JP5770178B2 - オイル生成能を有する微生物を用いた脂肪酸アルキルエステルの製造方法 - Google Patents
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Description
(a)オイル生成能を有する微生物を培養してオイルを生成する工程、
(b)前記生成されたオイルを含有する微生物においてオイルの自己分解を誘導して、遊離脂肪酸を生成する工程、及び
(c)前記生成された遊離脂肪酸にアルコールを添加し、反応させて脂肪酸アルキルエステルを製造する工程。
(a)オイル生成能とリパーゼをコードする遺伝子を有する微生物を培養して、オイルを生成させる工程、
(b)前記生成されたオイルを含有する微生物においてリパーゼによるオイルの自己分解を誘導して、遊離脂肪酸を生成させる工程、及び
(c)前記生成された遊離脂肪酸にメタノールを添加し、反応させて脂肪酸メチルエステルを製造する工程。
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。
(a)オイル生成能を有する微生物を培養してオイルを生成する工程、
(b)前記生成されたオイルを含有する微生物においてオイルの自己分解を誘導して、遊離脂肪酸を生成する工程、及び
(c)前記生成された遊離脂肪酸にアルコールを添加し、反応させて脂肪酸アルキルエステルを製造する工程。
本発明は下記の工程を含む脂肪酸アルキルエステルの製造方法に関する:
(a)オイル生成能を有する微生物を培養してオイルを生成する工程、
(b)前記生成されたオイルを含有する微生物においてオイルの自己分解を誘導して、遊離脂肪酸を生成する工程、及び
(c)前記生成された遊離脂肪酸にアルコールを添加し、反応させて脂肪酸アルキルエステルを製造する工程。
(a)オイル生成能とリパーゼをコードする遺伝子を有する微生物を培養して、オイルを生成させる工程、
(b)前記生成されたオイルを含有する微生物においてリパーゼによるオイルの自己分解を誘導して、遊離脂肪酸を生成させる工程、及び
(c)前記生成された遊離脂肪酸にメタノールを添加し、反応させて脂肪酸メチルエステルを製造する工程。
1−1.プラスミドpRUCSdpの作製
pUC18プラスミド(Phamacia、Biotech, Uppsala, Sweden)から図2の遺伝子地図を有するrpROUC18(配列番号1)及びrpROUC18_KM(配列番号2)組換えベクターを製造した後、下記のように遺伝子切片を導入した。
配列番号3:5’−TATAGGCGCCATGGATATAAGTAATGAGGC−3’
配列番号4:5’−TGTCCTGCAGCTAAGCATCTATAACACTAC−3’
マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)(KCTC9108)のゲノムDNAを鋳型とし、合成された配列番号6と7のプライマーでPCRを行い、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするMSMEG_0220遺伝子切片を作製した。
配列番号6:5’−TATATCTAGAACAACGGGGAGGACAACCGAATGGTGAGCAGCACCCGCAGTGAACAC−3’
配列番号7:5’−TATATCTAGATCACAGATGACTCACGATCCATGAG−3’
2−1.プラスミドの作製
下記提示されたプライマーを使って、表1の明示された条件と遺伝子鋳型からトリアシルグリセロールリパーゼとモノアシルグリセロールリパーゼを実施例1−1のrpROUC18プラスミド及びrpROUC18_KMプラスミドに導入する方式によって、図4に示されたように多様な種類のプラスミドを作製した。この時、トリアシルグリセロールリパーゼとモノアシルグリセロールリパーゼを共に導入した。表1は、各々の制限酵素の種類と遺伝子の由来等が記載されており、この他にも多様な種の遺伝子を導入してもよい。
ARAT_fプライマー(配列番号9)
5’−TATATTCCATGGGGAGGACAACATATAAGTAATGAGGCTAGT−3’
ARAT−rプライマー(配列番号10)
5’−CCGCCTGCAGCTAAGCATCTATAACACTAC−3’
ATAG7_fプライマー(配列番号11)
5’−TATTGACGTCGACAACGGGGAGGACAACCGAATGGAACGCGGATCCACTTG−3’
ATAG7−rプライマー(配列番号12)
5’−CTTGTACTAAGTCCCGGGTTAGTGGACGACCTCGAAGC−3’
Mlip2_fプライマー(配列番号13)
5’−TATTGGCGCCGACAACGGGGAGGACAACCGAATGGTGAGCAGCACCCGCAGTGAA−3’
Mlip2_rプライマー(配列番号14)
5’−CCACGATGGACACGTTGTACTAAGTCTGCAGTCACAGATGACTCACGATCC−3'
PAO_fプライマー(配列番号15)
5’−TATAGACGTCATGAAGAAGAAGTCTCTGCTCCCC−3’
PAO_rプライマー(配列番号16)
5’−TCGAaagcttCTACAGGCTGGCGTTCTTCA−3’
3−1:実施例1のロドコッカス・オパカスPD630の組換え菌株を利用した遊離脂肪酸(fatty acid)の産生(1)
実施例1のアセトアミドにより活性を有するように作製されたリパーゼ遺伝子が導入されたロドコッカス・オパカスPD630の組換え菌株を培養するに当たり、培地内に窒素源(nitrogen)を制限して、オイル産生のために2段階培養を行った。
乾燥された細胞は、キャピラリーカラムが装着されたAgilent6890Nシリーズガスクロマトグラフィー装置(Chiraldex G-TA of Astec, USA)を利用して、ガスクロマトグラフィー分析を行って、細胞内の合成された遊離脂肪酸含有量を測定した。2段階フラスコ培養結果、遊離脂肪酸は、0.27g/Lの濃度で生成されたことを確認した。
実施例2のアセトアミドにより活性を有するように作製されたリパーゼ遺伝子が導入されたロドコッカス・オパカスPD630の組換え菌株を培養するに当たり、培地内に窒素源を制限して、オイル産生のための2段階培養を行った。
実施例3−1で得られた乾燥菌株にクロロホルム2mLを添加して、3%(v/v)H2SO4を含むメタノール1mLを添加した後、この混合物を100℃で12時間反応させた。
また、実施例3−2で得られた上澄液に前記同様にメタノールを添加して反応させた後、生成された脂肪酸メチルエステルを測定した。
Claims (12)
- 次の工程を含む、オイル生成能を有し、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子及びモノアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子が導入された微生物を利用した脂肪酸アルキルエステルの製造方法:
(a)オイル生成能を有し、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子及びモノアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子が導入された微生物を培養してオイルを生成する工程、
(b)前記生成されたオイルを含有する微生物の中でトリアシルグリセロールリパーゼ及びモノアシルグリセロールリパーゼによるオイルの自己分解を誘導して、遊離脂肪酸を生成する工程、及び
(c)前記生成された遊離脂肪酸にアルコールを添加し、反応させて脂肪酸アルキルエステルを製造する工程。 - 前記オイルはトリアシルグリセロール(TAG)、ジアシルグリセロール(DAG)、モノアシルグリセロール(MAG)、リン脂質、スフィンゴ脂質、及びサッカロ脂質からなる群より選択される請求項1に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記オイル生成能を有する微生物はアエロモナス属微生物、アクロモバクター属微生物、アシドボラックス・デラフィルディ、アシドボラックス・ファシリス、アシネトバクター属微生物、アクチノマイセス属微生物、アルカリゲネス属微生物、アルテロモナス属微生物、アルソルニア属微生物、アプラノキトリウム属微生物、アスペルギルス属微生物、アモエボバクター属微生物、アファノカプサ属微生物、アファノテーケ属微生物、アクアスピリラム・オートトロフィカム、アゾリゾビウム・カウリノダンス、アゾスピリラム属微生物、アゾトバクター属微生物、バシラス属微生物、ベギアトア属微生物、ベイジェリンキア属微生物、ベネケア属微生物、ブラケスレア属微生物、ボルデテラ・パーツシス、ブラディリゾビウム・ジャポニカム、カリオファノン・ラタム、カウロバクター属微生物、クロログロエア属微生物、クロマチウム属微生物、クロモバクテリウム属微生物、クロストリジウム属微生物、コマモナス属微生物、コリネバクテリウム属微生物、クリプテコジニウム属微生物、シアノバクテリア、デルキシア属微生物、デスルホネマ属微生物、デスルホサルシナ・バリアビリス、デスルホビブリオ・サポボランス、エクトチオロドスピラ属微生物、エリナ属微生物、エントモフトラ属微生物、フェロバシラス・フェロキシダンス、フラボバクテリウム属微生物、ヘモフィルス・インフルエンザ、ハロバクテリウム属微生物、ヒドロクラスラタス・クラスラタス、ヒドロゲノモナス・ファシリス、ヒドロゲノファガ属微生物、ハイフォミクロビウム属微生物、イリオバクター・デラフィエルディ、ジャポノキトリウム属微生物、ラブリス・モナクス、ランプロシスティス・ロゼオペルシシーナ、ランプロペディア・ハイアリーナ、レジオネラ属微生物、レプトスリックス・ディスコホラス、メチロバクテリウム属微生物、メチロシナス属微生物、ミクロコッカス属微生物、モルティエレラ属微生物、マイコバクテリウム属微生物、ニトロバクター属微生物、ノカルディア属微生物、パラコッカス・デントリフィカンス、オシラトリア・リモサ、ペニシリウム・シクロピウム、フォトバクテリウム属微生物、フィサルム・ポリセファラム、フィコミセス属微生物、シュードモナス属微生物、ピシウム属微生物、ラルストニア属微生物、リゾビウム属微生物、ロドバシラス属微生物、ロドバクター属微生物、ロドコッカス属微生物、ロドシクルス属微生物、ロドミクロビウム・バニエリ、ロドシュードモナス属微生物、ロドスピリラム属微生物、シゾチトリウム属微生物、スフィンゴモナス・パウシモビリス、スピリラム属微生物、スピルリナ属微生物、スタフィロコッカス属微生物、ステラ属微生物、ストレプトマイセス属微生物、シントロフォモナス・ウォルフェイ、サーマス・サーモフィルス、チオバシラスA2、チオバシラス属微生物、チオカプサ属微生物、トラウストキトリウム属微生物、チオシスティス・バイオラセア、ビブリオ・パラハエモリティカス、キサントバクター・オートトロフィカス、キサントモナス・マルトフィリア、及びズーグロエア属微生物からなる群より選択される微生物である請求項1又は2に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記工程(a)の培養は、窒素源が制限された培地で行う請求項1〜3のいずれか一項に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記遊離脂肪酸は飽和又は不飽和脂肪酸である請求項1〜4のいずれか一項に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記遊離脂肪酸はオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、パルミトレイン酸、リシノール酸、バクセン酸、カドレン酸、アラキドン酸、EPA(5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid)、エルカ酸、DHA(4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid)酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸及びリグノセンリン酸からなる群より選択される請求項5に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記遊離脂肪酸は芳香族環基、エポキシ基、シアノ基及びハロゲン基からなる群から選択される置換基で置換されたものである請求項1〜6のいずれか一項に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記オイル生成能を有する微生物はロドコッカス・オパカスである請求項1〜7のいずれか一項に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記トリアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子は配列番号5、18、及び19からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を有する遺伝子あり、前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子は配列番号8の塩基配列を有する遺伝子である請求項1〜8のいずれか一項に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 前記工程(c)の反応は、80〜120℃で1〜24時間行う請求項1〜9のいずれか一項に記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。
- 次の工程を含む、オイル生成能を有し、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子及びモノアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子が導入された微生物を利用した脂肪酸メチルエステルの製造方法:
(a)オイル生成能を有し、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子及びモノアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子が導入された微生物を培養して、オイルを生成させる工程、
(b)前記生成されたオイルを含有する微生物の中でトリアシルグリセロールリパーゼ及びモノアシルグリセロールリパーゼによるオイルの自己分解を誘導して、遊離脂肪酸を生成させる工程、及び
(c)前記生成された遊離脂肪酸にメタノールを添加し、反応させて脂肪酸メチルエステルを製造する工程。 - 前記トリアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子は配列番号5、18、及び19からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を有する遺伝子であり、前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子は配列番号8の塩基配列を有する遺伝子である請求項11に記載の脂肪酸メチルエステルの製造方法。
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