CN102154161A - 一种乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂及其制备方法和应用。本发明快速增菌剂中的组分有低聚己糖、蛋白胨、胆盐、SDS、丙酮酸钠和水。本发明增菌剂可以代替目前通用的阪崎肠杆菌两步增菌法，达到快速增菌的目的，直接用于进行阪崎肠杆菌的分离鉴定。

Description

一种乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及检验检测技术领域，具体涉及一种乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）自从1929年被报道可引起婴儿败血症到1980年以前，被认为是非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌。1980年，FARMER和他的同事根据其DNA和生理生化特征，将其正式更名为阪崎肠杆菌，归类为肠杆菌属肠杆菌科的一个新种。

近年来，食品安全危象层出不穷，阪崎肠杆菌的致病性使其在乳制品细菌污染事件中最受瞩目。自1961年Uimeny和Franklin首次报道了新生儿脑膜炎之后，随后在全球范围内相继报道了一系列新生儿阪崎肠杆菌感染事件，惠氏婴儿配方奶粉、德国“美宝乐”、美国美赞臣、新西兰恒天然奶粉事件等。阪崎肠杆菌可能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可引起神经系统后遗症和死亡，该菌感染引起的死亡率高达50%以上，2004年FAO/WHO在制定婴幼儿配方奶粉标准时，经过风险评估后，将阪崎肠杆菌与沙门氏菌列为婴幼儿配方奶粉的A类致病菌。

为了有效控制病原的发生和扩散，准确及时的检测手段是预防控制阪崎肠杆菌传播的关键。目前国内国际上检测乳制品阪崎肠杆菌都采用了预增菌、增菌、分离纯化、鉴定4个步骤，这样下来一个样品要4-7天才能出检测结果，耗费了大量的时间，而且需要检测人员准备和清洗、灭菌很多实验器皿，费时又费力。近年来，快速检测方法中的PCR方法、金标试纸法、酶联免疫法和特异性的显色生化鉴定技术等快速检测方法，已被应用到食品安全检测中来，使得阪崎肠杆菌检测技术有了很大的发展，然而使用这些快速检测技术必须经过长达2天的前增菌、增菌培养阶段，操作繁琐、限制了这些技术的推广和应用。因此，研究开发能快速实现阪崎肠杆菌选择性增菌的培养基具有十分重要的意义和应用价值。目前用来预增菌阪崎肠杆菌主要是无菌水和无菌缓冲蛋白胨水，之后再接种到肠道菌增菌肉汤、改良月桂基硫酸盐胰酪蛋白肉汤-万古霉素中进行选择性增菌，用了48小时的时间完成阪崎肠杆菌的选择性增菌，这样才能够实用快速的检测方法。

申请号为200910037189.0的中国专利申请公开了一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法；申请号为201010165329.5的中国专利申请公开了一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，上述两个发明专利申请都是在样品中加入免疫磁珠与样品中的阪崎肠杆菌发生特异性结合以达到富集的目的，进而可以快速检测。两个发明均没有涉及到对样品中阪崎肠杆菌的增菌培养，而当样品中阪崎肠杆菌污染量很少时很容易导致阴性的检测结果。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的阪崎肠杆菌检测中存在的当阪崎肠杆菌污染量很少时难以检测、检测时间长，步骤繁琐等问题，提供一种快速、定向、简便检测阪崎肠杆菌増菌剂。

本发明另一目的在于提供上述增菌剂的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述增菌剂的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂，其组分为低聚己糖、蛋白胨、胆盐、SDS、丙酮酸钠和水。

上述増菌剂中，所述低聚己糖和蛋白胨可以弥补检测样本被稀释后中营养的不足，可以作为阪崎肠杆菌生长需要的碳源、氮源的补充。

胆盐和SDS可以有效抑制杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。

作为一种优选方案，本发明乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂包括如下组分：低聚己糖2~10g，蛋白胨2~8g，胆盐1~5g，SDS0.05~0.5g，丙酮酸钠1~2.5g，水900mL。

更进一步地，上述增菌剂中，所述低聚己糖为低聚葡萄糖、低聚半乳糖或低聚果糖。

更进一步地，上述增菌剂中，所述蛋白胨为胰蛋白胨、酪蛋白胨、植物蛋白胨或多聚蛋白胨。

本发明乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂中，所述乳制品可以是消毒牛乳、酸牛乳、炼乳、乳粉、奶油、奶酪或乳清粉。

本发明乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂的制备方法包括如下步骤：

（1）将低聚己糖、蛋白胨、胆盐、SDS和丙酮酸加入到900mL水中混匀；

（2）灭菌。

作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤（2）中所述灭菌的温度为115℃，灭菌时间为20min。

本发明乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂可在常温下保存1天，使用前应预热至44℃。

本发明乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂可广泛应用于阪崎肠杆菌的分离或鉴定中。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明从微生物生理生化角度出发，利用阪崎肠杆菌的生理生化特征，实现了对阪崎肠杆菌的定向选择增菌，通过结合使用阪崎肠杆菌显色生化快速检测方法，提高了检测效率；

（2）本发明通过阪崎肠杆菌的快速增菌剂对待检样品进行培养，可在4~6h实现阪崎肠杆菌的快速选择性增菌，增菌液可以直接进行分离纯化培养，并进行快速检测或鉴定；

（3）将预增菌和增菌合二为一，将时长2天的预增菌和增菌步骤直接变成4~6h的选择性增菌。本发明所建立的一套系统的阪崎肠杆菌检测方法，可对乳品和乳制品中的阪崎肠杆菌进行准确、即使的检测和鉴定，为微生物可素检测提供了新的途径，并且不需要昂贵的检测仪器和设备，不需要太多的人力成本就可以完成阪崎肠杆菌的检测，有利于向一般的乳品厂和基层的检验单位推行。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1  増菌剂的制备

称取低聚葡萄糖：2g，胰蛋白胨：2g，胆盐：5g，SDS：0.5g，丙酮酸钠2.5g，加入900mL蒸馏水或去离子水，混匀后，115℃灭菌20min，常温可存放1天。使用时预热至44℃。

实施例2  増菌剂制备

称取低聚果糖：10g，酪蛋白胨：8g，胆盐：1g，SDS：0.5g，丙酮酸钠1g，加入900mL蒸馏水或去离子水，混匀后，每100mL分装于一个容量为300mL锥形瓶中， 115℃灭菌20min，常温可存放1天。使用时预热至44℃。

实施例3 

称取低聚半乳糖：2g，植物蛋白胨：2g，胆盐：5g，SDS：0.5g，丙酮酸钠2.5g，加入900mL蒸馏水或去离子水，混匀后，添加100g奶粉样品充分溶解，加入到锥形瓶中，沸水浴20min，冷却恒温至44℃备用。

平行取以上4份增菌液，一瓶作为空白对照，其余瓶分别加入阪崎肠杆菌（ATCC51329）、肠炎沙门氏菌39111、鼠伤寒沙门氏菌50115、铜绿假单胞菌ATCC9027、大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、粪肠球菌ATCC29122、蜡样芽孢杆菌CMCC63303、阴沟肠杆菌和变形杆菌（两个为本实验室分离，经过API鉴定）， 44℃培养液4~6h。各吸取1mL增菌液加入到1mL无菌平皿内，倒入15mL营养琼脂培养基，37℃培养48h±2h，观察并记录平皿中菌落数量。

结果分析：营养琼脂平板对人工污染样品增菌后的检测结果见表1。粪肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌在经过增菌培养后，NA平板上少量生长或无生长，阪崎肠杆菌数量显著增高，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌在经过增菌培养后数量有所增加，但是不形成生长优势。

表1  各种菌经过增菌后在营养琼脂平板上检测结果

实施例4

称取低聚葡萄糖：5g，多聚蛋白胨：4g，胆盐：4g，SDS：0.3g，丙酮酸钠2.0g，加入900mL蒸馏水或去离子水，混匀后，添加100g奶粉样品充分溶解，加入到锥形瓶中，沸水浴20min，冷却恒温至44℃备用。

平行取以上4份增菌液，一瓶作为空白对照，其余瓶分别加入阪崎肠杆菌（ATCC51329）、肠炎沙门氏菌39111、鼠伤寒沙门氏菌50115、铜绿假单胞菌ATCC9027、大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、粪肠球菌ATCC29122、蜡样芽孢杆菌CMCC63303、阴沟肠杆菌和变形杆菌（两个为本实验室分离，经过API鉴定）， 44℃培养液4-6h。各吸取1mL增菌液加入到1mL无菌平皿内，倒入15mL营养琼脂培养基，37℃培养48h±2h。观察并记录平皿中菌落数量。

结果分析：营养琼脂平板对人工污染样品增菌后的检测结果见表2。粪肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌在经过增菌培养后，营养琼脂平板上基本无生长，阪崎肠杆菌数量显著增高，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌在经过增菌培养后有所增加，但是不形成生长优势。

表2  各种菌经过增菌后在营养琼脂平板上检测结果

实施例5 

称取低聚半乳糖：8g，酪蛋白：6g，胆盐：2g，SDS：0.1g，丙酮酸钠1.5g，加入900mL蒸馏水或去离子水，混匀后，添加100g奶粉样品充分溶解，加入到锥形瓶中，沸水浴20min，冷却恒温至44℃备用。

平行取以上4份增菌液，一瓶作为空白对照，其余瓶分别加入阪崎肠杆菌（ATCC51329）、肠炎沙门氏菌39111、鼠伤寒沙门氏菌50115、铜绿假单胞菌ATCC9027、大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、粪肠球菌ATCC29122、蜡样芽孢杆菌CMCC63303、阴沟肠杆菌和变形杆菌（两个为本实验室分离，经过API鉴定）， 44℃培养液4-6h。各吸取1mL增菌液加入到1mL无菌平皿内，倒入15mL营养琼脂培养基，37℃培养48h±2h。观察并记录平皿中菌落数量。

结果分析：营养琼脂平板对人工污染样品增菌后的检测结果见表1。粪肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌在经过增菌培养后，NA平板上少量生长或无生长，阪崎肠杆菌数量显著增高，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌在经过增菌培养后数量有所增加，但是不形成生长优势。

表3  各种菌经过增菌后在营养琼脂平板上检测结果

实施例6

称取低聚果糖：10g，胰蛋白胨：10g，胆盐：1g，SDS：0.05g，丙酮酸钠1g，加入900mL蒸馏水或去离子水，混匀后，每100mL分装于一个容量为300mL锥形瓶中，然后每个瓶中加入100mL液态奶样品，混匀后沸水浴20min，冷却恒温至44℃备用。

三个样品分别加入不同浓度的阪崎肠杆菌标准菌悬液，混匀，44℃培养4~6h。吸取1mL增菌液到灭菌平皿上，倒入15mL 营养琼脂培养基，凝固后37℃培养48h，观察并记录平板上菌落数。然后在每个平皿中挑5个代表菌落进行API菌种鉴定，报告结果。

表4 在液态奶样品中人为接入阪崎肠杆菌的增菌情况

结果分析：四个样品中，一个作为空白对照，灭菌处理后经检测阪崎肠杆菌阴性，其他三个分别接入了十倍梯度阪崎肠杆菌的菌悬液，经过4~6h的增菌培养，用营养琼脂倾注法检测，增菌液中菌量显著提高，而空白仍然无生长。各平板上生长菌落经API检测为阳性，说明阪崎肠杆菌增菌剂可以用于液态奶中微量阪崎肠杆菌的检测中。

Claims (8)

1.一种乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂，其特征在于该増菌剂的组分为低聚己糖、蛋白胨、胆盐、SDS、丙酮酸钠和水。

2.根据权利要求1所述的乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂，其特征在于所述增菌剂包括如下组分：低聚己糖2~10g，蛋白胨2~8g，胆盐1~5g，SDS 0.05~0.5g，丙酮酸钠1~2.5g，水900mL。

3.根据权利要求1所述的乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂，其特征在于所述低聚己糖为低聚葡萄糖、低聚半乳糖或低聚果糖。

4.根据权利要求1所述的乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂，其特征在于所述蛋白胨为胰蛋白胨、酪蛋白胨、植物蛋白胨或多聚蛋白胨。

5.根据权利要求1所述的乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂，其特征在于所述乳制品为消毒牛乳、酸牛乳、炼乳、乳粉、奶油、奶酪或乳清粉。

6.权利要求1~5中任意一条权利要求所述乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将低聚己糖、蛋白胨、胆盐、SDS和丙酮酸加入到900mL水中混匀；

（2）灭菌。

7.根据权利要求6所述乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述灭菌的温度为115℃，灭菌时间为20min。

8.权利要求1~5中任意一条权利要求所述乳制品中阪崎肠杆菌的快速增菌剂在阪崎肠杆菌的分离或鉴定中的应用。