CN112522135A

CN112522135A - 一种餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法

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Publication number: CN112522135A
Application number: CN202011300608.8A
Authority: CN
Inventors: 刘江涛; 肖通奋
Original assignee: Zhejiang Yan Hang Intelligent Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Yan Hang Intelligent Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-03-19

Abstract

本发明公开了一种餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：S1：进行固体基质预处理；S2：从餐厨垃圾样品中提取出可以分解餐厨垃圾的多种分解菌，并将该多种分解菌培养好；S3：将经过预处理的固体基质与经过S2步骤培养好的多种分解菌进行混合并进一步培养风干，风干后的产物即为固态的复合微生物菌剂。本发明将餐厨垃圾集中收运后，放入制备好的复合微生物菌剂，使餐厨垃圾充分发酵分解，最终制成堆肥。本发明所制成的复合微生物菌剂，使得各降解菌分解能力最优，能够最快诱发餐厨垃圾的堆肥，综合考虑土著微生物种群和外源菌种在堆肥中的作用，减少了菌种的适应时间，缩短堆肥周期。

Description

一种餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法

技术领域

本发明属于用餐厨或厨余垃圾制成堆肥的环保化工技术领域，具体涉及一种餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法。

背景技术

餐厨垃圾废物是一种典型的固液混合废弃物，具有含水率高，脱水性差，在高温下极易腐烂，进而滋长病菌及蚊蝇，所以对其进行有效及时地处理能够极大程度上缓解环境污染尤其是城市环境污染，改善人们的生活环境。餐厨垃圾废物中含有淀粉及纤维素等丰富营养的有机物质，具有较强的生物可降解性，鉴于此，利用生物法处理餐厨垃圾己经逐渐成为资源化处理餐厨垃圾的主要发展方向之一。

目前，对于如何成功的利用餐厨厨余垃圾资源作为日常的能源，如使餐厨垃圾成为堆肥使用等，己经是世界各国纷纷关注的研究热点，该领域也是我国在城市化进程中餐厨垃圾增量日趋增加的情况下嗜待解决的问题之一。而餐厨垃圾要想资源化利用后制成堆肥，其中用于发酵降解的复合微生物菌剂至关重要，复合微生物菌剂研究现状，目前主要存在以下问题:

(1)餐厨垃圾成分复杂，主要包括蛋白质、淀粉、油脂及纤维素等，涉及的降解菌种类较多。其次，餐厨垃圾含水率和含盐居高，影响微生物降解菌的生长。

(2)目前餐厨垃圾堆肥所用的复合微生物菌剂在分解速率、垃圾减量化、堆肥周期、腐熟程度、含水率等方面不能很好的兼顾，因此，均衡各个指标的复合微生物菌剂是迫切需要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，用该方法制成的复合微生物菌剂，可以作用于餐厨垃圾使餐厨垃圾降解发酵成为堆肥使用，从而使资源得到了合理化应用，也解决了餐厨垃圾不能及时处理所带来的种种环境问题。

本发明的技术方案为：

一种餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

S1：进行固体基质预处理；

S2：从餐厨垃圾样品中提取出可以分解餐厨垃圾的多种分解菌，并将该多种分解菌培养好；

S3：将经过预处理的固体基质与经过S2步骤培养好的多种分解菌进行混合并进一步培养，风干，风干后的产物即为固态复合微生物菌剂，将固态复合微生物菌剂添加进需要处理的餐厨垃圾中即可有效降解分解餐厨垃圾，从而使餐厨垃圾尽快变成堆肥使用。

本发明的固态复合微生物菌剂的制备方法是基于如下的原理：

好氧堆肥的基本反应过程如公式一所示:

有氧条件下，堆肥物料中的可溶性有机物透过微生物的细胞壁和细胞膜被微生物吸收；固体和胶体有机物质先附着在微生物体外，由微生物分泌的胞外酶将其分解为可溶性物质，再渗入细胞。

微生物通过自身的代谢活动，使一部分有机物质被氧化成简单的无机物，并释放能量，使另一部分有机物用于合成微生物自身的细胞物质，提供微生物各种生理活动斤需的能量，使机体能进行正常的生长繁殖。

好氧堆肥反应过程如下表1所示。

表1

一般情况下，堆肥的过程可以分为两个主要阶段：生物氧化阶段和腐熟阶段固定化阶段。生物氧化阶段通过三个步骤发生：(1)初始温度阶段持续1-3天，其中嗜温细菌和真菌降解结构简单的化合物，如糖、氨基酸、蛋白质等，从而使得堆肥温度迅速上升；(2)高温阶段由嗜热微生物降解脂肪、纤维素、半纤维素和一些木质素，在此阶段最大限度的降解有机物并杀死病原菌；(3)腐熟降温阶段，温度的下降是由于可利用的有机物质的减少，导致微生物活动减弱，堆肥的质量可以通过检测能被嗜热微生物降解的残余的糖、纤维素和半纤维素的含量来判断，在腐熟降温阶段和有机物腐殖化发生过程中，产生了含有腐殖质的成熟堆肥。

微生物是参与堆肥化过程的主体，堆肥中微生物主要来源于两方面。一是固体废弃物中的土著微生物种群，例如城市垃圾中细菌数量达到10¹⁴-10¹⁶个/kg；二是人为加入的外源菌种，这些菌种是针对堆肥中某些物质进行分解的，其活性强、繁殖速度快、分解彻底等特点，加速了堆肥进程，缩短了堆肥时间。

堆肥过程中起主导作用的微生物有细菌、真菌、放线菌以及部分原生动物等。堆肥化各时期的微生物种群和数量是变化的，细菌的数量在各阶段都是数量最多、最普遍、最主要的。

添加外源微生物菌剂不仅加快堆肥进度，还能显著减少恶臭气体的产生，同时微生物菌剂使高温期提前到来，且能延长高温期的持续时间，高温期时间的延长对杀死堆体中的有害菌及寄生虫卵，改善卫生状况有益。添加微生物菌剂，在堆肥中调控N的代谢，不但减少有刺激性气味的氨气产生，还能为堆肥产品中保留更多的N素，提高肥效。对堆肥材料中残留的有机污染物进行一定程度的降解，如一些农药、焦油等。

本发明基于上述原理，餐厨垃圾被集中收运后用容器盛装，再在容器内放入制备好的复合微生物菌剂，使餐厨垃圾充分发酵分解，最终制成堆肥。

进一步地，在所述S1步骤中，进行固体基质预处理的方法为：

将细鼓皮、细锯末用蒸馏水清洗后进行高压灭菌，细鼓皮与细锯末的配置比例为1:1，灭菌条件为121℃，灭菌30分钟，灭菌后太阳下晾晒，并利用灭菌灯继续灭菌，晾晒干燥后收集并碾碎成细粉末。

进一步地，在所述S2步骤中制备多种分解菌并将多种分解菌培养好的方法包括如下步骤：

S2-1：制备初筛培养基和复筛培养基；

S2-2：取餐厨垃圾的混合液稀释制备成不同浓度样品；

S2-3：将不同浓度样品滴在初筛培养基上进行培养，进而培养出多种菌株；

S2-4：将S2-3培养的多种菌株进行分离纯化，分离纯化后得到各品种纯菌株；

S2-5：将S2-4培养出的各品种纯菌株进行初步筛选，筛选出可以将餐厨垃圾物料进行分解的多种分解菌；

S2-6：将S2-5中筛选的多种分解菌的菌株接种到提前制备好的复筛培养基上培养，对分解菌的菌株进行进一步的复筛，以确定出所筛选出的多种分解菌的分解率；

S2-7：将复筛选出的多种分解菌进行拮抗实验；

S2-8：将通过S2-7拮抗实验的多种分解菌通过液态发酵手段进一步地培养。

进一步地，在所述S2-2步骤中，制备不同浓度样品的方法为：

将收集到的餐厨垃圾混合均匀后，取餐厨垃圾加入提前准备好的装有无菌水及若干已灭菌的玻璃珠的第一容器中，餐厨垃圾与无菌水比例为：1g：99ml，摇匀20分钟，使混合液分散充分，此时稀释液为10^-1；重复此法，配置一系列浓度的稀释液，依次浓度稀释至10^-8。

进一步地，在所述S2-3步骤中，培养出多种菌株的方法为：

选取S2-2步骤中制备的不同浓度样品的稀释液，每个浓度均滴加在初筛培养基上涂布均匀，每个浓度做3-5个对照，10分钟后放入恒温培养箱中，37℃倒置培养24小时，即可得到多种菌株。

进一步地，在所述S2-4步骤中，通过分离纯化方法得到各品种的纯的菌株的方法为：

挑选不同的菌株划线纯化，得到纯的培养物后用斜面保存。

进一步地，在所述S2-5步骤中，初步筛选出多种分解菌的方法为：

根据不同分解菌株分解相应菌落后菌落周围的不同状态，将分离纯化后得到的不同分解菌株滴在相应的初筛培养基上，倒置培养24h后，测定被分解的相应菌落辐射的直径D值及所得菌落的直径d值，每种分解菌重复多个作为对照，。

以下以淀粉分解菌、蛋白质分解菌、油脂分解菌和纤维素分解菌为例进行初筛方法说明。

(1)淀粉分解菌的初筛方法

淀粉分解菌可以分泌淀粉酶，淀粉酶可将淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖。淀粉遇碘显蓝色，而麦芽糖和葡萄糖遇碘不显色，所以在斜面的平板上滴加卢卡氏碘液，纯培养物的菌落附近会出现无色的透明圈。以D/d之比作为标准以判断产淀粉酶菌对淀粉的分解能力的强弱，直接反映了淀粉酶浓度的相对值，其中D是透明圈的直径、d是所得菌落的直径。

将分离纯化得到的菌株点接在初筛培养基上，倒置培养24h后，滴加卢卡氏碘液，用游标卡尺测定D及d值，每个菌重复3个作为对照。

(2)蛋白质分解菌的初筛方法

蛋白质分解菌能分泌蛋白酶，将蛋白质分解为多肤及氨基酸等，使菌落周围出现透明圈。以D/d之比作为标准以判断产蛋白酶菌对蛋白质的分解能力的强弱，直接反映了蛋白酶浓度的相对值，其中D是透明圈的直径、d是菌落的直径。

将分离纯化得到的菌株点接在初筛培养基上，倒置培养24h后，用游标卡尺测定D及d 值，每个菌重复3个作为对照。

(3)油脂分解菌的初筛方法

油脂分解菌能分泌脂肪酶，将脂肪分解为甘油和脂肪酸等小分子，使菌落周围出现被分解后朦胧的晕圈。以D/d之比作为标准以判断产脂肪酶菌对油脂的分解能力的强弱，直接反映了脂肪酶浓度的相对值；其中D是晕圈的直径、d是菌落的直径。

(4)纤维素分解菌的初筛方法

纤维素酶是一种复合酶，纤维素分解菌能够分泌多种纤维素酶，在其作用下，可将纤维素分解为低聚糖、纤维二糖及葡萄糖等小分子物质。水解产物与刚果红染液不显色，而纤维素与刚果红结合呈现红色，因此在纤维素刚果红培养基上，菌落附近会出现水解圈。以D/d 之比作为标准以判断产纤维素酶菌对纤维素的分解能力的强弱，直接反映了纤维素酶浓度的相对值，其中D是水解圈的直径、d是菌落的直径。

进一步地，在S2-6步骤中对分解菌的菌株进行进一步的复筛，以确定出所筛选出的多种分解菌的分解率；以下以淀粉分解菌、蛋白质分解菌、油脂分解菌和纤维素分解菌为例进行复筛具体方法的说明。

1)淀粉分解菌的复筛方法

将初筛得到菌株接种到复筛培养基上，放入40℃培养箱中，72h后再烘干，测定干重变化。筛选时，以初筛菌株对淀粉分解的分解率作为判断是否选入复合微生物菌剂的依据。

计算公式：

分解率＝(m1-m2)/m1*100％

m1：初始底物干重，m2：处理后的干重(单位：g)

2)蛋白质分解菌的复筛方法

将初筛得到菌株接种到以干酪素为唯一氮源的复筛培养基上，将其置于200r/min的摇床中，40℃培养。24小时后测定酪蛋白的分解率。筛选时，以初筛菌株对酪蛋白分解的分解率作为判断是否入选复合微生物菌剂的依据。

计算公式：

分解率＝(C1-C2)/C1 x 100％

C1：初始时酪蛋白的浓度，C2：处理后酪蛋白的浓度(单位：g/L)

附：复筛培养基中蛋白质含量的测定

1mL培养液+5mL福林一酚试剂(甲液)，摇匀，25℃静置10分钟,、一再加入0.5mL(乙液)，加入后立即摇匀，置于25℃环境中静放30min,测定OD500值，再对照标准曲线，从中查找蛋白质含量。

标准曲线：以酪蛋白浓度为横轴，吸光度为纵轴，用质量分数为福林一酚试剂0.05mg/mL NaOH溶液为溶剂，酪蛋白为溶质，配制成一系列梯度的溶液，测定OD₅₀₀值。

标准曲线的绘制：以0.05mg/ml NaOH溶液为溶剂，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/m1共5个浓度。测定OD₅₀₀值，以酪蛋白为溶剂，配制以酪蛋白浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

福林一酚试剂的制备：

甲液：吸取试剂A100m1，试剂A是由0.2mo1/L NaOH溶液与4％无水碳酸钠等体积混合，加入试剂B 2m1混合而成，试剂B是由2％酒石酸甲钠与1％CuS0₄-5H₂O溶液等体积混合。

乙液：吸取5ml苯酚试剂加入5ml蒸馏水稀释而成。

3)油脂分解菌的复筛方法

将初筛得到菌株接种到复筛培养基上，唯一碳源是豆油，放入200r/min的摇床培养箱中， 40℃培养。48小时后测定含油脂含量的变化情况。筛选时，判断是否选入复合微生物菌剂的依据为：初筛菌株对豆油分解的分解率。

计算公式：

分解率＝(C1-C2)/C1 x 100％

C1：初始时豆油的浓度，C2：为处理后豆油的浓度(单位：g/L)

附：复筛培养基中油脂含量的测定

培养基加入到250分液漏斗中，加入1mL浓盐酸，加入2gNaCl，用5mL石油醚清洗摇瓶2次，之后均移入分液漏斗中。充分震荡3min，待静置分层后，水层回收到摇瓶中，石油醚则移入烧杯中。重复萃取步骤一到两次。向回收的石油醚中加入适量的NaSO₄搅拌，使其充分脱水。然后定容至25mL，紫外分光光度计工作波长设定为225nm，测定吸光度后，从标准曲线中查找对应的油脂含量。

标准曲线：以豆油浓度为横轴，吸光度为纵轴，以石油醚为溶剂，豆油为溶质，配制成一系列梯度的溶液，选择225nm波长为工作波长，测出吸光度。

标准曲线的绘制：以石油醚为溶剂，以豆油为溶质，配制0.1，0.2，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0mg/ml 7个浓度的溶液。选择225nm波长作为紫外分光光度计工作波长，测出吸光度，以豆油浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

4)纤维素分解菌的复筛方法

将初筛得到菌株接种到复筛培养基上，唯一碳源是滤纸片，放入200r/min的摇床中，40℃培养。72小时后测定滤纸片干重的变化。筛选时，判断是否选入复合微生物菌剂的依据为：初筛菌株对滤纸片分解的分解率。

计算公式：

分解率＝(m1-m2)/m1*100％

m1：初始时滤纸片的质量，m2：处理后滤纸片的质量(单位：g)

微生物生长曲线的测定：

Ⅰ、细菌及无菌丝真菌生长曲线的测定：采用分光光度法。每隔2小时620nm处测定细菌培养菌液的OD值，在560nm处测定无菌丝真菌培养菌液OD值。以时间为横坐标，微生物OD值为纵坐标，进行细菌和无菌丝真菌的生长曲线测定。

Ⅱ、放线菌及霉菌的生长曲线测定：采用抽滤后称干重的方法。每隔12小时测定1次菌体干重，称量时先将滤纸烘干，称重，菌体分别放在称重过的滤纸上抽滤，菌体连同滤纸一起烘干后再称重，取差值得到菌体干重，以时间为横坐标，以菌体干重为纵坐标，绘制各菌株内生长曲线。

接种最佳时间点：生长曲线进行绘制，找出活性转移点，确定对数生长期进行到75％～80％时进程时刻点。例如，真菌菌种的对数生长期为4～16小时，则真菌的对数生长期75％～80％的时间点是13.5小时，即4+(16-4)×0.8＝13.5小时，此时刻对应的OD值为0.367。

进一步地，在所述S2-7步骤中，进行拮抗实验的方法为：

以划线的方式，将复筛选出的分解菌的菌株接种到平板上，培养一定时间待菌株特性稳定后，以十字交叉的方式，将复筛选出的几种分解菌的菌株接种在同一培养基上，培养一定时间后观察生长结果。

进一步地，在所述S2-8步骤中，将通过S2-7拮抗实验的多种分解菌进一步培养的示例方法为：

从提前保存的甘油管中将纯菌株的菌液接入到灭菌后的LB试管培养基中，以吸取100μL 纯菌株的菌液为例，从提前保存的甘油管中将纯菌株的菌液接入4mL灭菌后的LB试管培养基中，40-60℃摇床或摇瓶中过夜培养；从LB试管培养基中以1％的接种量将活化好的菌种接入含有100mL的LB试管培养基的摇床或摇瓶中；40-60℃温度连续培养24小时。通过同样的液体发酵手段，分别培养各种微生物菌种，将最终培养好的菌液保存在4℃冰箱。

进一步地，在所述S3步骤中，进一步培养及风干进而得到固态复合微生物菌剂的方法为：

本发明所述的餐厨垃圾在不同温度阶段存在并生长着不同的菌种分别称为低温菌、中温菌和高温菌；配制经过S2-8处理的多种分解菌的菌液若干升，以2L为例，经计算，生长在中温环境中的中温菌的菌液总体积与生长在高温环境中的高温菌的菌液的总体积比为11.5:1，即中温菌菌液的总体积为1840mL，中温菌菌液总体为160mL；

以1Kg细鼓皮和1Kg细锯末为例，将S9中炮制的细鼓皮与细锯末混合均匀，同样以11.5:1 的比例将该粉末基质分为两部分，一部分为1840g，标记为G1，另一部分为160g，标记为 G2；

将所有中温菌菌液共1840mL加入到G1固体粉末基质当中，添蒸馏水，使菌液与固体粉末基质混合物的含水率达到60％左右，并加入465g葡萄糖作为发酵引物，搅拌均匀；将高温菌菌液共160mL加入到G2固体粉末基质中，添蒸馏水，使菌液与固体粉末基质混合物的含水率达到55％～60％，并加入40g葡萄糖作为发酵引物，搅拌均匀；将两部分发酵体G1,G2分别堆叠放置，堆置高度不宜过高也不易过低，中温菌处理组堆制高度8cm，高温菌处理组堆制高度2cm；分别将两组固体粉末基质与菌液的混合发酵体G1和G2放入不同培养箱中培养；G1中温菌组的培养温度设置为40℃，G2高温菌组的培养温度设置为65℃；培养过程中每隔2小时对G1和G2分别进行翻搅使堆温上升；培养1天后取出，将G1放入设定温度为 40℃的循环通风烘箱中风干，将G2放入设定温度为65℃的循环通风烘箱中风干；将彻底风干后的G1和G2混合体在常温下混合搅拌；复合微生物固体菌剂即可制作完成。

本发明所制成的复合微生物菌剂，较好地解决了背景描述中所存在的问题，本发明的复合微生物菌剂，综合考虑了堆肥温度、堆肥周期、分解速率、垃圾减量化、含水率等要求，使得各降解菌分解能力最优，能够最快诱发餐厨垃圾的堆肥，本发明的复合微生物菌剂，综合考虑土著微生物种群和外源菌种在堆肥中的作用，减少了菌种的适应时间，缩短堆肥周期。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)复合微生物菌剂固态发酵剂型的开发，各降解菌充分配比从而达到降解分解能力最优，固态发酵剂型也有利菌种保藏与运输，最快诱发餐厨垃圾的堆肥。

(2)按照该方法制备的复合微生物菌剂固态发酵剂，综合考虑土著微生物种群和外源菌种在堆肥中的作用，减少菌种的适应时间，缩短堆肥周期。

(3)复合微生物菌剂微生物数量根据堆肥中采集数目的自然比例扩大培养，有利于菌种对环境的充分适应。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

本发明在制备复合微生物菌剂之前，需预先制备各类型培养基，如下所述的斜面培养基、分离筛选培养基、中温微生物菌剂、高温微生物菌剂等。

培养基制备

1、斜面培养基的制备

1-A、细菌保存用：

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠(NaCI)15.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。

1-B、纤维素分解菌保存用：

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20.0g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)2.5g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.5g，蛋白胨2.5g，酵母膏0.5g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。

2、分离筛选培养基

2-A、产淀粉酶菌株

2-A-1、初筛培养基：

可溶性淀粉20.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠(NaCI)5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。

2-A-2、复筛培养基：

氯化钠(NaCI)10.0g，蛋白胨10.0g，米饭(打成糊状)500.0g，土豆去皮打成泥状500.0g，使用时，取培养基30g+70g水混合均匀。

2-B、产蛋白酶菌株

2-B-1、初筛培养基：

干酪素4.0g，氯化锌(ZnCla)0.14g，氯化钠(NaCI)0.16g，氯化钙(CaC1₂)0.002g，七水合硫酸镁(MgS0₄-7H₂O)0.5g，硫酸亚铁(FeSO₄)0.002g，七水合磷酸氢二钠(Na₂HP0₄.7H₂0)1.07g，酪素水解液O.O5g，磷酸二氢钾(KH₂P0₄)0.36g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH6.5-7.0。

2-B-2、复筛培养基：

初筛培养基配方去除琼脂。

2-C、产脂肪酶菌株

2-C-1、初筛培养基：

氯化钠(NaCI)5.0g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.3g，七水合硫酸镁(MgSO₄-7H₂O)0.lg，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.5g，硫酸氨((NH4)₂SO₄)1.0g，豆油5.0mL，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。

2-C-2、复筛培养基：

蛋白胨1.0g，硝酸氨(NH₄NO₄)0.2g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.5g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g，七水合硫酸镁(MgSO₄-7H₂O)0.lg，豆油3.0mL，pH7.2-7.4。

2-D、产纤维素酶菌株

2-D-1、富集培养基：

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20.0g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)2.5g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g，蛋白胨2.5g，酵母膏0.5g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。

2-D-2、初筛培养基：

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g，七水合硫酸镁(MgSO₄-7H₂0)0.25g，琼脂20.0g，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2.0g，刚果红染料0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

2-D-3、复筛培养基：

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.0g，七水合硫酸镁(MgSO₄-7H₂0)0.3g，氯化钠(NaCI)0.lg，氯化铁(FeCl₃)0.01g，硝酸钠(NaNO₃)2.5g，滤纸碎片30.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。

3、中温微生物菌剂的制备：

枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌∶酿酒酵母∶乳酸乳球菌∶黑曲霉∶假单胞菌∶植物乳杆菌∶光合细菌∶链霉菌∶解钾菌∶固氮菌的集落数目比1.2∶1∶2.5∶1.4∶0.8∶0.4∶0.3∶ 1.1∶1.2∶0.2∶0.5。

4、高温微生物菌剂的制备：

枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌∶绿色木霉∶高温放线菌∶康宁木霉∶嗜热脂肪芽孢杆菌的集落数目比0.8∶0.71∶1.5∶3.4∶2.1∶0.9。

各类型培养基预制完成后，进入到制备复合微生物菌剂的过程中，本实施例按照从A到 F的步骤进行制备；依次包括如下步骤：A对菌株进行分离→B对菌株进行初筛→C对菌株进行复筛→D对复筛后的菌株进行拮抗作用验证→E对菌株进行微生物生长曲线的测定→F固态菌剂制备。

A、菌株的分离

A-1：制备样品稀释液

将收集的餐厨垃圾混合均匀后，取lg，加入三角锥形瓶中，内装有90mL无菌水及若干已灭菌玻璃珠，摇匀20min，使分散充分。静置20-30s，此时稀释液为10^-1。再用移液器吸取1mL菌液注入试管中，与无菌水总体积为10mL，充分摇匀，此时稀释液为10^-2重复此法，配置一系列浓度的稀释，依次梯度稀释至10^-8。

A-2：涂布培养

选取10^-5，10^-6，10^-7，10^-8的稀释液，每个梯度均滴加在各种初筛培养基上，并用已灭菌的涂布棒涂布均匀，每个梯度做3-5个对照，10分钟后放入恒温培养箱中，37℃倒置培养 24小时。

根据每种微生物的生长适宜温度和菌落数量关系，如下表2所示，计算各种微生物之间的数量比例。

由于生长温度不同，微生物群落比例的确定需要分而计之。

表2

各类中温微生物在不同温度下的菌落总数/cfu·g^-1

Total Communities of Medium temperature under different temperatureconditions/cfu·g^-1

根据表得知，总体的微生物活性在40℃达到2.29E+06cfu/g-1，45℃达到2.30E+06cfu /g-1。但相差不大，且45℃的细菌总量有所下降，且40℃更接近起始堆肥温度。所以综合考虑，取40℃的中温微生物菌落数量比例作为接种菌落数量比例进行，高温阶段采用同样方法，在此不再赘述。

A-3：分离纯化

挑选不同的菌株划线纯化，得到纯培养物后，编号并用斜面保存。

B、进行初筛

初筛的方法按照菌种类别依次包括如下不同步骤：

B-1、淀粉分解菌的初筛方法

淀粉分解菌可以分泌淀粉酶，淀粉酶可将淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖。淀粉遇碘显蓝色，而麦芽糖和葡萄糖遇碘不显色，所以在平板上滴加卢卡氏碘液，菌落附近会出现无色的透明圈。以D/d之比作为标准以判断产淀粉酶菌对淀粉的分解能力的强弱，直接反映了淀粉酶浓度的相对值，其中D是透明圈的直径，d是所得菌落的直径。

将分离纯化得到的菌株点接在初筛培养基上，倒置培养24小时后，滴加卢卡氏碘液，用游标卡尺测定D及d值，每个菌重复3个作为对照。

B-2、蛋白质分解菌的初筛方法

蛋白质分解菌能分泌蛋白酶，将蛋白质分解为多肤及氨基酸等，使菌落周围出现透明圈。以D/d之比作为标准以判断产蛋白酶菌对蛋白质的分解能力的强弱，直接反映了蛋白酶浓度的相对值，其中D是透明圈的直径，d是菌落的直径。

将分离纯化得到的菌株点接在初筛培养基上，倒置培养24小时后，用游标卡尺测定D及 d值，每个菌重复3个作为对照。

B-3、油脂分解菌的初筛方法

油脂分解菌能分泌脂肪酶，将脂肪分解为甘油和脂肪酸等小分子，使菌落周围出现被分解后朦胧的晕圈。以D/d之比作为标准以判断产脂肪酶菌对油脂的分解能力的强弱，直接反映了脂肪酶浓度的相对值，其中D是晕圈的直径，d是菌落直径。

B-4、纤维素分解菌的初筛方法

纤维素酶是一种复合酶，纤维素分解菌能够分泌多种纤维素酶，在其作用下，可将纤维素分解为低聚糖、纤维二糖及葡萄糖等小分子物质。水解产物与刚果红染液不显色，而纤维素与刚果红结合呈现红色，因此在纤维素刚果红培养基上，菌落附近会出现水解圈。以D/d 之比作为标准以判断产纤维素酶菌对纤维素的分解能力的强弱，直接反映了纤维素酶浓度的相对值，其中D是水解圈的直径，d是菌落直径。

C、进行复筛

复筛的方法按照菌种类别依次包括如下不同步骤：

C-1、淀粉分解菌的复筛方法

将初筛得到菌株接种到复筛培养基上，放入40℃培养箱中，72小时后再烘干，测定干重变化。筛选时，以初筛菌株对淀粉分解的分解率作为判断是否选入复合微生物菌剂的依据。

计算公式：

分解率＝(m1-m2)/m1*100％

m1：初始底物干重，m2：处理后的干重(单位：g)

C-2、蛋白质分解菌的复筛方法

将初筛得到菌株接种到以干酪素为唯一氮源的复筛培养基上，将其置于200r/min的摇床中，40℃培养。24h后测定酪蛋白的分解率。筛选时，以初筛菌株对酪蛋白分解的分解率作为判断是否入选复合微生物菌剂的依据。

计算公式：

分解率＝(C1-C2)/C1 x 100％

C1：初始时酪蛋白的浓度，

C2：处理后酪蛋白的浓度(单位：g/L)

附复筛培养基中蛋白质含量的测定的步骤如下：

1mL培养液+5mL福林一酚试剂(甲液)，摇匀，25℃静置10分钟,、一再加入0.5mL(乙液)，加入后立即摇匀，置于25℃环境中静放30分钟,测定OD500值，再对照标准曲线，从中查找蛋白质含量。

标准曲线的绘制：以0.05mg/ml NaOH溶液为溶剂，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/m1 5个浓度。测定OD₅₀₀值，以酪蛋白为溶剂，配制以酪蛋白浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

福林一酚试剂：

甲液：吸取试剂A 100m1，加入试剂B 2m1混合而成。

试剂A：0.2mo1/L NaOH溶液与4％无水碳酸钠等体积混合

试剂B：2％酒石酸甲钠与1％CuS0₄-5H₂O溶液等体积混合

乙液：吸取5ml苯酚试剂加入5ml蒸馏水稀释而成。

C-3、油脂分解菌的复筛方法

计算公式：

分解率＝(C1-C2)/C1 x 100％

C1：初始时豆油的浓度，

C2：为处理后豆油的浓度(单位：g/L)

并附复筛培养基中油脂含量的测定步骤如下：

培养基加入到250分液漏斗中，加入1mL浓盐酸，加入2gNaCl，用5mL石油醚清洗摇瓶 2次，之后均移入分液漏斗中。充分震荡3分钟，待静置分层后，水层回收到摇瓶中，石油醚则移入烧杯中。重复萃取步骤一到两次。向回收的石油醚中加入适量的NaSO₄搅拌，使其充分脱水。然后定容至25mL，紫外分光光度计工作波长设定为225nm，测定吸光度后，从标准曲线中查找对应的油脂含量。

C-4、纤维素分解菌的复筛方法

将初筛得到菌株接种到复筛培养基上，唯一碳源是滤纸片，放入200r/min的摇床中，40℃培养。72h后测定滤纸片干重的变化。筛选时，判断是否选入复合微生物菌剂的依据为：初筛菌株对滤纸片分解的分解率。

计算公式：

分解率＝(m1-m2)/m1*100％

m1：初始时滤纸片的质量，m2：处理后滤纸片的质量，单位：g。

D、拮抗作用验证

以划线的方式，将复筛选出的菌株接种到平板上，培养36小时之后，待菌株特性稳定后，以十字交叉的方式，将几种菌接种在同一培养基上，培养48小时后观察结果。

E、微生物生长曲线的测定

E-1、细菌及无菌丝真菌生长曲线的测定：

采用分光光度法。每隔2小时620nm处测定细菌培养菌液的OD值，在560nm处测定无菌丝真菌培养菌液OD值。以时间为横坐标，微生物OD值为纵坐标，进行细菌和无菌丝真菌的生长曲线测定。

E-2、放线菌及霉菌的生长曲线测定：

采用抽滤后称干重的方法。每隔12小时测定1次菌体干重，称量时先将滤纸烘干，称重，菌体分别放在称重过的滤纸上抽滤，菌体连同滤纸一起烘干后再称重，取差值得到菌体干重，以时间为横坐标，以菌体干重为纵坐标，绘制各菌株内生长曲线。

E-3、接种最佳时间点：

生长曲线进行绘制，找出活性转移点，确定对数生长期进行到80％左右时进程时刻点。例如，真菌菌种的对数生长期为4h-16h，则真菌的对数生长期80％的时间点是13.5h，即4+ (16-4)×0.8＝13.5h，此时刻对应的OD值约为0.367。

F、固态菌剂制备方法

F-1、各种微生物菌种发酵液

从保存的甘油管中吸取100μL菌液接入4mL灭菌后的试管LB培养基中，在40-60℃摇床中过夜培养。从试管LB培养基中以1％的接种量将活化好的菌种接入含有100mL LB培养基的摇瓶中。在40-60℃摇床中连续培养24小时。

本研究的复合微生物菌剂中各种微生物种类的确定仅选用自然比例，以尽量不破坏微生物之间相互关系，而只是从数量上对微生物量进行扩增，从而起到促进堆肥的作用。微生物接种比例按照自然堆肥过程的自然比例进行确定。

通过液体发酵手段分别培养各种微生物菌种，4℃冰箱保存，用于固态剂型的制备。

F-2、固体基质预处理

将1Kg细鼓皮、1Kg细锯末用蒸馏水清洗后进行灭菌锅高压灭菌。灭菌条件为121℃，灭菌30min。灭菌后在太阳下晾晒，并利用紫外线继续灭菌，晾晒的干燥后收集，并将结块的基质碾碎，使基质尽可能为细粉末。

F-3、配置过程

配制各种菌液共2L，其中经计算中温菌液总体积与高温菌液的总体积比大约为11.5:1，即中温菌液的总体积为1840mL，中温菌液总体为160mL。

将细鼓皮与细锯末混合均匀，同样以11.5:1的比例将混合固体基质分为两部分，一部分为1840g，标记为G1，另一部分为160g，标记为G2。

将所有中温菌菌液共1840mL加入到G1固体基质当中，稍添蒸馏水，使菌液与固体基质混合物的含水率达到55％～60％，并加入465g葡萄糖，作为发酵引物，搅拌均匀。同样的，将高温菌菌液共160mL加入到G2固体基质中，添蒸馏水，使菌液与固体基质混合物的含水率达到55％～60％，并加入40g葡萄糖，作为发酵引物，搅拌均匀。将两部分发酵体G1,G2堆叠在塑料箱中，堆置高度不宜过高也不易过低，中温微生物处理组堆制高度成8cm，高温微生物处理组堆制高度成2cm。分别将两组固体基质与菌液的混合发酵体G1和G2放入不同培养箱中进行培养。G1中温微生物组的培养温度设置成40℃,G2高温微生物温度设置成65℃。培养过程中每隔2小时对发培养体进行温度测定，并进行翻搅，组织堆温上升。培养1天，将混合培养体取出，将G1放入40℃设定温度的循环通风烘箱中进行风干，将G2放入65℃设定温度的循环通风烘箱中进行风干。将彻底风干后的G1和G2混合体进行在常温下混合搅拌。复合微生物固体菌剂即可制作完成。

Claims

1.一种餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：进行固体基质预处理；

S2：从餐厨垃圾样品中提取出可以分解餐厨垃圾的多种分解菌，并对该多种分解菌进行培养；

S3：将经过预处理的固体基质与经过S2步骤培养好的多种分解菌进行混合并进一步培养，风干，风干后的产物即为固态的复合微生物菌剂。

2.如权利要求1所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中，进行固体基质预处理的方法为：

3.如权利要求1所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在所述S2步骤中制备多种分解菌并将多种分解菌培养好的方法包括如下步骤：

S2-1：制备初筛培养基和复筛培养基；

S2-2：取餐厨垃圾的混合液稀释制备成不同浓度样品；

S2-5：将S2-4培养出的各品种的纯的菌株进行初步筛选，筛选出可以将餐厨垃圾物料进行分解的多种分解菌；

S2-7：将复筛选出的多种分解菌进行拮抗实验；

4.如权利要求3所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述S2-2步骤中，制备不同浓度样品的方法为：

5.如权利要求3所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述S2-3步骤中，培养出多种菌株的方法为：

6.如权利要求3所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述S2-4步骤中，通过分离纯化方法得到各品种的纯的菌株的方法为：

挑选不同的菌株划线纯化，得到纯的培养物后用斜面保存。

7.如权利要求3所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述S2-5步骤中，初步筛选出多种分解菌的方法为：

根据不同分解菌株分解相应菌落后菌落周围的不同状态，将分离纯化后得到的不同分解菌株滴在相应的初筛培养基上，倒置培养24h后，测定被分解的相应菌落辐射的直径D值及所得菌落的直径d值，每种分解菌重复多个作为对照。

8.如权利要求3所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在所述S2-7步骤中，进行拮抗实验的方法为：

9.如权利要求3所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述S2-8步骤中，将通过S2-7拮抗实验的多种分解菌进一步培养的示例方法为：

从提前保存的甘油管中将纯菌株的菌液接入到灭菌后的LB试管培养基中，吸取100μL纯菌株的菌液，从提前保存的甘油管中将纯菌株的菌液接入4mL灭菌后的LB试管培养基中，40-60℃摇床或摇瓶中过夜培养；从LB试管培养基中以1％的接种量将活化好的菌种接入含有100mL的LB试管培养基的摇床或摇瓶中；40-60℃温度连续培养24小时。通过同样的液体发酵手段，分别培养各种微生物菌种，将最终培养好的菌液保存在4℃冰箱。

10.如权利要求1所述的餐厨垃圾堆肥复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述S3步骤中，进一步培养及风干进而得到固态复合微生物菌剂的方法为：

本发明所述的餐厨垃圾在不同温度阶段存在并生长着不同的菌种分别称为低温菌、中温菌和高温菌；配制经过S2-8处理的多种分解菌的菌液2L，经计算，生长在中温环境中的中温菌的菌液总体积与生长在高温环境中的高温菌的菌液的总体积比为11.5:1，即中温菌菌液的总体积为1840mL，高温菌菌液总体为160mL。

取1Kg细鼓皮和1Kg细锯末，将S9中炮制的细鼓皮与细锯末混合均匀，同样以11.5:1的比例将该粉末基质分为两部分，一部分为1840g，标记为G1，另一部分为160g，标记为G2；

将所有中温菌菌液共1840mL加入到G1固体粉末基质当中，添蒸馏水，使菌液与固体粉末基质混合物的含水率达到55～60％，并加入465g葡萄糖作为发酵引物，搅拌均匀；将高温菌菌液共160mL加入到G2固体粉末基质中，添蒸馏水，使菌液与固体粉末基质混合物的含水率达到55～60％，并加入40g葡萄糖作为发酵引物，搅拌均匀；将两部分发酵体G1,G2分别堆叠放置，堆置高度不宜过高也不易过低，中温菌处理组堆制高度8cm，高温菌处理组堆制高度2cm；分别将两组固体粉末基质与菌液的混合发酵体G1和G2放入不同培养箱中培养；G1中温菌组的培养温度设置为40℃，G2高温菌组的培养温度设置为65℃；培养过程中每隔2小时对G1和G2分别进行翻搅使堆温上升；培养24小时后取出，将G1放入设定温度为40℃的循环通风烘箱中风干，将G2放入设定温度为65℃的循环通风烘箱中风干；将彻底风干后的G1和G2混合体在常温下混合搅拌；复合微生物固体菌剂即可制作完成。