CN114774510B - 一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用，试纸条包括试纸基体，设置在试纸基体上的E.coli BL21菌株，E.coli BL21菌株携带有pPNP‑LacZ质粒，pPNP‑LacZ质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，pPNP‑LacZ质粒的物理图谱如图1所示。当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与pPNP‑LacZ质粒中的阻遏蛋白pobR的结合消除了pobR与操纵基因位点pobO的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因，产生β‑半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β‑半乳糖苷酶显色底物时，产生的β‑半乳糖苷酶可降解β‑半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、成本低，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。

Description

一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用。
背景技术
对硝基酚(p-NP)是一类用途广泛的化工原料和药物中间体，主要用于生产合成医药、染料、有机磷农药及工业溶剂。其在自然环境中半衰期较长，对生态环境造成威胁，被认定为环境内分泌干扰物。
通用的化学分析方法能准确定量分析污染物中主要成分的含量，如高效液相色谱法(HPLC)和新型快速检测法(新型纳米材料的传感器)。但现有方法不能直接并及时地反映各种有毒物质(如对硝基酚)在复杂环境介质中对生物的综合影响(即有毒物质的生物可利用性)。全细胞细菌生物传感器因其独特的生理特性，与现代光电检测手段完美匹配的特点而倍受关注。试纸以其检测成本低、操作简单等独特的特点在各个领域中应用广泛，例如：实验室所用的pH试纸、淀粉碘化钾试纸；工业所用的温度热敏试纸、废水检测试纸；生活所用的血糖试纸等。由于制作试纸的材料和方法不同，试纸的检测领域和检测灵敏度也不同。目前，尚未有研究利用全细胞生物传感器制备试纸条用来检测土壤中的对硝基酚。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于尚未有研究利用全细胞生物传感器制备试纸条用于检测土壤中对硝基酚的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用，用以简便、快速、直观、准确地检测土壤中对硝基酚。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种用于检测对硝基酚的试纸条，其中，包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的E.coli BL21菌株，所述E.coli BL21菌株携带有pPNP-LacZ质粒，所述pPNP-LacZ质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pPNP-LacZ质粒的物理图谱如图1所示。
可选地，所述用于检测对硝基酚的试纸条还包括设置在所述试纸基体上的β-半乳糖苷酶显色底物。
可选地，所述β-半乳糖苷酶显色底物选自5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。
可选地，所述试纸基体为长方形，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/8～1/2处。
可选地，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有pPNP-LacZ质粒的E.coliBL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/4处。
可选地，所述试纸基体选自滤纸。
本发明的第二方面，提供一种本发明如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条的制备方法，其中，包括步骤：
利用引物聚合酶链反应，从pPNP-mrfp质粒上克隆pPNP基因片段的基因序列，从pCU19质粒上克隆LacZ报告基因片段的基因序列，所述pPNP-mrfp质粒的核苷酸序列如SEQID NO：2所示；
将所述pPNP基因片段的基因序列和所述LacZ报告基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
将所述连接产物转入到E.coli DH5α感受态细胞中，得到E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种；
将所述E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取pPNP-LacZ质粒，通过质粒热击转化法，将提取的pPNP-LacZ质粒导入到E.coli BL21菌株中，得到携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株，记作E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株；
将所述E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株接种于含有卡那霉素的液体培养基中，培养后收集，加入到含有乳糖和多粘菌素B的培养基中复苏；
将复苏后的菌株细胞悬液滴加在试纸基体上，在室温下风干后冷冻干燥，得到所述用于检测对硝基酚的试纸条。
可选地，扩增pPNP基因片段采用的引物：
正向引物序列：GAGATCCGGCTGCTAACAAAGC；
反向引物序列：ATGTATATCTCCTTGCTATTTTCTATTTT；
扩增LacZ报告基因片段采用的引物：
正向引物序列：AAAATAGAAAATAGCAAGGAGATATACATATGACCATGATTACGCCAA；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCCTATGCGGCATCAGAGCA。
可选地，将所述连接产物转入到E.coli DH5α感受态细胞中，得到E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种，利用引物聚合酶链反应鉴定所述E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种中的pPNP-LacZ质粒；
所述鉴定采用的引物：
正向引物序列：GCAAATGGGTCGCGGATCC；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC。
本发明的第三方面，提供一种本发明如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条在检测土壤中可提取态对硝基酚中的应用。
有益效果：本发明用于检测对硝基酚的试纸条包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的E.coli BL21菌株，所述E.coli BL21菌株携带有pPNP-LacZ质粒，当试纸条与含有对硝基酚的待检测液(如对硝基酚污染的土壤提取液)接触时，对硝基酚与pPNP-LacZ质粒中的阻遏蛋白pobR的结合消除了pobR与操纵基因位点pobO的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因(LacZ)，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。
附图说明
图1为本发明实施例中pPNP-LacZ质粒的物理图谱。
图2为本发明实施例中试纸条用于检测对硝基酚时的原理示意图。
图3中(a)为本发明实施例1中对硝基酚对E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌株的诱导曲线，
(b)为本发明实施例1中对硝基酚对E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌株诱导后的菌落直观图，(c)为本发明实施例1中用于检测对硝基酚的试纸条的实物图。
图4中(a)为用实施例1中制备得到的试纸条检测不同浓度对硝基酚的显色图，(b)为不同土壤中对硝基酚浓度与试纸条显色颜色强度的关系图。
图5中(a)为用实施例1中制备得到的试纸条检测不同土壤样品中可提取态对硝基酚的显色图(b)为采用高效液相色谱和实施例1中制备得到的试纸条检测不同土壤样品中可提取态对硝基酚浓度的结果图。
图6为用实施例1中制备得到的试纸条检测土壤样品中可提取态对硝基酚的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明实施例提供一种用于检测对硝基酚的试纸条，其中，包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的E.coli BL21菌株，所述E.coli BL21菌株携带有pPNP-LacZ质粒，所述pPNP-LacZ质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pPNP-LacZ质粒的物理图谱如图1所示。
本实施例中用于检测对硝基酚的试纸条包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的E.coli BL21菌株，所述E.coli BL21菌株携带有pPNP-LacZ质粒，如图2所示，当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与pPNP-LacZ质粒中的阻遏蛋白pobR的结合消除了pobR与操纵基因位点pobO的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因(LacZ)，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。
本发明实施例提供的试纸条在有效检测土壤中对硝基酚含量的同时并不引入任何有机化学试剂，为土壤中生物有效态对硝基酚的研究提供了有力手段。
在一种实施方式中，所述用于检测对硝基酚的试纸条还包括设置在所述试纸基体上的β-半乳糖苷酶显色底物。也就是说，为了采用试纸条检测含有对硝基酚的待检测液时更加方便，无需向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物，可将β-半乳糖苷酶显色底物直接固定设置在所述试纸基体上。当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与pPNP-LacZ质粒中的阻遏蛋白pobR的结合消除了pobR与操纵基因位点pobO的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因(LacZ)，产生的β-半乳糖苷酶可降解试纸条上固定设置的β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，进而实现对硝基酚的检测。具体地，可将携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株与β-半乳糖苷酶显色底物混合后设置在所述试纸基体上，也就是说携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株与β-半乳糖苷酶显色底物设置在试纸基体上的同一区域。
在一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶显色底物选自5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)。当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与pPNP-LacZ质粒中的阻遏蛋白pobR的结合消除了pobR与操纵基因位点pobO的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因，产生的β-半乳糖苷酶可降解试纸条上固定设置的β-半乳糖苷酶显色底物而产生蓝色。
在一种实施方式中，所述试纸基体为长方形，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/8～1/2处。当然，也可根据实际需要设置携带有pPNP-LacZ质粒的E.coliBL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷在所述试纸基体上的位置，也可根据实际需要选择试纸基体的形状。
在一种实施方式中，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/4处。为了便于对对硝基酚的检测，将携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的混合物设置在所述试纸基体长度方向上的1/4处。
在一种实施方式中，所述试纸基体选自滤纸。本实施方式中，所述试纸基体可由市售的普通滤纸经过裁剪得到。作为举例，裁剪后得到的滤纸的尺寸可为4cm×1cm。
本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条的制备方法，其中，包括步骤：
S11、利用引物聚合酶链反应(PCR)，从pPNP-mrfp质粒上克隆pPNP基因片段的基因序列，从pCU19质粒上克隆LacZ报告基因片段的基因序列，所述pPNP-mrfp质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
S12、将所述pPNP基因片段的基因序列和所述LacZ报告基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
S13、将所述连接产物转入到E.coli DH5α感受态细胞中，得到E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种；
S14、将所述E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取pPNP-LacZ质粒，通过质粒热击转化法，将提取的pPNP-LacZ质粒导入到E.coli BL21菌株中，得到携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株，记作E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株；
S15、将所述E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株接种于含有卡那霉素的液体培养基中，培养后收集，加入到含有乳糖和多粘菌素B(PMB)的培养基中复苏；
S16、将复苏后的菌株细胞悬液滴加在试纸基体上，在室温下风干后冷冻干燥，得到所述用于检测对硝基酚的试纸条。
步骤S11中，在一种实施方式中，利用引物聚合酶链反应(PCR)，从pPNP-mrfp质粒上克隆到pPNP基因片段(6747bp)的基因序列，退火温度为55℃。
扩增pPNP基因片段采用的引物：
正向引物序列：GAGATCCGGCTGCTAACAAAGC；
反向引物序列：ATGTATATCTCCTTGCTATTTTCTATTTT。
在一种实施方式中，利用引物聚合酶链反应(PCR)从pCU19质粒上克隆LacZ报告基因片段(375bp)的基因序列，退火温度为64℃，在设计引物时，添加同源片段。
扩增LacZ报告基因片段采用的引物：
正向引物序列：AAAATAGAAAATAGCAAGGAGATATACATATGACCATGATTACGCCAA；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCCTATGCGGCATCAGAGCA。
作为举例，所述pPNP-mrfp质粒的制备方法如下：
S111、利用引物聚合酶链反应(PCR)，从pET22b-YFP质粒(其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示)上克隆到pET22b质粒骨架结构的pPNP基因片段(4677bp)的基因序列，退火温度为53℃；从pMV_pobRO质粒(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)上克隆pobRO-m报告基因片段(842bp)的基因序列，退火温度为60℃；从pUC19_mrfp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)质粒上克隆mrfp报告基因片段(860bp)的基因序列，退火温度为60℃；
扩增pPNP基因片段采用的引物：
正向引物序列(pPNPF)：GAGATCCGGCTGCTAACAAAGC；
反向引物序列(pPNPR)：GGATCCGCGACCCATTTGC。
扩增pobRO-m基因片段采用的引物：
正向引物序列(pobR-mF)：TTATACCAGATTGCGCAGTTCGTTG；
反向引物序列(pobR-mR)：
AAACCATTTTGGATTTGAATGTTATGATGGAACAACACCATCAGTATTTGG；
扩增mrfp基因片段采用的引物：
正向引物序列(mrfpF)：CCAAATACTGATGGTGTTGTTCCATCATAACATTCAAATCCAAAATGGTTT；
反向引物序列(mrfpR)：TCATTTATATAATTCGTCCATGCCAC。
S112、以pobRO-m基因片段和mrfp基因片段的扩增产物的混合物(1:1，v/v)为模板，以pobR-mF/mrfpR引物，利用引物聚合酶链反应，得到pobRO-m-mrfp基因；
采用的引物：
正向引物序列(pobR-mF)：TTATACCAGATTGCGCAGTTCGTTG；
反向引物序列为(mrfpR)：TCATTTATATAATTCGTCCATGCCAC；
S113、使用pClone007 Blunt Simple Vector Kit试剂盒将pobRO-m-mrfp基因连接到pClone007骨架上，获得pClone007_pobRO-m-mrfp质粒；
S114、从pClone007_pobRO-m-mrfp质粒上克隆pobRO-m-mrfp基因片段(1694bp)的基因序列，退火温度为64℃，设计引物时，添加同源片段；
扩增加同源臂pobRO-m-mrfp基因片段采用的引物：
正向引物序列(pobR-mrfp-F)：TTATACCAGATTGCGCAGTTCGTTG；
反向引物序列(pobR-mrfp-R)：
GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCTCATTTATATAATTCGTCCATGCC。
S115、将pobRO-m-mrfp基因片段的基因序列和pPNP基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到pPNP-mrfp质粒。
步骤S12中，在一种实施方式中，将LacZ报告基因片段和pPNP基因片段添加到PCR管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用10～100ng，载体与插入片段的摩尔比为1:1～1:10，各片段之固摩尔比为1:1，pmols＝(质量ng×1000)/(片段长度bp×650daltons)，混合液在50℃反应15min，得到连接产物。
步骤S13中，在一种实施方式中，所述将所述连接产物转入到E.coli DH5α感受态细胞中，得到E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种的步骤具体包括：
取100μL冰浴上融化的E.coli DH5α感受态细胞置于离心管中，加入所述连接产物，混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激30～45s，转移至冰浴中，静置2min，向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含50mg/L卡那霉素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
在一种实施方式中，将所述连接产物转入到E.coli DH5α感受态细胞中，得到E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种，利用引物聚合酶链反应鉴定所述E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种中的pPNP-LacZ质粒；
所述鉴定采用的引物：
正向引物序列：GCAAATGGGTCGCGGATCC；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC。
步骤S15中，所述培养的时间为4～5h。
所述加入到含有乳糖和多粘菌素B(PMB)的培养基中进行复苏的E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株与含有乳糖和多粘菌素B(PMB)的培养基的比例为：(3～4)mg：100μL。多粘菌素B作为对硝基酚的敏化剂。
本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条在检测土壤中可提取态对硝基酚中的应用。
当试纸条用于检测土壤中可提取态对硝基酚时，对硝基酚与pPNP-LacZ质粒中的阻遏蛋白pobR的结合消除了pobR与操纵基因位点pobO的结合，转录反方向的β-半乳糖苷酶基因，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
以下实施例所用菌种和质粒的信息如下表1所示。
实施例1
(1)利用引物聚合酶链反应(PCR)，从pPNP-mrfp质粒上克隆到pPNP基因片段(6747bp)的基因序列，退火温度为55℃；
扩增pPNP基因片段采用的引物：
正向引物序列：GAGATCCGGCTGCTAACAAAGC；
反向引物序列：ATGTATATCTCCTTGCTATTTTCTATTTT；
(2)利用引物聚合酶链反应(PCR)从pCU19质粒上克隆LacZ报告基因片段(375bp)的基因序列，退火温度为64℃，在设计引物时，添加同源片段；
扩增LacZ报告基因片段采用的引物：
正向引物序列：AAAATAGAAAATAGCAAGGAGATATACATATGACCATGATTACGCCAA；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCCTATGCGGCATCAGAGCA；
(3)将LacZ报告基因片段的基因序列和pPNP基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，将LacZ报告基因片段和pPNP基因片段添加到PCR管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用100ng，载体与插入片段的摩尔比为1:1，各片段之固摩尔比为1:1，pmols＝(质量ng×1000)/(片段长度bp×650daltons)，混合液在50℃反应15min，得到连接产物；
(4)取100μL冰浴上融化的E.coli DH5α感受态细胞置于离心管中，加入上述连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激30s，迅速转移至冰浴中，静置2min，向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含50mg/L卡那霉素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；
(5)在培养基上挑克隆菌斑，使用无菌的10μL移液枪头在含50mg/L卡那霉素的LB培养基和含50mg/L卡那霉素、20mg/L X-gal、10mg/L对硝基酚的LB固体培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含50mg/L卡那霉素、20mg/L X-gal、10mg/L对硝基酚的LB固体培养基上长出蓝色斑点的E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌株，使用引物PCR鉴定重组后的质粒pPNP-LacZ，退火温度为60℃，验证质粒的核心片段为2436bp；
鉴定采用的引物：
正向引物序列：GCAAATGGGTCGCGGATCC；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC；
并测序验证所得含重组质粒的E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种，pPNP-LacZ质粒图谱如图1所示。
使用不同浓度的对硝基酚(0、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000μg/L)对E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种进行诱导12h，并测定OD420nm值，获得诱导曲线，如图3中(a)所示，诱导后得到的菌落直观图如图3中(b)所示。
(5)使用无菌的接种环将E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌株接种在含50mg/L卡那霉素和10mg/L对硝基酚的LB液体培养基中，培养24h后，10000g离心收集菌体，使用质粒提取试剂盒提取pPNP-LacZ质粒，通过普通质粒热击转化试验，将提取获得的pPNP-LacZ质粒导入到E.coli BL21菌株中，记作E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株；
(6)将上述E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株接种于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃培养5小时，150r/min剧烈振荡，OD600 nm为0.450～0.500，以4000g离心10min收集细菌细胞，加入到10％乳糖和0.50μg/mL PMB的1/4LB培养基中复苏，取50μL复苏后得到的菌株细胞悬液滴加在滤纸条(4cm×1cm)上，具体位置如图3中(c)所示，在室温下风干10min，随后冷冻干燥4h，得到用于检测对硝基酚的试纸条，然后-20℃的温度下保存备用。
测试：
(1)对硝基酚比色卡(标准曲线方程)的建立：
将实施例1中制备得到的用于检测对硝基酚的试纸条放入不同浓度(分别为0、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000μg/L)对硝基酚土壤浸出液中，反应150min后立即使用相机获取初始显色照片，然后加入X-gal，等待150min，待反应完毕，使用相机获取反应后显色照片，将反应后显色照片和初始显色照片传入电脑上用ImageJ软件处理得到反应后显色颜色强度和初始显色颜色强度，检测某个浓度的对硝基酚时，反应后显色颜色强度与初始显色颜色强度的差值即为该对硝基酚浓度下对应的显色颜色强度，通过显色颜色强度与对硝基酚浓度对数值建立标准曲线方程。由于不同类型的土壤中的有机质和离子强度不同，需要不同类型的土壤(黄棕壤、黑体、紫土和红壤)浸出液来构建检测对硝基酚比色卡(标准曲线方程)，以对硝基酚浓度的对数值(x)为横坐标，颜色强度(y)为纵坐表，制图后，得到不同土壤中对硝基酚浓度与颜色强度之间的关系，结果如图4中(a)和(b)所示。
其中，黄宗壤：y＝16.8x-15.9(相关系数R2＝0.979)；
黑土：y＝15.6x-12.7(相关系数R2＝0.938)；
紫土：y＝15.7x-13.5(相关系数R2＝0.980)；
红壤：y＝21.7x-17.6(相关系数R2＝0.985)。
(2)随机选择对硝基酚污染的土壤提取液(黄棕壤A1-10、黑土M1-10、紫土I1-10、红壤U1-10)和两种采集于南京的对硝基酚污染土壤提取液(黄棕壤SA和SB)进行测试，如图6所示，将实施例1中制备得到的试纸条分别放入100μL各土壤提取液和900μL LB培养基的混合液中，反应150min立即读取初始显色颜色强度(参见上述方法)，然后滴加X-gal等待150min，待反应完毕，读取反应后显色颜色强度，将初始显色颜色强度与反应后显色颜色强度对比得出颜色强度，然后根据构建的对硝基酚比色卡(标准曲线方程)计算出该颜色强度所对应的对硝基酚的浓度，进而得到各土壤提取液样品的对硝基酚浓度，同时利用高效液相色谱检测各土壤提取液样品的对硝基酚浓度以验证采用试纸条检测的准确性和可靠性，结果如图5中(a)和(b)所示。结果证明采用试纸条进行测试结果为稳定且具重现性。因此可以认定该方法可靠可行，具有实际应用价值。
综上所述，本发明提供了一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用。本发明中用于检测对硝基酚的试纸条包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的E.coliBL21菌株，所述E.coli BL21菌株携带有pPNP-LacZ质粒，当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与pPNP-LacZ质粒中的阻遏蛋白pobR的结合消除了pobR与操纵基因位点pobO的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。本发明提供的试纸条在有效检测土壤中对硝基酚含量的同时并不引入任何有机化学试剂，为土壤中生物有效态对硝基酚的研究提供了有力手段。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7071
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120
gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180
cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 240
acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag 300
cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360
cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420
actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 480
ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 540
ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 600
gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660
agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720
cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct 780
tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840
cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 900
cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960
cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 1020
ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 1080
cacattcacc accctgaatt gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt 1140
tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta 1200
ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat 1260
gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga 1320
aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga 1380
tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt 1440
agaggatcga gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc 1500
ggataacaat tcccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatgg 1560
gcagcagcca tcatcatcat catcacagca gcggcctggt gccgcgcggc agccatatgg 1620
ctagcatgac tggtggacag caaatgggtc gcggatccat gcccctgaag aaccgcttgc 1680
tggcccgcct gtcctgtgtt gcggccgtgg tggccgccac ggccgccgtt gcaccgttga 1740
cgctggtgtc caccgcccgc gccgccgcac cgcaggtgcg cacctcggcc cccggctact 1800
accggatgct gctgggcgac ttcgaaatca ccgcgctgtc ggacggcacg gtggcgctgc 1860
cggtcgacaa gcggctgaac cagccggccc cgaagacgca gagcgcgctg gccaagtcct 1920
tccagaaagc gccgctcgaa acctcggtca ccggttacct cgtcaacacc ggctccaagc 1980
tggtgctggt ggacaccggc gcggccggcc tgttcggccc caccctgggc cggctggcgg 2040
ccaacctcaa ggccgcaggc tatcagcccg agcaggtcga cgagatctac atcacccaca 2100
tgcaccccga ccacgtgggc ggcttgatgg tgggtgagca actggcgttc ccgaacgcgg 2160
tggtgcgtgc ggaccagaaa gaagccgatt tctggctcag ccagaccaac ctcgacaagg 2220
ccccggacga cgagagcaaa ggcttcttca aaggcgccat ggcctcgctg aacccctatg 2280
tgaaggccgg caagttcaag cctttctcgg ggaacaccga cctggtgccc ggcatcaaag 2340
cgctggccag ccacggccac accccgggcc acaccaccta cgtggtcgaa agccaggggc 2400
aaaagctcgc cctgctcggc gacctgatac tcgtcgccgc ggtgcagttc gacgacccca 2460
gcgtcacgac ccagctcgac agcgacagca agtccgtcgc ggtggagcgc aagaaggcct 2520
tcgcggatgc cgccaagggc ggctacctga tcgcggcgtc ccacctgtcg ttccccggca 2580
tcggccacat ccgcgccgaa ggcaagggct accgtttcgt gccggtgaac tactcggtcg 2640
tcaaccccaa gtgataacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 2700
caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 2760
ggaggaacta tatccggatt tataccagat tgcgcagttc gttggcagtg ttgcgcagca 2820
acggtaacac ctggtcgatg aggtactggg gttgaacccg attagtctgg gacaggcagt 2880
tcagggctgc aatcgtcagc ccttgtgcgt tgaggactgg aaccgcaatg ccaatcacac 2940
cgagctcata ttcttccgtg gttaagcagt aatccgactg acgaacggca tccagggttt 3000
caagaaaggt gtgttcatcg gtgatggtat acggcgtcag gcgtttcagg ccatacttct 3060
cgatccactc gatctgtact tcgcgatcaa gcacgctaag aagcacttta ccggttgcga 3120
tagcatgcgc aggcagacga ttccctaagt gcatgccata cggactgagg cggttgtctt 3180
gctgaggcag ataggaacgg gcgactggaa ccacctcgtg ttcatccagg accacaatgg 3240
taaacgtcag actcgtctgc gcacacagca gattgaggaa agattgggcc actttcggca 3300
aatgcgctga actcagatag ctcgaagaga agcgcaaaac acgatgggtt aaccagaagt 3360
agtgttcgtc agtatccagg taacccagaa acttcagggt tttcagatag cgacgagctg 3420
ctgtacggct aatgccggtg cgttcagcta cctgtgtcac gtttaagcgc tgccgatcaa 3480
tgccaaacgc ttccagtaac gccagacctt ttgccagtcc cgcgatgtag tcctctgtac 3540
gaatctcttc gctcgaatgc ggatgcgcca aatactgatg gtgttgttcc ataacattca 3600
aatccaaaat ggttttgtcc gatcatcgga cagttgtaat gctaatcgga taattttgag 3660
ccttgattat agatgtcttt ttaatgaggc ggtactttaa aaatagaaaa tagcaaggag 3720
atatacatat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc 3780
cccgggtacc gagctcgaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 3840
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 3900
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 3960
gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4020
ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat aggagatccg gctgctaaca aagcccgaaa 4080
ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc 4140
taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat tggcgaatgg 4200
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 4260
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 4320
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 4380
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 4440
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 4500
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 4560
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 4620
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 4680
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 4740
aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 4800
attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 4860
gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 4920
aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 4980
agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc 5040
aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 5100
tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 5160
aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 5220
atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 5280
ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 5340
cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 5400
tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 5460
ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 5520
taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 5580
actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 5640
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 5700
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 5760
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 5820
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caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 5940
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 6000
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 6060
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 6120
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 6180
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tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 6300
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 6360
ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 6420
ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc 6480
ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta caatctgctc 6540
tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct 6600
gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 6660
tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 6720
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aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg t 7071
<210> 2
<211> 7470
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120
gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180
cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 240
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cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360
cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420
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gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660
agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720
cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct 780
tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840
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cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960
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ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttaccc acagaatcag 1380
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 1440
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 1500
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1560
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 1620
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 1680
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 1740
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 1800
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 1860
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 1920
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 1980
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 2040
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 2100
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 2160
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 2220
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctctttcgt tcatccatag 2280
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 2340
gtgctgcaat aataccgcgg gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 2400
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 2460
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 2520
ttgttgccat cgctacaggc atcgtggtat cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 2580
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgcgc aaaaaagcgg 2640
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgccgtg ttatcactca 2700
tggttatggc agcactacat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 2760
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 2820
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 2880
tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 2940
gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 3000
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 3060
ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 3120
attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttag 3158
<210> 5
<211> 3085
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaatcatt tatataattc gtccatgcca cctgttgagt 180
gtcgtccctc tgctcgttca tactgttcga cgatcgtata gtcttcatta tgactcgtga 240
tatccagctt aatattgacg ttatatgcgc ctggcagttg aactggtttc ttagctttat 300
aagtcgtttt gacttccgca tcatagtgac caccatcttt taatttcaac cgctgtttaa 360
tttcaccttt caaagcgcca tcttctggat acatgcgttc actgctcgct tcccaaccca 420
tagttttctt ttgcattact ggtccatctg acggaaaatt cgtacctcgc aacttaacct 480
tgtaaataaa ttcaccatct tgcaacgaag aatcttgagt tactgtaaca acgccaccgt 540
cttcaaagtt cataacacgt tcccacttaa atccttctgg aaaacttaac ttcaaataat 600
ccggaatatc ggcagggtgc tttacgtaag ctttcgatcc atacatgaac tgtggactca 660
aaatatccca agcaaatggc agcggacctc ccttagtgac ttttaacttc gccgtctgcg 720
taccttcata cggacgccct tcgccctcac cttcaatctc aaattcatga ccattgaccg 780
acccttccat atgcacttta aaccgcataa attccttgat aatcgccata ttatcctcct 840
ccccttttga aaccatatct gaattcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 900
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 960
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 1020
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 1080
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 1140
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 1200
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 1260
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 1320
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 1380
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 1440
ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 1500
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 1560
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 1620
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 1680
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 1740
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 1800
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 1860
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 1920
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 1980
tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 2040
agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 2100
gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 2160
ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 2220
gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 2280
cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 2340
acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 2400
cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 2460
cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 2520
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 2580
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 2640
atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 2700
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 2760
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 2820
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 2880
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 2940
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 3000
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 3060
aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3085

Claims (6)

1.一种用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的E. coli BL21菌株，所述E. coli BL21菌株携带有pPNP-LacZ质粒，所述pPNP-LacZ质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述用于检测对硝基酚的试纸条还包括设置在所述试纸基体上的β-半乳糖苷酶显色底物；所述试纸基体为长方形，沿所述试纸基体的长度方向上，携带有pPNP-LacZ质粒的E. coli BL21菌株和β-半乳糖苷酶显色底物设置在所述试纸基体的1/8~1/2处；
所述β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。
2.根据权利要求1所述的用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有pPNP-LacZ质粒的E. coli BL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/4处。
3.根据权利要求1所述的用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，所述试纸基体为滤纸。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的用于检测对硝基酚的试纸条的制备方法，其特征在于，包括步骤：
利用引物聚合酶链反应，从pPNP-mrfp质粒上克隆pPNP基因片段的基因序列，从pCU19质粒上克隆LacZ报告基因片段的基因序列，所述pPNP-mrfp质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；
将所述pPNP基因片段的基因序列和所述LacZ报告基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
将所述连接产物转入到E. coli DH5α感受态细胞中，得到E. coli DH5α/pPNP-LacZ菌种；
将所述E. coli DH5α/pPNP-LacZ菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取pPNP-LacZ质粒，通过质粒热击转化法，将提取的pPNP-LacZ质粒导入到E. coli BL21菌株中，得到携带有pPNP-LacZ质粒的E. coli BL21菌株，记作E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株；
将所述E. coli BL21/pPNP-LacZ菌株接种于含有卡那霉素的液体培养基中，培养后收集，加入到含有乳糖和多粘菌素B的培养基中复苏；
将复苏后的菌株细胞悬液滴加在试纸基体上，在室温下风干后冷冻干燥，得到所述用于检测对硝基酚的试纸条；
扩增pPNP基因片段采用的引物：
正向引物序列：GAGATCCGGCTGCTAACAAAGC；
反向引物序列：ATGTATATCTCCTTGCTATTTTCTATTTT；
扩增LacZ报告基因片段采用的引物：
正向引物序列：AAAATAGAAAATAGCAAGGAGATATACATATGACCATGATTACGCCAA；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCCTATGCGGCATCAGAGCA。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
将所述连接产物转入到E. coli DH5α感受态细胞中，得到E. coli DH5α/pPNP- LacZ菌种，利用引物聚合酶链反应鉴定所述E. coli DH5α/pPNP-LacZ菌种中的pPNP-LacZ质粒；
所述鉴定采用的引物：
正向引物序列：GCAAATGGGTCGCGGATCC；
反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的用于检测对硝基酚的试纸条在检测土壤中可提取态对硝基酚中的应用。
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