CN104593477B - 一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法，包括如下步骤：A、选择性富集培养与初筛；B、多孔细胞培养板复筛；C、平板培养复筛；D、菌种保存。本发明采用纤维素内切酶检测底物作为筛选指示剂和筛选培养基的唯一碳源，并通过增加培养基的选择压力(包括低营养、低pH、抑菌剂、微量元素等)，实现快速、准确地从各种复杂的样品中分离筛选出产纤维酶的高产菌株的目标；采用了反应灵敏的筛选指示剂和选择性强的筛选培养基，联合多孔培养板的应用，使筛选工作快速、准确，节约了大量人力物力。

Description

一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法
技术领域
本发明属于生物工程及生物资源转化利用领域，涉及一种纤维素分解真菌的筛选方法。具体地讲，本发明涉及一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法。
背景技术
纤维素是自然界贮量最丰富的可再生资源，据估计，通过光合作用，每年可合成纤维素1011～1012吨。将秸秆纤维素降解为可发酵性糖，进一步转化为乙醇、单细胞蛋白及气体燃料等，对解决全球面临的能源危机、食品短缺及环境污染等问题具有重大意义，成为世界关注的热点。
纤维素是由D葡萄糖分子以β-1，4-糖苷键组成的高聚物，其结构稳定，不易降解，目前，纤维素有效转化的难点在于如何高效地将它降解为可发酵性糖，与酸水解法(产糖率低于60％)相比，酶催化水解的产糖率大于90％，其核心之一是优良的纤维素酶工业生产菌株，酶催化水解具有反应条件温和、无副产物和污染少等优势。
纤维素分解真菌广泛存在于土壤、纤维素植物表面、亦可栖息于动物的消化道，特别是反刍动物的瘤胃中。一般自然界在好氧条件下纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用；而在厌氧条件下纤维素的分解，主要是一些厌氧性的细菌起作用。通过从自然界分离筛选出产纤维素分解酶的菌株，并通过生物技术提高其产酶效率，是解决纤维素有效转化利用的重要环节。
大量研究表明，纤维素酶是一种多组分的复合酶系，主要包括3种组分：内切型β-1，4-葡聚糖酶，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切型β-1，4-葡聚糖酶，它作用于纤维素线状分子末端，水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，此酶与滤纸酶(FPase)活性有很好的相关性；纤维二糖酶，这类酶能将纤维二糖和水溶性纤维寡糖水解成葡萄糖分子。
目前常用的产纤维素酶的菌株分离筛选方法大致为：台盼兰法(typanblue)、CMC-天青法(CMC-azure)、凉乙醇沉淀法(precipitationwithchilledethanol)、十六烷基三甲基溴化氨法(hexadecytrimethylammoneumbromide)、Unitex染色法(Unitexdyes)、刚果红法(congored)等，其中，刚果红法是目前比较公认的一种分离方法。刚果红法的原理是：刚果红能与培养基中的纤维素(多糖物质)形成红色复合物，但不与单糖结合，微生物在此培养基上生长，产生的胞外纤维素酶将纤维素降解后，红色复合物解体，通过NaCl溶液冲洗后，在菌落周围形成透明圈，能形成透明圈的菌落为初筛目标菌。将初筛得到的单菌再行纤维素滤纸崩解实验或纤维素酶活性测定后才能确定目标菌。
现有技术存在的缺陷在于：在刚果红初筛平板培养基上真菌的菌落易长满平皿而影响水解圈的观察；平板培养基上细菌快速生长影响目标菌的分离；刚果红能与培养基中的纤维素(多糖物质)形成红色复合物，也能和淀粉形成红色复合物，因此产淀粉酶的菌株也能干扰筛选结果；刚果红初筛得到的菌株需进行滤纸崩解的鉴别实验，该实验是以目测纤维素滤纸的崩解效果，由于纤维素滤纸在液体培养基中会软化、溶胀，振荡后易破碎，因而影响纤维素酶分解效果的判断。
发明内容
本发明的目的是建立一种快速、准确地从各种复杂样品(包括土壤、垃圾、污泥等)中分离筛选纤维素分解真菌的方法。
以解决现有纤维素分解真菌的分离筛选技术中存在的问题，如在刚果红初筛平板培养基上真菌的菌落易长满平皿而影响水解圈的观察；平板培养基上细菌快速生长影响目标真菌的分离；刚果红能与培养基中的纤维素(多糖物质)形成红色复合物，也能和淀粉形成红色复合物，因此产淀粉酶的菌株也能干扰筛选结果；刚果红初筛得到的菌株需进行滤纸崩解的鉴别实验，该实验是以目测纤维素滤纸的崩解，由于纤维素滤纸在液体培养基中会软化、溶胀，振荡后易破碎，因而影响纤维素酶分解效果的判断。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法，包括如下步骤：
A、选择性富集培养与初筛：取样品10g加入至200ml富集筛选培养基中，28℃，150r/min摇瓶培养6～10天，分别吸取样品培养液2ml离心，10000rpm，10min，取500μl用分光光度计检测，测590nm的OD值，选OD值大于0.3的试样为候选含有产纤维素酶菌种的试样，取该试样的菌液作梯度稀释，在PDA平板上分离出单菌落；
B、多孔细胞培养板复筛：将步骤A中分离出的单菌落分别接入多孔细胞培养板的孔中培养，孔中培养基为产酶培养基300μl，28℃，静置培养6天，孔中出现蓝色者为目标菌，将多孔细胞培养板置于离心机中离心，8000rpm，30min，分别吸取各孔上清200μl至另外一个多孔细胞培养板用酶标仪进行检测，测590nm的OD值，选OD值大于1.0的菌株为候选产纤维素酶菌种；
C、平板培养复筛：将步骤B中的候选产纤维素酶菌种在平板复筛培养基上进行划线培养，28℃，静置培养6天，根据菌落显色圈直径与菌落直径的比值大小确定菌种的产酶能力，直径比大于2.2的菌种为最终纤维素酶高产菌株；
D、菌种保存：将步骤C中的最终纤维素酶高产菌株接到PDA平板培养基，28℃静置培养7～14天，观察菌落形态；将步骤C中的最终纤维素酶高产菌株接入YPD液体培养基摇瓶培养，28℃，150r/min，6天，显微镜观察菌体形态一致，将YPD液体培养基摇瓶培养物作甘油保存；即得纤维素分解真菌。
优选地，所述富集筛选培养基的配方为：(NH4)2SO410g/l，KH2PO410g/l，AZCL-HE-cellulose10g/l，MgSO4·7H2O1.2g/l，Tween-801.2g/l，ZnSO4·7H2O0.01g/l，MnSO4·6H2O0.01g/l，CuSO4·7H2O0.01g/l，青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml，pH值为5.0。
优选地，所述产酶培养基的配方为：AZCL-HE-cellulose40g/l，酵母提取物10g/l，MgSO4·7H2O1.2g/l，KNO36g/l，(NH4)2SO43g/l，KCl1.6g/l，KH2PO420g/l，pH值为4.5。
优选地，所述平板复筛培养基的配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖40g/l，AZCL-HE-cellulose1g/l，阿司匹林0.8g/l，琼脂20g/l，pH值为5.0。
本发明采用纤维素内切酶检测底物作为筛选指示剂和筛选培养基的唯一碳源，并通过增加培养基的选择压力(包括低营养、低pH、抑菌剂、微量元素等)，实现快速、准确地从各种复杂的样品中分离筛选出产纤维酶的高产菌株的目标；采用了反应灵敏的筛选指示剂和选择性强的筛选培养基，联合多孔培养板的应用，使筛选工作快速、准确，节约了大量人力物力。
与现有技术相比，本发明的优点在于能快速准确地从各种复杂的样品中分离筛选出产纤维酶的高产菌株：
(1)采用纤维素内切酶检测底物(AZCL-HE-cellulose)，作为筛选指示剂和唯一碳源的液体培养基进行液体摇瓶初筛，该偶联物具水不溶性，在土壤等含复杂微生物组成的样品进行液体摇瓶富集时，样品中的目的菌产生的纤维素酶可将偶联物的葡聚糖底物降解成小分子的寡糖、纤维二糖或葡萄糖，使水不溶的偶合物成为可溶的，溶液变为蓝色，因此可以快速接近锁定目标样本，并且可以同时对多份样品进行初筛；
(2)复筛中采用多孔培养板，孔中加入以染料偶联的葡聚糖底物“AZCL-HE-cellulose”为筛选指示剂的产酶培养基，将目标样本中分离出来的单菌分别接入一个培养孔，孔中液体变蓝者为目标菌株，目测、分光光度计检测或用酶标仪测定孔中液体颜色，从而准确快速地筛选出高产目标菌株；
(3)初筛和复筛中所用的培养基组成可以根据真菌、细菌等不同类型菌的特点增加培养基的选择压力进行调整，以抑制细菌生长而更适合丝状真菌生长，或抑制真菌而有益于细菌生长，从而克服了现在刚果红法中多种菌相互干扰难以分离的缺点。
附图说明
图1是本发明快速分离筛选纤维素分解真菌的方法的技术流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法作进一步的详细说明。
一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法，包括如下步骤：
A、选择性富集培养与初筛：取南昌市京东地区水稻田土壤样品和草垛下土壤样品，德安县水稻田土壤样品和草垛下土壤样品，安义县、宜丰县沤麻池底土壤样品和堆肥下土壤样品各10g，分别加入至装有200ml富集筛选培养基的三角瓶中，28℃，150r/min摇瓶培养6～10天，分别吸取样品培养液2ml离心，10000rpm，10min，取500μl用分光光度计检测，测590nm的OD值，选OD值大于0.3的试样为候选含有产纤维素酶菌种的试样，将选出的样品作梯度稀释后，在PDA平板上分离出单菌落共227个；所述富集筛选培养基的配方为：(NH4)2SO410g/l，KH2PO410g/l，MgSO4·7H2O1.2g/l，Tween-801.2g/l，AZCL-HE-cellulose(MegazymeInternationalIreland,Ltd.)10g/l，ZnSO4·7H2O0.01g/l，MnSO4·6H2O0.01g/l，CuSO4·7H2O0.01g/l，青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml，pH值为5.0。
B、多孔细胞培养板复筛：将步骤A中分离出的单菌落分别接入96孔细胞培养板的孔中培养，孔中培养基为产酶培养基300μl，28℃，静置培养6天，孔中出现蓝色者为目标菌，将96孔细胞培养板置于离心机中离心，8000rpm，30min，分别吸取各孔上清200μl至另外一个96孔细胞培养板用酶标仪进行检测，测590nm的OD值，选OD值大于1.0的菌株29株为候选产纤维素酶菌种；所述产酶培养基的配方为：AZCL-HE-cellulose(MegazymeInternationalIreland,Ltd.)40g/l，MgSO4·7H2O1.2g/l，酵母提取物10g/l，KNO36g/l，(NH4)2SO43g/l，KCl1.6g/l，KH2PO420g/l，pH值为4.5；本步骤中的96孔细胞培养板也可用48孔细胞培养板等多孔细胞培养板替代。
C、平板培养复筛：将步骤B中的候选产纤维素酶菌种在平板复筛培养基上进行划线培养，28℃，静置培养6天，根据菌落显色圈直径与菌落直径的比值大小确定菌种的产酶能力，直径比大于2.2的菌种12株为最终纤维素酶高产菌株；所述平板复筛培养基的配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖40g/l，AZCL-HE-cellulose(MegazymeInternationalIreland,Ltd.)1g/l，阿司匹林0.8g/l，琼脂20g/l，pH值为5.0。
D、产酶特性试验：将步骤C中选出的12株菌分别进行产酶特性试验，摇瓶培养基：cellucose50g，蛋白胨6g，(NH4)2SO45g，MgSO41.2g，CuSO40.1g，ZnSO40.1g，MnSO40.1g，urea4g，KH2PO412g，吐温-801ml，加水至1000ml，pH4.0。液体菌种接入量为10％，28℃，摇转150r/min，摇瓶培养6天，将摇瓶培养液离心10000×g，10min，取上清液即为制好的粗酶液，按QB2583-2003标准测定各自的滤纸酶活力(FPA)和羧甲基纤维素酶活力(CMCA-DNS)，测定结果如下表：
分离菌株 滤纸酶活力(U/ml) 羧甲基纤维素酶活力(U/ml)
JD1 169.7 824.5
JD5 154.9 781.2
JD7 136.7 685.0
JCD3 178.0 924.3
DD1 180.6 964.5
DCD9 160.8 867.8
AM11 197.2 973.8
YM2 199.6 998.0
ADF1 208.1 950.2
ADF8 180.9 821.9
ADF9 201.6 997.6
YDF1 180.0 894.9
D、菌种保存：将目标菌接到PDA平板培养基，28℃静置培养7～14天，观察菌落形态；将目标菌接入YPD液体培养基摇瓶培养，28℃，150r/min，6天，显微镜观察菌体形态一致，将YPD液体培养基摇瓶培养物作甘油保存，即得纤维素分解真菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、选择性富集培养与初筛：取样品10g加入至200ml富集筛选培养基中，28℃，150r/min摇瓶培养6～10天，分别吸取样品培养液2ml离心，10000rpm，10min，取500μl用分光光度计检测，测590nm的OD值，选OD值大于0.3的试样为候选含有产纤维素酶菌种的试样，取该试样的菌液作梯度稀释，在PDA平板上分离出单菌落；所述富集筛选培养基的配方为：(NH4)2SO410g/l，AZCL-HE-cellulose10g/l，KH2PO410g/l，MgSO4·7H2O1.2g/l，Tween-801.2g/l，ZnSO4·7H2O0.01g/l，MnSO4·6H2O0.01g/l，CuSO4·7H2O0.01g/l，青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml，pH值为5.0；
B、多孔细胞培养板复筛：将步骤A中分离出的单菌落分别接入多孔细胞培养板的孔中培养，孔中培养基为产酶培养基300μl，28℃，静置培养6天，孔中出现蓝色者为目标菌，将多孔细胞培养板置于离心机中离心，8000rpm，30min，分别吸取各孔上清200μl至另外一个多孔细胞培养板用酶标仪进行检测，测590nm的OD值，选OD值大于1.0的菌株为候选产纤维素酶菌种；所述产酶培养基的配方为：AZCL-HE-cellulose40g/l，酵母提取物10g/l，MgSO4·7H2O1.2g/l，KNO36g/l，(NH4)2SO43g/l，KCl1.6g/l，KH2PO420g/l，pH值为4.5；
C、平板培养复筛：将步骤B中的候选产纤维素酶菌种在平板复筛培养基上进行划线培养，28℃，静置培养6天，根据菌落显色圈直径与菌落直径的比值大小确定菌种的产酶能力，直径比大于2.2的菌种为最终纤维素酶高产菌株；所述平板复筛培养基的配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖40g/l，AZCL-HE-cellulose1g/l，阿司匹林0.8g/l，琼脂20g/l，pH值为5.0；
D、菌种保存：将步骤C中的最终纤维素酶高产菌株接到PDA平板培养基，28℃静置培养7～14天，观察菌落形态；将步骤C中的最终纤维素酶高产菌株接入YPD液体培养基摇瓶培养，28℃，150r/min，6天，显微镜观察菌体形态一致，将YPD液体培养基摇瓶培养物作甘油保存；即得纤维素分解真菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105315024A (zh) * 2015-08-11 2016-02-10 董玲玲 一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法
CN112375692A (zh) * 2020-11-23 2021-02-19 天津大学 一种筛选具有纤维素酶活性的破囊壶菌的方法
CN114410472A (zh) * 2021-12-27 2022-04-29 乌兰察布职业学院 一种产纤维素酶菌株的筛选方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103602592A (zh) * 2013-10-21 2014-02-26 山东农业大学 一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用
CN104328056A (zh) * 2014-10-29 2015-02-04 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103602592A (zh) * 2013-10-21 2014-02-26 山东农业大学 一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用
CN104328056A (zh) * 2014-10-29 2015-02-04 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Increasing the eficiency of screening Streptomycetes able to produce glucanases by using insoluble chromogenic substrates;GIGI COMAN等;《Roumanian Biotechnological Letters》;20081231;第13卷(第6期);20-25 *
Isolation and characterization of cellulose-decomposing bacteria inhabiting sawdust and coffee residue composts.;Fathallh Eida M等;《Microbes Environ.》;20120222;第27卷(第3期);226-33 *
一株纤维素降解真菌的筛选、鉴定及酶学性质分析;甄静 等;《微生物学通报》;20110520;第38卷(第5期);709-714 *
高效稳定纤维素分解菌群筛选及其分解特性研究;王得武 等;《草业学报》;20140430;第23卷(第2期);253-259 *

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