ES2713526T3 - Procedimiento de producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos usando microorganismos que tienen capacidad de producir aceite - Google Patents
Procedimiento de producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos usando microorganismos que tienen capacidad de producir aceite Download PDFInfo
- Publication number
- ES2713526T3 ES2713526T3 ES10800069T ES10800069T ES2713526T3 ES 2713526 T3 ES2713526 T3 ES 2713526T3 ES 10800069 T ES10800069 T ES 10800069T ES 10800069 T ES10800069 T ES 10800069T ES 2713526 T3 ES2713526 T3 ES 2713526T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- acid
- fatty acid
- lipase
- free fatty
- oil
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 38
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 title claims abstract description 38
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 27
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 title claims description 26
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 25
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 title description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 53
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 241001524101 Rhodococcus opacus Species 0.000 claims abstract description 21
- 108020002334 Monoacylglycerol lipase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 claims abstract description 15
- 102000005398 Monoacylglycerol Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 claims abstract description 12
- -1 alkyl fatty acid ester Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 101001018712 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Monoacylglycerol lipase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101000574288 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Monoglyceride lipase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101000574287 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Putative monoglyceride lipase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MBMBGCFOFBJSGT-SFGLVEFQSA-N docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-SFGLVEFQSA-N 0.000 claims description 4
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N docosahexaenoic acid Natural products CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 claims description 4
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 claims description 4
- SBHCLVQMTBWHCD-METXMMQOSA-N (2e,4e,6e,8e,10e)-icosa-2,4,6,8,10-pentaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O SBHCLVQMTBWHCD-METXMMQOSA-N 0.000 claims description 3
- HXWJFEZDFPRLBG-UHFFFAOYSA-N Timnodonic acid Natural products CCCC=CC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O HXWJFEZDFPRLBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 3
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 claims description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 claims description 2
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 claims description 2
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000021353 Lignoceric acid Nutrition 0.000 claims description 2
- CQXMAMUUWHYSIY-UHFFFAOYSA-N Lignoceric acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCC1=CC=C(O)C=C1 CQXMAMUUWHYSIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000021322 Vaccenic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M Vaccenic acid Natural products CCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC([O-])=O UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M 0.000 claims description 2
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 claims description 2
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 claims description 2
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims description 2
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 2
- FARYTWBWLZAXNK-WAYWQWQTSA-N ethyl (z)-3-(methylamino)but-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C(\C)NC FARYTWBWLZAXNK-WAYWQWQTSA-N 0.000 claims description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-QXMHVHEDSA-N gadoleic acid Chemical compound CCCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-QXMHVHEDSA-N 0.000 claims description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 claims description 2
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 claims description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- WBHHMMIMDMUBKC-XLNAKTSKSA-N ricinelaidic acid Chemical compound CCCCCC[C@@H](O)C\C=C\CCCCCCCC(O)=O WBHHMMIMDMUBKC-XLNAKTSKSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003656 ricinoleic acid Drugs 0.000 claims description 2
- FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N ricinoleic acid Natural products CCCCCCC(O[Si](C)(C)C)CC=CCCCCCCCC(=O)OC FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N trans-vaccenic acid Chemical compound CCCCCC\C=C\CCCCCCCCCC(O)=O UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N 0.000 claims description 2
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 abstract description 7
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 abstract description 7
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 56
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 56
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 17
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000119319 Rhodococcus opacus PD630 Species 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 7
- 101710136418 NADPH-dependent 1-acyldihydroxyacetone phosphate reductase Proteins 0.000 description 6
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 4
- 101150002333 MSMEG_0220 gene Proteins 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- 241001478327 Azospirillum sp. Species 0.000 description 2
- 229910016374 CuSO45H2O Inorganic materials 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 101100237458 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) MSMEG_0220 gene Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229920000180 alkyd Polymers 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000008162 cooking oil Substances 0.000 description 2
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000726118 Acidovorax facilis Species 0.000 description 1
- 241000192706 Aphanocapsa sp. Species 0.000 description 1
- 241000178563 Aphanothece sp. Species 0.000 description 1
- 241000003610 Aplanochytrium Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000894009 Azorhizobium caulinodans Species 0.000 description 1
- 241000099686 Azotobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000190909 Beggiatoa Species 0.000 description 1
- 241001520610 Beijerinckia sp. Species 0.000 description 1
- 241000839432 Blakeslea sp. Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 description 1
- 241001468186 Caryophanon latum Species 0.000 description 1
- 241000863013 Caulobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241001353638 Chlorogloea Species 0.000 description 1
- 241000190831 Chromatium Species 0.000 description 1
- 241000941525 Chromobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 1
- 241001478312 Comamonas sp. Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241001282408 Crypthecodinium sp. Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000980491 Derxia sp. Species 0.000 description 1
- 241000605777 Desulfobotulus sapovorans Species 0.000 description 1
- 241000193104 Desulfonema Species 0.000 description 1
- 241000204669 Desulfosarcina variabilis Species 0.000 description 1
- 241000486143 Ectothiorhodospira sp. Species 0.000 description 1
- 241001462977 Elina Species 0.000 description 1
- 241001480508 Entomophthora Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000589564 Flavobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000204942 Halobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000204988 Haloferax mediterranei Species 0.000 description 1
- 241001051274 Herbaspirillum autotrophicum Species 0.000 description 1
- 241000588117 Hydrogenophaga sp. Species 0.000 description 1
- 241000862979 Hyphomicrobium sp. Species 0.000 description 1
- 241000261919 Ilyobacter delafieldii Species 0.000 description 1
- 241000003482 Japonochytrium Species 0.000 description 1
- 241001610708 Labrys monachus Species 0.000 description 1
- 241000520773 Lamprocystis roseopersicina Species 0.000 description 1
- 241001516471 Lampropedia hyalina Species 0.000 description 1
- 241000589268 Legionella sp. Species 0.000 description 1
- 241000862991 Leptothrix <Bacteria> Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000589309 Methylobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000589352 Methylosinus sp. Species 0.000 description 1
- 241000191936 Micrococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241001558147 Mortierella sp. Species 0.000 description 1
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241001148162 Nitrobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000187681 Nocardia sp. Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001663787 Oscillatoria limosa Species 0.000 description 1
- 241000589597 Paracoccus denitrificans Species 0.000 description 1
- 241001507683 Penicillium aurantiogriseum Species 0.000 description 1
- 241000607606 Photobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000235400 Phycomyces Species 0.000 description 1
- 241000224485 Physarum Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 241001385948 Pythium sp. Species 0.000 description 1
- 241000529919 Ralstonia sp. Species 0.000 description 1
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 241000191021 Rhodobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241001302476 Rhodocyclus sp. Species 0.000 description 1
- 241000191033 Rhodomicrobium vannielii Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 241001466451 Stramenopiles Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000191001 Thiocapsa Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ASUAYTHWZCLXAN-UHFFFAOYSA-N prenol Chemical compound CC(C)=CCO ASUAYTHWZCLXAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229960004274 stearic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003509 tertiary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000019871 vegetable fat Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un procedimiento de producción de un éster alquílico de ácido graso usando Rhodococcus opacus, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) cultivar Rhodococcus opacus que tiene la capacidad de producir aceite y transformado con un primer gen que codifica una triacilglicerol lipasa y un segundo gen que codifica una monoacilglicerol lipasa, produciendo así aceite; (b) inducir la autolisis del aceite producido en Rhodococcus opacus para producir un ácido graso libre, en el que la autolisis es llevada a cabo en Rhodococcus opacus mediante la triacil glicerol lipasa y la monoacil glicerol lipasa; y (c) agregar un alcohol al ácido graso libre producido y hacer reaccionar el alcohol con el ácido graso libre para producir un éster alquílico de ácido graso, en el que el primer gen comprende la SEQ ID NO: 19, y el segundo gen comprende el gen de la lipasa MAG de M. smegmatis producido por amplificación por PCR de ADN genómico de M. smegmatis con los cebadores de la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14 de acuerdo con el Ejemplo 2.
Description
DESCRIPCION
Procedimiento de produccion de esteres alqmlicos de acidos grasos usando microorganismos que tienen capacidad de producir aceite
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un procedimiento de produccion de un ester alqmlico de acido graso usando Rhodococcus opacus que tiene la capacidad de producir aceite, y mas particularmente a un procedimiento de produccion de un ester alqmlico de acido graso, comprendiendo el procedimiento el cultivo de Rhodococcus opacus que tiene la capacidad para producir aceite, acumulando asf una gran cantidad de aceite en los microorganismos, induciendo la autolisis del aceite producido en Rhodococcus opacus para producir un acido graso libre, y convirtiendo el acido graso libre en un ester alqmlico.
Antecedentes de la invencion
Recientemente, debido a los altos precios del petroleo y las preocupaciones medioambientales, la produccion microbiana de biocombustibles ha recibido una gran atencion. Ademas, el biodiesel ha sido sustituido por un aceite liviano, o una mezcla de biodiesel con aceite liviano ha surgido como un combustible alternativo que se puede usar en motores diesel, y por lo tanto el tamano de mercado del biodiesel ha aumentado rapidamente. En la Union Europea (UE) en 2008, se produjeron 6,6 millones de toneladas de biodiesel, lo que representa un tamano de mercado de 5,5 mil millones de euros (Biodiesel Market, Frost & Sullivan). Ademas, en Estados Unidos. En 2006, se produjeron 3 mil millones de galones de biodiesel (Biodiesel Market, Global Industry Analysts Inc, 2006. 5).
El biodiesel es ventajoso porque tiene una alta tasa de combustion y, por lo tanto, una baja emision de gases venenosos, un valor de calentamiento aproximadamente 10 % mas bajo que el del petroleo ligero y un punto de ignicion mas alto que el del petroleo ligero, lo que indica que es mas estable durante almacenamiento y transporte. El biodiesel se ha producido principalmente al procesar los componentes grasos de los animales y las plantas para que tengan propiedades similares a las de los aceites ligeros o para permitir que los aceites y grasas vegetales (salvado de arroz, aceite de cocina de desecho, aceite de soja, aceite de colza, etc.) reaccionen con alcohol. Sin embargo, en este caso, hay un inconveniente en que es diffcil producir biodiesel en grandes cantidades. Por lo tanto, si el biodiesel adecuado como combustible alternativo para el aceite liviano se produce en grandes cantidades usando microorganismos, la importacion de petroleo crudo disminuira y la emision de gases de efecto invernadero disminuira, lo que provocara efectos ambientales.
Mientras tanto, el aceite es un portador de energfa que se sintetiza y se acumula en las celulas microbianas cuando los microorganismos son ricos en fuentes de carbono, pero carecen de otros factores de crecimiento (nitrogeno, fosforo, oxfgeno, azufre, etc.). Cuando el entorno de crecimiento microbiano cambia de modo que los otros factores de crecimiento se suministran a los microorganismos, el aceite acumulado se degradara y se usara como fuente de energfa.
Se sabe que el aceite puede consistir en mas de 100 tipos de monomeros, dependiendo del tipo de microorganismo productor de aceite, el tipo de material qmmico suministrado, los cambios en las condiciones de cultivo, etc.
Recientemente, se desarrollo la tecnologfa de produccion de ester alqmlico de acido graso mediante la adicion de alcohol a acido graso vegetal tal como cana de azucar, y el ester alqmlico de acido graso producido se esta usando actualmente como combustible biodiesel. Ademas, los procedimientos para esterificar acidos grasos libres se describen en la Publicacion de Patente Europea No. 127104A, en la Publicacion de Patente Europea No. 184740A y en la Patente Estadounidense No. 4,164,506. De acuerdo con las descripciones de estas patentes, se lleva a cabo una reaccion de esterificacion calentando una mezcla de acidos grasos y trigliceridos de acidos graso junto con metanol. Ademas, la Publicacion de Patente Europea No. 708813A describe un procedimiento de produccion de ester alqmlico de acidos grasos a partir de aceites y grasas en un mayor rendimiento, en el cual el acido graso libre se separa de una glicerina resultante del intercambio de ester y luego se esterifica.
El documento WO 2008/151149 describe un procedimiento de produccion de diesel renovable que comprende:
(a) cultivar una poblacion de microorganismos en presencia de una fuente de carbono fija, en donde:
(i) los microorganismos acumulan al menos el 10 % de su peso celular seco como lfpidos; y (ii) la fuente de carbono fija se selecciona del grupo que consiste en glicerol, material celulosico despolimerizado, sacarosa, melaza, glucosa, arabinosa, galactosa, xilosa, fructosa, arabinosa, manosa, acetato y cualquier combinacion de los anteriores;
(b) aislar componentes lipfdicos de los microorganismos cultivados; y
(c) someter los componentes lipfdicos aislados a una o mas reacciones qmmicas para generar alcanos de cadena lineal, mediante lo cual se produce diesel renovable.
El documento WO 2009/035551 describe un procedimiento de produccion de un aceite biologico que comprende cultivar un microorganismo del reino Stramenopile mediante fermentacion heterotrofica usando materia prima que contiene celulosa como fuente de carbono, en donde aproximadamente del 11 % a aproximadamente el 99 % de los acidos grasos insaturados en dicho aceite biologico son acidos grasos poliinsaturados.
Sin embargo, en este procedimiento, es diffcil obtener grandes cantidades de acidos grasos o acidos grasos libres. Ademas, es diffcil aumentar la acumulacion y la produccion de acidos grasos vegetales que se usan actualmente con mayor frecuencia, debido a que el penodo de crecimiento de las plantas es largo y un enfoque de ingeniena metabolica para producir los acidos grasos vegetales es algo diffcil.
Por consiguiente, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar un nuevo procedimiento capaz de producir un ester alqrnlico de acido graso, que se puede usar como biodiesel, con alta eficiencia y productividad usando una metodologfa de ingeniena metabolica, y como resultado, han encontrado que el ester alqrnlico de acido graso se puede producir con alta eficiencia al maximizar la produccion de aceite en microorganismos productores de aceite usando un procedimiento de ingeniena metabolica, y luego inducir la autolisis del aceite en los microorganismos para producir un acido graso libre que luego es convertido en un ester de alquilo, completando asf la presente invencion.
Divulgacion de la invencion
Un objeto de la presente invencion es proporcionar un nuevo procedimiento capaz de producir grandes cantidades de un ester alqrnlico de acidos grasos, que se puede usar como biodiesel, con alta eficiencia y productividad usando una metodologfa de ingeniena metabolica.
Para lograr el objeto anterior, la presente invencion proporciona un procedimiento de produccion de un ester alqrnlico de acido graso usando Rhodococcus opacus, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar Rhodococcus opacus que tiene la capacidad de producir aceite y transformarse con un primer gen que codifica una triacilglicerol lipasa y un segundo gen que codifica una monoacil glicerol lipasa, produciendo asf aceite;
(b) inducir la autolisis del aceite producido en Rhodococcus opacus para producir un acido graso libre, en donde la autolisis es llevada a cabo en Rhodococcus opacus mediante triacil glicerol lipasa y monoacil glicerol lipasa; y
(c) agregar un alcohol al acido graso libre producido y hacer reaccionar el alcohol con el acido graso libre para producir un ester alqrnlico de acido graso,
en donde el primer gen comprende la SEQ ID NO: 19, y el segundo gen comprende el gen de la lipasa MAG de M. smegmatis producido por amplificacion por PCR de ADN genomico de M. smegmatis con los cebadores de la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14 de acuerdo con el Ejemplo 2.
Otras caractensticas y realizaciones de la presente invencion seran mas evidentes a partir de las siguientes descripciones detalladas y las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra un proceso de produccion de un ester mefflico de acido graso con alta eficiencia a partir del aceite ffpico de triacilglicerol (TAG) usando Rhodococcus opacus PD630.
La figura 2 muestra mapas geneticos de los vectores recombinantes rpROUC18 (a) y rpROUC18_KM (b). La figura 3 muestra un mapa genetico del vector recombinante pRUCSdpMag que contiene los genes sdp1 y MSMEG_0220.
La figura 4 muestra los tipos y la informacion de plasmidos hechos en base a la informacion que se muestra en la Tabla 1.
La figura 5 muestra los resultados del analisis por cromatograffa de gases de acidos grasos libres.
Las figuras 6 y 7 muestran los resultados del analisis por cromatograffa de gases del ester mefflico de acidos grasos.
Mejor modo para llevar a cabo la invencion
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cienffficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece la invencion. En general, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos experimentales son aquellos bien conocidos y comunmente empleados en la tecnica.
La definicion de los terminos principales usados en la descripcion detallada de la invencion es la siguiente.
Como se usa en este documento, el termino "aceite" se refiere a un portador de ene^a que se sintetiza y se acumula en las celulas de los microorganismos cuando los microorganismos son ricos en fuentes de carbono, pero carecen de otros factores de crecimiento (nitrogeno, fosforo, ox^geno, azufre, etc.). Es un precursor de acidos grasos libres que se hidroliza en acidos grasos libres y glicerol.
Como se usa en el presente documento, el termino "acidos grasos" se refiere a un tipo de cadena de acidos monocarboxflicos saturados o insaturados. Estos acidos grasos se clasifican de acuerdo con la longitud de la cadena de carbono y la saturacion, y los acidos grasos resultantes de la hidrolisis del aceite (es decir, la grasa) se denominan "acidos grasos libres".
En un aspecto, la presente invencion esta dirigida a un procedimiento de produccion de un ester alqrnlico de acido graso usando Rhodococcus opacus, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar Rhodococcus opacus que tiene la capacidad de producir aceite y transformarse con un primer gen que codifica una triacilglicerol lipasa y un segundo gen que codifica una monoacil glicerol lipasa, produciendo asf aceite;
(b) inducir la autolisis del aceite producido en Rhodococcus opacus para producir un acido graso libre, en donde la es llevada a cabo en Rhodococcus opacus mediante triacil glicerol lipasa y monoacil glicerol lipasa; y
(c) agregar un alcohol al acido graso libre producido y hacer reaccionar el alcohol con el acido graso libre para producir un ester alqrnlico de acido graso,
en donde el primer gen comprende la SEQ ID NO: 19, y el segundo gen comprende el gen de la lipasa MAG de M. smegmatis producido por amplificacion por PCR de ADN genomico de M. smegmatis con los cebadores de la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14 de acuerdo con el Ejemplo 2.
En la presente invencion, el aceite puede ser cualquier aceite producido en microorganismos, y sus ejemplos incluyen, pero no se limitan a, triacilglicerol (TAG), diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG), fosfolfpido, lfpido de esterol, esfingolfpido, sacarolfpido, llfpidos de prenol y policetido.
En este documento, el acido graso libre que se produce por la descomposicion del aceite puede ser un acido graso saturado o insaturado, en el que el acido graso insaturado se refiere a un acido graso que tiene uno o mas enlaces dobles en la cadena de carbono, y sus ejemplos incluyen acido oleico, acido linoleico, acido linolenico, acido palmitoleico, acido ricinoleico, acido vaccenico, acido gadoleico, acido araquidonico, EPA (acido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico), acido erucico, DHA (acido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico), etc. Ademas, el acido graso saturado se refiere a un acido graso que no tiene doble enlace en la cadena de carbono, y sus ejemplos incluyen acido butmco, acido caproico, acido capnlico, acido caprico, acido laurico, acido minstico, acido palmttico, acido estearico, acido araqrndico, acido behenico, acido lignocerico, etc. El acido graso que se usa en la presente invencion puede sustituirse con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en, pero no limitado a, un grupo de anillos aromaticos, un grupo epoxi, un grupo ciano y un grupo halogeno.
En la presente invencion, el aceite que es un precursor de acido graso libre es producido por Rhodococcus opacus que tiene la capacidad de producir aceite.
Aplanochytrium sp., Aspergillus sp., Amoebobacter sp., Aphanocapsa sp., Aphanothece sp. Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium caulinodans, Azospirillum sp., Azospirillum sp., Azotobacter sp., Bacillus sp., Beggiatoa sp., Beijerinckia sp., Beneckea sp., Blakeslea sp., Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Caryophanon latum, Caulobacter sp., Chlorogloea sp., Chromatium sp., Chromobacterium sp., Clostridium sp., Comamonas sp., Corynebacterium sp., Crypthecodinium sp., Cyanobacteria sp., Derxia sp., Desulfonema sp., Desulfosarcina variabilis, Desulfovibrio sapovorans, Ectothiorhodospira sp., Elina sp., Entomophthora sp., Ferrobacillus ferroxidans, Flavobacterium sp., Haemophilus influenzae, Halobacterium sp., Haloferax mediterranei, Hydroclathratus clathratus, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenophaga sp., Hyphomicrobium sp., Ilyobacter delafieldii, Japonochytrium sp., Labrys monachus, Lamprocystis roseopersicina, Lampropedia hyalina, Legionella sp., Leptothrix discophorus, Methylobacterium sp., Methylosinus sp., Micrococcus sp., Mortierella sp., Mycobacterium sp., Nitrobacter sp., Nocardia sp., Paracoccus dentrificans, Oscillatoria limosa, Penicillium cyclopium, Photobacterium sp., Physarum ploycephalum, Phycomyces sp., Pseudomonas sp., Pythium sp., Ralstonia sp., Rhizobium sp., Rhodobacillus sp., Rhodobacter sp., Rhodococcus sp., Rhodocyclus sp., Rhodomicrobium vannielii, Rhodopseudomonas.
En la presente invencion, el cultivo en la etapa (a) puede comprender un cultivo de primer paso para el crecimiento de celulas microbianas y un cultivo de segundo paso para la produccion de aceite, en el cual el cultivo para la produccion de aceite se lleva a cabo preferiblemente en un medio que contiene una fuente de nitrogeno limitada con el fin de aumentar la produccion de petroleo.
El aceite producido por Rhodococcus opacus se somete autolisis en el microorganismo, y la autolisis en la etapa (b) se puede llevar a cabo mediante la triacilglicerol lipasa (EC: 3,1,1.34, 3,1,1,13) y la monoacilglicerol lipasa (EC: 3,1.
1,23).
Preferiblemente, un gen que codifica lipasa puede introducirse o amplificarse en los microorganismos que tienen la capacidad de producir aceite. Mas preferiblemente, un gen de lipasa que puede activarse por reaccion con un sustrato puede introducirse en los microorganismos. En un ejemplo de la presente invencion, para la autolisis de aceite en microorganismos, se uso una cepa microbiana introducida con genes de lipasa de SEQ ID NO: 5 y 8. En otro ejemplo de la presente invencion, se uso una cepa microbiana introducida con los genes de la triacilglicerol lipasa de SEQ ID NOS: 17, 18 y 19 solos o un gen de la monoacilglicerol lipasa de SEQ ID NO: 20 solo o una combinacion de los mismos.
En la presente invencion, el alcohol que se anade en la etapa (c) puede ser un alcohol primario, un alcohol secundario o un alcohol terciario. Preferiblemente, se puede usar un alcohol que tiene de 1 a 8 atomos de carbono o una mezcla de dos o mas de alcoholes que tienen de 1 a 8 atomos de carbono. Mas preferiblemente, se puede usar metanol.
Ademas, la reaccion en la etapa (c) se puede llevar a cabo a 80-120 °C durante 1-24 horas. Ademas, la reaccion en la etapa (c) se puede llevar a cabo en presencia de un disolvente organico, preferiblemente cloroformo.
En un ejemplo de la presente invencion, se uso Rhodococcus opacus PD630 como una cepa microbiana que tiene la capacidad de producir aceite, y se realizo un proceso de cultivo de dos etapas que consiste en un cultivo de primera etapa para el crecimiento de celulas microbianas y un cultivo de segunda etapa para la produccion de petroleo. En el cultivo de la segunda etapa para la produccion de petroleo, se uso un medio con una fuente limitada de nitrogeno para inducir la produccion de petroleo. Para la autolisis del aceite producido, se introdujo un gen de lipasa que se activa con acetamida en la cepa microbiana, y la lipasa activada agregando acetamida a los microorganismos se uso para producir aproximadamente 0,27 g/L de acido graso libre in vivo.
Ademas, la solucion de acido graso libre obtenida se liofilizo para eliminar el agua, despues se le agregaron cloroformo y metanol que conterna H2SO4 y se dejo reaccionar a 100 °C durante 12 horas. Luego, se anadio agua y se separo la capa de disolvente organico, obteniendo asf el ester metflico de acidos grasos libres. La concentracion del ester metflico de acidos grasos libres producido fue de 0,2 g/L, lo que sugiere que se logro la conversion del acido graso libre en el ester metflico de acidos grasos libres (Figura 1). Esto demostro que el uso del procedimiento de acuerdo con la presente invencion permite que se produzca un ester metflico de acidos grasos con alta eficiencia en un procedimiento mas facil y respetuoso con el medio ambiente, lo que indica que el procedimiento de la presente invencion es muy util para la produccion de biodiesel como un sustituto del aceite liviano o similar.
En otro ejemplo de la presente invencion, se uso una cepa microbiana introducida con un gen de la triacilglicerol lipasa solo o un gen de la monoacilglicerol lipasa solo o una combinacion de los mismos, y luego se vio que, cuando el gen de la triacilglicerol lipasa y el gen de la monoacilglicerol lipasa se introdujeron juntos en la cepa microbiana, se produjo una mayor cantidad de acido graso libre a partir de la misma cantidad de glucosa en comparacion a cuando se introdujo el gen de la triacilglicerol lipasa o el gen de la monoacilglicerol lipasa, y se produjo un ester metflico de acido graso con mayor eficiencia cuando el gen de la triacilglicerol lipasa y el gen de la monoacilglicerol lipasa se introdujeron juntos. Por lo tanto, en la presente invencion, el gen de la triacilglicerol lipasa y el gen de la monoacilglicerol lipasa se introducen juntos en una cepa microbiana.
Mientras tanto, los siguientes ejemplos de la presente invencion ilustran solo medios espedficos y procedimientos de cultivo, sera obvio para los expertos en la materia usar una solucion glicolttica como suero o CSL (licor de mafz) y otros medios, y usar diversos procedimientos de cultivo, como el cultivo discontinuo o el cultivo continuo, como se informa en la literatura (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001).
Ejemplos
En lo que sigue, la presente invencion se describira con mas detalle con referencia a ejemplos.
Ademas, aunque los siguientes ejemplos ilustran que se usa metanol como alcohol en un proceso de esterificacion de un acido graso libre, sera obvio para una persona experta en la tecnica que se pueden usar otros alcoholes para esterificar acidos grasos libres, produciendo asf diversos tipos de esteres alqrnlicos de acidos grasos.
Ejemplo 1: Preparacion (1) de la cepa recombinante Rhodococcus opacus PD630 con introduccion de genes que inducen la autolisis del aceite
1-1. Construccion del plasmido pRUCSdp
Un vector recombinante de rpROUC18 (SEQ ID NO: 1) y un vector recombinante de rpROUC18_KM (SEQ ID NO: 2), que tienen los mapas geneticos mostrados en la Figura 2, se prepararon a partir de un plasmido pUC18 (Phamacia, Biotech, Uppsala, Suecia) y luego se introdujeron fragmented de genes de la siguiente manera.
En primer lugar, se realizo PCR usando el ADN genomico de Arabidopsis thaliana col. como plantilla con cebadores sintetizados de SEQ ID NOS: 3 y 4, construyendo asf un fragmento del gen sdpl que codifica la triacilglicerol lipasa.
SEQ ID NO: 3: 5'-TATAGGCGCCATGGATATAAGTAATGAGGC-3'
SEQ ID NO: 4: 5'-TGTCCTGCAGCTAAGCATCTATAACACTAC-3'
Luego, el fragmento sdpl preparado (SEQ ID NO: 5) se trato con enzimas de restriccion (NarI y PstI) y luego se ligo en un plasmido rpROUC18 (Phamacia, Biotech, Uppsala, Suecia) mediante ADN ligasa T4, construyendo asf el plasmido recombinante pRUCSdp.
1- 2. Construccion del plasmido pRUCSdpMag
Se realizo PCR usando el ADN genomico de Mycobacterium smegmatis (KCTC 9108) como plantilla con cebadores sintetizados de SEQ ID NOS: 6 y 7, construyendo asf un fragmento del gen MSMEG-0220 que codifica la monoacilglicerol lipasa.
SEQ ID NO: 6:
5 ' -
TATATCTAGAACAACGGGGAGGACAACCGAATGGTGAGCAGCACCCGCAGTGAACAC-3'
SEQ ID NO: 7: 5'-TATATCTAGATCACAGATGACTCACGATCCATGAG-3'
Luego, el fragmento MSMEG_0220 preparado (SEQ ID NO: 8) se trato con una enzima de restriccion (XbaI) y luego se ligo en un plasmido pRUCSdp mediante la ADN-ligasa T4, construyendo asf el plasmido recombinante pRUCSdpMag que se muestra en la Figura 3. Luego, el plasmido recombinante preparado pRUCSdpMag se introdujo en una cepa Rhodococcus opacus PD630 DSM 44193 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Alemania), construyendo asf una cepa recombinante introducida con un gen de lipasa que se activa con acetamida.
Ejemplo 2: Preparacion (2) de cepas recombinantes de Rhodococcus opacus PD630 con introduccion de genes que inducen la autolisis del aceite
2- 1. Construccion de plasmidos.
Usando los cebadores, las condiciones y las plantillas de genes mostrados en la Tabla 1 a continuacion, se construyeron diversos plasmidos como se muestra en la Figura 4 introduciendo triacilglicerol lipasa y monoacilglicerol lipasa en el plasmido rpROUC18 y un plasmido rpROUC18_KM del Ejemplo 1-1. Ademas, la triacilglicerol lipasa y la monoacilglicerol lipasa tambien se introdujeron juntos en los plasmidos. La tabla 1 a continuacion indica los tipos de enzimas de restriccion y los ongenes de los genes, y, ademas, se pueden introducir diversos tipos de genes.
Como se describe en el Ejemplo 1, se uso un promotor inducido por la acetamida en el plasmido rpROUC18 de manera que el gen introducido podna operarse en el momento deseado, en el que la acetamida se uso a una concentracion del 0,5 % (p/p).
Cebador ARAT_f (SEQ ID NO: 9)
5'-TATATTCCATGGGGAGGACAACATATAAGTAATGAGGCTAGT-3'
Cebador ARAT-r (SEQ ID NO: 10)
5'-CCGCCTGCAGCTAAGCATCTATAACACTAC-3'
Cebador ATAG7_f (SEQ ID NO: 11)
5'-TATTGACGTCGACAACGGGGAGGACAACCGAATGGAACGCGGATCCACTTG-3'
Cebador ATAG7-r (SEQ ID NO: 12)
5'-CTTGTACTAAGTCCCGGGTTAGTGGACGACCTCGAAGC-3'
Cebador Mlip2_f (SEQ ID NO: 13)
5'-TATTGGCGCCGACAACGGGGAGGACAACCGAATGGTGAGCAGCACCCGCAGTGAA-3'
Cebador Mlip2_r (SEQ ID NO: 14)
5'-CCACGATGGACACGTTGTACTAAGTCTGCAGTCACAGATGACTCACGATCC-3'
Cebador PAO_f (SEQ ID NO: 15) 5'-TATAGACGTCATGAAGAAGAAGTCTCTGCTCCCC-3'
Cebador PAO_r (SEQ ID NO: 16)
5'-TCGAaagcttCTACAGGCTGGCGTTCTTCA-3'
[Tabla 1]
En la Figura 4, el fragmento del gen de la TAG lipasa de Arabidopsis thaliana introducido en el plasmido rpROUC18KM_Ara y en el plasmido rpROUC18KM_Ara_MAG, tiene una secuencia de SEQ ID NO: 17, y el fragmento del gen de la TAG 7G lipasa de Aspergillus fumigatus introducido en el plasmido rpROUC18KM_Af7G y en el plasmido rpROUC18KM_Af7G_MAG tiene una secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 18. Tambien, el fragmento del gen de la TAG lipasa de Pseudomonas aeruginosa introducido en el plasmido rpROUC18KM_PAO y el plasmido rpROUC18KM_PAO_MAG tiene una secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 19, y el fragmento del gen de la lipasa MAG de M. smegmatis introducido en el plasmido rpROUC18KM_MAG y en el plasmido rpROUC18KM_Ara_MAG, el plasmido rpROUC18KM_Af7G_MAG y el plasmido rpROUC18KM_PAO_MAG tiene una secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 20.
Ejemplo 3: Produccion de ester metftico de acidos grasos usando la cepa recombinante de Rhodococcus opacus PD630
3-1: Produccion (1) de acido graso libre usando la cepa recombinante de Rhodococcus opacus PD630 del Ejemplo 1 Con el fin de cultivar la cepa recombinante de Rhodococcus opacus PD630 del Ejemplo 1, introducida con el gen de la lipasa que se activa con acetamida, se realizo un cultivo de dos etapas en un medio que tiene una fuente de nitrogeno limitada para producir aceite.
En primer lugar, en el cultivo de la primera etapa, la cepa recombinante del Ejemplo 1 se cultivo en un matraz de 250 ml que contema 100 ml de NB (caldo nutritivo) a 30 °C y 250 rpm durante 24 horas.
El caldo de cultivo se centrifugo a 6000 rpm durante 10 minutos para recolectar las celulas microbianas que luego se lavaron con medio MSM (que se usa en el cultivo de segunda etapa) para eliminar el componente n B. Luego, la solucion celular se centrifugo a 6000 rpm durante 10 minutos para recolectar las celulas microbianas que luego se suspendieron en 100 ml de medio MSM. La composicion del medio MSM (pH 7,0) fue la siguiente: por litro de agua destilada, 0,8 g de KH2PO4, 5,58 g de Na2HPO4, 0,1g de (NH4)2SO4, 0,12 g de MgSO47H2O, 0,5 mg de FeSO45H2O, 1,54 mg de MnSO45H2O, 2,86 mg de H3BO3, 0,039 mg de CuSO45H2O, 0,041 mg de CoCh6H2O, 0,021 mg de ZnCl2, 0,025 mg de Na2MoO42H2O, y 11,6 mg de CaCh2H2O.
Se anadieron 20 g/l de glucosa como fuente de carbono a las celulas microbianas suspendidas en 100 ml del medio MSM, despues de lo cual las celulas microbianas se cultivaron a 30°C y 250 rpm durante 24 horas. Luego, se verifico la acumulacion de aceite en la cepa microbiana en tiempo real mediante monitorizacion microscopica. Luego, para activar la lipasa para producir acido graso libre, se agrego 0,5 % (p/v) de acetamida a las celulas microbianas que luego se cultivaron a 30 °C durante 48 horas.
Una vez completado el cultivo, el caldo de cultivo se centrifugo a 6000 rpm durante 10 minutos para recolectar las celulas. Las celulas recolectadas se lavaron una vez con agua destilada y luego se secaron en un secador a 100 °C durante 24 horas.
Las celulas secas se analizaron mediante cromatograffa de gases usando un sistema de cromatograffa de gases de la serie Agilent 6890N (Chiraldex G-TA de Astec, Estados Unidos) equipado con una columna capilar, midiendo asf el contenido de acido graso libre sintetizado en las celulas. Los resultados del cultivo en matraz de dos etapas indicaron que el acido graso libre se produjo a una concentracion de 0,27 g/l.
3-2: Produccion (2) de acido graso libre usando la cepa recombinante de Rhodococcus opacus PD630 del Ejemplo 2 Para cultivar las cepas recombinantes de Rhodococcus opacus PD630 del Ejemplo 2, introducidas con el gen de la lipasa que se activa con acetamida, se realizo un cultivo de dos etapas en un medio que tiene una fuente limitada de nitrogeno para producir aceite.
En primer lugar, en el cultivo de la primera etapa, cada una de las cepas recombinantes del Ejemplo 2 se cultivo en un matraz de 250 ml que contema 200 ml de TSB (caldo de soja tffptico) a 30 °C y 200 rpm durante 16 horas.
El caldo de cultivo se centrifugo a 3000 rpm durante 30 minutos para recolectar las celulas microbianas que luego se lavaron con medio MSM para eliminar el componente TSB. Luego, la solucion de celulas se centrifugo a 3000 rpm durante 30 minutos para recolectar las celulas microbianas que luego se suspendieron en 200 ml de medio MSM. La composicion del medio MSM (pH 7,0) fue la siguiente: por litro de agua destilada, 0,8 g de KH2PO4, 5,58 g de Na2HpO4, 0,1 g (NH4)2SO4, 0,12 g de MgSO47H2O, 1,0 mg de FeSO45H2O, 3,08 mg de MnSO45H2O, 5,72 mg de H3BO3, 0,078 mg de CuSO45H2O, 0,082 mg de CoCh6H2O, 0,042 mg de ZnCl2, 0,050 mg de Na2MoO42H2O y 23,2 mg de CaCl22H2O.
Se anadieron 20 g/l de glucosa como fuente de carbono a las celulas microbianas suspendidas en 200 ml del medio MSM, despues de lo cual las celulas microbianas se cultivaron a 30°C y 200 rpm durante 48 horas. Luego, se verifico la acumulacion de aceite en la cepa microbiana en tiempo real mediante monitorizacion microscopica. Luego, para activar la lipasa para producir acido graso libre, se agrego 0,5 % (p/v) de acetamida a las celulas microbianas que luego se cultivaron a 30 °C durante 24 horas.
Una vez completado el cultivo, el caldo de cultivo se centrifugo a 3,000 rpm durante 30 minutos para recolectar las celulas. El sobrenadante se liofilizo a -45 °C y 1,33 kPa durante 48 horas. Las celulas recolectadas se lavaron una vez con agua destilada y luego se secaron en un secador a 80 °C durante 24 horas. Se tomaron y trataron 0,1 g de cada uno de los materiales resultantes usando un sistema de identificacion microbiana (Microbial ID, Inc., Network, Del., Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, preparando asf las muestras de cromatograffa de gases.
Cada una de las muestras preparadas se analizo mediante cromatograffa de gases usando un sistema de cromatograffa de gases de la serie Agilent 6890N (Chiraldex G-TA de Astec, Estados Unidos) equipado con una columna capilar, midiendo asf el contenido de acido graso libre sintetizado en las celulas.
Los resultados del cultivo en matraz de 2 etapas como se describio anteriormente indicaron que el contenido de acido graso libre en el sobrenadante fue significativamente mayor que el contenido de acido graso libre en las celulas, lo que sugiere que el acido graso libre se secreto extracelularmente. La Figura 5 muestra los resultados de la medicion del acido graso libre en el sobrenadante liofilizado. Como puede verse en la Figura 5, el acido graso libre se produjo como una mezcla de acidos grasos libres que tienen diversas longitudes. Ademas, se pudo ver que, cuando la triacilglicerol lipasa se introdujo junto con la monoacilglicerol lipasa, se produjo una mayor cantidad de acido graso libre a partir de la misma cantidad de glucosa en comparacion con la introduccion de la triacilglicerol lipasa sola.
3-3: Conversion de acido graso libre en ester mefflico de acido graso
A la cepa microbiana seca obtenida en el Ejemplo 3-1, se agregaron 2 ml de cloroformo y se agrego 1 ml de metanol que contema 3 % (v/v) de H2SO4. La mezcla se dejo reaccionar a 100°C durante 12 horas.
Una vez completada la reaccion, la mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se anadio 1 ml de agua destilada a la mezcla, que luego se agito intensamente durante 5 minutos, con lo cual la mezcla se separo en una capa de disolvente organico (cloroformo) y una capa de agua (solucion acuosa). El material resultante se centrifugo a 10000 rpm durante 10 minutos, y solo la capa de disolvente organico se recogio y analizo por cromatograffa de gases usando un sistema de cromatograffa de gases de la serie Agilent 6890N (Chiraldex G-TA de Astec, Estados Unidos) equipado con una columna capilar, midiendo asf la concentracion de ester mefflico de acido graso producido en la capa de disolvente organico.
Como resultado, como se muestra en la Figura 6, se encontro que se produjo un ester mefflico de acido graso C13 a una concentracion de 0,2 g/l. Esto sugiere que el acido graso libre se convirtio en el ester mefflico del acido graso. Ademas, se anadio el mismo metanol descrito anteriormente y se hizo reaccionar con el sobrenadante obtenido en el Ejemplo 3-2, y luego se midio la concentracion del ester mefflico graso producido en la solucion de reaccion. Como resultado, como puede verse en la Figura 7, el acido graso libre se convirtio en ester mefflico de acido graso. En particular, se pudo observar que, cuando se introdujeron triacilglicerol lipasa (TAG lipasa) y monoacilglicerol lipasa (lipasa MAG), se produjo una cantidad significativamente mayor de metil ester de acido graso en comparacion con la introduccion de triacilglicerol lipasa (TAG lipasa) o monoacilglicerol lipasa (MAG lipasa) sola. Como se describio anteriormente, el procedimiento de produccion de ester alqrnlico de acido graso usando microorganismos de acuerdo con la presente invencion muestra una alta eficiencia de produccion, de manera que se puede usar inmediatamente para la produccion de biocombustible. Ademas, se pudo observar que la eficiencia de produccion del ester mefflico de acidos grasos de la presente invencion fue significativamente mayor que la de un procedimiento existente conocido en la tecnica.
En otras palabras, se demostro que el uso del procedimiento de acuerdo con la presente invencion permite que se produzca un ester mefflico de acido graso con una alta eficiencia en un procedimiento mas facil y respetuoso con el medio ambiente, lo que indica que el procedimiento de la presente invencion es muy util para la produccion de biodiesel como sustituto del aceite liviano o similar.
Aplicabilidad industrial
Como se describio anteriormente, de acuerdo con el procedimiento de la presente invencion, el aceite acumulado en microorganismos, como el triacilglicerol que es un aceite ffpico producido por microorganismos, se puede convertir en un ester alqrnlico de acido graso con alta eficiencia usando una metodologfa de ingenieffa metabolica. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invencion es util para la produccion industrial de un ester alqrnlico de acido graso del cual recientemente se ha encontrado que es efectivo como biodiesel.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Procedimiento de preparacion de esteres alqrnlicos de acidos grasos usando microorganismos capaces de producir aceite
<130> PP-B0941
<150> KR10-2009-0065490
<151> 2009-07-17
<160> 20
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 3181
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> rpROUC18 <400> 1
gatctaccgg ttccacgagg cgctcaacgt gtacgggcct gcgctcaagg aactcatcca 60 cgaagagttc ggtgacggca tcatgagcgc catcaacttc aaggtggaca tccagcgtcg 120 tcccgatcca gacggggacc gggtggtggt gaccttcgac gggaagttcc tcgactaccg 180 ctggtagtcc gacgcgtgcg tcaattctgg ctgatgtcaa cgggttcgaa cgcaaccgca 240 acgtcgtcgc aacatggcgt gggtagcttc gggcccgtcg acaacgggga ggacaaccga 300 ggcgccctgc aggtcgactc tagacggcat cttgcccaga tttttcccag gtaagagcgc 360 gtctcattgc caaagatttg cgactgtgcc gaatgagact gtcgggcgtc tcattccccc 420 acgtcgggcc gtctcgaaag tcagtcgcat tagaccggct catttgttgc tcaatgcgcc 480 gacttatgag actgttgagt catgacagac accgcgaaca tccccgcccc gaccggacgc 540 acattcggat acgcccgcgt ctcgacttcc cggcagaacc ttgaccgcca gatggacacg 600 ctccgcaaga tgggcgtgga cggcgaccgg atctatgccg ataaggtgac cggccgcacg 660 atggaccgcc ccgcgtggca ggtctgcaac tcgcatctgg atgccggcga cacgctcgtg 720 gtggacgcac tcgaccgttt gggacgctcc acgttggagg tcatcgacac aatccacgac 780 ctgaccgaac gcggcgtcat catcgtggac cgcacgtacc gccgcctaga tgccagtgac 340 gcggtcggga aggcgttggt gcagatcatg gcggtcatgg ccgagatgga agtcaacttg 900 aaagccgagc gtgccgccgc tgctcgtgag tccgccgccg cccgtggaaa gcacaccgga 960 cgcccccgca agctcgccaa ccacgacgtt gctcgtgccc gtgagctcga attcgtaatc 1020 atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 1080 agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 1140 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 1200
aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 1260 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 1320 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 1380 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 1440 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 1500 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 1560 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 1620 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 1680 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 1740 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 1800 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 1860 tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 1920 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 1980 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 2040 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 2100 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tetaaagtat 2160 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgottaate agtgaggcac ctatctcagc 2220 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccG gtcgtgtaga taactacgat 2280 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 2340 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc ageeggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 2400 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc egggaageta gagtaagtag 2460 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 2520 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 2580 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 2640 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggeagea ctgcataatt ctcttactgt 2700 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 2760 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca ataegggata ataccgcgcc 2820 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 2880 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 2940 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 3000 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 3060 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 3120 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 3180
<210>2
<211> 6625
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> rpROUC18_KM <400>2
cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgg gggggggggg aaagccacgt tgtgtctcaa 60 aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aaaactgtct 120 gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc 180 tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc 240 gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca 300 gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 360 agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 420 cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta 480 gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 540 ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 600 caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 660 aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg 720 gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 780 ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatettgee 840 atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 900 tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 960 ttctaagatc taccggttcc acgaggcgct caacgtgtac gggcctgcgc tcaaggaact 1020 catccacgaa gagttcggtg acggcatcat gagcgccatc aacttcaagg tggacatcca 1080 gcgtcgtccc gatccagacg gggaccgggt ggtggtgacc ttcgacggga agttcctcga 1140 ctaccgctgg tagtccgacg cgtgcgtcaa ttctggctga tgtcaacggg ttegaaegea 1200 accgcaacgt cgtcgcaaca tggcgtgggt agcttcgggc ccgtcgacaa cggggaggac 1260 aaccgaggcg ccatggatat aagtaatgag gctagtgtcg atcccttttc gattggacca 1320 tcatctatca tgggtcgaac cattgctttc agagtcttgt tctgtagate aatgtcacag 1380
cttaggcgtg atctctttcg gttcttgttg cattggtttc ttagatttaa gctgaccgtt 1440 tcaccgtttg tgtcgtggtt tcatcctcgg aaccctcaag ggattttagc ggtggttaca 1500 atcattgcct ttgtgttgaa acgatacacg aatgtgaaaa taaaggcgga aatggcttac 1560 cggaggaagt tttggaggaa tatgatgcgg acggctttga cttatgagga atgggctcat 1620 gctgctaaga tgttagagaa ggaaacacca aagatgaatg aatctgatct ttatgatgaa 1680 gagttggtta agaacaagct tcaggagctt cgtcatcgtc gccaagaagg ctcacttaga 1740 gacattatgt tttgtatgag agctgatttg gtgaggaatc tcggtaatat gtgtaattcg 1800 gagcttcata aaggtagact tcaggttcct agacatatca aagagtacat tgatgaggtg 1860 tctactcagt tgagaatggt ttgtaactct gattcagagg agctttcttt agaagagaag 1920 ctttctttta tgcatgaaac acggcatgcc tttggtagaa cggctttgct tttgagtggt 1980 ggggcttctc ttggtgcgtt tcatgttggt gtggttagga ctttggttga gcataagctt 2040 ttacctcgaa taattgctgg ttctagtgtt ggatccatca tttgtgctgt tgtggcctca 2100 aggtcttggc cagaactaca gagtttcttt gagaattctt tgcattcttt acagttcttt 2160 gatcagctcg gaggcgtgtt ctcaatagtg aaacgggtaa tgacacaagg ggctctacac 2220 gatatcagac agttgcaatg tatgcttaga aacctcacaa gcaatctcac attccaagaa 2280 gcttatgaca tgacaggaag gattctcggg atcaccgttt gctccccaag aaagcatgaa 2340 cctcctcggt gtcttaacta tttgacttcg cctcatgtgg ttatatggag cgcagtgact 2400 gcttcttgtg cttttcctgg tctctttgaa gctcaagagc taatggctaa agatcgaagt 2460 ggagagatcg taccgtatca tccacctttc aatttggatc cagaagtagg cactaaatca 2520 tcatctggac gccggtggag agatggtagt ttggaggttg atttaccaat gatgcagctt 2580 aaagaactgt tcaatgtcaa tcattttatt gtgagccaag ccaatcctca cattgctcca 2640 ttactgcgtc taaaggattt agttcgagct tatggtggta gattcgcagc taagctcgcg 2700 catctagtgg agatggaggt caaacataga tgcaaccagg tattagagct cggttttcct 2760 ctcggtggac tcgcaaagct ttttgctcag gagtgggaag gtgatgttac agttgtaatg 2820 cctgctactc ttgctcagta ctcgaagatt atacaaaatc cgactcatgt cgagcttcag 2880 aaagcggcta accaaggaag aagatgcact tgggagaagc tctcagccat aaaatcaaac 2940 tgcgggatcg agcttgcgct tgatgattct gtagctattc ttaaccatat gcggaggctc 3000 aagaaaagtg cggagagagc cgccactgcc acgtcttcgt ctcatcacgg attggcttca 3060 accaccagat tcaatgcttc aagaagaatc ccatcttgga acgtccttgc cagagagaac 3120 tcaacaggct cactggatga tctagtcact gacaataacc tccacgcttc ttcgggcagg 3180 aatttaagcg acagtgaaac agagagcgtg gagttgagtt cttggacaag aactggtgga 3240 cctttaatga gaacagcttc tgctaataag ttcattgatt ttgttcagag tcttgatatc 3300
gacattgcat tggtcagagg atttagtagc agtcccaatt ctccagcagt tcctcctggt 3360 ggctcgttta ctccaagccc gagatccata gcggctcatt cggatatcga atcaaacagc 3420 aatagcaaca atcttggaac aagcacttca agcataacag ttactgaagg tgatcttcta 3480 cagcctgaga gaacgagtaa cggatttgtg ttaaacgtcg ttaaaagaga gaacttggga 3540 atgccatcga ttgggaacca aaatacagag ttaccagaga gtgtacagct cgatataccg 3600 gagaaggaga tggattgtag ctctgtatca gaacacgaag aagatgataa cgacaatgaa 3660 gaagaacata acggctcgag tctggttact gtttcttcag aagattccgg tttacaagaa 3720 ccggtgtctg gtagtgttat agatgcttag ctgcaggtcg actctagacg gcatcttgcc 3780 cagatttttc ccaggtaaga gcgcgtctca ttgccaaaga tttgcgactg tgccgaatga 3840 gactgtcggg cgtctcattc ccccacgtcg ggccgtctcg aaagtcagtc gcattagacc 3900 ggctcatttg ttgctcaatg cgccgactta tgagactgtt gagtcatgac agacaccgcg 3960 aacatccccg occcgaccgg acgcacattc ggatacgccc gcgtctcgac ttcccggcag 4020 aaccttgacG gccagatgga cacgctccgc aagatgggcg tggacggcga ccggatctat 4080 gccgataagg tgaccggccg cacgatggac cgccccgcgt ggcaggtctg caactcgcat 4140 ctggatgccg gcgacacgct cgtggtggac gcactcgacc gtttgggacg ctccacgttg 4200 gaggtcatcg acacaatcca cgacctgacc gaacgcggcg tcatcatcgt ggaccgcacg 4260 taccgccgcc tagatgocag tgacgcggtc gggaaggcgt tggtgcagat catggcggtc 4320 atggccgaga tggaagtcaa cttgaaagcc gagcgtgccg ccgctgctcg tgagtccgcc 4380 gccgcccgtg gaaagcacac cggacgcccc cgcaagctcg ccaaccacga cgttgctcgt 4440 gcccgtgagc tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 4500 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 4560 atgagtgaga taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 4620 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 4680 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 4740 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 4800 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 4860 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 4920 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 4980 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 5040 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 5100 cgttcgctca aagctgggct gtgtgcacga acaccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 5160
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 5220 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 5280 gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 5340 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 5400 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 5460 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 5520 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 5580 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 5640 aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 5700 ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 5760 gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 5820 aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 5880 ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 5340 tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 6000 ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 6060 cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 6120 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 6180 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 6240 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 6300 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 6360 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 6420 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 6480 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 6540 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 6600 tccccgaaaa gtgccacctg acgtc 6625 <210>3
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223>Cebador de PCR para el fragmento del gen sdpl
<400>3
tataggcgcc atggatataa gtaatgaggc 30
<210> 4
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR para el fragmento del gen sdpl <400>4
tgtcctgcag ctaagcatct ataacactac 30
<210>5
<211> 2478
<212> ADN
<213> Fragmento del gen sdpl de Arabidopsis thaliana col. <400> 5
atggatataa gtaatgaggc tagtgtcgat cccttttcga ttggaccatc atctatcatg 60 ggtcgaacca ttgctttcag agtcttgttc tgtagatcaa tgtcacagct taggcgtgat 120 ctctttcggt tcttgttgca ttggtttctt agatttaagc tgaccgtttc accgtttgtg 180 tcgtggtttc atcctcggaa ccctcaaggg attttagcgg tggttacaat cattgccttt 240 gtgttgaaac gatacacgaa tgtgaaaata aaggcggaaa tggcttaccg gaggaagttt 300 tggaggaata tgatgcggac ggctttgact tatgaggaat gggctcatgc tgctaagatg 360 ttagagaagg aaacaccaaa gatgaatgaa tctgatcttt atgatgaaga gttggttaag 420 aacaagcttc aggagcttcg tcatcgtcgc caagaaggct cacttagaga cattatgttt 480 tgtatgagag ctgatttggt gaggaatctc ggtaatatgt gtaattcgga gcttcataaa 540 ggtagacttc aggttcctag acatatcaaa gagtacattg atgaggtgtc tactcagttg 600 agaatggttt gtaactctga ttcagaggag ctttctttag aagagaagct ttcttttatg 660 catgaaacac ggcatgcctt tggtagaacg gctttgcttt tgagtggtgg ggcttctctt 720 ggtgcgtttc atgttggtgt ggttaggact ttggttgagc ataagctttt acctcgaata 780 attgctggtt ctagtgttgg atccatcatt tgtgctgttg tggcctcaag gtcttggcca 340 gaactacaga gtttctttga gaattctttg cattctttac agttctttga tcagctcgga 900 ggcgtgttct caatagtgaa acgggtaatg acacaagggg ctctacacga tatcagacag 960 ttgcaatgta tgcttagaaa cctcacaagc aatctcacat tccaagaagc ttatgacatg 1020 acaggaagga ttctcgggat caccgtttgc tccccaagaa agcatgaacc tcctcggtgt 1080 cttaactatt tgacttcgcc tcatgtggtt atatggagcg cagtgactgc ttcttgtgct 1140 tttcctggtc tctttgaagc tcaagagcta atggctaaag atcgaagtgg agagatcgta 1200 ccgtatcatc cacctttcaa tttggatcca gaagtaggca ctaaatcatc atctggacgc 1260 cggtggagag atggtagttt ggaggttgat ttaccaatga tgcagcttaa agaactgttc 1320
aatgtcaatc attttattgt gagccaagcc aatcctcaca ttgctccatt actgcgtcta 1380
aaggatttag ttcgagctta tggtggtaga ttcgcagcta agctcgcgca tctagtggag 1440
atggaggtca aacatagatg caaccaggta ttagagctcg gttttcctct cggtggactc 1500
gcaaagcttt ttgctcagga gtgggaaggt gatgttacag ttgtaatgcc tgctactctt 1560
gctcagtact cgaagattat acaaaatccg actcatgtcg agcttcagaa agcggctaac 1620
caaggaagaa gatgcacttg ggagaagctc tcagccataa aatcaaactg cgggatcgag 1680
cttgcgcttg atgattctgt agctattctt aaccatatgc ggaggctcaa gaaaagtgcg 1740
gagagagccg ccactgccac gtcttcgtct catcacggat tggcttcaac caccagattc 1800
aatgcttcaa gaagaatccc atcttggaac gtccttgcca gagagaactc aacaggctca 1860
ctggatgatc tagtcactga caataacctc cacgcttctt cgggcaggaa tttaagcgac 1920
agtgaaacag agagcgtgga gttgagttct tggacaagaa ctggtggacc tttaatgaga 1980
acagcttctg ctaataagtt cattgatttt gttcagagtc ttgatatcga cattgcattg 2040
gtcagaggat ttagtagcag tcccaattct ccagcagttc ctcctggtgg ctcgtttact 2100
ccaagcccga gatccatagc ggctcattcg gatatcgaat caaacagcaa tagcaacaat 2160
cttggaacaa gcacttcaag cataacagtt actgaaggtg atcttctaca gcctgagaga 2220
acgagtaacg gatttgtgtt aaacgtcgtt aaaagagaga acttgggaat gccatcgatt 2280
gggaaccaaa atacagagtt accagagagt gbacagctcg atataccgga gaaggagatg 2340
gattgtagct ctgtatcaga acacgaagaa gatgataacg acaatgaaga agaacataac 2400
ggctcgagtc tggttactgt ttcttcagaa gattccggtt tacaagaacc ggtgtctggt 2460
agtgttatag atgcttag 2478 <210>6
<211 > 57
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR para el fragmento del gen MSMEG_0220
<400>6
tatatctaga acaacgggga ggacaaccga atggtgagca gcacccgcag tgaacac 57
<210>7
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR para el fragmento del gen MSMEG_0220
<400> 7
tatatctaga tcacagatga ctcacgatcc atgag 35
<210>8
<211> 843
<212> ADN
<213> Fragmento del gen MSMEG_0220 de Mycobacterium smegmatis
<400> 8
atggtgagca gcacccgcag tgaacacagc tttgccggcg tcggcggcgt ccgcatcgtc 60
tacgacgtgt ggacccccga caccgacccg cgcggggtcg tcgtgctggc gcacggttac 120
gccgaacacg caggccgcta ccaccacgtc gcgcaacggt tcggggccgc gggcctgctc 180
gtgtacgcac tcgaccaccg cggacacggc cgctccggcg gtaagcgcgt tcacctgcgc 240
gacctgtcgg agttcgtcga ggacttccgc acactcgtcg gcatcgccgc gaacgaccac 300
cccacactgc cgcggatcgt gctcggccac agcatgggcg gcggcatcgt cttcgcctat 360
ggcgctcggt acccgggcga gtactcggcc atggtgctgt ccgggcccgc cgtgaacgca 420
cacgacggcg tatcgccggt gctggtcgcg gtggccaaag tgctgggcaa actcgcgccc 480
ggcatcccgg tggagaacct ggacgccgac gcggtctcgc gcgaccccga ggtggtcgcg 540
gcctacaagg ccgatccgat ggttcaccac ggcaagctgc ccgcgggcat cgcgcgcgcg 600
ctgatcggcc tgggacagag catgccgcag cgggccgcgg cgctgaccgc gccgctgctg 660
gtggtgcacg gcgacaagga ccgcctcatc ccggtggcgg gcagccggct gctcgtcgac 720
cgcgtggctt ccgaggatgt ccacctgaag gtctaccccg ggctgtacca cgaggtgttc 780
aacgaacccg aacagaaact cgtcctcgac gacgtcacct catggatcgt gagtcatctg 840
tga 843 <210>9
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de ARAT_f
<400> 9
tatattccat ggggaggaca acatataagt aatgaggcta gt 42
<210> 10
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador ARAT-r
<400> 10
ccgcctgcag ctaagcatct ataacactac 30
<210> 11
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador ATAG7_f
<400> 11
tattgacgtc gacaacgggg aggacaaccg aatggaacgc ggatccactt g 51 <210> 12
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador ATAG7-r
<400> 12
cttgtactaa gtcccgggtt agtggacgac ctcgaagc 38
<210> 13
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador Mlip2_f
<400> 13
tattggcgcc gacaacgggg aggacaaccg aatggtgagc agcacccgca gtgaa 55 <210> 14
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador Mlip2_r
<400> 14
ccacgatgga cacgttgtac taagtctgca gtcacagatg actcacgatc c 51 <210> 15
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador PAO_f
<400> 15
tatagacgtc atgaagaaga agtctctgct cccc 34
<210> 16
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador PAO_r
<400> 16
tcgaaagctt ctacaggctg gcgttcttca 30
<210> 17
<211> 2478
<212> ADN
<213>Fragmento del gen de la TAG lipasa de Arabidopsis thaliana <400> 17
atggatataa gtaatgaggc tagtgtcgat cccttttcga ttggaccatc atctatcatg 60 ggtcgaacca ttgctttcag agtcttgttc tgtagatcaa tgtcacagct taggcgtgat 120 ctctttcggt tcttgttgca ttggtttctt agatttaagc tgaccgtttc accgtttgtg 180 tcgtggtttc atcctcggaa Gcctcaaggg attttagcgg tggttacaat cattgcGttt 240 gtgttgaaac gatacacgaa tgtgaaaata aaggcggaaa tggcttaccg gaggaagttt 300 tggaggaata tgatgcggac ggctttgact tatgaggaat gggctcatgc tgctaagatg 360 ttagagaagg aaacaccaaa gatgaatgaa tctgatcttt atgatgaaga gttggttaag 420 aacaagctta aggagcttcg tcatcgtcgc caagaaggct cacttagaga cattatgttt 480 tgtatgagag ctgatttggt gaggaatctc ggtaatatgt gtaattcgga gcttcataaa 540 ggtagacttc aggttcctag acatatcaaa gagtacattg atgaggtgtc tactcagttg 600 agaatggttt gtaactctga ttcagaggag ctttctttag aagagaagct ttcttttatg 660 catgaaacac ggcatgcctt tggtagaacg gctttgcttt tgagtggtgg ggcttctctt 720 ggtgcgtttc atgttggtgt ggttaggact tbggttgagc ataagctttt acctcgaata 780 attgctggtt ctagtgttgg atccatcatt tgtgctgttg tggcctcaag gtcttggcca 340 gaactacaga gtttctttga gaattctttg cattctttac agttctttga tcagctcgga 900 ggcgtgttct caatagtgaa acgggtaatg acacaagggg ctctacacga tatcagacag 960 ttgcaatgta tgcttagaaa cctcacaagc aatctcacat tccaagaagc ttatgacatg 1020 acaggaagga ttctcgggat caccgtttgc tccccaagaa agcatgaacc tcctcggtgt 1080 cttaactatt tgacttcgcc tcatgtggtt atatggagcg cagtgactgc ttcttgtgct 1140
t t t c c t g g t c tc t t tg a a g c tcaagag c ta a tggctaaag a tcgaag tgg agaga tcg ta 1200 c c g ta tc a tc c a c c tt tc a a t t tg g a tc c a gaagtaggca c ta a a tc a tc a tc tg g a cg c 1260 cggtggagag a tg g ta g t t t g g a g g ttg a t tta c c a a tg a tg c a g c tta a a g a a c tg ttc 1320 a a tg tc a a tc a t t t t a t t g t gagccaagcc a a tcc tca ca t t g c t c c a t t a c tg c g tc ta 1380 a a g g a ttta g t tc g a g c t ta tg g tg g ta g a ttc g c a g c ta agctcgcgca tc ta g tg g a g 1440 a tggaggtca aaca tag a tg caaccaggta tta g a g c tc g g t t t t c c t c t cgg tg g a c tc 1500 g c a a a g c ttt ttg c tc a g g a gtgggaaggt g a tg tta c a g t tg ta a tg c c tg c t a c t c t t 1560 g c tc a g ta c t c g a a g a tta t acaaaatccg a c tc a tg tc g agc ttcaga a agcggctaac 1620 caaggaagaa g a tg c a c ttg ggagaagctc tca g cca ta a aa tcaaa c tg cgggatcgag 1680 c t tg c g c t tg a tg a t t c tg t a g c ta t t c t t aa cca ta tg c ggaggctcaa gaaaagtgcg 1740 gagagagccg ccactgccac g t c t t c g t c t ca tcacgga t tg g c ttc a a c ca cca g a ttc 1800 a a tg c ttc a a gaagaatccc a tc ttg g a a c g tc c t tg c c a gagagaactc aacaggctca 1860 c tg g a tg a tc ta g tc a c tg a ca a ta a cc tc c a c g c t tc t t cgggcaggaa ttta a g c g a c 1920 agtgaaacag agagcgtgga g t tg a g t t c t tggacaagaa c tg g tg g a cc tt ta a tg a g a 1980 a c a g c ttc tg c ta a ta a g t t c a t t g a t t t t g ttc a g a g tc t tg a ta tc g a c a t tg c a t tg 2040 g tcagaggat tta g ta g c a g tc c c a a t tc t cca g ca g ttc c tc c tg g tg g c t c g t t t a c t 2100 ccaagcccga g a tcca ta g c g g c tc a ttc g g a ta tc g a a t caaacagcaa tagcaacaa t 2160 c ttggaacaa g ca c ttca a g c a ta a c a g tt ac tgaagg tg a tc t tc ta c a gcctgagaga 2220 acgagtaacg g a t t t g t g t t a a a c g tc g tt aaaagagaga a c ttg g g a a t g c c a tc g a tt 2280 gggaaccaaa a ta c a g a g tt accagagagt g ta ca g c tcg a ta taccgg a gaaggagatg 2340 g a t tg ta g c t c tg ta tc a g a acacgaagaa ga tga taacg acaatgaaga agaacataac 2400 ggc tcg a g tc tg g t ta c tg t t tc t tc a g a a g a t tc c g g t t tacaagaacc g g tg tc tg g t 2460 a g tg t ta ta g a tg c t ta g 2478 <210> 18
<211> 1047
<212> ADN
<213> Fragmento del gen de la TAG 7G lipasa de Aspergillus fumigatus
<400> 18
atggaacgcg gatcaacttg cgtcataagg actgcggctt ctcgatcaca atggacgact 60 atggtacatg ttggtgcaga attgaatgcg tctgcacaag taaggtttct tcgcagcctg 120 tgtaggtttc gatcatttag ttcttcctat cggagcttcc acgctttgcc gtgcaggagc 180 aaatcacata agcatatagg ttccgatgct cttgaccctc gccttgatga tcttggaaag 240 gtcttacgag acgaatatgc ggtgatccga gatcattacg aaaccccaaa gtatccagtt 300 gtccttgcgc atgggctcct aggttttgat gagttacgcc tcgctggccc tctccttcct 360 ggagttcagt actggcgagg aatcaaggaa gctttgaccc agaaaggagt gcaagtcatc 420 actgcaacag tacctccttc ggggtccatt gagatgcgtg cggaggagct ggtgaaggat 480 atagatgagg gcgcccaggg gaaagctgta aatattattg cgggccttga tgctcgttac 540 atgataagtc gtctaagacc gaagaagttc aaggtcttgt ctttgacgac aattgcgact 600 cctcatcgtg gttctacggt tgcagattat gtccttgagc gaattggtga cgagcggcta 660 ccccagttat attacactct cggaaaactc aaggttgaaa ctggagcctt ttcccagttg 720 acgcgcaagt atatggaaga tacgttcaat ccagccacgc ctgacgttga ggatgttcgt 780 tacttcagct acggcgcagc gatgcaacca agcttttggt ctatgttccg cttgtcccat 840 cgcgttcttc aagaggtgga aggatataac gatgggctag tcagcgtcgc tagcagcaaa 900 tggggaaaat acaaaggcac cctggaaggg gccagccacc tggatttgat caactggacc 960 aacaggctga agtggcttgc gggcgagata actggaaaca ggcaaaggtt tgtaaaatct 1020 atctctggct tcgaggtcgt ccactaa 1047 <210> 19
<211> 936
<212> ADN
<213> Fragmento del gen de la TAG lipasa de Pseudomonas aeruginosa
<400> 19
atgaagaaga agtctctgct ccccctcggc ctggccatcg gtctcgcctc tctcgctgcc 60 agccctctga tccaggccag cacctacacc cagaccaaat accccatcgt gctggcccac 120 ggcatgctcg gcttcgacaa catcctcggg gtcgactact ggttcggcat tcccagcgcc 180 ttgcgccgtg acggtgccca ggtctacgtc accgaagtca gccagttgga cacctcggaa 240 gtccgcggcg agcagttgct gcaacaggtg gaggaaatcg tcgccctcag cggccagccc 300 aaggtcaacc tgatcggcca cagccacggc gggccgacca tccgctacgt cgccgccgta 360 cgtcccgacc tgatcgcttc cgccaccagc gtcggcgccc cgcacaaggg ttcggacacc 420 gccgacttcc tgcgccagat cccaccgggt tcggccggcg aggcagtcct ctccgggctg 480 gtcaacagcc tcggcgcgct gatcagcttc ctttccagcg gcagcaccgg tacgcagaat 540 tcactgggct cgctggagtc gctgaacagc gagggtgccg cgcgcttcaa cgccaagtac 600 ccgcagggca tccccacctc ggcctgcggc gaaggcgcct acaaggtcaa cggcgtgagc 660 tattactcct ggagcggttc ctcgccgctg accaacttcc tcgatccgag cgacgccttc 720 ctcggcgcct cgtcgctgac cttcaagaac ggcaccgcca acgacggcct ggtcggcacc 780 tgcagttcgc acctgggcat ggtgatccgc gacaactacc ggatgaacca cctggacgag 840 gtgaaccagg tcttcggcct caccagcctg ttcgagacca gcccggtcag cgtctaccgc 900 cagcacgcca accgcctgaa gaacgccagc ctgtag 936 <210> 20
<211> 936
<212> ADN
<213>Fragmento del gen de la monoacil glicerido lipasa de M.smegmatis
<400> 20
atgaagaaga agtctctgct ccccctcggc ctggccatcg gtctcgcctc tctcgctgcc 60 agccctctga tccaggccag cacctacacc cagaccaaat accccatcgt gctggcccac 120 ggcatgctcg gcttcgacaa catcctcggg gtcgactact ggttcggcat tcccagcgcc 180 ttgcgccgtg acggtgccca ggtctacgtc accgaagtca gccagttgga cacctcggaa 240 gtccgcggcg agcagttgct gcaacaggtg gaggaaatcg tcgccctcag cggccagccc 300 aaggtcaacc tgatcggcca cagccacggc gggccgacca tccgctacgt cgccgccgta 360 cgtceegacc tgatcgettc egccaccagc gtcggcgcec cgeacaaggg ttcggacacc 420 gccgacttcc tgcgccagat cccaccgggt tcggccggcg aggcagtcct ctccgggctg 480 gtcaacagcc tcggcgcgct gatcagcttc ctttccagcg gcagcaccgg tacgcagaat 540 tcactgggct cgctggagtc gctgaacagc gagggtgccg cgcgcttcaa cgccaagtac 600 ccgcagggca tcccaacctc ggcctgcggc gaaggcgcct acaaggtcaa cggcgtgagc 660 tattactcct ggagcggttc ctcgccgctg accaacttcc tcgatccgag cgacgccttc 720 ctcggcgcct cgtcgctgac cttcaagaac ggcaccgcca acgacggcct ggtcggcacc 780 tgcagttcgc acctgggcat ggtgatccgc gacaactacc ggatgaacca cctggacgag 840 gtgaaccagg tcttcggcct caccagcctg ttcgagacca gcccggtcag cgtctaccgc 900 cagcacgcca accgcctgaa gaacgccagc ctgtag 936
Claims (6)
1. Un procedimiento de produccion de un ester alqmlico de acido graso usando Rhodococcus opacus, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar Rhodococcus opacus que tiene la capacidad de producir aceite y transformado con un primer gen que codifica una triacilglicerol lipasa y un segundo gen que codifica una monoacilglicerol lipasa, produciendo asf aceite;
(b) inducir la autolisis del aceite producido en Rhodococcus opacus para producir un acido graso libre, en el que la autolisis es llevada a cabo en Rhodococcus opacus mediante la triacil glicerol lipasa y la monoacil glicerol lipasa; y
(c) agregar un alcohol al acido graso libre producido y hacer reaccionar el alcohol con el acido graso libre para producir un ester alqmlico de acido graso,
en el que el primer gen comprende la SEQ ID NO: 19, y el segundo gen comprende el gen de la lipasa MAG de M. smegmatis producido por amplificacion por PCR de ADN genomico de M. smegmatis con los cebadores de la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14 de acuerdo con el Ejemplo 2.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el cultivo en la etapa (a) se lleva a cabo en un medio que contiene una fuente de nitrogeno limitada.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el acido graso libre es un acido graso saturado o insaturado.
4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que el acido graso libre se selecciona del grupo que consiste en acido oleico, acido linoleico, acido linolenico, acido palmitoleico, acido ricinoleico, acido vaccenico, acido gadoleico, acido araquidonico, EPA (acido 5, 8,11,14,17-eicosapentaenoico), acido erucico, DHA (4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico), acido butmco, acido caproico, acido capnlico, acido caprico, acido laurico, acido minstico, acido palmftico, acido estearico, acido araqmdico, acido behenico y acido lignocerico.
5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el acido graso libre se sustituye con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en un grupo de anillo aromatico, un grupo epoxi, un grupo ciano y un grupo halogeno.
6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la reaccion en la etapa (c) se lleva a cabo a 80-120 °C durante 1-24 horas.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20090065490 | 2009-07-17 | ||
| PCT/KR2010/004701 WO2011008058A2 (ko) | 2009-07-17 | 2010-07-19 | 오일 생성능을 가지는 미생물을 이용한 지방산 알킬에스테르의 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2713526T3 true ES2713526T3 (es) | 2019-05-22 |
Family
ID=43450002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10800069T Active ES2713526T3 (es) | 2009-07-17 | 2010-07-19 | Procedimiento de producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos usando microorganismos que tienen capacidad de producir aceite |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9322004B2 (es) |
| EP (1) | EP2455484B1 (es) |
| JP (1) | JP5770178B2 (es) |
| KR (1) | KR101546885B1 (es) |
| CN (1) | CN102575272B (es) |
| BR (1) | BR112012001131A2 (es) |
| ES (1) | ES2713526T3 (es) |
| WO (1) | WO2011008058A2 (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101407233B1 (ko) | 2012-03-05 | 2014-06-16 | 한국생명공학연구원 | 보트리오코커스 브라우니의 생장 촉진 및 지방산 함량 증가 특성을 가진 신규 미생물 리조비움 속 ｋｂ１０ |
| MY172692A (en) * | 2012-07-13 | 2019-12-10 | Calysta Inc | Biorefinery system, methods and compositions thereof |
| CA2886642A1 (en) | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Calysta, Inc. | Compositions and methods for biological production of fatty acid derivatives |
| KR102189471B1 (ko) * | 2013-12-18 | 2020-12-11 | 경북대학교 산학협력단 | 하이드록시지방산 글리세롤유도체의 연속적 제조방법 |
| CN103789365B (zh) * | 2014-01-20 | 2016-08-31 | 湖南大学 | 回收轻油生产微生物油脂的方法 |
| CN107075538A (zh) * | 2014-05-22 | 2017-08-18 | 合成基因组股份有限公司 | 用于生产二十二碳六烯酸的网粘菌纲菌株 |
| CN104313067A (zh) * | 2014-10-21 | 2015-01-28 | 镇江拜因诺生物科技有限公司 | 红球菌高效利用木糖渣生产生物柴油的方法 |
| CN106811242B (zh) * | 2017-01-24 | 2017-11-10 | 上海千茂化工科技有限公司 | 一种环保低碳高热值船用燃料油 |
| CN107840994A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-03-27 | 成都新柯力化工科技有限公司 | 一种可完全降解淀粉基生物塑料膜的制备方法 |
| CN108060202B (zh) * | 2017-12-12 | 2021-02-23 | 江南大学 | 山嵛酸甾醇酯抗霜剂的合成方法及其在巧克力中的应用 |
| CN112342251B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-05-17 | 华南协同创新研究院 | 一种利用微生物发酵制备1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯的方法 |
| TW202333409A (zh) * | 2021-09-30 | 2023-08-16 | 日商大金工業股份有限公司 | 聚四氟乙烯粉末、電極用黏合劑、電極合劑、電極、及二次電池 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6025478B2 (ja) | 1977-03-17 | 1985-06-18 | 花王株式会社 | 脂肪酸低級アルコ−ルエステルの製造法 |
| DE3319590A1 (de) | 1983-05-30 | 1984-12-06 | Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf | Verfahren zur herstellung von fettsaeureestern kurzkettiger aliphatischer alkohole aus freie fettsaeuren enthaltenden fetten und/oder oelen |
| JPS60130396A (ja) * | 1983-12-19 | 1985-07-11 | Asahi Denka Kogyo Kk | 長鎖不飽和脂肪酸含有油脂の加水分解方法 |
| DE3444893A1 (de) | 1984-12-08 | 1986-06-12 | Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf | Verfahren zur herstellung von fettsaeuremethylestern |
| JP2678915B2 (ja) * | 1988-05-20 | 1997-11-19 | 曽田香料株式会社 | 脂肪酸の製造法 |
| AT399336B (de) | 1993-07-14 | 1995-04-25 | Martin Mag Dr Mittelbach | Verfahren zur herstellung von fettsäurealkylestern |
| FR2722798B1 (fr) * | 1994-07-25 | 1996-09-13 | Toulouse Inst Nat Polytech | 1procede de production d'acides gras2plantes oleagineuses |
| DE19731990A1 (de) * | 1997-07-25 | 1999-01-28 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Verfahren zur Herstellung und Identifizierung von neuen Hydrolasen mit verbesserten Eigenschaften |
| AU1417901A (en) * | 1999-11-26 | 2001-06-04 | Kansai Chemical Engineering Co., Ltd. | Process for producing fatty acid lower alcohol ester |
| JP3893107B2 (ja) * | 2002-12-27 | 2007-03-14 | 花王株式会社 | 脂肪酸の製造方法 |
| US7112229B2 (en) * | 2003-07-18 | 2006-09-26 | Petroleo Brasileiro S.A. -Petrobras | Process for producing biodiesel fuel using triglyceride-rich oleagineous seed directly in a transesterification reaction in the presence of an alkaline alkoxide catalyst |
| CN1238469C (zh) | 2004-01-16 | 2006-01-25 | 清华大学 | 有机介质反应体系中脂肪酶转化油脂生产生物柴油新工艺 |
| CA2604087A1 (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-14 | The University Of York | Lipase polypeptide |
| EP1893764B2 (en) * | 2005-06-13 | 2020-11-04 | Novozymes A/S | Enzymatic production of degummed fatty acid alkyl esters |
| DE102005052551A1 (de) | 2005-11-02 | 2007-05-16 | Rothamsted Res Harpenden | Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae |
| US7723574B2 (en) | 2005-11-24 | 2010-05-25 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of Δ5-unsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| ES2289943B1 (es) | 2006-07-21 | 2008-12-16 | Universidad De Cordoba | Procedimiento de produccion de biodiesel mediante el uso de lipasa pancreatica de cerdo como biocatalizador enzimatico. |
| EP3546588A3 (en) * | 2007-06-01 | 2019-12-18 | Corbion Biotech, Inc. | Recombinant microalgal cell and method of producing lipids using said cell |
| US20090030219A1 (en) * | 2007-07-24 | 2009-01-29 | Mon-Han Wu | Heterogeneous acid-catalyzed process for biodiesel production from fatty acids |
| US20090064567A1 (en) * | 2007-09-12 | 2009-03-12 | Martek Biosciences Corporation | Biological oils and production and uses Thereof |
| US7790429B2 (en) * | 2007-11-28 | 2010-09-07 | Transbiodiesel Ltd. | Robust multi-enzyme preparation for the synthesis of fatty acid alkyl esters |
-
2010
- 2010-07-19 JP JP2012520549A patent/JP5770178B2/ja active Active
- 2010-07-19 ES ES10800069T patent/ES2713526T3/es active Active
- 2010-07-19 CN CN201080038327.8A patent/CN102575272B/zh active Active
- 2010-07-19 BR BR112012001131A patent/BR112012001131A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-07-19 EP EP10800069.6A patent/EP2455484B1/en active Active
- 2010-07-19 US US13/384,576 patent/US9322004B2/en active Active
- 2010-07-19 WO PCT/KR2010/004701 patent/WO2011008058A2/ko active Application Filing
- 2010-07-19 KR KR1020100069404A patent/KR101546885B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2455484B1 (en) | 2018-12-05 |
| EP2455484A2 (en) | 2012-05-23 |
| CN102575272B (zh) | 2014-12-10 |
| JP5770178B2 (ja) | 2015-08-26 |
| WO2011008058A3 (ko) | 2011-08-25 |
| EP2455484A4 (en) | 2013-01-02 |
| WO2011008058A2 (ko) | 2011-01-20 |
| CN102575272A (zh) | 2012-07-11 |
| US9322004B2 (en) | 2016-04-26 |
| US20120190088A1 (en) | 2012-07-26 |
| JP2012533292A (ja) | 2012-12-27 |
| KR20110007989A (ko) | 2011-01-25 |
| BR112012001131A2 (pt) | 2019-09-24 |
| KR101546885B1 (ko) | 2015-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2713526T3 (es) | Procedimiento de producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos usando microorganismos que tienen capacidad de producir aceite | |
| CN110747198B (zh) | 毕赤酵母生产重组人源ⅱ型胶原蛋白单链的方法 | |
| CN111088176B (zh) | 产β-胡萝卜素的基因工程菌及其应用 | |
| TW200530262A (en) | Microbially expressed xylanases and their use as feed additives and other uses | |
| CN104342411B (zh) | 活性增强的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法 | |
| CN104342406B (zh) | 热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法 | |
| CN104342410B (zh) | 一种酮还原酶突变体及其制备方法 | |
| CN108368490A (zh) | 真菌产生fdca | |
| CN104694452B (zh) | 一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 | |
| KR101951128B1 (ko) | T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도 | |
| CN104342412A (zh) | 用于生产(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体 | |
| KR102013788B1 (ko) | 인간상피세포 성장인자 또는 피부침투성 인간상피세포 성장인자 발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류 | |
| KR102269272B1 (ko) | 장기면역 강화 유전자가 삽입된 구제역 a형 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물 | |
| CN111149730B (zh) | 一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法 | |
| KR20140000711A (ko) | 수크로스 이용에 있어서의 야로위아 리포라이티카에서의 사카로마이세스 세레비지애 suc2 유전자의 용도 | |
| CN111549048A (zh) | 用于细菌asd基因平衡致死系统的表达质粒及其应用 | |
| CN113755518B (zh) | 一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用 | |
| CN113846019A (zh) | 一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法 | |
| KR102543061B1 (ko) | 사카로미세스 세레비시아에서 브라제인을 고발현하기 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법 | |
| CN101492685A (zh) | 一种重组表达载体的基因序列及其构建方法 | |
| KR102224580B1 (ko) | 유전자 발현 및 억제가 동시에 가능한 핵산 구조체 | |
| CN101967475A (zh) | 一种基于位点特异性重组的基因打靶载体快速构建方法 | |
| CN108138188A (zh) | 用于体外和体内表达的多核苷酸构建体 | |
| KR102422842B1 (ko) | 크리스퍼 간섭을 이용한 rna 번역 조절용 조성물 | |
| CN114774510B (zh) | 一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用 |