CN114410472A - 一种产纤维素酶菌株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及菌株的筛选技术领域，尤其涉及一种产纤维素酶菌株的筛选方法，针对当前现有的产纤维素酶菌株的筛选方法仍存在筛选过程较为简单导致筛选结果不够准确的问题，现提出如下方案，其中包括以下步骤：S1：原料准备,S2：准备，S3：梯度稀释,S4：涂布及培养，S5：初步筛选，S6：复筛，S7：测定，本发明的目的是通过初筛和复筛进行多次筛选，提高筛选的准确率，同时对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，提高筛选的可信度。
Description
技术领域
本发明涉及菌株的筛选技术领域，尤其涉及一种产纤维素酶菌株的筛选方法。
背景技术
纤维素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。微生物纤维素酶在转化不溶性纤维素成葡萄糖以及在果蔬汁中破坏细胞壁从而提高果汁得率等方面具有非常重要的意义。产纤维素酶也因此成为一种重要的菌株。
但是目前现有的产纤维素酶菌株的筛选方法仍存在筛选过程较为简单导致筛选结果不够准确的问题，因此，我们提出一种产纤维素酶菌株的筛选方法用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前现有的产纤维素酶菌株的筛选方法仍存在筛选过程较为简单导致筛选结果不够准确等问题，而提出的一种产纤维素酶菌株的筛选方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种产纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
S1：原料准备：采集土壤样本，并对样本进行处理；
S2：准备：按照配方配制CMC培养基，并对需要使用的装置进行处理；
S3：梯度稀释：对土壤溶液进行梯度稀释；
S4：涂布及培养：将稀释液进行涂布并培养，同时记录菌株的形态及特征；
S5：初步筛选：通过培养基的特定反应对菌株进行初步筛选；
S6：复筛：通过培养基的特定反应对菌株进行二次筛选；
S7：测定：对筛选出的菌株的酶的活性进行测定；
优选的，所述S1中，采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40-50g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置；
优选的，所述S2中，按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min，其中所述CMC培养基是将CMC 5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.2-7.6，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min；
优选的，所述S3中，在无菌台上倒置9个CMC培养基备用，另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液中的上清液1mL加入1号试管，同时加无菌水9mL，混匀后吸取1mL混合液加入2号试管，重复上述操作直至进行6次梯度稀释；
优选的，所述S4中，待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106的倍稀释液0.1mL放于CMC培养基上进行稀释涂布，其中每种稀释液涂布三份，将涂布后的培养基置于37℃培养箱中培养24小时并标记菌落并记录各菌落形态、菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理；
优选的，所述S5中，配制200mL刚果红鉴别培养基与三套培养皿一起在121℃环境中灭菌20min，其中刚果红培养基是由(NH4)2S04 2g、MgS04·H20 0.5g、K2HP04 1g、NaCl0.5g、微晶纤维素2g、刚果红0.4g和琼脂20g混合后加水至1000mL，另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用，在无菌操作台上倒置3个鉴别培养基备用，将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，在37℃环境中培养24h，培养完成后挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛；
优选的，所述S6中，进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养2-3天，培养完成后放入4℃冰箱保藏，其中所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO419g、MgSO4 0.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌；
优选的，所述S7中，对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，并与现有同种菌株的酶活性范围进行对比，判断筛选出的菌株的酶活性强弱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过初筛和复筛进行多次筛选，提高筛选的准确率。
2、对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，提高筛选的可信度。
本发明的目的是通过初筛和复筛进行多次筛选，提高筛选的准确率，同时对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，提高筛选的可信度。
附图说明
图1为本发明提出的一种产纤维素酶菌株的筛选方法的流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
参照图1，一种产纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
S1：原料准备：采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置；
S2：准备：按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min，其中所述CMC培养基是将CMC5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.2，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min；
S3：梯度稀释：在无菌台上倒置9个CMC培养基备用，另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液中的上清液1mL加入1号试管，同时加无菌水9mL，混匀后吸取1mL混合液加入2号试管，重复上述操作直至进行6次梯度稀释；
S4：涂布及培养：待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106的倍稀释液0.1mL放于CMC培养基上进行稀释涂布，其中每种稀释液涂布三份，将涂布后的培养基置于37℃培养箱中培养24小时并标记菌落并记录各菌落形态、菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理；
S5：初步筛选：配制200mL刚果红鉴别培养基与三套培养皿一起在121℃环境中灭菌20min，其中刚果红培养基是由(NH4)2S04 2g、MgS04·H20 0.5g、K2HP04 1g、NaCl 0.5g、微晶纤维素2g、刚果红0.4g和琼脂20g混合后加水至1000mL，另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用，在无菌操作台上倒置3个鉴别培养基备用，将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，在37℃环境中培养24h，培养完成后挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛；
S6：复筛：进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养2天，培养完成后放入4℃冰箱保藏，其中所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO4 19g、MgSO40.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌；
S7：测定：对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，并与现有同种菌株的酶活性范围进行对比，判断筛选出的菌株的酶活性强弱。
实施例二
参照图1，一种产纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
S1：原料准备：采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本50g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置；
S2：准备：按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min，其中所述CMC培养基是将CMC5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.6，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min；
S3：梯度稀释：在无菌台上倒置9个CMC培养基备用，另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液中的上清液1mL加入1号试管，同时加无菌水9mL，混匀后吸取1mL混合液加入2号试管，重复上述操作直至进行6次梯度稀释；
S4：涂布及培养：待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106的倍稀释液0.1mL放于CMC培养基上进行稀释涂布，其中每种稀释液涂布三份，将涂布后的培养基置于37℃培养箱中培养24小时并标记菌落并记录各菌落形态、菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理；
S5：初步筛选：配制200mL刚果红鉴别培养基与三套培养皿一起在121℃环境中灭菌20min，其中刚果红培养基是由(NH4)2S04 2g、MgS04·H20 0.5g、K2HP04 1g、NaCl 0.5g、微晶纤维素2g、刚果红0.4g和琼脂20g混合后加水至1000mL，另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用，在无菌操作台上倒置3个鉴别培养基备用，将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，在37℃环境中培养24h，培养完成后挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛；
S6：复筛：进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养3天，培养完成后放入4℃冰箱保藏，其中所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO4 19g、MgSO40.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌；
S7：测定：对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，并与现有同种菌株的酶活性范围进行对比，判断筛选出的菌株的酶活性强弱。
实施例三
参照图1，一种产纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
S1：原料准备：采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本45g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置；
S2：准备：按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min，其中所述CMC培养基是将CMC5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.5，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min；
S3：梯度稀释：在无菌台上倒置9个CMC培养基备用，另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液中的上清液1mL加入1号试管，同时加无菌水9mL，混匀后吸取1mL混合液加入2号试管，重复上述操作直至进行6次梯度稀释；
S4：涂布及培养：待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106的倍稀释液0.1mL放于CMC培养基上进行稀释涂布，其中每种稀释液涂布三份，将涂布后的培养基置于37℃培养箱中培养24小时并标记菌落并记录各菌落形态、菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理；
S5：初步筛选：配制200mL刚果红鉴别培养基与三套培养皿一起在121℃环境中灭菌20min，其中刚果红培养基是由(NH4)2S04 2g、MgS04·H20 0.5g、K2HP04 1g、NaCl 0.5g、微晶纤维素2g、刚果红0.4g和琼脂20g混合后加水至1000mL，另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用，在无菌操作台上倒置3个鉴别培养基备用，将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，在37℃环境中培养24h，培养完成后挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛；
S6：复筛：进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养2天，培养完成后放入4℃冰箱保藏，其中所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO4 19g、MgSO40.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌；
S7：测定：对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，并与现有同种菌株的酶活性范围进行对比，判断筛选出的菌株的酶活性强弱。
实施例四
参照图1，一种产纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
S1：原料准备：采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本48g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置；
S2：准备：按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min，其中所述CMC培养基是将CMC5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.3，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min；
S3：梯度稀释：在无菌台上倒置9个CMC培养基备用，另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液中的上清液1mL加入1号试管，同时加无菌水9mL，混匀后吸取1mL混合液加入2号试管，重复上述操作直至进行6次梯度稀释；
S4：涂布及培养：待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106的倍稀释液0.1mL放于CMC培养基上进行稀释涂布，其中每种稀释液涂布三份，将涂布后的培养基置于37℃培养箱中培养24小时并标记菌落并记录各菌落形态、菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理；
S5：初步筛选：配制200mL刚果红鉴别培养基与三套培养皿一起在121℃环境中灭菌20min，其中刚果红培养基是由(NH4)2S04 2g、MgS04·H20 0.5g、K2HP04 1g、NaCl 0.5g、微晶纤维素2g、刚果红0.4g和琼脂20g混合后加水至1000mL，另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用，在无菌操作台上倒置3个鉴别培养基备用，将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，在37℃环境中培养24h，培养完成后挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛；
S6：复筛：进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养3天，培养完成后放入4℃冰箱保藏，其中所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO4 19g、MgSO40.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌；
S7：测定：对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，并与现有同种菌株的酶活性范围进行对比，判断筛选出的菌株的酶活性强弱。
实施例五
参照图1，一种产纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
S1：原料准备：采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本47g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置；
S2：准备：按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min，其中所述CMC培养基是将CMC5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.4，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min；
S3：梯度稀释：在无菌台上倒置9个CMC培养基备用，另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液中的上清液1mL加入1号试管，同时加无菌水9mL，混匀后吸取1mL混合液加入2号试管，重复上述操作直至进行6次梯度稀释；
S4：涂布及培养：待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106的倍稀释液0.1mL放于CMC培养基上进行稀释涂布，其中每种稀释液涂布三份，将涂布后的培养基置于37℃培养箱中培养24小时并标记菌落并记录各菌落形态、菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理；
S5：初步筛选：配制200mL刚果红鉴别培养基与三套培养皿一起在121℃环境中灭菌20min，其中刚果红培养基是由(NH4)2S04 2g、MgS04·H20 0.5g、K2HP04 1g、NaCl 0.5g、微晶纤维素2g、刚果红0.4g和琼脂20g混合后加水至1000mL，另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用，在无菌操作台上倒置3个鉴别培养基备用，将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，在37℃环境中培养24h，培养完成后挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛；
S6：复筛：进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养2.5天，培养完成后放入4℃冰箱保藏，其中所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO4 19g、MgSO40.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌；
S7：测定：对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，并与现有同种菌株的酶活性范围进行对比，判断筛选出的菌株的酶活性强弱。
对比例一
与实施利一不同之处在于，S1：原料准备：采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本42g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置，其余与实施利一相同。
对比例二
与实施利一不同之处在于，S2：准备：按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min，其中所述CMC培养基是将CMC 5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.6，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min，其余与实施利一相同。
对比例三
与实施利一不同之处在于，S6：复筛：进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养2.5天，培养完成后放入4℃冰箱保藏，其中所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO4 19g、MgSO4 0.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌，其余与实施利一相同。
实验例
将实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五中一种产纤维素酶菌株的筛选方法进行试验，得出结果如下：
实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五制得的产纤维素酶菌株的筛选方法对比现有方法筛选准确率有了显著提高，且实施例一为最佳实施例。
检测报告
本发明的目的是为了解决目前现有的产纤维素酶菌株的筛选方法仍存在筛选过程较为简单导致筛选结果不够准确等问题，而提出的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，本发明的实施例提供一种产纤维素酶菌株的筛选方法，通过初筛和复筛进行多次筛选，提高筛选的准确率，同时对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，提高筛选的可信度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种产纤维素酶菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：原料准备：采集土壤样本，并对样本进行处理；
S2：准备：按照配方配制CMC培养基，并对需要使用的装置进行处理；
S3：梯度稀释：对土壤溶液进行梯度稀释；
S4：涂布及培养：将稀释液进行涂布并培养，同时记录菌株的形态及特征；
S5：初步筛选：通过培养基的特定反应对菌株进行初步筛选；
S6：复筛：通过培养基的特定反应对菌株进行二次筛选；
S7：测定：对筛选出的菌株的酶的活性进行测定。
2.根据权利要求1所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，其特征在于，所述S1中，采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40-50g,用研钵研成粉末后称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，并加入99mL无菌水摇匀静置。
3.根据权利要求1所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述S2中，按照配方配制200mLCMC培养基，并选取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管塞上棉塞并用报纸、棉线包扎成一捆，同时取12套培养皿码齐包扎，并将1只1000mL的锥形瓶各入无菌水1000mL，加棉塞后与CMC培养基一起灭菌20min。
4.根据权利要求3所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述CMC培养基是将CMC5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O 0.005g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g混合于1000mL锥形瓶中，并加蒸馏水至500mL，调节pH为7.2-7.6，调节后加棉塞在121℃环境中灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述S3中，在无菌台上倒置9个CMC培养基备用，另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液中的上清液1mL加入1号试管，同时加无菌水9mL，混匀后吸取1mL混合液加入2号试管，重复上述操作直至进行6次梯度稀释。
6.根据权利要求1所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述S4中，待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106的倍稀释液0.1mL放于CMC培养基上进行稀释涂布，其中每种稀释液涂布三份，将涂布后的培养基置于37℃培养箱中培养24小时并标记菌落并记录各菌落形态、菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理。
7.根据权利要求1所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述S5中，配制200mL刚果红鉴别培养基与三套培养皿一起在121℃环境中灭菌20min，其中刚果红培养基是由(NH4)2S042g、MgS04·H200.5g、K2HP04 1g、NaCl 0.5g、微晶纤维素2g、刚果红0.4g和琼脂20g混合后加水至1000mL，另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用，在无菌操作台上倒置3个鉴别培养基备用，将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，在37℃环境中培养24h，培养完成后挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。
8.根据权利要求1所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述S6中，进行复筛时，配制500mL基础发酵培养基分装到5只250mL的锥形瓶中，并在121℃环境中采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，其中灭菌时间为20min，将初筛得到的菌株用接种环接种在纤维素培养基上，在37℃、150r/min下培养2-3天，培养完成后放入4℃冰箱保藏。
9.根据权利要求6所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述基础发酵培养基是由羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、KH2PO419g、MgSO4 0.29g、氯化钠10g、水1000mL值得，将pH调至7，在121℃环境中灭菌20min，所述纤维素培养基是由硫酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.5g、纤维素粉20.0g、刚果红0.2g、琼脂20.0g,pH调至7.1，在25℃条件下灭菌。
10.根据权利要求1所述的一种产纤维素酶菌株的筛选方法，其特征在于，所述S7中，对筛选出的菌株的酶的活性进行测定，并与现有同种菌株的酶活性范围进行对比，判断筛选出的菌株的酶活性强弱。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114774324A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-07-22 | 安徽农业大学 | 一种益生菌的优化分离方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20220429 |