CN113308404A - 油脂降解菌株的筛选方法及油脂降解产品 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种油脂降解菌株的筛选方法及油脂降解产品，该筛选方法包括以下步骤：S1、提供培养液、培养基和菌源，所述培养液中以油脂作为唯一碳源，所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和中性红培养基；S2、将所述菌源制成样液并加入所述培养液进行驯化培养；S3、将驯化培养后的样液在所述牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化培养；S4、将所述纯化培养得到的菌落进行筛选。本申请通过科学有效的筛选方法得到对动植物油脂均具有较强降解能力的菌株组合。在驯化过程中培养液浓度梯度逐渐升高，菌株逐渐驯化而适应含油培养基，因此该条件下筛选的菌种在实际油脂中的生存能力、降解效率得到提高。

Description

油脂降解菌株的筛选方法及油脂降解产品
技术领域
本发明涉及一种油脂降解菌株的筛选方法及油脂降解产品，属于微生物技术领域。
背景技术
随着人们环保意识的提高，微生物在处理餐厨废弃物中油脂方面的研究越来越多。使用微生物处理含油废弃物的研究目前仍处于研究阶段，因发展不够成熟未能大规模投入商业化运营中。对含油污水或受污染土壤环境中的优势菌群进行分离，并从中筛选出具有高效油脂降解特性的菌株，仍是目前研究的重点。
餐厨废弃物是指家庭、学校、机关公共食堂以及餐饮行业的食物废料和食物残余，主要包括米和面粉类食物残余、蔬菜、植物油、动物油、肉骨、鱼刺等，是城市生活垃圾的主要组成部分之一。餐厨废弃物富含蛋白质、淀粉、脂肪等有机质，C/N值低，无毒、无重金属污染，富含大量能源物质，有机物、油脂及盐分含量高，营养元素丰富，使其被誉为“一种放错了地方的资源”，具有很高的回收利用价值。在当前社会资源紧缺的现状下，餐厨废弃物可发展成为一种科学持续的资源化利用原料。
堆肥利用自然界中广泛的微生物，通过微生物活动达到升温、高温、降温三阶段反应，对堆肥物料中的有机物质进行代谢降解，经无害化处理得到有机肥。我国人口诸多，餐厨废弃物产生量巨大，可将餐厨废弃物与堆肥结合起来，通过垃圾分类收集大量餐厨废弃物，进行集中就地堆肥处理，通过微生物来分解餐厨废弃物中的有机物质，加以科学技术促进堆肥进程，使得餐厨废弃物资源物尽其用。然而，目前我国在油脂降解菌应用于堆肥中的技术还不成熟，多效混合菌剂的研发还不够完善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油脂降解菌株的筛选方法及油脂降解产品，其通过科学有效的筛选方法，得到对动植物油脂均具有较强降解能力的菌株组合。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种油脂降解菌株的筛选方法，包括以下步骤：
S1、提供培养液、培养基和菌源，所述培养液中以油脂作为唯一碳源，所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和中性红培养基；
S2、将所述菌源制成样液并加入所述培养液进行驯化培养；
S3、将驯化培养后的样液在所述牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化培养；
S4、将所述纯化培养得到的菌落进行筛选。
进一步地，所述培养液中以豆油和猪油的混合样作为唯一碳源，所述菌源包括食堂下水道淤泥样品。
进一步地，步骤S2中，将所述菌源制成样液的过程包括：
将所述菌源与灭菌的去离子水混合，在25-35℃、100-300r/min的条件下，振荡12-36h。
进一步地，步骤S2中，所述驯化培养的过程包括：
将所述样液加入至培养液中，设置N个平行样，其中，N≥1；将N个所述平行样在25-35℃下振荡培养3-7个周期，每个所述周期为4-10天。
进一步地，所述驯化培养的具体过程包括：
取5mL所述样液加入到45mL所述培养液中，设定3个平行样，分别在30℃、140r/min条件下振荡培养5个周期，每6天为1个周期，每周期末接种10mL菌液到40mL新富集培养液中开始下一周期的生长。
进一步地，所述培养液在每周期初始添加油量逐次递增，分别为0.8，1.6，2.4，3.2，4.0mL/L。
进一步地，步骤S3中，所述纯化培养包括：
选取油脂分解较充分的样液，分别稀释涂布于所述牛肉膏蛋白胨培养基上进行培养，再挑选不同形态特征的单一菌落，在所述牛肉膏蛋白胨培养基上划线进行纯化培养。
进一步地，步骤S4中，所述筛选包括：
将所述纯化培养后的单一菌株用接种环蘸取菌落，点涂接种于所述中性红培养基上形成菌落，观察菌落周围是否变红，选取变色反应最明显的菌株，并在所述牛肉膏蛋白胨培养基上两两交叉划线，形成十字划线，观察菌株间是否有拮抗效果。
进一步地，还包括：
S5、对所述菌株进行复筛，通过生长曲线和菌落数实验，筛选得到生长速度最快、长势最好的菌株组合。
本申请还提供一种油脂降解产品，其包括由以下菌种形成的菌株组合：芽孢杆菌、微杆菌、反硝化菌、地芽胞杆菌、短波单胞菌、鞘氨醇杆菌和苍白杆菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本申请的油脂降解菌株的筛选方法及油脂降解产品，其通过科学有效的筛选方法，得到对动植物油脂均具有较强降解能力的菌株组合。在驯化过程中培养液浓度梯度逐渐升高，菌株逐渐驯化而适应含油培养基，因此该条件下筛选的菌种在实际油脂中的生存能力、降解效率得到提高。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本申请一实施例中油脂浓度与OD225值之间的关系示意图；
图2为本申请一实施例中菌株在0-5天内的降解效率图；
图3为本申请一实施例中CK组与SY组在0-30天内的堆肥油脂含量变化图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本申请的油脂降解菌株的筛选方法包括以下步骤：
S1、提供培养液、培养基和菌源，培养液中以油脂作为唯一碳源，培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和中性红培养基；
S2、将菌源制成样液并加入培养液进行驯化培养；
S3、将驯化培养后的样液在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化培养；
S4、将纯化培养得到的菌落进行筛选。
其中，培养液可以以豆油和猪油的混合样作为唯一碳源，菌源可以选自食堂下水道淤泥样品。
步骤S2中，将菌源制成样液的过程包括：将菌源与灭菌的去离子水混合，在25-35℃、100-300r/min的条件下，振荡12-36h。驯化培养的过程包括：将样液加入至培养液中，设置N个平行样，其中，N≥1，N可以是1-5；将N个平行样在25-35℃下振荡培养3-7个周期，每个周期为4-10天。具体的，取5mL样液加入到45mL培养液中，设定3个平行样，分别在30℃、140r/min条件下振荡培养5个周期，每6天为1个周期，每周期末接种10mL菌液到40mL新富集培养液中开始下一周期的生长。并且，培养液在每周期初始添加油量逐次递增，分别为0.8，1.6，2.4，3.2，4.0mL/L。
步骤S3中，纯化培养包括：选取油脂分解较充分的样液，分别稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上进行培养，再挑选不同形态特征的单一菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线进行纯化培养。
步骤S4中，筛选包括：将纯化培养后的单一菌株用接种环蘸取菌落，点涂接种于中性红培养基上形成菌落，观察菌落周围是否变红，选取变色反应最明显的菌株，并在牛肉膏蛋白胨培养基上两两交叉划线，形成十字划线，观察菌株间是否有拮抗效果。
本申请中，还包括步骤S5：对菌株进行复筛，通过生长曲线和菌落数实验，筛选得到生长速度最快、长势最好的菌株组合。
下面将结合具体实施例来进行进一步说明。
驯化初筛
(1)驯化培养配方
驯化富集培养液：NaCl 0.5g，蛋白胨5.0g，牛肉膏0.5g，pH＝7.2-7.4，去离子1000mL，按周期递增加入猪油：豆油＝1:1的油样品，121℃高压灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉20g，H2O 1000mL，pH＝7.2-7.4，121℃高压灭菌20min。
中性红培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉20g，1:1猪油+豆油10mL，1.6％中性红水溶液1mL，H2O 1000mL，pH＝7.2-7.4，121℃高压灭菌20min。
(2)驯化实验步骤
将采集到的食堂下水道淤泥样品各取10g，加入100mL灭菌去离子水充分混合，在30℃、200r/min振荡24h，制成样液。取5mL样液加入到45mL驯化富集培养液中，设定3个平行样，分别在30℃、140r/min条件下振荡培养。以6天为1个周期，且每周期末接种10mL菌液到40mL新富集培养液中开始下一周期的生长，持续驯化5个周期，共驯化30天。其中，驯化富集培养液在每周期初始添加油量逐次递增，分别为0.8，1.6，2.4，3.2，4.0mL/L。
在驯化过程中，可以每2天观察一次，若油脂降解迅速则适量补加油样品。从驯化样中选取油脂分解较充分的菌液，分别以10-5、10-6、10-7、10-8稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，分别在30℃下培养48h。挑选不同形态特征的单一菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化培养。
(3)驯化所得菌株初步筛选
将纯化后的单一菌株用接种环蘸取菌落，点涂接种于中性红培养基上，观察菌落周围是否变红，若变红则表明菌株能够分解油脂产生脂肪酸，选取变色反应最明显的菌株进行进一步实验。将上述有油脂降解功能的菌在牛肉膏蛋白胨培养基上两两交叉划线，形成十字划线，观察菌株间是否有拮抗效果
基因鉴定
根据博迈德细菌基因组DNA快速提取试剂盒的操作步骤提取已分离的细菌的DNA，将提取的细菌DNA用ddH20进行1:10稀释。之后在冰上操作，将Takara Mix(含Mg2+,dNTPs,Taq)、BSA(5mg/mL)、DMSO(100％)、BOX primers(0.3μg/μL)、ddH2O根据体系所需量按比例装入适量大小的离心管中，混匀后分装到已灭菌的PCR管中(24μL)。在对应的PCR管中分别加入对应样品1μLDNA，阴性对照加入等量的ddH2O，分别做好标记。
将PCR管中的反应溶液体系(表1所示)进行快速离心后，上机以预设条件扩增。采用细菌通用引物27F和1492R对各菌株的16S rDNA基因片段进行扩增，其中，PCR反应条件如表2所示。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003095502890000061
表2 PCR扩增调节
Figure BDA0003095502890000062
Figure BDA0003095502890000071
取10μL PCR产物进行琼脂凝胶电泳，在80V条件下电泳90min，使用EB染色20-30min，在凝胶系统紫外灯下观察条带图谱，验证PCR扩增结果。最后送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
菌株复筛
(1)菌株生长状况
将各菌接种到10mL牛肉膏蛋白胨培养液中培养12-18h，在紫外分光光度计600nm下测各菌液吸光度。取1mL原菌液加入150mL牛肉膏蛋白胨培养液，在30℃、200r/min下振荡培养24h，每2h使用紫外分光光度计测量OD600值，绘制生长曲线。
将各菌接种到10mL牛肉膏蛋白胨培养液中培养12-18h，取1mL原菌液加入150mL牛肉膏蛋白胨培养液，在30℃、200r/min下振荡培养24h，每隔4h取100μL菌液和0.9mL生理盐水(0.85％NaCl)至1.5mL离心管，用涡旋仪充分振荡混匀，依次稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，吸取10μL分为五点均匀滴在牛肉膏蛋白胨培养基上，正放平板晾干菌液，30℃下培7-8h后统计菌落点个数。
(2)菌株油脂降解效率
菌株培养：在50mL离心管中加入30mL无机盐培养液，按照油脂占无机盐培养液体积1％的比例，加入0.3mL混合油脂(猪油+豆油＝1:1)。用无菌接种环蘸取菌落，接种于无机盐培养液中，在1、2、3、4、5d后萃取残留油脂。
油脂萃取：在培养1、2、3、4、5d的离心管中，分三次先后加入5、3、2mL正己烷(共计10mL)，在每次加入后拧紧离心管盖子振荡，充分溶解油脂。静置5min后，将三次所得上清液吸取至同一洁净干燥离心管中。
稀释测定：将装有上清液的离心管拧紧盖子，在涡旋仪振荡涡旋15s，使萃取溶液充分混合。吸取0.2mL于另一洁净干燥10mL离心管中，加入4.8mL正己烷稀释混匀，在紫外分光光度计225nm下测OD225值。
绘制标准曲线：由朗伯-比尔定律可知，样品的吸光度与其浓度成正比，用正己烷溶解混合油脂，配置浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20mL/L(混合油脂：正己烷)溶解液测OD225值。通过配制不同浓度的油脂溶液，探索油脂含量变化与OD225值之间的线性关系，得到相应的标准曲线，可根据标准曲线计算出油脂浓度。
本实施例中，三批样品先后共筛选出98株具有油脂降解效果的菌。将筛选得的所有油脂降解菌统一进行中性红验证，选取了显色反应最显著的22株菌株，经验证这22株菌株彼此间均无拮抗反应。将22株菌株测序，使用DNAman进行序列拼接，在NCBI上进行BLAST序列比对，确定菌属、排除致病菌后得到14株菌株。随后对这14株菌株进行复筛，并通过24h生长曲线和菌落数实验，选出生长速度最快、长势最好的10株(如表3所示)。对最终这10株进行油脂降解效果的测定，将该10株菌株制成菌液，等体积复配成菌剂用于餐厨废弃物堆肥中。
表3三批样品中的10株菌株
Figure BDA0003095502890000081
Figure BDA0003095502890000091
菌株组合对油脂的降解效果
(1)堆肥材料
本实施例中，餐厨废弃物和木屑均由苏州市韩博电器科技有限公司提供，餐厨废弃物取自苏州市区内各个餐厨废弃物回收处理点，木屑来自与苏州韩博公司合作的家具厂。
堆肥空白对照组(CK组)液体：灭菌牛肉膏蛋白胨培养液。
堆肥实验菌剂组(SY组)菌液：10株油脂降解菌的等体积复配菌液，本实施例采用上述的A-N的菌株，每株菌株在灭菌牛肉膏蛋白胨培养液中培养24h，各菌等体积比例混合成复合菌液，得到实验菌剂组(SY组)菌液。
(2)堆肥设计
测得该批餐厨废弃物和木屑的基础性质，通过计算，最后配比定为80kg餐厨废弃物与30kg木屑(比例＝8:3)充分混匀进行堆肥。经计算可调节C/N＝25左右，含水率＝60％左右。混匀餐厨废弃物和木屑后，测得混合物的含水率为61.59％，堆肥混合配比具有可行性，具体原料基础性质如表4所示。
表4原料基础性质
Figure BDA0003095502890000092
本实施例中，使用粉碎机对新鲜餐厨物料进行破壁粉碎，将粉碎好的餐厨废弃物与木屑称重，按照上述8:3比例混合并在搅拌机中进行搅拌混匀30min，使其充分混匀。接种菌液的比例为固液比＝菌液：堆肥物料＝0.5％，分别将不同菌液装入不同喷壶中，分别均匀喷在堆肥物料中，边喷边对堆肥物料翻堆，尽可能保证接种均匀。根据所接种菌的不同，可将堆肥实验分为2组，分别是无菌接入的空白对照组(CK组)，接种10株油脂降解菌液的实验菌剂组(SY组)，每组处理设有3个重复，共6个堆肥箱。在本实施例的堆肥过程中的，堆肥处理组的配方如表5所示。
表5堆肥处理组配方
Figure BDA0003095502890000101
称取30kg餐厨混匀物料，加入到120L带盖泡沫箱中，堆肥共30天。使用额定出气量为100L/min的气泵同时连接9个箱子，测得每箱通气量在7-8L/min，曝气设定为通气15min、停止30min，无限循环。在堆肥开始至高温期结束阶段内每天使用铁锨进行箱内翻堆，每6天测一次堆肥的油脂含量。
(3)菌株的油脂降解曲线
请参见图1和图2，由图可知，油脂溶于正己烷的浓度在0.1、0.2、0.5、1、2、5mL/L时，与OD225值有显著的线性关系，标准曲线方程为y＝0.4749x+0.0739，R2＝0.9967；当浓度大于5mL/L时，直线明显走势向下变弯曲，这是因为正己烷对油脂的溶解度趋于饱和，不能溶解更多的油脂。
10株菌在第一天降解效率均一般，这与接种方式有关，使用接种环蘸取少量菌落进行接种时，所接入的菌落数较少。在接种进入无机盐培养液中的前24h中，菌处于适应期。降解效率最好的菌为编号为J—鞘氨醇杆菌、N—短波单胞菌，降解效率分别达到45.34％、45.90％，其中鞘氨醇杆菌J菌的降解效率逐步上升，短波单胞菌N菌在前四天呈稳定上升趋势，到第五天与第四天曲线趋于平缓。其余菌株在0-3天内，降解效率呈显著上升趋势，到3天后，部分菌株的降解效率上升变缓，B菌(芽孢杆菌属)、C菌(微杆菌属)、D菌(反硝化菌属)、F菌(地芽胞杆菌属)在第4、5两天增长率趋于减缓。
(4)菌株的降解效果
请参见图3，由图可知，，SY组堆肥一直比CK组堆肥油脂含量更低，说明添加油脂降解菌具有明显促进降解的效果。其中，两组处理堆肥的油脂含量在0-30天内均持续降低，堆肥初始油脂含量为10.29％，在0-6天内，此阶段两组处理的油脂含量下降幅度较大，CK组降低0.52％，SY组降低1.69％，SY组降低幅度最大，该实验结果说明添加菌剂的SY组油脂含量下降显著，添加自主研发的菌剂降解油脂效果较好；在6-12天内，所绘制的油脂降解折线图可清晰表现出，在此阶段两组堆肥的油脂含量大幅度下降，是下降幅度最大的时期，其中CK组降低2.46％，SY组降低2.00％。在0-30天内，CK组油脂含量从10.29％降低到4.43％，共降低5.86％，SY组从10.29％降低至4.22％，共降低6.07％，其中油脂降解程度为SY＞CK组，实验证明，添加所筛选的油脂降解菌有助于促进微生物的对油脂的降解活动。
上述实施例中，是采用豆油和猪油作为唯一碳源，以筛选得到对餐厨废弃物具有较佳降解效果的菌株；诚然，在其他实施例中，还可以采用其他油成分作为碳源。
进一步地，本申请还涉及一种包括上述筛选得到的菌株的油脂降解产品，该产品可以是菌剂。
综上所述：本申请的油脂降解菌株的筛选方法及油脂降解产品，其通过科学有效的筛选方法，得到对动植物油脂均具有较强降解能力的菌株组合。在驯化过程中培养液浓度梯度逐渐升高，菌株逐渐驯化而适应含油培养基，因此该条件下筛选的菌种在实际油脂中的生存能力、降解效率得到提高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提供培养液、培养基和菌源，所述培养液中以油脂作为唯一碳源，所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和中性红培养基；
S2、将所述菌源制成样液并加入所述培养液进行驯化培养；
S3、将驯化培养后的样液在所述牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化培养；
S4、将所述纯化培养得到的菌落进行筛选。
2.如权利要求1所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述培养液中以豆油和猪油的混合样作为唯一碳源，所述菌源包括食堂下水道淤泥样品。
3.如权利要求1所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，将所述菌源制成样液的过程包括：
将所述菌源与灭菌的去离子水混合，在25-35℃、100-300r/min的条件下，振荡12-36h。
4.如权利要求1或3所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，所述驯化培养的过程包括：
将所述样液加入至培养液中，设置N个平行样，其中，N≥1；将N个所述平行样在25-35℃下振荡培养3-7个周期，每个所述周期为4-10天。
5.如权利要求4所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述驯化培养的具体过程包括：
取5mL所述样液加入到45mL所述培养液中，设定3个平行样，分别在30℃、140r/min条件下振荡培养5个周期，每6天为1个周期，每周期末接种10mL菌液到40mL新富集培养液中开始下一周期的生长。
6.如权利要求5所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述培养液在每周期初始添加油量逐次递增，分别为0.8，1.6，2.4，3.2，4.0mL/L。
7.如权利要求1所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，步骤S3中，所述纯化培养包括：
选取油脂分解较充分的样液，分别稀释涂布于所述牛肉膏蛋白胨培养基上进行培养，再挑选不同形态特征的单一菌落，在所述牛肉膏蛋白胨培养基上划线进行纯化培养。
8.如权利要求1所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，步骤S4中，所述筛选包括：
将所述纯化培养后的单一菌株用接种环蘸取菌落，点涂接种于所述中性红培养基上形成菌落，观察菌落周围是否变红，选取变色反应最明显的菌株，并在所述牛肉膏蛋白胨培养基上两两交叉划线，形成十字划线，观察菌株间是否有拮抗效果。
9.如权利要求8所述的油脂降解菌株的筛选方法，其特征在于，还包括：
S5、对所述菌株进行复筛，通过生长曲线和菌落数实验，筛选得到生长速度最快、长势最好的菌株组合。
10.一种油脂降解产品，其特征在于，包括由以下菌种形成的菌株组合：芽孢杆菌、微杆菌、反硝化菌、地芽胞杆菌、短波单胞菌、鞘氨醇杆菌和苍白杆菌。
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