CN101423862A - 阪崎肠杆菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)显色培养基、检测试剂盒及检测方法涉及一种微生物的检测方法及所用的组合物。所述的显色培养基配方为：蛋白胨8～20g、牛肉膏粉4～7g、氯化钠4～7g、胆盐1.0～2.0g、琼脂12～20g、X－a－glucopyranoside 0.05～0.5g、Na2CO3 0.01～0.04g、柠檬酸铁铵0.3～2.0g、硫代硫酸钠0.3～2.0g。所述的检测试剂盒组成为：上述阪崎肠杆菌显色培养基、增菌液A：缓冲蛋白胨水培养基和增菌液B：改良月桂基硫酸盐胰蛋白肉汤。本发明所述的试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏度高，适用于处理大通量的样本。

Description

阪崎肠杆菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
本发明涉及一种微生物的检测方法及所用的组合物。
【背景技术】
食品微生物安全是食品安全中的重中之重，阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)是乳制品中新发现的引起广泛关注的一种致病菌。1961年，两位英国科学家首次报道2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例，随后相继在美国、希腊、荷兰、冰岛、加拿大、比利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。由此可见，由阪崎肠杆菌引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球范围内相继出现，在特定情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而致死的病例可高达40％～50％。多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，故已引起世界各国政府部门的重视。继美国FDA2002年从惠氏婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2002年9月，香港从德国″美乐宝″奶粉中也检出含有阪崎肠杆菌，2003年美国美赞臣公司又主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉。此后，配方奶粉中阪崎肠杆菌污染问题成为世界瞩目的焦点。我国最近也先后从进口和国产婴幼儿配方奶粉中检出了阪崎肠杆菌。2001年7月，福建省疾病预防控制中心从一箱进口利乐包纯牛奶中检测到阪崎肠杆菌；2004年4月，我国安徽省阜阳地区连续发生了与″劣质奶粉″有关的婴儿营养状况不良甚至导致死亡事件的报道，引起了国务院及相关部门的极大关注。2004年2月，世界卫生组织和联合国粮食及农业组织就婴儿配方奶粉含阪崎肠杆菌这课题，共同召开专家会议。2004年3月在美国华盛顿召开的国际食品卫生法典委员会第36次会议，也对阪崎肠杆菌的危险性给予了特别的关注。WHO的代表介绍了FAO/WHO有关婴幼儿配方食品中阪崎肠杆菌会议的讨论情况，大会通过由加拿大牵头组成起草工作组，修订婴幼儿食品的国际卫生操作规范，并制定阪崎肠杆菌及相关微生物的标准。婴儿是父母、国家未来的希望，每一个出生的婴儿几乎都需要喝奶粉，良好的婴儿奶粉有助于婴儿的健康成长。因此，对这种致病菌的监测和检验就显得越来越重要。
为有效控制病原的发生和扩散，准确及时的检测手段是预防和控制阪崎肠杆菌传播的关键。目前，阪崎肠杆菌传统的检测方法需要分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，检测周期长，整个过程大约6-7天，且操作复杂，已不能满足食品中病原菌快速检测的现实需要，而且当有其它的肠道菌群存在时会影响阪崎肠杆菌在传统结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂培养基中的检出。近年来，快速检验法中的PCR法、金标试纸法、免疫法和特异性的显色生化鉴定技术等快速检验方法，已在不断得到扩大应用，使阪崎肠杆菌的快速检测有了很大发展。但是这些技术也存在一定缺陷，如技术要求高，设备操作复杂，需要专业的技术人员进行操作，以及检测费用昂贵等。
【发明内容】
本发明旨在提供一种成本低廉并能快速检测出阪崎肠杆菌的显色培养基。
本发明还提供了一种含有上述培养基的阪崎肠杆菌检测试剂盒，以及使用检测试剂盒检测阪崎肠杆菌的方法。
所述的阪崎肠杆菌显色培养基，其配方为：蛋白胨8～20g、牛肉膏粉4～7g、氯化钠4～7g、胆盐1.0～2.0g、琼脂12～20g、显色底物X-a-glucopyranoside 0.05～0.5g、Na2CO3 0.01～0.04g、柠檬酸铁铵0.3～2.0g、硫代硫酸钠0.3～2.0g。
上述显色培养基较优选的配方为：蛋白胨11g、牛肉膏粉5g、氯化钠5g、胆盐1.5g、琼脂15g、显色底物X-a-glucopyranoside 0.1g、Na2CO3 0.02g、柠檬酸铁铵1.0g、硫代硫酸钠1.0g。
所述的阪崎肠杆菌检测试剂盒，其组成为：上述阪崎肠杆菌显色培养基、增菌液A和增菌液B。
其中，增菌液A为高压灭菌处理的缓冲蛋白胨水培养基(BP)；
增菌液B为高压灭菌处理的改良月桂基硫酸盐胰蛋白月示肉汤(mLST)。
所述的检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备显色平板：每1000mL蒸馏水或去离子水中加入29.66～60.54g阪崎肠杆菌显色培养基，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
(2)一步增菌：将样品置于增菌液A中，混合均匀后37℃培养16-20h；
(3)二步增菌：取一步增菌液1mL加入到9mL增菌液B中，混合均匀后44℃培养22-26h；
(4)接种培养：将二步增菌液接种显色平板上，37℃培养22-26h；
(5)结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的蓝绿色菌落，说明该样品存在阪崎肠杆菌。
本发明针对现有技术中的不足，从生物化学的角度出发，利用细菌特异性酶对其进行快速检测。首先，在分析阪崎肠杆菌特异性生化反应的基础上，筛选出细菌特异性酶，然后通过在分离培养基上加入细菌特异性酶的显色底物，研制出显色培养基，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴定，同时结合高效的样本前处理技术，建立特异性显色生化检测方法，用于阪崎肠杆菌的快速诊断和监控，可大大节省检测成本和时间，具有更广泛的应用前景。
本发明通过筛选阪崎肠杆菌特异性酶及显色底物，开发了阪崎肠杆菌的显色培养基，克服了已有显色培养基价格昂贵和传统培养基特异性差等缺点；并通过对比各种标准方法的样本前处理技术，建立了一套系统的阪崎肠杆菌显色生化快速检测方法，提高了检测效率；所建立的阪崎肠杆菌显色生化快速检测方法，可对食品和环境中阪崎肠杆菌进行全面、系统、准确的检测和鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
本发明所述的试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏度高，周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可以广泛推广应用到食品卫生等领域。
【具体实施方式】
实施例1：本发明所述的阪崎肠杆菌显色培养基特异性的验证
1、阪崎肠杆菌显色培养基的配制：称取39.62g阪崎肠杆菌显色培养基(含蛋白胨11g、牛肉膏粉5g、氯化钠5g、胆盐1.5g、琼脂15g、显色底物X-a-glucopyranoside(Apoloscientific，BIMB1190)0.1g、Na2CO3 0.02g、柠檬酸铁铵1.0g、硫代硫酸钠1.0g)，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
2、接种：阪崎肠杆菌、普通变型杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷伯氏菌(Serralia marcescens)、粪肠球菌(Streptococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在营养琼脂复苏24h后，分别划线接种上述显色培养基平板，37℃培养18～24h。
3、结果及分析：阪崎肠杆菌在显色平板上均出现蓝绿色菌落，奇异变形杆菌和大肠杆菌在显色平板上均出现无色菌落，普通变形杆菌和沙门氏菌在显色平板上均出现灰黑色菌落，铜绿假单胞菌在显色平板上出现黄绿色菌落，粘质沙雷伯氏菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌在显色平板上均无生长现象，说明阪崎肠杆菌显色培养基具有较高的特异性。
实施例2：本发明所述的阪崎肠杆菌显色培养基灵敏度及特异性的验证
1、阪崎肠杆菌显色培养基的配制：称取39.62g阪崎肠杆菌显色培养基(含蛋白胨11g、牛肉膏粉5g、氯化钠5g、胆盐1.5g、琼脂15g、显色底物X-a-glucopyranoside(Apoloscientific，BIMB1190)0.1g、Na2CO3 0.02g、柠檬酸铁铵1.0g、硫代硫酸钠1.0g)，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
2、接种：阪崎肠杆菌ATCC51329、HK7402、普通变形杆菌CMCC(B)49027、奇异变形杆菌CMCC(B)49005、铜绿假单胞菌ATCC9027、ATCC27853、大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115、粘质沙雷伯氏菌HK7121、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC6538在营养琼脂复苏，37℃培养18～24h。按以下菌种的组合，分别用接种环挑取1环，加入到10mL0.85％生理盐水中配成原液，然后进行10倍梯度稀释，取10-5～10-6浓度混合菌液各0.1mL，分别涂布上述显色培养基平板(简称HK阪)、国外OXOID公司的阪崎肠杆菌显色培养基(简称OX阪)，37℃培养18～24h。
菌种组合：
1)阪崎肠杆菌ATCC51329+鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115+粘质沙雷伯氏菌HK7121+金黄色葡萄球菌ATCC6538+铜绿假单胞菌ATCC9027+大肠杆菌ATCC25922
2)阪崎肠杆菌HK7402+奇异变形杆菌CMCC(B)49005+普通变形杆菌CMCC(B)49027+粪肠球菌ATCC29212+铜绿假单胞菌ATCC27853
3、结果及分析：
混合菌液涂布各平板灵敏度试验结果如表1，表明本发明所述的阪崎肠杆菌显色培养基与国外品牌的阪崎肠杆菌显色培养基平板的阪崎肠杆菌检出率没有显著差异，二种培养基可以达到相同的检测限。
混合菌液涂布各平板特异性试验结果如表2，在本发明所述的阪崎肠杆菌显色培养基平板上阪崎肠杆菌仍呈特殊的蓝绿色菌落，其他肠道菌受抑或呈现灰黑色、淡黄色或呈无色菌落。表明其他肠道菌基本不影响阪崎肠杆菌的检测，显色培养基对阪崎肠杆菌的特异性高。
表1  二种组合中的阪崎肠杆菌在各培养基上的灵敏度试验结果
表2  二种组合中各种菌在各培养基上的特异性试验结果
 
菌株 接种量(cfu) HK阪 OX阪
 
阪崎肠杆菌菌落特征 蓝绿色 蓝绿色
阪崎肠杆菌ATCC51329 30～300 蓝绿色 蓝绿色
阪崎肠杆菌HK7402 30～300 蓝绿色 蓝绿色
鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115 30～300 灰黑色 灰黑色
大肠杆菌ATCC25922 30～300 淡黄色 淡黄色
普通变形杆菌CMCC(B)49027 30～300 灰黑色 灰黑色
奇异变形杆菌CMCC(B)49005 30～300 灰黑色 灰黑色
铜绿假单胞菌ATCC9027 30～300 无色 无色
铜绿假单胞菌ATCC27853 30～300 黄绿 黄绿
粘质沙雷伯氏菌HK7121 5000 受抑制 受抑制
粪肠球菌ATCC29212 5000 受抑制 受抑制
金黄色葡萄球菌ATCC6538 5000 受抑制 受抑制
实施例3：人工污染样品中阪崎肠杆菌的检测
1、制备显色平板
称取39.62g显色培养基干粉(含蛋白胨11g、牛肉膏粉5g、氯化钠5g、胆盐1.5g、琼脂15g、显色底物X-a-glucopyranoside(Apoloscientific，BIMB 1190)0.1g、Na2CO3 0.02g、柠檬酸铁铵1.0g、硫代硫酸钠1.0g)，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
2、前增菌
4种奶粉样品各称取8份，每份100g，无菌操作分别将4份样品加到含有900mL BP增菌液的三角瓶中，其中3份添加三种浓度阪崎肠杆菌；另外4份样品分别加到含有900mL无菌水的三角瓶中，其中3份添加三种浓度阪崎肠杆菌，模拟实际样品混合均匀，37℃培养16～20h。
3、选择性增菌
各取1mL样品前增菌液分别加入到9mLmLST(前增菌液为BP)/9mLEE(前增菌液为无菌水)中进行二次增菌，44℃/37℃培养16～20h。
4、接种培养
各取1环二次增菌液，划线接种显色培养基平板，37℃培养22～26h，观察记录菌落颜色和形态。
5、结果观察和分析
显色培养基的对人工污染样品的检测结果见表4。未添加阪崎肠杆菌的样品增菌后在显色平板上无蓝绿色菌落，有无色菌落生长；添加阪崎肠杆菌的样品增菌后在显色平板上呈现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的蓝绿色菌落。HKM阪崎肠杆菌显色培养基和OXOID阪崎肠杆菌显色培养基对人工污染样品中阪崎肠杆菌的检出率没有差异，二种培养基可以达到相同的检测限，对4份奶粉用BP—mLST增菌体系，检测灵敏度均可以达到1～10cfu，而且竞争性抑制了奶粉中杂菌的生长；而用无菌水—EE增菌体系，对伊利奶粉和三鹿奶粉检测灵敏度均为<102～103cfu/100g奶粉，且无法抑制奶粉中本身杂菌的生长。说明BP—mLST增菌体系优于无菌水—EE增菌体系。检测过程中，前增菌需18h，选择性增菌18h，显色平板培养24h，阳性结果时间最长需60h。按本发明所述的检测方法对阪崎肠杆菌进行检测，检测灵敏度可以达到1～10cfu。
表4 人工污染样品中阪崎肠杆菌的检测结果
Figure A200810220194D00101
实施例4：豆奶中阪崎肠杆菌的检测
1、制备显色平板
称取39.62g显色培养基干粉(含蛋白胨11g、牛肉膏粉5g、氯化钠5g、胆盐1.5g、琼脂15g、显色底物X-a-glucopyranoside(Apoloscientific，BIMB 1190)0.1g、Na2CO3 0.02g、柠檬酸铁铵1.0g、硫代硫酸钠1.0g)，加入1000mL蒸馏水或去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
2、前增菌
在无菌条件下，量取100mL豆奶，无菌操作将样品加到含有900mL BP增菌液的三角瓶中，37℃培养16～20h。
3、选择性增菌
取1mL样品前增菌液加入到9mLmLST中进行二次增菌，44℃培养22～26h。
4、接种培养
取1环二次增菌液，划线接种显色培养基，37℃培养18～24h，观察记录菌落大小、颜色和形态。以阪崎肠杆菌标准菌株划线接种显色培养基作对照，对比分析检测结果。
5、结果分析
显色平板上呈现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的蓝绿色菌落，菌落颜色和形态与标准菌株相符，说明豆奶样品中存在阪崎肠杆菌。
实施例5：实际样品中阪崎肠杆菌的检测
从全国超市购买318份奶粉样品，按本发明所述的检测方法对阪崎肠杆菌进行检测，检测阳性样本用梅理埃API鉴定试剂条进行验证。
本发明所述的检测法：样本—BP前增菌18h—mLST选择性增菌18h—划线接种本发明所述的显色培养基(HK阪)—直接观察有无蓝绿色菌落。
以API鉴定和测序比对为标准判定最终结果。
与最终结果相比，本发明所述的检测法检出试验的阳性分离率、敏感性、特异性和符合率分别按下列公式进行计算。
阳性分离率＝阳性数/被检总数
真阳性数＝实际检出的阳性数-假阳性数
真阴性数＝实际检出的阴性数-假阴性数
敏感性＝真阳性数/(真阳性数+假阴性数)
特异性＝真阴性数/(真阴性数+假阳性数)
符合率＝(真阳性数+真阴性数)/被检总数
阳性数、假阳性数和真阳性数等小结见表5。
表5 实际样品中阪崎肠杆菌的检测结果
 
方法结果 HK阪 最终结果
阳性数 25份 28份
假阳性 2份 0份
真阳性数 23份 28份
阴性数 293份 290份
假阴性数 3份 0份
真阴性数 290份 290份
阳性率 7.86％ 8.81％
敏感性 88.46％ 100.00％
特异性 99.31％ 100.00％
符合率 98.43％ 100.00％

Claims (4)

1、一种阪崎肠杆菌显色培养基，其特征在于所述培养基的配方为：蛋白胨8～20g、牛肉膏粉4～7g、氯化钠4～7g、胆盐1.0～2.0g、琼脂12～20g、显色底物X-a-glucopyranoside 0.05～0.5g、Na2CO3 0.01～0.04g、柠檬酸铁铵0.3～2.0g、硫代硫酸钠0.3～2.0g。
2、如权利要求1所述的阪崎肠杆菌显色培养基，其特征在于所述培养基的配方为：蛋白胨11g、牛肉膏粉5g、氯化钠5g、胆盐1.5g、琼脂15g、显色底物X-a-glucopyranoside 0.1g、Na2CO30.02g、柠檬酸铁铵1.0g、硫代硫酸钠1.0g。
3、一种阪崎肠杆菌检测试剂盒，其组成为
增菌液A：缓冲蛋白胨水培养基，
增菌液B：改良月桂基硫酸盐胰蛋白月示肉汤，
及如权利要求1或2所述的阪崎肠杆菌显色培养基。
4、一种使用如权利要求3所述的试剂盒检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备显色平板：每1000mL蒸馏水或去离子水中加入29.66～60.54g阪崎肠杆菌显色培养基，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；
(2)一步增菌：将样品置于增菌液A中，混合均匀后37℃培养16-20h；
(3)二步增菌：取一步增菌液1mL加入到9mL增菌液B中，混合均匀后44℃培养22-26h；
(4)接种培养：将二步增菌液接种显色平板上，37℃培养22-26h；
(5)结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1～3mm、边缘整齐的蓝绿色菌落，说明该样品存在阪崎肠杆菌。
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