JP2023502994A - 動物産物を含まないレンサ球菌の培養 - Google Patents

動物産物を含まないレンサ球菌の培養 Download PDF

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Abstract

本開示は、カタラーゼ陰性細菌のインビトロ培養のための方法、組成物、およびキットを提供する。本開示は、本明細書に記載される方法に従って培養されたカタラーゼ陰性細菌およびその細菌ストックをさらに提供する。【選択図】図９

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９３６，７９７号の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、微生物学および細菌培養方法の分野に関する。
血清および血液などの動物由来材料は、細菌培養プロセスで頻繁に使用される。栄養素を豊富に含む環境を提供することに加えて、動物血液中に存在するヘモグロビンは、耐気性または通性溶血性細菌が過酸化水素副産物を分解し、細菌細胞増殖を促進することを可能にする。しかしながら、ワクチン生産における細菌培養プロセスでの動物由来産物の使用は、プリオンタンパク質、マイコプラズマ、またはウイルスなどの動物由来汚染物質を、ワクチン製造で利用される最終的な細菌成分にもたらすことにつながるおそれがある。従って、当技術分野には、動物由来材料を利用しない細菌培養方法に対するニーズがある。
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）寒天培地にカタラーゼ陰性細菌を接種することであって、寒天培地が、カタラーゼ酵素を含み、動物由来材料を含まない寒天培地であることと、（ｂ）寒天培地上で一つ以上の細菌コロニーの増殖を許容する条件下で、寒天培地上でカタラーゼ陰性細菌をインキュベートすることと、を含む、インビトロ細菌培養の方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、（ｃ）寒天培地から一つ以上の細菌コロニーのうちの一つを選択することと、（ｄ）液体培地に選択した細菌コロニーを接種して液体細菌培養物を産生することと、（ｅ）増殖を許容する条件下で液体細菌培養物をインキュベートすることと、（ｆ）培養したカタラーゼ陰性細菌を液体細菌培養物から採取することと、をさらに含む。
一部の実施形態では、カタラーゼ陰性細菌は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の菌種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｃｕｓ）の菌種、アビオトロフィア属（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ）の菌種、グラニュリカテラ属（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、ゲメラ属（Ｇｅｍｅｌｌａ）の菌種、ロチア・ムシラギノサ属（Ｒｏｔｈｉａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）の菌種、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、グロビカテラ属（Ｇｌｏｂｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、およびドロシグラヌルム属（Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ）の菌種から選択される。
一部の実施形態では、カタラーゼ陰性細菌は、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）タイプ１およびシゲラ・ボイディ（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）タイプ１２から選択されるシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌種である。
一部の実施形態では、カタラーゼ陰性細菌は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、およびエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種から選択される。一部の実施形態では、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、Ａ群レンサ球菌属の細菌、Ｃ群レンサ球菌属の細菌、または緑色レンサ球菌属の細菌である。一部の実施形態では、Ａ群レンサ球菌属の細菌は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。一部の実施形態では、Ａ群レンサ球菌属の細菌は、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ１２、Ｍ２８から選択される血清型のものである。一部の実施形態では、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、ｍｕｔａｎｓ群、ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群、ｂｏｖｉｓ群、ｍｉｔｉｓ群、およびａｎｇｉｎｏｓｕｓ群から選択される緑色（ｖｉｒｉｄｉａｎｓ）レンサ球菌属の細菌である。
一部の実施形態では、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）である。一部の実施形態では、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、および３３Ｆからなる群から選択される血清型のものである。一部の実施形態では、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は、１、３、１４、および１９Ａからなる群から選択される血清型のものである。一部の実施形態では、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３４、３５Ｂ、３３Ｆ、および３８からなる群から選択される血清型のものである。
一部の実施形態では、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、緑色アエロコッカス（Ａ．ｖｉｒｉｄｉａｎｓ）である。
一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、少なくとも約５００国際単位（ＩＵ）の濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、少なくとも約５００ＩＵ～１００００ＩＵの濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、約４０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約４５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５０００ＩＵ、または約５０００～５５００ＩＵの濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、約４５００ＩＵ、約４６００ＩＵ、約４７００ＩＵ、約４８００ＩＵ、約４９００ＩＵ、約５０００ＩＵ、約５１００ＩＵ、約５２００ＩＵ、約５３００ＩＵ、約５４００ＩＵ、または約５５００ＩＵの濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は約５０００ＩＵの濃度で存在する。
一部の実施形態では、寒天培地は、酵母抽出物、大豆ペプトン、グルコース、一つ以上の塩、およびＬ－システインをさらに含む。一部の実施形態では、一つ以上の塩は、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＣｌ、およびＭｇＳＯ４から選択される。
一部の実施形態では、Ｌ－システインは、少なくとも約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、約０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、または５．０ｇ／Ｌの濃度で存在する。
一部の実施形態では、酵母抽出物は、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、酵母抽出物は、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、酵母抽出物は、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する。
一部の実施形態では、大豆ペプトンは、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、大豆ペプトンは、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、大豆ペプトンは、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する。
一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件は、約３７℃の温度を含む。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件は、約３４℃～３９℃の温度を含む。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件は、嫌気性培養環境をさらに含む。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件は、少なくとも約５％のＣＯ２レベルをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＯ２レベルは、約５％～約９５％である。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件は、約０％のＣＯ２レベルをさらに含む。
一部の実施形態では、液体培地は、寒天培地と実質的に同じ成分を含む。
一部の実施形態では、一つ以上の細菌コロニーは、不透明、半透明、および透明なコロニーを含む。一部の実施形態では、選択した細菌コロニーは、不透明なコロニーである。
一部の実施形態では、培養したカタラーゼ陰性細菌は、液体細菌培養物が所定の光学密度（ＯＤ）閾値に達した後に採取される。一部の実施形態では、光学密度は、６００ｎｍの波長（ＯＤ６００）で測定される。一部の実施形態では、所定のＯＤ閾値は、少なくとも約１．０のＯＤ６００である。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法によって産生される培養したカタラーゼ陰性細菌を提供する。一部の実施形態では、細菌は、動物由来材料を含む培地を使用して培養された類似の細菌と比較して、多糖類産生の増強を示す。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される培養したカタラーゼ陰性細菌を含む細菌ストックを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）動物由来材料を含まない寒天培地、および（ｂ）カタラーゼ酵素を含む、インビトロ細菌培養のためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、寒天培地と実質的に同じ成分を含む液体培地をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）動物由来材料を含まない寒天培地、および（ｂ）カタラーゼ酵素を含むアガロースプレートを提供する。一部の実施形態では、アガロースプレートは、カタラーゼ陰性細菌をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、培養したカタラーゼ陰性細菌、液体培地、および随意にグリセロールを含む細菌ストックを提供し、細菌ストックは動物由来材料を含まない。一部の実施形態では、細菌ストックは動物由来ヘムを含まない。一部の実施形態では、細菌ストックは、プリオンタンパク質、マイコプラズマ、またはウイルスを含まない。一部の実施形態では、細菌ストックは、動物由来材料を含む媒体を使用して培養された類似の細菌を含む細菌ストックと比較して、細胞壁多糖（ＣＷＰＳ）汚染物質の量の減少を示す。
図１は、培地１、２、３、および４を使用した段階１の液体培地培養中の、血清型１４の経時的なＯＤ６００を示す。 図２は、培地１、２、３、および４を使用した段階１の液体培地培養中の、血清型１の経時的なＯＤ６００を示す。 図３は、培地１および培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型１の経時的なＯＤ６００を示す。 図４は、培地１および培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型４の経時的なＯＤ６００を示す。 図５は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型６Ａおよび２３Ｆの経時的なＯＤ６００を示す。 図６は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型３および１９Ａの経時的なＯＤ６００を示す。 図７は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、および１８Ｃの経時的なＯＤ６００を示す。 図８は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａの経時的なＯＤ６００を示す。 図９は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、および１９Ｆの経時的なＯＤ６００を示す。 図１０は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型２、２０、２２Ｆ、および３３Ｆの経時的なＯＤ６００を示す。 図１１は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型１５Ａ、３５Ｂ、および２３Ｂの経時的なＯＤ６００を示す。 図１２は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型１６Ｆ、７Ｃ、および３１の経時的なＯＤ６００を示す。 図１３は、培地５を使用した段階１および２の液体培地培養中の、血清型２３Ａの経時的なＯＤ６００を示す。 図１４は、透明な媒体上で血清型６Ａを発現しているコロニーを示す。 図１５は、培養実験中の、熱（ＨＳ）およびフィルター（ＦＳ）滅菌培地中の血清型２０のＯＤ６００の時間経過を６００ｍＬスケールで示す。
概要
好気性環境での細菌増殖は、活性酸素種の形成につながる。スーパーオキシド（Ｏ２－）などの活性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞膜およびＤＮＡを損傷し、従って増殖を阻害する。細菌細胞は、スーパーオキシドジスムターゼ酵素を発現して、スーパーオキシドを過酸化水素に変換するように進化してきた。残念ながら、過酸化水素は反応性であり、細菌細胞に損傷を引き起こす。従って、好気性環境で増殖させるためには、細菌細胞の損傷を防止するために、細菌が過酸化水素を水および酸素に分解できる機構がなければならない。
一つのこうした機構は、ヘモグロビン中に存在するヘム基の使用であり、これは過酸化水素の水と酸素への分解を触媒する。血液寒天プレートは、ヘモグロビン源を提供することができる。例えば、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、血液寒天上に蒔かれた時、アルファ溶血性であり、溶解酵素を放出して赤血球を部分的に加水分解してヘモグロビンを放出する。ヒツジ血液寒天プレート上に蒔かれた肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）コロニーの周りに、溶血ゾーンを見ることができる。血液寒天プレート上の血球が溶解されると、それらはヘモグロビンを放出し、ヘム基は過酸化水素の水と酸素への分解を触媒し、それによって肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が好気性環境のプレート上で増殖することを可能にする。
もう一つのこうした機構は、過酸化水素を水と酸素に分解する酵素であるカタラーゼの使用である。カタラーゼのタンパク質構造は、この活性を促進するヘム基を含有する。ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）および小球菌属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉ）の菌種を含む、いくつかのカタラーゼ陽性細菌が知られている。他の細菌は、例えば、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種などの、カタラーゼ陰性であり、ヘモグロビンを含有しない一般的な実験室培地上の好気性環境では増殖しない。カタラーゼ陰性細菌は、血液寒天プレート上で増殖することができるが、これは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）およびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）などの慢性神経変性疾患をもたらしうるプリオンタンパク質による汚染のリスクを増加させる。
世界保健機関は、ワクチン製造における血液などの動物由来材料の使用に関する指針をワクチン製造業者に対して公表しており、可能な限り、動物由来の材料の使用を避けるよう製造業者に奨励している。（結合型ワクチンに関するＷＨＯレポート９２７）。動物由来の材料が必要な場合は、感染性が低い組織（ＩＢ）または感染性のない組織（ＩＣ）から調達し、既知の感染性のない国（すなわちニュージーランド）から調達するべきである。様々な組織の相対的な感染性レベルを以下の表１に提供する。
Figure 2023502994000002
本明細書に提供される方法および組成物は、医薬品および生物製剤に使用される最終細菌産物の望ましくない汚染をもたらしうる動物由来材料を使用することなく、カタラーゼ陰性細菌の培養を可能にする。以前の方法は、ウシ由来カタラーゼを使用して説明されてきたが、本明細書に提供される方法は、１００％動物を含まない培地を使用してカタラーゼ陰性細菌を培養することを可能にし、それによって上述のＢＳＥ／ＴＳＥの懸念を低減する。本方法は、相変異技術を利用して細菌コロニーを選択することをさらに可能とし、プレーティングおよびコロニー選択段階、ならびに発酵段階の間に同じ成分を含む培地が使用されることを可能にする。これは、培地の変化、すなわち血液寒天、ヘミン、または他の動物由来材料では不可能な要素による、発酵中の増殖失敗の可能性を低減する。
本明細書に記載され、かつ請求される方法の使用はまた、培養された時に、多糖類産生性が改善された細菌コロニーの選択を可能にしうる。多糖類産生性が改善された培養物は、多糖類産生における効率および／または対費用効果の改善という利点を有しうる。例えば、効率の改善は、採取前の培養物中の細菌増殖の高速化、培地供給原料と得られた多糖類との間の転換率の改善、発酵ブロス１リットル当たりの多糖類収率の増大などの結果でありうる。
カタラーゼ陰性細菌
一部の実施形態では、本開示は、カタラーゼ陰性細菌のインビトロ培養のための方法、組成物、およびキットを提供する。「カタラーゼ陰性細菌」は、酵素カタラーゼを発現せず、かつ以下に記載され、Ｒｅｉｎｅｒら、 “Ｃａｔａｌａｓｅ ｔｅｓｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ”， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭＭｉｃｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ（２０１０）にさらに記載される、共通カタラーゼ試験により陰性として識別される細菌を指す。
カタラーゼは、過酸化水素の水と酸素への分解を触媒し、それによって活性酸素種による酸化的損傷から細胞を保護する、様々な生物に見られる一般的な酵素である。カタラーゼは、すべての酵素の中で最も高い代謝回転数を有するものの一つであり、１個のカタラーゼ分子は、毎秒数百万個の過酸化水素分子を水と酸素に変換することができる。カタラーゼは、四つのポリペプチド鎖の四量体であり、各々が５００を超えるアミノ酸の長さである。それは、酵素が過酸化水素と反応することを可能にする四つの鉄含有ヘム基を含有する。ヒトカタラーゼの最適ｐＨは約７であり、かなり広範な最大値を有し、反応速度はｐＨ６．８～７．５の間で顕著に変わらない。他の種からのカタラーゼの最適ｐＨは、種に応じて４～１１の間で変化する。最適な温度も、種によって変化する。
カタラーゼ試験は、微生物学者が細菌の種類を特定するために使用する三つの主な試験のうちの一つである。細菌がカタラーゼを有する（すなわち、カタラーゼ陽性である）場合、少量の細菌分離株が過酸化水素に添加された時、酸素の気泡が観察される。カタラーゼ試験は、一滴の過酸化水素を顕微鏡スライド上に置くことによって行われる。アプリケータースティックをコロニーに接触させ、次いで先端を過酸化水素液滴上に塗り付ける。
混合物が気泡またはあぶくを発生する場合、生物は「カタラーゼ陽性」であると言われる。ブドウ球菌および小球菌はカタラーゼ陽性である。他のカタラーゼ陽性生物としては、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、腸内細菌科 （シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびロドコッカス・エクイ （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）が含まれる。
混合物が気泡またはあぶくを発生しない場合、生物は「カタラーゼ陰性」である。（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の菌種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｃｕｓ）の菌種、アビオトロフィア属（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ）の菌種、グラニュリカテラ属（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、ゲメラ属（Ｇｅｍｅｌｌａ）の菌種、ロチア・ムシラギノサ属（Ｒｏｔｈｉａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）の菌種、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、グロビカテラ属（Ｇｌｏｂｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種およびドロシグラヌルム属（Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ）の菌種は、カタラーゼ陰性細菌の例である。
一部の実施形態では、本開示は、カタラーゼ陰性細菌のインビトロ培養のための方法、組成物キットを提供する。一部の実施形態では、カタラーゼ陰性細菌は嫌気性細菌である。「嫌気性菌」という用語は、増殖に酸素を必要としない生物を指す。この用語には、酸素の存在下でネガティブに反応（例えば、死滅）しうる偏性嫌気性菌、ならびに酸素の非存在下で増殖し、酸素が存在する場合には好気性呼吸によってＡＴＰを作ることができる通性嫌気性菌が含まれる。
一部の実施形態では、カタラーゼ陰性細菌は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の菌種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｃｕｓ）の菌種、アビオトロフィア属（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ）の菌種、グラニュリカテラ属（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、ゲメラ属（Ｇｅｍｅｌｌａ）の菌種、ロチア・ムシラギノサ属（Ｒｏｔｈｉａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）の菌種、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、グロビカテラ属（Ｇｌｏｂｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、およびドロシグラヌルム属（Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ）の菌種から選択される。一部の実施形態では、カタラーゼ陰性細菌は、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）タイプ１およびシゲラ・ボイディ（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）タイプ１２から選択されるシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌種である。
一部の実施形態では、カタラーゼ陰性細菌は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、およびエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種から選択される。一部の実施形態では、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、緑色アエロコッカス（Ａ．ｖｉｒｉｄｉａｎｓ）である。一部の実施形態では、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、Ａ群レンサ球菌属の細菌、Ｃ群レンサ球菌属の細菌、または緑色レンサ球菌属の細菌である。一部の実施形態では、Ａ群レンサ球菌属の細菌は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。一部の実施形態では、Ａ群レンサ球菌属の細菌は、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ１２、Ｍ２８から選択される血清型のものである。
一部の実施形態では、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、ｍｕｔａｎｓ群、ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群、ｂｏｖｉｓ群、ｍｉｔｉｓ群、およびａｎｇｉｎｏｓｕｓ群から選択される緑色レンサ球菌属の細菌である。一部の実施形態では、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種は、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）である。一部の実施形態では、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、および３３Ｆからなる群から選択される血清型のものである。一部の実施形態では、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は、１、３、１４、および１９Ａからなる群から選択される血清型のものである。一部の実施形態では、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３４、３５Ｂ、３３Ｆ、および３８からなる群から選択される血清型のものである。
培養培地
一部の実施形態では、本開示は、動物由来産物を含まない培養培地を利用したインビトロ細菌培養の方法を提供する。「動物由来産物」および「動物由来材料」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物または動物細胞から精製された産物または材料を指す。動物由来産物には、血液、血清、成長因子、サイトカイン、アルブミンなどが含まれる。本開示の培養培地は、動物由来材料を含まず、従って、「動物成分を含まない培地」または「動物質を含まない培地」である。これらの用語は、本明細書では互換的に使用され、動物由来材料が一切含まれない培養培地を指す。具体的には、こうした培地は、動物から精製されたいかなる成分も含有しない。
「培養培地」という用語は、微生物または細胞の増殖を支援するように設計された液体またはゲル（例えば、寒天）を指す。こうした培地は、生物の増殖の特定要件および／またはその増殖の目的を満たすようにカスタマイズされてもよい。この用語は、細菌培養の初期プレーティング段階中に使用される寒天培地（例えば、実施例１を参照）などの固体または半固体の培地を指す「寒天培地」、ならびに細菌培養の後期増殖および発酵段階で使用される液体培地（例えば、実施例２を参照）などの「液体培養培地」を含む。「液体培地」および「液体培養培地」という用語はまた、本開示全体を通して互換的に使用される。
一部の実施形態では、本開示の培地は、寒天培地および液体培地を含む。
現在の優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）は、生物製剤、特にワクチンの産生のための微生物発酵のための培地開発における品質およびいくつかの基準の選択に厳しい。ＧＭＰ発酵手順では、品質がプロセス全体に組み込まれ、規制当局の要件が安全性、製品同一性、品質、および純度に関して満たされていることを確実にする（ＦＤＡ Ｔｉｔｌｅ ２１、連邦規則集、Ｐａｒｔ ２１０、２１１および６００～６８０）。理想的には、培地は必須成分のみを含み、再現性のある方法で容易に調製されるべきである。最後に、培地は、体積生産性を改善し、その組成物および生理学的状態が下流処理に適している最終培養物を生成するために、問題の微生物を高い細胞密度へと培養することを支援するべきである。従って、培地開発および培養プロトコル開発はＧＭＰ製造の重要な部分である。
肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のための様々な細胞培地が文献に記録されており、いくつかの培地が市販されている。肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、５％の二酸化炭素および複合培地で最もよく増殖する、選好性細菌である。新鮮な臨床分離株の２０％近くは、完全な嫌気条件を必要とする。典型的には、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの選好性生物の増殖に使用される培地のほとんどが、全血（チョコレート血液寒天、炭培地）、ヘミン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎのクックトミートブロス）などの血液成分、卵黄（Ｄｏｒｓｅｔ Ｅｇｇ Ｍｅｄｉａ）、または他の動物材料を含有する。これらの成分は、基礎培地を栄養的に富化させ、選好性細菌の増殖を支援する。
しかしながら、培地における血液成分または他の動物材料の使用は、最終ワクチン物質に伝達されうる外来ウイルス、プリオン、およびマイコプラズマなどの汚染物質のリスクの増大により、深刻な健康上の危険をもたらしうる。さらに、動物由来成分（例えば、血液、血清など）は化学的に定義されていない。そのため、これらの成分のロット間変動があり、それによって、培地の組成物にロット間変動をもたらしうる。培地中のこれらの動物由来成分の存在は、動物由来タンパク質を除去する必要があるため、精製の複雑さおよびコストをさらに増大させうる。
このように、動物由来材料を含まず、かつ微生物の大量産生を高い純度および収率で可能にする培地の開発には課題がある。
一部の実施形態では、本開示の培地は、炭素源、窒素源、およびリン源のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、本開示の培地は、カタラーゼ酵素と、炭素源、窒素源、およびリン源のうちの一つ以上とを含む。一部の実施形態では、本開示の培地は、一つ以上の塩をさらに含む。
炭素源
一部の実施形態では、本開示の培地は、例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、グリセロール、大豆油などの植物油、炭化水素、メタノールおよびエタノールなどのアルコール、ならびに酢酸などの有機酸から選択される一つ以上の炭素源を含む。一部の実施形態では、炭素源は、グルコース、グリセロール、ラクトース、フルクトース、スクロース、および大豆油から選択される。「グルコース」という用語は、グルコースシロップ、例えば、グルコースオリゴマーを含むグルコース組成物を含む。炭素源は、固体または液体として培養物に添加されてもよい。培養培地に添加される炭素源の量は、当業者によって既知である量、および／または市販の培地中に存在する量などである（例えば、ＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｓのウェブサイト、カタログ番号Ｍ１５８９で入手可能な、グルコース寒天用のＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｓプロトコルを参照のこと）。
一部の実施形態では、炭素源はグルコースである。一部の実施形態では、グルコースは、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、グルコースは、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、グルコースは、約５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、または約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する。
窒素源
一部の実施形態では、本開示の培養培地は、例えば、尿素、水酸化アンモニウム、アンモニウム塩（硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および硝酸アンモニウムなど）、他の硝酸塩、グルタミン酸およびリジンなどのアミノ酸、酵母抽出物、酵母自己溶解物、酵母窒素塩基、タンパク質加水分解物（ペプトン、トリプトンおよびカザミノ酸などのカゼイン加水分解物を含むがこれらに限定されない）、大豆粕、Ｈｙ－Ｓｏｙ、トリプトンソイブイヨン培地、綿実粕、麦芽エキス、コーンスティープリカー、および糖蜜から選択される一つ以上の窒素源を含む。培養培地に添加される窒素源の量は、当業者によって既知である量、および／または市販の培地中に存在する量などである。（例えば、ＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｓのウェブサイト、カタログ番号Ｍ４５６で入手可能な、グルコース寒天用のＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｓプロトコル、およびＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ； ２００６； ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｒｅｃ８１４１で入手可能な、ＬＢ液体培地用のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒプロトコルを参照のこと）。
一部の実施形態では、窒素源は酵母抽出物である。一部の実施形態では、酵母抽出物は、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、酵母抽出物は、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、酵母抽出物は、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する。
一部の実施形態では、窒素源は、大豆ペプトンである。一部の実施形態では、大豆ペプトンは、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、大豆ペプトンは、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、大豆ペプトンは、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する。
一部の実施形態では、窒素源は、Ｌ－システインなどのアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、少なくとも約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、約０．５ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、約０．５ｇ／Ｌ～約５／０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ～約５．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ、または約２．０ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌの濃度で存在する。一部の実施形態では、Ｌ－システインは、約０．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、または約５．０ｇ／Ｌの濃度で存在する。
一部の実施形態では、培地中のＬ－システインの濃度を増加させることは、フラスコ中のより良好な増殖を促進しうる。一部の実施形態では、約１．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ、または約３．０ｇ／ＬのＬ－システインを、接種前に培地に直接添加することが、増殖促進のために最適である。一部の実施形態では、約１．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ、または約３．０ｇ／ＬのＬ－システインを、接種前に培地に直接添加すると、望ましくない沈殿をもたらすことなく、増殖が促進される。
リン源
一部の実施形態では、本開示の培養培地は、一つ以上のリン源を含む。リンは、塩の形態であってもよく、例えば、リン酸塩（リン酸アンモニウムまたはリン酸カリウムなど）またはポリリン酸塩として添加されてもよい。ポリリン酸塩を使用する場合、ポリリン酸ナトリウムなどのリン酸ガラスの形態であってもよい。こうしたリン酸ガラスは、溶解特性が、混合時に結果として生じる沈殿なしに、濃縮された栄養培地を調製することができるようなものであるため、有用である。培養培地に添加されるリン源の量は、当業者によって既知である量、および／または市販の培地中に存在する量などである。（例えば、ＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｓのウェブサイト、カタログ番号Ｍ５２０で入手可能なグルコース寒天用のＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｓプロトコルを参照のこと）。
カタラーゼ酵素
一部の実施形態では、本開示の培養培地は、カタラーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素を含む培養培地は、寒天培地である。カタラーゼ酵素は、非動物源に由来することが好ましい。例えば、一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ５５３０３）、アスペルギウス・フミガーツフ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９２４０５）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１３０２９）に由来する。カタラーゼ酵素は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＬＳ Ｂｉｏ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、およびその他の商業的供給源から市販されている。
一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、少なくとも約５００国際単位（ＩＵ）の濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、少なくとも約５００ＩＵ～１００００ＩＵの濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、約４０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約４５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５０００ＩＵ、または約５０００～５５００ＩＵの濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は、約４５００ＩＵ、約４６００ＩＵ、約４７００ＩＵ、約４８００ＩＵ、約４９００ＩＵ、約５０００ＩＵ、約５１００ＩＵ、約５２００ＩＵ、約５３００ＩＵ、約５４００ＩＵ、または約５５００ＩＵの濃度で存在する。一部の実施形態では、カタラーゼ酵素は約５０００ＩＵの濃度で存在する。
例示的な培養培地
一部の実施形態では、本開示は、カタラーゼ酵素、酵母抽出物、大豆ペプトン、グルコース、一つ以上の塩、およびＬ－システインを含む寒天培地を提供する。一部の実施形態では、一つ以上の塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＣＯ３、およびＭｇＳＯ４から選択される。一部の実施形態では、寒天培地は、ＨＥＰＥＳ溶液（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）をさらに含む。
一部の実施形態では、寒天培地は、約４０００国際単位（ＩＵ）～６０００ＩＵの濃度で存在するカタラーゼ酵素、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ～約７．５ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａＣｌ、少なくとも約０．０５ｇ／Ｌ～約０．２０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約０．２５ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＭｇＳＯ４、少なくとも約０．２５ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、およびグルコースを含む。一部の実施形態では、寒天培地は、約５０００ＩＵの濃度で存在するカタラーゼ酵素、約５ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約５ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａＣｌ、約０．１０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在するＭｇＳＯ４、約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、およびグルコースを含む。
一部の実施形態では、寒天培地は、約４０００国際単位（ＩＵ）～６０００ＩＵの濃度で存在するカタラーゼ酵素、少なくとも約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、少なくとも約０．０５ｇ／Ｌ～約０．２０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約０．２５ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌ，の濃度で存在するＭｇＳＯ４、少なくとも約０．２５ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、およびグルコースを含む。一部の実施形態では、寒天培地は、約５０００ＩＵの濃度で存在するカタラーゼ酵素、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．１０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在するＭｇＳＯ４、約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、およびグルコースとを含む。
一部の実施形態では、寒天培地は、約４０００国際単位（ＩＵ）～６０００ＩＵの濃度で存在するカタラーゼ酵素、少なくとも約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．１ｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、グルコース、および少なくとも約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液を含む。一部の実施形態では、寒天培地は、約５０００ＩＵの濃度で存在するカタラーゼ酵素、約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在するＭｇＳＯ４、約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、グルコース、および約４７ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液を含む。
一部の実施形態では、本開示は、酵母抽出物、大豆ペプトン、グルコース、一つ以上の塩、Ｌ－システイン、およびＨＥＰＥＳ溶液（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）を含む液体培養培地を提供する。一部の実施形態では、一つ以上の塩は、Ｎａ２ＣＯ３、およびＭｇＳＯ４から選択される。一部の実施形態では、液体媒体は、リン酸カリウム緩衝液をさらに含む。
一部の実施形態では、液体培地は、少なくとも約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、少なくとも約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、少なくとも約０．１～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、少なくとも約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、およびグルコースを含む。一部の実施形態では、液体培地は、約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．４ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、約４７ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、およびグルコースを含む。
一部の実施形態では、液体培地は、少なくとも約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、少なくとも約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、少なくとも約０．１～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約２ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、少なくとも約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、およびグルコースを含む。一部の実施形態では、液体培地は、約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．４ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、約４．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、約４７ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、およびグルコースを含む。
一部の実施形態では、液体培地は、少なくとも約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、少なくとも約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、少なくとも約０．１～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約２ｇ／Ｌ～約８．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、少なくとも約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、およびグルコースを含む。一部の実施形態では、液体培地は、約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．４ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、約３．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、約４７ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、およびグルコースを含む。
一部の実施形態では、液体媒体は、少なくとも約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、少なくとも約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、少なくとも約０．１～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約０．５～約２．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、少なくとも約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、グルコース、および少なくとも約０．０１Ｍ～約０．０７５Ｍの濃度で存在するリン酸カリウム緩衝液を含む。一部の実施形態では、液体培地は、約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．４ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、約４７ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、グルコース、および約０．０５Ｍの濃度で存在するリン酸カリウム緩衝液を含む。
一部の実施形態では、液体媒体は、少なくとも約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、少なくとも約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、少なくとも約０．１～約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、少なくとも約０．５～約２．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、少なくとも約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、グルコース、および少なくとも約０．０５Ｍ～約０．２Ｍの濃度で存在するリン酸カリウム緩衝液を含む。一部の実施形態では、液体培地は、約２０ｇ／Ｌの濃度で存在する酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する大豆ペプトン、約０．４ｇ／Ｌの濃度で存在するＮａ２ＣＯ３、約１．０ｇ／Ｌの濃度で存在するＬ－システイン、約４７ｇ／Ｌの濃度で存在するＨＥＰＥＳ溶液、グルコース、および約０．１Ｍの濃度で存在するリン酸カリウム緩衝液を含む。
培養プロトコル
一部の実施形態では、本開示は、寒天培地にカタラーゼ陰性細菌を接種することであって、寒天培地が、カタラーゼ酵素を含み、動物由来材料を含まない寒天培地であることと、寒天培地上の一つ以上の細菌コロニーの増殖を許容する条件下で、寒天培地上のカタラーゼ陰性細菌をインキュベートすることと、を含む、インビトロ細菌培養の方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、寒天プレートから一つ以上の細菌コロニーのうちの一つを選択することと、液体培地に選択した細菌コロニーを接種して液体細菌培養物を産生することと、増殖を許容する条件下で液体細菌培養物をインキュベートすることと、培養したカタラーゼ陰性細菌を液体細菌培養物から採取することと、をさらに含む。
一部の実施形態では、 本開示は、寒天培地にカタラーゼ陰性細菌を接種することであって、寒天培地が、カタラーゼ酵素を含み、動物由来材料を含まない寒天培地であることと、寒天培地上の一つ以上の細菌コロニーの増殖を許容する条件下で、寒天培地上のカタラーゼ陰性細菌をインキュベートすることと、寒天プレートから一つ以上の細菌コロニーのうちの一つを選択することと、液体培地に選択した細菌コロニーを接種して、液体細菌培養物を産生することと、増殖を許容する条件下で液体細菌培養物をインキュベートすることと、液体細菌培養物から培養したカタラーゼ陰性細菌を採取することと、を含む、インビトロ細菌培養の方法を提供する。
一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件、および／または液体培地の増殖を許容する条件は、温度、培養環境中に存在するＣＯ２の量、培養環境中に存在するＯ２の量、および／または本明細書に記載される条件などの攪拌または曝気の速度を含む。
一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件、および／または液体培地の増殖を許容する条件は、約３４℃～約３９℃の温度を含む。よって、一定の培養温度が維持されることを確実にするために、培養物を含有する容器を加熱または冷却する必要がありうる。温度は、倍加時間（ｔｄ）を制御するために使用されうるので、所与の培養プロセスに対して、温度は異なる段階で異なっていてもよい。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件、および／または液体培地の増殖を許容する条件は、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、または約３９℃の温度を含む。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件、および／または液体培地の増殖を許容する条件は、約３７℃の温度を含む。
一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件および／または液体培地の増殖を許容する条件は、嫌気性培養環境を含む。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件および／または液体培地の増殖を許容する条件は、約０％のＣＯ２レベルを含む。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件および／または液体培地の増殖を許容する条件は、少なくとも約５％のＣＯ２レベルを含む。一部の実施形態では、細菌コロニーの増殖を許容する条件および／または液体培地の増殖を許容する条件は、約５％～約９５％のＣＯ２レベルを含む。
一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用される液体培地および寒天培地は、実質的に同じ成分を含む。例えば、一部の実施形態では、液体培地および寒天培地はそれぞれ、酵母抽出物、大豆ペプトン、グルコース、一つ以上の塩、およびＬ－システインを含み、動物由来材料を含まない。
一部の実施形態では、寒天プレートから選択される一つ以上の細菌コロニーは、不透明、半透明、または透明なコロニーである。一部の実施形態では、寒天プレートから選択される一つ以上の細菌コロニーは、不透明なコロニーである。一部の実施形態では、一つ以上の細菌コロニーは、実体顕微鏡を使用して選択される。本開示の寒天培地は、糖タンパク質結合型ワクチンの産生に有用な微生物炭水化物のより高い濃度を含むと考えられる不透明なコロニーの選択を可能にする。血液寒天もまた不透明であるため、不透明なコロニーの選択は、従来の血液寒天上では実施することができない。本開示の寒天培地は、より高濃度の微生物炭水化物を有するコロニーの選択を可能にしうる。図１４は、本開示の培地上に増殖している不透明なコロニーを明確に示す。より生産的なコロニーの選択および使用は、多糖類産生においてより大きな効率をもたらしうる。
一部の実施形態では、培養したカタラーゼ陰性細菌は、液体細菌培養物が所定の光学密度（ＯＤ）閾値に達した後に採取される。一部の実施形態では、光学密度は、液体培養物中に存在する細菌の量を決定するために、分光光度計を使用して測定される。一部の実施形態では、光学密度は、６００ｎｍの波長（ＯＤ６００）で測定される。一部の実施形態では、所定のＯＤ閾値は、少なくとも約１．０のＯＤ６００である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、液体培地に選択した細菌コロニーを接種する前に、複数回ラウンドのアガロースプレーティングおよび培養を利用する。例えば、一部の実施形態では、寒天培地にカタラーゼ陰性細菌を接種し、一つ以上の細菌コロニーの増殖を許容する条件下、寒天培地上で培養する。こうした実施形態では、細菌コロニーは、寒天培地から選択され、適切な緩衝液中に再懸濁される。次に、第二の寒天培地に、第二の寒天培地上で一つ以上の細菌コロニーの増殖を許容する条件下で培養された再懸濁細菌溶液を接種する。このプロセスを合計で１回、２回、３回、４回、５回またはそれ以上の回数繰り返して、液体培地に接種するために使用される細菌の純度を増加させることができる。
組成物およびキット
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法によって産生される培養したカタラーゼ陰性細菌を提供する。「培養した細菌」は、インビトロ方法によって産生された細菌集団を指す。一部の実施形態では、培養したカタラーゼ陰性細菌は、他の方法に従って培養された類似の細菌と比較して、多糖類産生の増強を示す。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生される培養したカタラーゼ陰性細菌は、他の方法に従って培養された類似の細菌の多糖類含有量よりも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約２５０％高い多糖類含量を含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法によって産生される培養したカタラーゼ陰性細菌を含む細菌ストックを提供する。液体培地および／またはグリセロールなどの一つ以上の追加的成分が、細菌ストックに存在しうる。一部の実施形態では、本開示は、培養したカタラーゼ陰性細菌、液体培地、および随意にグリセロールを含む細菌ストックを提供し、細菌ストックは動物由来材料を含まない。
一部の実施形態では、細菌ストックは、動物由来材料などの汚染物質を含まない。例えば、一部の実施形態では、細菌ストックは、動物由来ヘム、プリオンタンパク質、マイコプラズマ、および／またはウイルスを含まない。一部の実施形態では、細菌ストックは、細胞壁多糖（ＣＷＰＳ）などの減少した汚染物質を含む。例えば、一部の実施形態では、細菌ストックは、ＣＷＰＳ汚染物質を実質的に含まない。一部の実施形態では、細菌ストックは、本明細書に記載される方法によって産生される培養したカタラーゼ陰性細菌を含み、他の培養方法に従って培養された類似の細菌の細菌ストックと比較して、少ない量のＣＷＰＳ汚染物質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される細菌ストックは、他の培養方法に従って培養された類似の細菌の細菌ストックと比較して、少なくとも約２０％少ないＣＷＰＳ汚染物質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される細菌ストックは、他の培養方法に従って培養された類似の細菌の細菌ストックと比較して、約２０％～約７０％少ないＣＷＰＳ汚染物質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される細菌ストックは、他の培養方法に従って培養された類似の細菌の細菌ストックと比較して、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％少ないＣＷＰＳ汚染物質を含む。
一部の実施形態では、本開示は、動物由来材料を含まない寒天培地、およびカタラーゼ酵素を含むアガロースプレートを提供する。一部の実施形態では、アガロースプレートは、カタラーゼ陰性細菌をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるインビトロ細菌培養方法を実施するためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、一つ以上の培養培地（例えば、寒天培地および／または液体培地）、一つ以上のアガロースプレート、カタラーゼ酵素、キット構成要素を再構成および／または希釈するための一つ以上の試薬のうちの一つ以上を含むことができる。キットの構成要素は、別個の容器にすることも、単一の容器で組み合わせることもできる。一部の実施形態では、キットは、一つ以上の培養培地（例えば、寒天培地および／または液体培地）、一つ以上のアガロースプレート、カタラーゼ酵素、細菌ストック、キット構成要素を再構成および／または希釈するための一つ以上の試薬のうちの一つ以上を含むことができる。キットの構成要素は、別個の容器にすることも、単一の容器で組み合わせることもできる。
一部の実施形態では、本開示は、動物由来材料を含まない寒天培地、およびカタラーゼ酵素を含む、インビトロ細菌培養のためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、寒天培地と実質的に同じ成分を含む液体培地をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、カタラーゼ陰性細菌の細菌ストックをさらに含む。
上述の構成要素に加えて、一部の実施形態では、キットは、本開示の方法を実践するための、キットの構成要素の取扱説明書をさらに含む。方法を実践するための説明書は、一般的に適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷されてもよい。そのため、説明書は、添付文書としてキット中に、またはキットまたはその構成要素の容器（すなわち、包装またはサブ包装に関連する）のラベルに、存在してもよい。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなど）上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。また他の実施形態では、実際の説明書はキット中に存在せず、例えば、インターネットを介して、遠隔ソースから指示を取得するための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を閲覧できる、および／または説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を取得するためのこの手段は、適切な基材上に記録される。
番号付けされたさらなる実施形態
本開示のさらなる実施形態は、以下の番号付けされた実施形態で提供される。
実施形態１． （ａ）寒天培地にカタラーゼ陰性細菌を接種することであって、寒天培地が、カタラーゼ酵素を含み、動物由来材料を含まない寒天培地であることと、（ｂ）寒天培地上の一つ以上の細菌コロニーの増殖を許容する条件下で、寒天培地上のカタラーゼ陰性細菌をインキュベートすることと、を含む、インビトロ細菌培養の方法。
実施形態２． （ｃ）寒天培地から一つ以上の細菌コロニーのうちの一つを選択することと、（ｄ）液体培地に選択した細菌コロニーを接種して液体細菌培養物を作製することと、（ｅ）増殖を許容する条件下で液体細菌培養物をインキュベートすることと、（ｆ）培養したカタラーゼ陰性細菌を液体細菌培養物から採取することと、をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３． カタラーゼ陰性細菌が、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の菌種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｃｕｓ）の菌種、アビオトロフィア属（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ）の菌種、グラニュリカテラ属（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、ゲメラ属（Ｇｅｍｅｌｌａ）の菌種、ロチア・ムシラギノサ属（Ｒｏｔｈｉａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）の菌種、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、グロビカテラ属（Ｇｌｏｂｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、およびドロシグラヌルム属（Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ）の菌種から選択される、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
実施形態４． カタラーゼ陰性細菌が、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）タイプ１およびシゲラ・ボイディ（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）タイプ１２から選択されるシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌種である、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
実施形態５． カタラーゼ陰性細菌が、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、およびエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種から選択される、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
実施形態６． レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が、Ａ群レンサ球菌属の細菌、Ｃ群レンサ球菌属の細菌、または緑色レンサ球菌属の細菌である、実施形態３または実施形態５に記載の方法。
実施形態７． Ａ群レンサ球菌属の細菌が、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である、実施形態６に記載の方法。
実施形態８． Ａ群レンサ球菌属の細菌が、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ１２、Ｍ２８から選択される血清型のものである、実施形態６に記載の方法。
実施形態９． レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が、ｍｕｔａｎｓ群、ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群、ｂｏｖｉｓ群、ｍｉｔｉｓ群、およびａｎｇｉｎｏｓｕｓ群から選択される緑色レンサ球菌属の細菌である、実施形態３または実施形態５に記載の方法。
実施形態１０． レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）である、実施形態３または実施形態５に記載の方法。
実施形態１１． 肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、および３３Ｆからなる群から選択される血清型のものである、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２． 肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）が、１、３、１４、および１９Ａからなる群から選択される血清型のものである、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１３． 肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３４、３５Ｂ、３３Ｆ、および３８からなる群から選択される血清型のものである、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１４． アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が、緑色アエロコッカス（Ａ．ｖｉｒｉｄｉａｎｓ）である、実施形態３または実施形態５に記載の方法。
実施形態１５． カタラーゼ酵素が、少なくとも約５００国際単位（ＩＵ）の濃度で存在する、実施形態１～実施形態１４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１６． カタラーゼ酵素が、約５００ＩＵ～約１００００ＩＵの濃度で存在する、実施形態１～実施形態１４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１７． カタラーゼ酵素が、約４０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約４５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５０００ＩＵ、または約５０００～５５００ＩＵの濃度で存在する、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８． カタラーゼ酵素が、約４５００ＩＵ、約４６００ＩＵ、約４７００ＩＵ、約４８００ＩＵ、約４９００ＩＵ、約５０００ＩＵ、約５１００ＩＵ、約５２００ＩＵ、約５３００ＩＵ、約５４００ＩＵ、または約５５００ＩＵの濃度で存在する、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１９． カタラーゼ酵素が、約５０００ＩＵの濃度で存在する、実施形態１５～実施形態１８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０． 寒天培地が、酵母抽出物、大豆ペプトン、グルコース、一つ以上の塩、およびＬ－システインをさらに含む、実施形態１～実施形態１９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２１． 一つ以上の塩が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＣｌ、およびＭｇＳＯ４から選択される、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２． Ｌ－システインが、少なくとも約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２０または実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３． Ｌ－システインが、約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２０または実施形態２１に記載の方法。
実施形態２４． Ｌ－システインが、約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５． Ｌ－システインが、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２６． Ｌ－システインが、約０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、または５．０ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２２～実施形態２５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２７． 酵母抽出物が、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２０～実施形態２６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２８． 酵母抽出物が、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９． 酵母抽出物が、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２７または実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０． 大豆ペプトンが、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態２０～実施形態２９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３１． 大豆ペプトンが、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２． 大豆ペプトンが、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する、実施形態３０または実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３． 細菌コロニーの増殖を許容する条件が、約３７℃の温度を含む、実施形態１～実施形態３２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３４． 細菌コロニーの増殖を許容する条件が、約３４℃～３９℃の温度を含む、実施形態１～実施形態３２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３５． 細菌コロニーの増殖を許容する条件が、嫌気性培養環境をさらに含む、実施形態１～実施形態３４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３６． 細菌コロニーの増殖を許容する条件が、少なくとも約５％のＣＯ２レベルをさらに含む、実施形態１～実施形態３５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３７． ＣＯ２レベルが、約５％～約９５％である、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８． 細菌コロニーの増殖を許容する条件が、約０％のＣＯ２レベルをさらに含む、実施形態１～実施形態３５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３９． 液体培地が、寒天培地と実質的に同じ成分を含む、実施形態２～実施形態３８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４０． 一つ以上の細菌コロニーが、不透明、半透明、および透明なコロニーを含む、実施形態１～実施形態３９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４１． 選択した細菌コロニーが、不透明なコロニーである、実施形態２～実施形態４０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４２． 培養したカタラーゼ陰性細菌が、液体細菌培養物が所定の光学密度（ＯＤ）閾値に達した後に採取される、実施形態２～実施形態４１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４３． 光学密度が、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長で測定される、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４． 所定のＯＤ閾値が、少なくとも約１．０のＯＤ６００である、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４５． 実施形態１～実施形態４４のいずれか一つに記載の方法によって産生される培養したカタラーゼ陰性細菌。
実施形態４６． 細菌が、動物由来材料を含む培地を使用して培養された類似の細菌と比較して、多糖類産生の増強を示す、実施形態４５に記載の培養したカタラーゼ陰性細菌。
実施形態４７． 実施形態４５または実施形態４６に記載の培養したカタラーゼ陰性細菌を含む、細菌ストック。
実施形態４８． （ａ）動物由来物質を含まない寒天培地、および（ｂ）カタラーゼ酵素を含む、インビトロ細菌培養のためのキット。
実施形態４９． 寒天培地と実質的に同じ成分を含む液体培地をさらに含む、実施形態４８に記載のキット。
実施形態５０． （ａ）動物由来物質を含まない寒天培地、および（ｂ）カタラーゼ酵素を含む、アガロースプレート。
実施形態５１． カタラーゼ陰性細菌をさらに含む、実施形態５０に記載のアガロースプレート。
実施形態５２． 培養したカタラーゼ陰性細菌、液体培地、および随意にグリセロールを含む細菌ストックであって、細菌ストックが動物由来材料を含まない、細菌ストック。
実施形態５３． 細菌ストックが動物由来ヘムを含まない、実施形態５２に記載の細菌ストック。
実施形態５４． 細菌ストックが、プリオンタンパク質、マイコプラズマ、またはウイルスを含まない、実施形態５２または実施形態５３に記載の細菌ストック。
実施形態５５． 細菌ストックが、動物由来材料を含む培地を使用して培養された類似の細菌を含む細菌ストックと比較して、細胞壁多糖（ＣＷＰＳ）汚染物質の量の減少を示す、実施形態５２～実施形態５４のいずれか一つに記載の細菌ストック。
寒天プレート上での培養
肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）コロニーの増殖を十分に支援する培地および条件を見つけるために、異なる種類の寒天プレート上での異なる増殖条件の試験を評価した。これらの実験で使用した血清型を表２に列挙する。
Figure 2023502994000003
三つの固体寒天培地（ＹＥＰＤ２、ＰＹＥ２、およびＳＹＧ）を、以下の表３、４、および５に従って調製した。
Figure 2023502994000004
Figure 2023502994000005
Figure 2023502994000006
Figure 2023502994000007
これらのプレートに加えて、異なる使用準備済みのプレートまたは使用準備済みの寒天混合物を、上述のＹＥＰＤ２、ＰＹＥ２、およびＳＹＧ寒天の対照または代替物として使用した。これらの追加のプレートおよび寒天は、以下の通りである。
（ａ）ＴＳＢ（Ｍｅｒｃｋ、１．００５５０．０５００）、
（ｂ）５％ヒツジ血液添加ＴＳＡＩＩ寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、４３００９）、および
（ｃ）ＴＳＡ非動物性ではない（Ｍｅｒｃｋ， １４６０１５００２０）。
細胞接種前に、カタラーゼ（５０００Ｕ／プレート）を、すべての動物を含まない寒天プレート上に塗り付けた。細胞増殖に対するこの溶液の悪影響の可能性を排除するために、対照として、ＴＳＡおよび血液寒天プレート上にカタラーゼを追加的に塗り付けた。
以下の四つの方法のうちの一つで、プレートに細菌細胞を接種した。
（ａ）細胞を、保存バイアルの表面から削り、寒天プレート上に直に画線した、
（ｂ）細胞懸濁液を解凍し、プレート上に直に画線した、
（ｃ）細胞懸濁液を解凍し、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ溶液中、１：５もしくは１：１０もしくは１：１００に希釈した後、プレート上に画線した、または
（ｄ）細胞懸濁液を解凍し、カタラーゼストック溶液中、１：１０または１：２０に希釈し、その後プレート上に画線した。
接種後、プレートを、５％のＣＯ２条件または嫌気性条件のいずれかで、３７℃で１６～２４時間インキュベートした。
インキュベーション後、最大８個のコロニーを採集用に選択した。実体顕微鏡を使用して、粗い／不透明なコロニーを識別および選択した。採集コロニーを、１ｍＬまたは２ｍＬの滅菌０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ溶液中に再懸濁した。
プレートからの細菌懸濁液を、以下のように、異なる体積（１０μＬ、１００μＬ、２００μＬ）で第二のラウンドの寒天プレート上に接種した。
（ａ）ＹＥＰＤ寒天プレートから選択した細菌懸濁液を、ＹＥＰＤ寒天プレートおよび陽性対照プレート上に接種した、
（ｂ）ＰＹＥ寒天プレートから選択した細菌懸濁液を、ＰＹＥ寒天プレートおよび陽性対照プレート上に接種した、
（ｃ）ＳＹＧ寒天プレートから選択した細菌懸濁液を、ＳＹＧ寒天プレートおよび陽性対照プレート上に接種した、
（ｄ）陽性対照プレートから選択した細菌懸濁液を、ＰＹＥ、ＹＥＰＤまたはＳＹＧプレート上に接種した。
完全な精製プロセスには、液体培養を開始する前に、寒天プレート上での４段階が含まれた。
プレーティング、接種、環境条件、および細菌増殖の概要を以下の表７に提供する。
Figure 2023502994000008
Figure 2023502994000009
上述の実験に基づいて、以下の結論が出された：
（ａ）ＹＥＰＤおよびＰＹＥ寒天は、選択した肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の増殖には適さなかった。
（ｂ）使用準備済みで動物質を含まないＴＳＢから調製された培地は肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３の増殖を支援したが、他の血清型１および１４の増殖は支援しなかった。従って、この培地はそれ以上使用されなかった。
（ｃ）カタラーゼを含むＳＹＧ寒天は、多様な条件下で試験されたすべての血清型の増殖を支援した。従って、この寒天は、２４種類の異なる肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の精製手順のため、および各血清型に対する親細胞バンクの生成のために選択した。
（ｄ）５％ヒツジ血液を含むＴＳＡＩＩ寒天と、カタラーゼを含むＴＳＡ寒天の両方が、すべての条件下で試験されたすべての血清型の増殖を支援した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは非常に典型的なコロニー増殖を示し、血液寒天プレート上のコロニーの周りに溶血円を有したため、カタラーゼを添加しない５％ヒツジ血液を含むＴＳＡＩＩ寒天を、親細胞バンク生成中に陽性対照として使用した。
（ｅ）興味深いことに、ＳＹＧ寒天上で培養した場合、試験された血清型はすべて、ＣＯ２インキュベーター中よりも嫌気性チャンバーで良好な増殖を示した。５％ヒツジ血液を含むＴＳＡＩＩ寒天上で増殖したコロニーは、嫌気性チャンバー中よりもＣＯ２インキュベーター中で良好なコロニー増殖を示した。
精製プロセスの最終手順は、カタラーゼ（５０００Ｕ／プレート）で処理したＳＹＧ寒天プレート、および５％ヒツジ血液を含むＴＳＡＩＩ寒天を陽性対照として使用した。細菌ストックのバイアルを解凍し、１０μＬの細胞懸濁液を２ｍＬのＮａＣｌ ０．９％で希釈した。
細胞懸濁液の１００μＬを、５％ヒツジ血液を含むＴＳＡＩＩ寒天陽性対照プレート上に塗り、プレートを５％ ＣＯ２、３７℃で約２４時間、嫌気的に培養した。１００μＬの細胞懸濁液、ならびに最大１０－３までの希釈物を、ＳＹＧ寒天プレート上に塗り、プレートを３７℃で約２４時間、嫌気的に培養した。
プレーティングおよび培養手順を追加的に３回、合計４回繰り返して完了した。各プレートから 一つの不透明な単一コロニー（顕微鏡観察により決定）を、２ｍＬのＮａＣｌ０．９％溶液中に再懸濁した。細胞懸濁液の１００μＬを、５％ヒツジ血液を含むＴＳＡＩＩ寒天陽性対照プレート上に接種し、５％ ＣＯ２、３７℃で約２４時間、嫌気的に培養した。細胞懸濁液の１００μＬを、（コロニーサイズに応じて）１０－２～最大１０－５に希釈して、ＳＹＧ寒天プレート上に接種し、３７℃で約２４時間、嫌気的に培養した。第四段階の終わりに、コロニーをプレートから削り取って、第一の液体培養段階の接種液として使用した。
動物を含まないプレートから選択した細菌の液体培養
以下の条件は、液体培地のすべての予備的実験について同じに保たれた。
（ａ）温度：３７．０±２．０℃
（ｂ）ＣＯ２濃度を高めた雰囲気（５％）
（ｃ）２ｃｍの振とう直径で２００ｒｐｍの振とう速度
（ｄ）開始ｐＨ：７．５±０．２（ｐＨは最初の実験中に、２０％ Ｎａ２ＣＯ３溶液を用いて適合させた）
（ｅ）光学密度のすべての測定は、ＯＤ６００で非接種培地をブランクとして実施した。
（ｆ）試験した血清型：１、４、および１４
（ｇ）寒天プレート培養段階２または３からのコロニーを使用した。
予備実験では、５つの液体培地を使用した。培地１：１．０ｇ／ＬのＬ－システインを含むＳＹＧ液体培地（加熱滅菌）、培地２：１．０ｇ／ＬのＬ－システインを含むＳＹＧ液体培地（フィルター滅菌）、培地３：１．０ｇ／ＬのＬ－システインおよび０．０５Ｍリン酸緩衝液を含むＳＹＧ液体培地（フィルター滅菌）、培地４：１．０ｇ／ＬのＬ－システインおよび０．１Ｍリン酸緩衝剤を含むＳＹＧ液体培地（フィルター滅菌）、培地５：４．０ｇ／ＬのＬ－システイン（フィルター滅菌）を含むＳＹＧ液体媒体。各培地の詳細を表８に示す。
Figure 2023502994000010
ｐＨ調整後、培地１を撹拌し、類似の量の参照水と共に、１２２℃以上で３０分以上加熱滅菌し、その後、２５ｍＬ／Ｌの４００ｇ／Ｌグルコースを添加した。ｐＨ調整後、培地２～５を撹拌し、０．２２μｍのフィルターを使用して濾過した。
最初の実験は、培地１～４、および血清型１および１４を用いて実施した（図１および図 ２）。プレートからのコロニーを、５ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、１ｍＬの細胞懸濁液を、バッフルなしの１００ｍＬ振とうフラスコ中、２５ｍＬの液体培地に添加した。液体培養物の開始ＯＤ６００は、０．０１～０．０２であった。第一段階の最大光学密度は０．４～０．７であった。ｐＨは、すべての振とうフラスコで一度調整された。液体培養の第一段階中のｐＨ調整は、細胞増殖に悪影響を与えた。第一段階からの液体培養物２ｍＬを、第二の液体培養段階のための液体培地の第二のフラスコに接種した。第二段階の増殖は非常に遅く、実験を中止した。この最初の液体培養実験に基づいて、第一の液体培養段階は、より大量の細菌細胞懸濁液を接種するべきであり、培養中にｐＨ調整を行うべきではなく、第一段階の増殖は、第二段階への培養移動前の対数期にあるべきであると結論付けられた。
第二の群の実験は、培地１および５、ならびに血清型１および４を用いて実施した（図３および図 ４）。プレートからのコロニーを、５ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁し、４ｍＬの細胞懸濁液を、バッフルなしの５００ｍＬ振とうフラスコ中、１００ｍＬの液体培地に添加した。液体培養物の開始ＯＤ６００は、およそ０．１であった。第一の液体培養段階の最大光学密度は、培地１ではおよそ０．４であり、培地５では０．５より高かった。第二段階で、第一段階からの１０ｍＬの培養物を、バッフルなしの５００ｍＬの振とうフラスコ中、１００ｍＬの培地に接種した。液体培養物の第二段階の最大光学密度は、培地１ではおよそ０．４～０．５であり、培地５では１．０より高かった。
予備実験に基づいて、以下の結論が出され、親細胞バンクの生成のための以下の手順が定義された。
（ａ）親細胞バンクの生成用には培地５を選択した。
（ｂ）液体培地は、使用前の可能な限り短い期間に調製すべきである（Ｌ－システイン含有培地は調製から２日を超えてはならない）。培地の古さは、細胞増殖に悪影響を与える可能性がある（図６および図 ９）。
（ｃ）第一の液体培養段階では、バッフルなしの３００ｍＬ振とうフラスコおよび６０ｍＬの培地を使用するべきである。
（ｄ）第二の液体培養段階では、バッフルなしの１０００ｍＬ振とうフラスコおよび１８０ｍＬの培地を使用するべきである。
（ｅ）第一の液体培養段階の接種には、２．４ｍＬの細胞懸濁液（コロニーサイズに応じて最大２００コロニー、ＮａＣｌの０．９％溶液９ｍＬに再懸濁、開始ＯＤ６００は０．０２～０．１）を使用するべきである。
（ｆ）第二の液体培養段階の接種については、０．３を超えるＯＤ６００で第一段階からの１８ｍＬ（第一段階において少なくとも１回の倍化が必要である）。
（ｇ）温度は３７．０℃±２．０℃であるべきである
（ｈ）雰囲気はＣＯ２濃度が高められているべきである（５％）
（ｉ）振とう速度は、２ｃｍの振とう直径（モータの冷却を伴う）で２００ｒｐｍであるべきである。低熱発生マグネチックスターラーの使用は除外した（図８を参照）。
（ｊ）開始ｐＨは７．５±０．２であるべき（ｐＨは最初の実験中に、２０％ Ｎａ２ＣＯ３溶液を用いて調整した）
（ｋ）光学密度のすべての測定は、ＯＤ６００で非接種培地をブランク（対照）として実施した。
（ｌ）採取前の最終光学密度：１．０
（ｍ）最終濃度１２％ｖ／ｖへのグリセロール（３０％ｖ／ｖ）の添加および少なくとも１０分間の平衡化
（ｎ）培養物４．５ｍＬで３５バイアルを満たし、－１４０℃／－１２０℃未満で初期凍結（－８０℃／－６５℃未満でさらに保存）
（ｏ）陽性対照：第一および第二段階の接種に使用した細胞懸濁液を、５％ヒツジ血液を含むＳＹＧまたはＴＳＡＩＩ寒天のいずれかにプレーティングし、嫌気性条件下または５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃でインキュベーション。
（ｐ）各血清型四つ組の精製手順中、少なくとも二つの血清型を液体培地における増殖挙動について試験した。図５～図１０を参照。
（ｑ）培地の沈殿レベルの後に、いくつかの実験で非接種培地中のＯＤ６００の測定を行なった。
培地中のＬ－システインの濃度を増加させることは、フラスコ中のより良好な増殖を促進する。接種前に培地に直接添加された３．０ｇ／ＬのＬ－システインが、増殖促進に最適であった。図１５に示されるように、血清型２０の培地に添加された３．０ｇ／Ｌおよび４．０ｇ／ＬのＬ－システインは、同等の生細胞数および増殖性能を提供した（６００ｍＬスケールの培養実験中の熱（ＨＳ）およびフィルター（ＦＳ）滅菌培地における血清型２０のＯＤ６００の経時変化が示されている）。しかしながら、ほとんどの血清型については、４．０ｇ／Ｌは望ましくない沈殿をもたらす可能性があるので、３．０ｇ／ＬのＬ－システインが最適濃度であることが判明した。
参照による組み込み
本明細書に引用されるすべての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、世界の任意の国において、有効な先行技術を構成する、または共通の一般知識の一部を形成するという承認または任意の形態の提案ではなく、かつそのようにみなされるべきではない。

Claims (55)

  1. インビトロ細菌培養の方法であって、
    ａ．寒天培地にカタラーゼ陰性細菌を接種することであって、前記寒天培地が、カタラーゼ酵素を含み、動物由来材料を含まない寒天培地であることと、
    ｂ．前記寒天培地上の前記カタラーゼ陰性細菌を、前記寒天培地上で一つ以上の細菌コロニーの増殖を許容する条件下でインキュベートすることと、を含む、方法。
  2. 請求項１のいずれか一項に記載の方法であって、
    ｃ．前記寒天培地から前記一つ以上の細菌コロニーのうちの一つを選択することと、
    ｄ．液体培地に前記選択した細菌コロニーを接種して、液体細菌培養物を産生することと、
    ｅ．前記液体細菌培養物を、増殖を許容する条件下でインキュベートすることと、
    ｆ．前記液体細菌培養物から、培養したカタラーゼ陰性細菌を採取することと、をさらに含む、方法。
  3. カタラーゼ陰性細菌が、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の菌種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｃｕｓ）の菌種、アビオトロフィア属（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ）の菌種、グラニュリカテラ属（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、ゲメラ属（Ｇｅｍｅｌｌａ）の菌種、ロチア・ムシラギノサ属（Ｒｏｔｈｉａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）の菌種、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、グロビカテラ属（Ｇｌｏｂｉｃａｔｅｌｌａ）の菌種、およびドロシグラヌルム属（Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ）の菌種から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記カタラーゼ陰性細菌が、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）タイプ１およびシゲラ・ボイディ（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）タイプ１２から選択されるシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌種である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  5. 前記カタラーゼ陰性細菌が、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、クロストリジウス属（Ｃｌｏｓｔｒｉｕｄｉｕｍ）の菌種、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、およびエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  6. 前記レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が、Ａ群レンサ球菌属の細菌、Ｃ群レンサ球菌属の細菌、または緑色レンサ球菌属の細菌である、請求項３または請求項５に記載の方法。
  7. 前記Ａ群レンサ球菌属の細菌が、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記Ａ群レンサ球菌属の細菌が、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ１２、Ｍ２８から選択される血清型のものである、請求項６に記載の方法。
  9. 前記レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が、ｍｕｔａｎｓ群、ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群、ｂｏｖｉｓ群、ｍｉｔｉｓ群、およびａｎｇｉｎｏｓｕｓ群から選択される緑色レンサ球菌属の細菌である、請求項３または請求項５に記載の方法。
  10. 前記00レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）である、請求項３または請求項５に記載の方法。
  11. 前記肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、および３３Ｆからなる群から選択される血清型のものである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）が、１、３、１４、および１９Ａからなる群から選択される血清型のものである、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３４、３５Ｂ、３３Ｆ、および３８からなる群から選択される血清型のものである、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種が緑色アエロコッカス（Ａ．ｖｉｒｉｄｉａｎｓ）である、請求項３または請求項５に記載の方法。
  15. 前記カタラーゼ酵素が、少なくとも約５００国際単位（ＩＵ）の濃度で存在する、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記カタラーゼ酵素が、約５００ＩＵ～約１００００ＩＵの濃度で存在する、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記カタラーゼ酵素が、約４０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５０００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約５５００ＩＵ～約６０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約５０００ＩＵ、約４０００ＩＵ～約４５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５５００ＩＵ、約４５００ＩＵ～約５０００ＩＵ、または約５０００～約５５００ＩＵの濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記カタラーゼ酵素が、約４５００ＩＵ、約４６００ＩＵ、約４７００ＩＵ、約４８００ＩＵ、約４９００ＩＵ、約５０００ＩＵ、約５１００ＩＵ、約５２００ＩＵ、約５３００ＩＵ、約５４００ＩＵ、または約５５００ＩＵの濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記カタラーゼ酵素が、約５０００ＩＵの濃度で存在する、請求項１５～請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記寒天培地が、酵母抽出物、大豆ペプトン、グルコース、一つ以上の塩、およびＬ－システインをさらに含む、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記一つ以上の塩が、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＣｌ、およびＭｇＳＯ４から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記Ｌ－システインが、少なくとも約０．５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
  23. 前記Ｌ－システインが、約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
  24. 前記Ｌ－システインが、約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記Ｌ－システインが、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２３に記載の方法。
  26. Ｌ－システインが、約０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、または５．０ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２２～請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記酵母抽出物が、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２０～請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記酵母抽出物が、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記酵母抽出物が、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
  30. 前記大豆ペプトンが、少なくとも約５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２０～請求項２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記大豆ペプトンが、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項３０に記載の方法。
  32. 大豆ペプトンが、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、または約２５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
  33. 細菌コロニーの増殖を許容する前記条件が、約３７℃の温度を含む、請求項１～請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 細菌コロニーの増殖を許容する前記条件が、約３４℃～約３９℃の温度を含む、請求項１～請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 細菌コロニーの増殖を許容する前記条件が、嫌気性培養環境をさらに含む、請求項１～請求項３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 細菌コロニーの増殖を許容する前記条件が、少なくとも約５％のＣＯ２レベルをさらに含む、請求項１～請求項３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＣＯ２レベルが、約５％～約９５％である、請求項３６に記載の方法。
  38. 細菌コロニーの増殖を許容する前記条件が、約０％のＣＯ２レベルをさらに含む、請求項１～請求項３５のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記液体培地が、前記寒天培地と実質的に同じ成分を含む、請求項２～請求項３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記一つ以上の細菌コロニーが、不透明、半透明、および透明なコロニーを含む、請求項１～請求項３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記選択した細菌コロニーが、不透明なコロニーである、請求項２～請求項４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記培養したカタラーゼ陰性細菌が、前記液体細菌培養物が所定の光学密度（ＯＤ）閾値に達した後に採取される、請求項２～請求項４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記光学密度が、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長で測定される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記所定のＯＤ閾値が、少なくとも約１．０のＯＤ６００である、請求項４２に記載の方法。
  45. 請求項１～請求項４４のいずれか一項に記載の方法によって産生される培養したカタラーゼ陰性細菌。
  46. 前記細菌が、動物由来材料を含む培地を使用して培養された類似の細菌と比較して、多糖類産生の増強を示す、請求項４５に記載の培養したカタラーゼ陰性細菌。
  47. 請求項４５または請求項４６に記載の培養したカタラーゼ陰性細菌を含む、細菌ストック。
  48. インビトロ細菌培養のためのキットであって、
    ａ．動物由来材料を含まない寒天培地と、
    ｂ．カタラーゼ酵素と、を含むキット。
  49. 前記寒天培地と実質的に同じ成分を含む液体培地をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
  50. アガロースプレートであって、
    ａ．動物由来材料を含まない寒天培地と、
    ｂ．カタラーゼ酵素と、を含むアガロースプレート。
  51. カタラーゼ陰性細菌をさらに含む、請求項５０に記載のアガロースプレート。
  52. 培養したカタラーゼ陰性細菌、液体培地、および随意にグリセロールを含む細菌ストックであって、前記細菌ストックが動物由来材料を含まない、細菌ストック。
  53. 前記細菌ストックが動物由来ヘムを含まない、請求項５２に記載の細菌ストック。
  54. 前記細菌ストックが、プリオンタンパク質、マイコプラズマ、またはウイルスを含まない、請求項５２または請求項５３に記載の細菌ストック。
  55. 前記細菌ストックが、動物由来材料を含む培地を使用して培養された類似の細菌を含む細菌ストックと比較して、細胞壁多糖類（ＣＷＰＳ）汚染物質の量の減少を示す、請求項５２～請求項５４のいずれか一項に記載の細菌ストック。
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