用いてもよい。
【００４１】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の反応速度を安定化するためには、サンプルと反応混合物を一緒にした後、測定を開始する前にしばらく待機するのが好ましい。この時間は当業者により適宜決定することができ、通常、５〜１５分である。
【００４２】
本発明はまたＡＴＰを検出する上記の方法に用いるキットに関する。
それらの安定性の低さにより、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは、凍結された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態でキットに存在するのが好ましい。この状態を作るには、次のようにすればよい。所望量のルシフェラーゼおよびルシフェリンの混合物を緩衝剤、例えば、ＰＢＳ緩衝剤に溶解する。好ましくは、少量の安定剤、例えば、ＢＳＡをこれに同様に加える。得られる組成物は通常の助剤、例えば、トレハロースの存在下に凍結させることができる。
【００４３】
上記の、好ましくは凍結状態の、ルシフェリンおよびルシフェラーゼの混合物に加えて、本発明のキットは、上記反応混合物の他の構成成分を含有する緩衝剤を含む。好ましい実施例においては、キットはまた上記の溶解溶液を含むとよい。
【００４４】
【実施例】
本発明を以下の実施例に基づいて説明する。
実施例１
ＡＴＰＬｉｔｅ−Ｍキットのテスト感度および直線性。
希釈シリーズ Ｕ９３７（ヒト前骨髄球）、ＨｅＬａ（ヒト頸部癌腫）、およびＣＨＯ（中国ハムスター卵巣）細胞。
Ｕ９３７細胞は、ＦＣＳ（致死性 血清）を１０％最終濃度まで加えたＲＰＭＩ培地で培養した。ＨｅＬａ細胞は、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）即ち、デュルベコ変性ワシ培地で培養した。ＣＨＯ細胞は、ＤＭＥＭとＦＣＳを５％最終濃度まで加えたＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地との１：１混合物において３７℃の培養器中で５％ＣＯ2雰囲気で培養した。
【００４５】
着生したＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞を、カルシウム塩およびマグネシウム塩を含まないＰＢＳで洗浄した。細胞は、１：１０希釈の商業的に入手可能なトリプシン−ＥＤＴＡ溶液の薄層で培養して、培養基体から放出させ、次いで培地＋ＦＣＳ中に集めた。Ｕ９３７懸濁細胞は５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管中５００ × ｇで５分間遠心分離に供した。細胞ペレットはフレッシュな培地に含ませた。細胞力価は、コールター・カウンタ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用い、集めた細胞懸濁液の等張溶液による１：２０希釈液をカウントして決定した。
【００４６】
細胞懸濁液の一連の希釈物を培地＋ＦＣＳで準備した。ミリリットル当たり７８１２５０細胞の力価を有する細胞懸濁液から始まって、１：５希釈物を調製して、それぞれ、ミリリットル当たり、７８１２５０、１５６２５０、３１２５０、６２５０、１２５０、２５０および５０細胞の希釈物シリーズを得た。１００マイクロリットルの細胞懸濁液を９６−ウェル・マイクロ滴定プレートのウェルの中にピペットで入れた。培養器で２時間培養した後、各ウェルに５０マイクロリットルの哺乳類細胞溶解溶液（実施例４の溶液Ｄ）を添加して細胞を溶解し、溶解物を２分間振とう台の上で振った。その後、５０マイクロリットルのＡＴＰ−Ｍ緩衝液（実施例４の溶液Ｅ）を各ウェルに添加し、ＡＴＰ−依存ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を開始した。１時間の培養の後、各ウェル中の放出光の強度をパッカード・トップコートにより決定した。結果を図１、２および３に示す。
【００４７】
図１、図２および図３は、測定した細胞ラインにかかわらず、各ウェル中の細胞の数と測定した関連光強度（秒当たりのカウントで表す。）との間には直線的関係があることを示している。これらの結果は、サンプルとすべきウェル中の細胞の数は、測定した光強度を標準線に関連づけることにより正確に決定できることを示している。さらに、測定した光強度は、細胞数の広い範囲にわたり、細胞の数に正比例していることがわかる。
【００４８】
図面の説明
種々の細胞ラインを使用する間の直線性ＡＴＰ−Ｍ検定。細胞の希釈物シリーズを細胞懸濁液から調製した。細胞（０；５；２５；１２５；６２５；３１２５；１５６２５；７８１２５）を９６−ウェル・プレートのウェルに添加した。２時間の培養の後、５０μｌ溶解溶液を添加した。溶解後、５０μｌ検定基体緩衝液を加えた。光強度をパッカード・トップコートで測定した。図面は、ダブル対数スケールで、細胞数（Ｘ軸）と測定した光強度（秒当たりのカウント、（ＣＰＳ，Ｙ軸））との間の関係を示す。各グラフの点線は検定のバックグランドレベルを示す。
【００４９】
以下の実施例は、簡単な調合により、時間とともにゆっくりと減少する光信号を得ることができることを示している。信号は、測定する混合物中のＡＴＰ濃度に比例する。
【００５０】
実施例２
この目的のために、水中へのＡＴＰの希釈物シリーズ（１：１０）を１Ｅ−０６Ｍから１Ｅ−１１ＭのＡＴＰまで作成した。これらＡＴＰ溶液の各溶液１００μｌに、１００μｌの溶液Ａを白色９６−ウェル・ミクロプレートのウェル中で添加し、光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で４時間にわたり繰り返して測定した。
【００５１】
調合溶液Ａ
ＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ ４ｍＭ
ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ
ＮａＣｌ ２６０ｍＭ
ＢＳＡ １．５グラム／リットル
トレハロース ５．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．２ｍＭ
ルシフェラーゼ ６ｍｇ／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.8に調整。
溶液ＡとＡＴＰ溶液との１：１混合物中の溶液Ａ中の成分およびＡＴＰの最終濃度は、これら２つの溶液の混合により、ウェルの中で２倍少なくなる。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
上記結果から、信号はＡＴＰの濃度に直線的であり、また信号は時間とともにゆっくりと減少し、信号が最初の測定時の信号の半分まで減少するまでに４時間以上かかる、ということになる（図４参照）。
【００５４】
実施例３
この目的のために、水中へのＡＴＰの希釈シリーズ（１：１０）を１Ｅ−０６Ｍから１Ｅ−１１Ｍ ＡＴＰまで作成した。これらＡＴＰ溶液の各溶液１００μｌに、１００μｌの溶液Ｂを白色９６−ウェル・ミクロプレートのウェル中で添加し、光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定した。
【００５５】
調合溶液Ｂ
ＨＥＰＥＳ １７５ｍＭ
ＥＤＴＡ ２ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ
ＮａＣｌ １００ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 ７５ｍＭ
ＢＳＡ １．５グラム／リットル
トレハロース ５．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．２ｍＭ
ルシフェラーゼ ６ｍｇ／リットル
トリトン Ｎ−１０１ ２．０グラム／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.4に調整。
溶液ＢとＡＴＰ溶液との１：１混合物中の溶液Ｂ中の成分およびＡＴＰの最終濃度は、これら２つの溶液の混合により、ウェルの中で２倍少なくなる。結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
上記結果から、信号はＡＴＰの濃度に直線的であり、また信号は時間とともにゆっくりと減少し、この例における半減期は約７時間である、ということになる（図５参照）。
【００５８】
実施例４
この目的のために、ＣＨＯの、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ中への希釈シリーズ（１：２）を１００μｌ当たり３７０００細胞から１００μｌ当たり３６細胞まで白色の「組織培養処理」したミクロプレート中で作成した。各細胞希釈物１００μｌに、１００μｌの溶液Ｃを添加し、ＡＴＰ依存光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定した。
【００５９】
調合溶液Ｃ
ＨＥＰＥＳ １７５ｍＭ
ＥＤＴＡ ２ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ
ＮａＣｌ ６５ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 ７５ｍＭ
ＢＳＡ １．５グラム／リットル
トレハロース ５．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．２ｍＭ
ルシフェラーゼ ６ｍｇ／リットル
トリトン Ｎ−１０１ ２．０グラム／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.4に調合。
結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
これら結果は、光信号は細胞の数に関連するが、光信号の減少速度は細胞の数に依存することを示している。高細胞数における半減期はおおよそ１時間である。この時間は、細胞数が少なくなると増加する（図６参照）。
【００６２】
溶液Ｃを２つの部分、即ち溶液Ｄと溶液Ｅとに分割し、それぞれを連続的に細胞懸濁液に添加することにより、光信号の減少速度が細胞数から独立したシステムを作成することができる。
【００６３】
調合溶液Ｄ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ−１０１ ４グラム／リットル
ＮａＯＨ １００ｍＭ
【００６４】
調合溶液Ｅ
ＨＥＰＥＳ ３５０ｍＭ
ＥＤＴＡ ４ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ４ｍＭ
ＮａＣｌ １３０ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 １５０ｍＭ
ＢＳＡ ３．０グラム／リットル
トレハロース １０．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．４ｍＭ
ルシフェラーゼ １２ｍｇ／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.4に調整。
【００６５】
この目的のために、ＣＨＯの、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ中への希釈シリーズ（１：２）を１００μｌ当たり３７０００細胞から１００μｌ当たり３６細胞まで白色の「組織培養処理」したミクロプレート中で作成した。各細胞希釈物１００μｌに、５０μｌの溶液Ｄを添加し、ミクロプレートを約２分間振った。次に、５０μｌの溶液Ｅを加えて、もう一度振った。ＡＴＰ依存光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定した。結果を表４に示す。
【００６６】
【表４】
【００６７】
これら結果から、光信号は細胞数に直線的に関連する、ということになる。今や、また、光信号の減少速度は、細胞数から独立したものとなった。この実施例において、半減期はおおよそ５時間である（図７参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の実験結果（Ｕ９３７細胞）のグラフ
【図２】 実施例１の実験結果（ＣＨＯ細胞）のグラフ
【図３】 実施例１の実験結果（Ｈｅｌａ細胞）のグラフ
【図４】 実施例２の実験結果（表１）のグラフ
【図５】 実施例３の実験結果（表２）のグラフ
【図６】 実施例４の実験結果（表３）のグラフ
【図７】 実施例４の実験結果（表４）のグラフ
【発明の属する技術分野】
本発明はＡＴＰを検出する方法およびこの方法に使用するキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を検出する公知の方法は生物ルミネセンスを利用するものである。ルシフェラーゼ／ルシフェリン有機物の生物ルミネセンスは公知であり、ここでルシフェリンはオキシルシフェリンに変換される。この変換では酵素ルシフェラーゼが触媒的に作用する。
【０００３】
公知のルシフェラーゼは蛍、ホチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）から生成する。このルシフェラーゼは約６０，０００ダルトンの分子量を有し、約５５０のアミノ酸を含む酵素である。この酵素の基質はルシフェリンであり、これもまた蛍から生成する。これはポリヘテロ環有機酸、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸である。
【０００４】
ルシフェラーゼが触媒的に作用する生物ルミネセンス反応は次のように進行するものと推定される。
【０００５】
【化１】
ここで、ＰＰはピロホスフェートであり、ＡＭＰはアデノシン一リン酸である。オキシルシフェリンは最初励起された状態で製造され、基底状態に戻るときに、光が放出される。
【０００７】
ＡＴＰが培地に存在するとき、ＡＴＰの量はルシフェリン・ルシフェラーゼ反応によって決定することができる。ＡＴＰまたはＡＴＰ含有培地をルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウムイオンおよび酸素を含む組成物に添加すると、試薬の選択された組成に応じて、短くて、強い光信号が得られる。２、３秒間は、比較的安定した光ということができる。反応速度の低下は生成物の阻害によるものと推定される。
【０００８】
注入システムによって、ＡＴＰ含有サンプルをルシフェリン・ルシフェラーゼ反応用の試薬を含む組成物に添加すると、サンプル中のＡＴＰの濃度を決定することができる。この測定システムの欠点は、ミクロ滴定プレートを用いると、各ウェル（ｗｅｌｌ）を別々に、すなわちウェル毎に測定しなければならないことである。これは時間のかかる仕事である。ＡＴＰ含有サンプルを多くの反応容器、あるいはミクロ滴定プレートのウェルに添加して測定すると、測定される最後の容器あるいはウェルの光信号は既に全くあるいは大幅に消えてしまっているであろう。
【０００９】
したがって、比較的安定した光信号がルシフェリン・ルシフェラーゼ反応において得られることが好ましい。光信号がより長い間安定であると、注入システムを必要としないプレート・ルミノメータを使用することができる。さらに、ほんの僅かな時間の後で光信号を測定するために、多数の反応容器あるいはミクロ滴定プレートを用意することができる。光信号は種々のサンプル中のＡＴＰの量の基準となる。
【００１０】
本発明の目的は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によりＡＴＰを決定する方法であって、反応中の光放出の持続時間が著しく延長された方法を提供することにある。
【００１１】
文献には、ルシフェラーゼ反応における光信号の持続時間に影響を及ぼし、また延長させるための多くの試みが記載されている。
【００１２】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に影響を及ぼし、光放出の時間を延長する一つの方法は、ルシフェラーゼ酵素の阻害剤を利用する。大いに注目されている阻害剤の例はヒ酸塩である。ヒ酸塩はフラッシュの強度を低下させ、またその長さを延長する。しかし、ＡＴＰを検出する反応の感度もまた低下する。また、ヒ酸塩の使用は環境の面から望ましいものではない。さらに、光信号の強度の低下は、特にミクロ滴定プレート、あるいはストリップ（ｓｔｒｉｐ）を読み出すことのできる装置を用いるときに、望ましくないと考えられる。
【００１３】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の速度はデルカ（ＤｅＬｕｃａ）などにより、分析化学（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９５巻，１９４〜１９８頁，１９７９年で研究されている。ヒ酸塩およびその他のイオンの添加効果が著者により示されている。しかし、提案された方法の欠点は、光強度の減少が、ＡＴＰの決定の広範囲の濃度にわたり非線形関係にあることである。
【００１４】
米国特許第５，６１８，６８２号明細書には、ルシフェラーゼを検出する方法が開示されているが、ここではＡＴＰを含む反応混合物が用いられている。この反応混合物は、ＡＴＰに加えて、アデノシン一リン酸、ラジカル捕捉剤（ＤＴＴ）、ジチオトレイトール、およびキレート化剤（ＥＤＴＡ）を含有している。プロテアーゼ阻害剤、例えば、フェニル酢酸もまた用いられる。
【００１５】
もう一つの方法は、共酵素Ａ（ＣｏＡ）の使用を選択するものである。
「ビオチミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ」（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、２７巻（１９５８年）、５１９〜５３２頁では、エールス（Ａｉｒｔｈ）等が、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応混合物へのＣｏＡの添加は光フラッシュへの効果はないが、フラッシュ後の光信号の強度はより長時間より高いレベルにとどまると述べている。
【００１６】
この方法は米国特許第５，６５０，２８９号明細書にも記載されており、ここではルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の速度に影響を及ぼす技術および反応混合物の組成が提案されている。ここに述べられた技術はＣｏＡおよびＤＴＴの使用に基づくものである。光信号の半減期、すなわち元の光信号が５０％となる時間が３００〜５００秒に決められている。
【００１７】
米国特許第４，２４６，３４０号明細書もまた２、３分の、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応における光信号の半減期を得る方法を提案している。ここに述べられた方法は、阻害剤、例えば、Ｄ−ルシフェリン類似体の使用に基づくものである。その一例はＬ−ルシフェリンである。
【００１８】
【発明の課題および課題を解決するための手段】
既に述べたように、本発明の目的は、従来技術で述べられているよりも著しく長く続く光信号が得られる、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によりＡＴＰを検出する改良された方法を提供することにある。さらに、簡単で、ミクロ滴定プレートのウェルで行うことのできる方法を提供することが本発明の目的の一つである。
【００１９】
驚くべきことに、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を、添加した塩から生成する比較的多量のアニオン類およびカチオン類の存在下に、行うことにより上記目的が達成できることがわかった。アニオン類およびカチオン類はルシフェラーゼ酵素の非競合的阻害を行い、これにより光信号の持続時間が少なくとも３０分、８時間を超えるまでに延長される。
【００２０】
かくして、本発明は、サンプルを、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つまたはそれ以上の水溶性塩類を含み、全塩濃度が少なくとも０．０５モル／リットルである反応混合物と接触させて光信号を生じせしめ、この光信号を測定する、サンプル中のＡＴＰを検出する方法に関する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明によるＡＴＰの検出においては、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応で生成する光信号は、ＡＴＰが存在するとき、３０分から８時間以上の半減期を有することがわかった。本発明の方法によれば、ＡＴＰをいかなる適当なタイプの容器のなかでも正確かつ簡単に測定することができるが、この方法は、ミクロ滴定プレートのウェル、あるいは液体シンチレーション計測器において特に適当に用いられる。
【００２２】
ルシフェラーゼとは、ルシフェリンの酸化を触媒的に進める酵素を意味し、この酸化は光信号の生成をもたらす。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼを生産する生物から単離することができる。ルシフェラーゼはまたルシフェラーゼをコード化するポリヌクレオチドで形質転換もしくは形質変換された細胞から回収することができる。好ましくは、蛍、ホチヌス・ピラリスのルシフェラーゼが用いられる。
【００２３】
ルシフェリンとは、物質、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−△2−チアゾリン−４−カルボン酸を意味する。ルシフェリンもまた自然から単離することができる。しかし、化学的に合成したルシフェリンを使用するのが、入手の容易さおよび高純度のために、好ましい。
【００２４】
既に述べたように、本発明によれば、ＡＴＰの存在を評価すべきサンプルをルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つ以上の水溶性塩類を含む反応混合物と接触させる。
【００２５】
この反応混合物においては、ルシフェリンは通常０．０１〜１ｍＭ、好ましくは０．０５〜０．５ｍＭの量で存在する。酵素ルシフェラーゼは通常反応混合物のリットル当たり、０．０００３〜０．０５、好ましくは０．００１〜０．０３ｇの量で存在する。
【００２６】
好ましくは、反応混合物はマグネシウムイオンを含むとよい。マグネシウムイオンはリットル当たり少なくとも０．０００５モルの量で存在する。通常、マグネシウムイオンの量はリットル当たり０．２モルより多くはない。
【００２７】
反応混合物中の塩類の合計量は少なくとも０．０５モル／リットル、好ましくはリットル当たり少なくとも０．１０モルである。多量の塩類が存在すると、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応で生成する光信号が半時間あるいはそれ以上まで延長されることがわかった。
【００２８】
反応混合物中の塩類の量は、もちろん、塩類のイオンがルシフェラーゼの阻害を引き起こすことのできる程度に依存する。さらに、塩類が反応混合物中に全部溶解することが重要である。したがって、用いられる塩類の最大量は、特に、選択した塩類の溶解度によって決定される。
【００２９】
原則として、全ての水溶性塩類を選べる。適当な塩類の例は、Ｃｌ-、Ｂｒ-、ＳＯ4 2-、ＨＳＯ4 -、ＨＰＯ4 2-、Ｈ2ＰＯ4 -、ＮＯ3 -およびＨＣＯ3 -のアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩金属である。Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4およびＮａＣｌの塩溶液を用いるとよい結果が得られる。好ましくは、反応混合物中のＮａＣｌの濃度は約１００ｍＭである。
【００３０】
既に述べた物質とは別に、反応混合物はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に用いられる全ての通常の物質を含んでいてもよい。
反応混合物は、適当な緩衝剤、例えば、トリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＨＡＰＳ、あるいはリン酸塩を含むのが好ましい。好ましくは、ＨＥＰＥＳ、またはこれら緩衝剤の混合物が用いられる。このような緩衝剤はｐＨを適当な値に維持することができる。好ましくは、ｐＨを６．５と８．２の間に維持する。緩衝剤の量は当業者によって適宜選択することができ、通常、２５ｍＭないし１Ｍの範囲にある。
【００３１】
さらに、反応混合物はルシフェラーゼの安定剤を含むのが好ましい。安定剤の適当な例としては、ほ乳動物の血清アルブミン、ラクトアルブミンおよびオバルブミンがある。好ましくは、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が用いられる。安定剤の量は、反応混合物の質量に基づいて、１質量％以下である。
【００３２】
さらに、反応混合物は、ＥＤＴＡあるいはＣＤＴＡなどの金属イオン封鎖剤を含むのが好ましい。このような物質は０．１〜１０ｍＭの量で存在するのが好ましい。
【００３３】
上述の反応混合物と接触させるサンプルは、原則として、ＡＴＰの存在を評価すべきサンプルであればいずれでもよい。ＡＴＰは、例えば、緩衝溶液に溶解した状態で存在する。
【００３４】
特殊なケースにおいては、サンプルは、例えば、細胞培養から生成する、生物学的性質のものである。生きた細胞は、知られているように、ＡＴＰを含んでいる。もしサンプルが細胞を含んでいるならば、予め細胞中に存在するＡＴＰを放出し、検出できるように、サンプルを細胞溶解に供さなければならない。
【００３５】
細胞を含むサンプル中のＡＴＰを検出する際の問題は、細胞は、通常、検出すべきＡＴＰを分解し、そのため測定に支障を来すＡＴＰ消費酵素、例えば、ＡＴＰアーゼを含むことである。本発明によれば、ＡＴＰアーゼのかく乱効果は、細胞溶解をアルカリ性培地で、好ましくは非イオン洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を利用して、行うことにより取り除くことができることがわかった。特に好適な溶解洗浄剤はノニルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１−米国登録商標））およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であった。
【００３６】
本発明が完成される前では、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応によるＡＴＰの決定の間の光信号の減少は、分当たりかなりのパーセントから１分以内に元の光信号の半分までの減少まで変動した。ＡＴＰを検出するための生物ルミネセンス反応の光放出の急速な減少の結果として、例えば、細胞数を測るためにＡＴＰの検出を用いるのは限定的であった。その理由は、光信号が急速に減少するだけではなく、ＡＴＰ消費酵素がまた光放出パターンに影響を及ぼし、光放出の一層急速な減少を引き起こすからである。この細胞溶解によって、本発明はこの問題に対しても同様に回答を出すものである。
【００３７】
細胞溶解を行うためには、サンプルを溶解溶液と接触させる。この溶液は、好ましくは、リットル当たり０．１〜１０グラムの量の溶解洗浄剤を含有する。溶液のｐＨは好ましくは９．５を超え、特に好ましくは１０を超えるものであり、水酸化ナトリウムなどの塩基で適宜調整することができる。細胞溶解を行うに必要なインキュベーション期間は当業者によりその職業的知識に基づいて適宜決定することができる。
【００３８】
細胞溶解の後、サンプルを上記の反応混合物と接触させる。この工程は酸素の存在下に、例えば、空気中で行う。細胞溶解、もしあれば、およびルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の両方をミクロ滴定プレートのウェルで行うのが好ましい。このためには、好ましくは、１００μｌの溶解されたサンプルおよび５０μｌの細胞溶解混合物、それに続いて５０μｌの反応混合物を一緒にする。
【００３９】
サンプルが反応混合物と接触させられると直ちに、ＡＴＰがサンプルに存在する場合には、光信号が放出される。この光信号がサンプル中のＡＴＰ量の尺度となる。もし、サンプルが細胞を含んでいると、ＡＴＰの量は、サンプル中に存在した、生きた細胞の量の尺度と考えることができる。
【００４０】
光信号を測定すること、およびそれに基づいて、ＡＴＰの量を測ることは、公知の方法によって行うことができる。このためには、パッカード社（Ｐａｃｋａｒｄ）製のトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）、あるいはパッカード社製のルミカウント（Ｌｕｍｉｃｏｕｎｔ）、あるいはミクロ滴定プレートを測定するに用いる他のプレートルミノメータなどの装置を用いることができる。また、いわゆるストリップルミノメータ、あるいは注入システムを備えたルミノメータを用いてもよい。また、液体シンチレータや生成する光信号のレベルを測定することのできる他の装置を用いてもよい。
【００４１】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の反応速度を安定化するためには、サンプルと反応混合物を一緒にした後、測定を開始する前にしばらく待機するのが好ましい。この時間は当業者により適宜決定することができ、通常、５〜１５分である。
【００４２】
本発明はまたＡＴＰを検出する上記の方法に用いるキットに関する。
それらの安定性の低さにより、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは、凍結された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態でキットに存在するのが好ましい。この状態を作るには、次のようにすればよい。所望量のルシフェラーゼおよびルシフェリンの混合物を緩衝剤、例えば、ＰＢＳ緩衝剤に溶解する。好ましくは、少量の安定剤、例えば、ＢＳＡをこれに同様に加える。得られる組成物は通常の助剤、例えば、トレハロースの存在下に凍結させることができる。
【００４３】
上記の、好ましくは凍結状態の、ルシフェリンおよびルシフェラーゼの混合物に加えて、本発明のキットは、上記反応混合物の他の構成成分を含有する緩衝剤を含む。好ましい実施例においては、キットはまた上記の溶解溶液を含むとよい。
【００４４】
【実施例】
本発明を以下の実施例に基づいて説明する。
実施例１
ＡＴＰＬｉｔｅ−Ｍキットのテスト感度および直線性。
希釈シリーズ Ｕ９３７（ヒト前骨髄球）、ＨｅＬａ（ヒト頸部癌腫）、およびＣＨＯ（中国ハムスター卵巣）細胞。
Ｕ９３７細胞は、ＦＣＳ（致死性 血清）を１０％最終濃度まで加えたＲＰＭＩ培地で培養した。ＨｅＬａ細胞は、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）即ち、デュルベコ変性ワシ培地で培養した。ＣＨＯ細胞は、ＤＭＥＭとＦＣＳを５％最終濃度まで加えたＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地との１：１混合物において３７℃の培養器中で５％ＣＯ2雰囲気で培養した。
【００４５】
着生したＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞を、カルシウム塩およびマグネシウム塩を含まないＰＢＳで洗浄した。細胞は、１：１０希釈の商業的に入手可能なトリプシン−ＥＤＴＡ溶液の薄層で培養して、培養基体から放出させ、次いで培地＋ＦＣＳ中に集めた。Ｕ９３７懸濁細胞は５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管中５００ × ｇで５分間遠心分離に供した。細胞ペレットはフレッシュな培地に含ませた。細胞力価は、コールター・カウンタ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用い、集めた細胞懸濁液の等張溶液による１：２０希釈液をカウントして決定した。
【００４６】
細胞懸濁液の一連の希釈物を培地＋ＦＣＳで準備した。ミリリットル当たり７８１２５０細胞の力価を有する細胞懸濁液から始まって、１：５希釈物を調製して、それぞれ、ミリリットル当たり、７８１２５０、１５６２５０、３１２５０、６２５０、１２５０、２５０および５０細胞の希釈物シリーズを得た。１００マイクロリットルの細胞懸濁液を９６−ウェル・マイクロ滴定プレートのウェルの中にピペットで入れた。培養器で２時間培養した後、各ウェルに５０マイクロリットルの哺乳類細胞溶解溶液（実施例４の溶液Ｄ）を添加して細胞を溶解し、溶解物を２分間振とう台の上で振った。その後、５０マイクロリットルのＡＴＰ−Ｍ緩衝液（実施例４の溶液Ｅ）を各ウェルに添加し、ＡＴＰ−依存ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を開始した。１時間の培養の後、各ウェル中の放出光の強度をパッカード・トップコートにより決定した。結果を図１、２および３に示す。
【００４７】
図１、図２および図３は、測定した細胞ラインにかかわらず、各ウェル中の細胞の数と測定した関連光強度（秒当たりのカウントで表す。）との間には直線的関係があることを示している。これらの結果は、サンプルとすべきウェル中の細胞の数は、測定した光強度を標準線に関連づけることにより正確に決定できることを示している。さらに、測定した光強度は、細胞数の広い範囲にわたり、細胞の数に正比例していることがわかる。
【００４８】
図面の説明
種々の細胞ラインを使用する間の直線性ＡＴＰ−Ｍ検定。細胞の希釈物シリーズを細胞懸濁液から調製した。細胞（０；５；２５；１２５；６２５；３１２５；１５６２５；７８１２５）を９６−ウェル・プレートのウェルに添加した。２時間の培養の後、５０μｌ溶解溶液を添加した。溶解後、５０μｌ検定基体緩衝液を加えた。光強度をパッカード・トップコートで測定した。図面は、ダブル対数スケールで、細胞数（Ｘ軸）と測定した光強度（秒当たりのカウント、（ＣＰＳ，Ｙ軸））との間の関係を示す。各グラフの点線は検定のバックグランドレベルを示す。
【００４９】
以下の実施例は、簡単な調合により、時間とともにゆっくりと減少する光信号を得ることができることを示している。信号は、測定する混合物中のＡＴＰ濃度に比例する。
【００５０】
実施例２
この目的のために、水中へのＡＴＰの希釈物シリーズ（１：１０）を１Ｅ−０６Ｍから１Ｅ−１１ＭのＡＴＰまで作成した。これらＡＴＰ溶液の各溶液１００μｌに、１００μｌの溶液Ａを白色９６−ウェル・ミクロプレートのウェル中で添加し、光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で４時間にわたり繰り返して測定した。
【００５１】
調合溶液Ａ
ＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ ４ｍＭ
ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ
ＮａＣｌ ２６０ｍＭ
ＢＳＡ １．５グラム／リットル
トレハロース ５．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．２ｍＭ
ルシフェラーゼ ６ｍｇ／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.8に調整。
溶液ＡとＡＴＰ溶液との１：１混合物中の溶液Ａ中の成分およびＡＴＰの最終濃度は、これら２つの溶液の混合により、ウェルの中で２倍少なくなる。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
上記結果から、信号はＡＴＰの濃度に直線的であり、また信号は時間とともにゆっくりと減少し、信号が最初の測定時の信号の半分まで減少するまでに４時間以上かかる、ということになる（図４参照）。
【００５４】
実施例３
この目的のために、水中へのＡＴＰの希釈シリーズ（１：１０）を１Ｅ−０６Ｍから１Ｅ−１１Ｍ ＡＴＰまで作成した。これらＡＴＰ溶液の各溶液１００μｌに、１００μｌの溶液Ｂを白色９６−ウェル・ミクロプレートのウェル中で添加し、光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定した。
【００５５】
調合溶液Ｂ
ＨＥＰＥＳ １７５ｍＭ
ＥＤＴＡ ２ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ
ＮａＣｌ １００ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 ７５ｍＭ
ＢＳＡ １．５グラム／リットル
トレハロース ５．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．２ｍＭ
ルシフェラーゼ ６ｍｇ／リットル
トリトン Ｎ−１０１ ２．０グラム／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.4に調整。
溶液ＢとＡＴＰ溶液との１：１混合物中の溶液Ｂ中の成分およびＡＴＰの最終濃度は、これら２つの溶液の混合により、ウェルの中で２倍少なくなる。結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
上記結果から、信号はＡＴＰの濃度に直線的であり、また信号は時間とともにゆっくりと減少し、この例における半減期は約７時間である、ということになる（図５参照）。
【００５８】
実施例４
この目的のために、ＣＨＯの、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ中への希釈シリーズ（１：２）を１００μｌ当たり３７０００細胞から１００μｌ当たり３６細胞まで白色の「組織培養処理」したミクロプレート中で作成した。各細胞希釈物１００μｌに、１００μｌの溶液Ｃを添加し、ＡＴＰ依存光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定した。
【００５９】
調合溶液Ｃ
ＨＥＰＥＳ １７５ｍＭ
ＥＤＴＡ ２ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ
ＮａＣｌ ６５ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 ７５ｍＭ
ＢＳＡ １．５グラム／リットル
トレハロース ５．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．２ｍＭ
ルシフェラーゼ ６ｍｇ／リットル
トリトン Ｎ−１０１ ２．０グラム／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.4に調合。
結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
これら結果は、光信号は細胞の数に関連するが、光信号の減少速度は細胞の数に依存することを示している。高細胞数における半減期はおおよそ１時間である。この時間は、細胞数が少なくなると増加する（図６参照）。
【００６２】
溶液Ｃを２つの部分、即ち溶液Ｄと溶液Ｅとに分割し、それぞれを連続的に細胞懸濁液に添加することにより、光信号の減少速度が細胞数から独立したシステムを作成することができる。
【００６３】
調合溶液Ｄ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ−１０１ ４グラム／リットル
ＮａＯＨ １００ｍＭ
【００６４】
調合溶液Ｅ
ＨＥＰＥＳ ３５０ｍＭ
ＥＤＴＡ ４ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ４ｍＭ
ＮａＣｌ １３０ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4 １５０ｍＭ
ＢＳＡ ３．０グラム／リットル
トレハロース １０．０グラム／リットル
Ｄ−ルシフェリン ０．４ｍＭ
ルシフェラーゼ １２ｍｇ／リットル
ｐＨはＮａＯＨで7.4に調整。
【００６５】
この目的のために、ＣＨＯの、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ中への希釈シリーズ（１：２）を１００μｌ当たり３７０００細胞から１００μｌ当たり３６細胞まで白色の「組織培養処理」したミクロプレート中で作成した。各細胞希釈物１００μｌに、５０μｌの溶液Ｄを添加し、ミクロプレートを約２分間振った。次に、５０μｌの溶液Ｅを加えて、もう一度振った。ＡＴＰ依存光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定した。結果を表４に示す。
【００６６】
【表４】
これら結果から、光信号は細胞数に直線的に関連する、ということになる。今や、また、光信号の減少速度は、細胞数から独立したものとなった。この実施例において、半減期はおおよそ５時間である（図７参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の実験結果（Ｕ９３７細胞）のグラフ
【図２】 実施例１の実験結果（ＣＨＯ細胞）のグラフ
【図３】 実施例１の実験結果（Ｈｅｌａ細胞）のグラフ
【図４】 実施例２の実験結果（表１）のグラフ
【図５】 実施例３の実験結果（表２）のグラフ
【図６】 実施例４の実験結果（表３）のグラフ
【図７】 実施例４の実験結果（表４）のグラフ
Claims (8)
- サンプル中のＡＴＰを検出する方法であって、前記サンプルは細胞を含有するものであって、この細胞は予め９.５を超えるｐＨを有するアルカリ性培地で細胞溶解を受けたものであり；前記サンプルを反応混合物と接触させて光信号を生じせしめ、ここで、前記反応混合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つ以上の水溶性塩を含み、全塩濃度が少なくとも０.０５モル／リットルであり；および前記光信号を測定する、サンプル中のＡＴＰを検出する方法。
- 全塩濃度が少なくとも０.１０モル／リットルである請求項１記載の方法。
- 水溶性塩が、Ｃｌ-、Ｂｒ-、ＳＯ4 2-、ＨＳＯ4 -、ＨＰＯ4 2-、Ｈ2ＰＯ4 -、ＮＯ3 -およびＨＣＯ3 -のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩から選択される請求項１または２記載の方法。
- 反応混合物が、この反応混合物を６.５〜８.２のｐＨに維持する緩衝剤を含有する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 細胞溶解を、溶解洗浄剤を使用して行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 溶解洗浄剤が非イオン洗浄剤である請求項５記載の方法。
- 請求項１〜６のいずれかに記載の方法において使用するキットであって、ルシフェリンおよびルシフェラーゼの混合物と、一つ以上の水溶性塩を含有する緩衝溶液とを含み、全塩濃度が少なくとも０.０５モル／リットルである反応混合物を含んでなり、さらに、細胞溶解洗浄剤を含み、９.５を越えるｐＨを有するアルカリ性細胞溶解溶液を含んでなるキット。
- ルシフェリンおよびルシフェラーゼの混合物が凍結された状態で存在する請求項７記載のキット。
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