CN103789365B - 回收轻油生产微生物油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种回收轻油生产微生物油脂的方法，以轻油为原料，将轻油稀释，添加盐分，调节pH值为4～8.5，灭菌，制得产油培养基，以浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.44193或浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069为发酵菌株，将发酵菌株驯化培养，得到驯化培养后的菌株，将驯化培养后的菌株添加入产油培养基中，通风、振荡培养，发酵12～45 h后收集菌体，通过酯交换反应得到微生物油脂，本发明生产工艺简单，运行成本低廉，可有效利用轻油。
Description
技术领域
本发明涉及微生物油脂生产领域，具体涉及到一种回收轻油生产微生物油脂的方法。
背景技术
传统燃料的消耗和产生的环境污染问题使可再生清洁能源的发展显得日益重要，生物柴油作为一种新型替代能源日益受到广泛的重视。生物柴油的油料主要来自于动物脂肪、植物油脂和微藻，通过其与醇类（如甲醇）在催化剂作用下进行酯交换反应得到脂肪酸酯类物质。然而，这种方法受到油料供给成本（约占整个生产成本的60～75%）的限制，随着生物柴油的需求进一步扩大，微生物发酵作为一种新型的油脂生产方式具有很高的研究和应用价值，是未来油脂生产重要的发展方向之一。与传统的油脂生产相比，微生物可以利用多种碳源，且生产周期短，不受季节和地域的影响，易于大规模连续生产。
生物质热解被视为可将生物质原料高效转化为清洁能源和化工产品的途径之一。热解过程是在无氧或者氧含量有限的情况下，通过高温热化学反应将复杂的生物质大分子物质，如纤维素、半纤维素和木质素转化成小分子可利用的燃料物质。热解产品包括固态碳，可燃气和生物油。其中生物油中的轻油部分包含65%以上的水分和少量的小分子物质，如甲醇，葡聚糖和乙酸类物质。轻油因其利用率较低而通常作为热解副产品丢弃。目前对轻油的回收和再利用少有报导，主要是利用水相处理从轻油中生产氢气，烷烃及醇类物质。轻油作为微生物生长及油脂生产碳营养物来源的研究未见相关报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有制备生物柴油原料的不足，提供一种效率高、成本低廉的回收轻油生产微生物油脂的方法，所述微生物油脂可应用于生物柴油。
为解决上述技术问题，本发明提供一种回收轻油生产微生物油脂的方法，以轻油为原料，将轻油稀释，添加盐分，调节pH值为4～8.5，灭菌，制得产油培养基，将浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 44193或浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069（购买于德国微生物菌种保藏中心，网址为www.dsmz.de）为发酵菌株，将发酵菌株驯化培养，得到驯化培养后的菌株，将驯化培养后的菌株添加入产油培养基中，通风、振荡培养，发酵12～45 h后收集菌体，通过酯交换反应得到微生物油脂。
所述轻油为木质纤维素生物质热解后液体产品中的水溶液部分，并通过小于0.5 μm的滤膜过滤去除杂质。
所述稀释的物质为水，稀释比例为轻油与水的体积比为1:7～10。
调节pH的物质为氢氧化钠。
所述发酵菌株的驯化培养方法为，将所述发酵菌株添加入种子培养基活化培养，得到活化菌株种子液，然后将活化菌株种子液添加至驯化培养基中，活化菌株种子液的添加体积为驯化培养基体积的1%～5%，18～30 h之后收集菌体，得到驯化培养后的菌株。
所述种子培养基的配方为，当发酵菌株为浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 44193时，1 L水中添加30 g 大豆胰化蛋白胨（Trypticase Soy Broth），调节pH值为7.3；当发酵菌株为浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 1069时，1 L水中添加4 g葡萄糖，4 g酵母抽提物，10 g麦芽提取物，调节pH为7.2。
当发酵菌株为浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.44193时，1 L驯化培养基的组成及含量为：8～10 g Na2HPO4·12H2O，1～2 g KH2PO4，0.1～0.3 g MgSO4·7H2O，1.0～1.5 mg FeNH4-citrate（16.5~18.5% Fe，购于Sigma公司），15～25 mg CaCl2，1.5～2.5 ml霍格兰溶液（购买于Sigma公司，产品编号H2395），0.4～0.6 g NaHCO3和1～5 g NH4Cl，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1:7～10；
当发酵菌株为浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069时，1 L驯化培养基的组成及含量为：0.3～0.5 g KH2PO4，1.3～2.0 g K2HPO4，0.1～0.3 g MgSO4·7H2O，0.01～0.02 g FeCl3，0.4～0.6 mg MnSO4·H2O，0.5～1.5 mg CuSO4·5H2O，0.5～1.5 mg ZnSO4·7H2O，0.3～0.6 mg CaCl2,
0.1～0.3 mg KCl，0.4～0.6 mg H3BO3和1～5 g NH4NO3，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1:7～10。
当发酵菌株为浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 44193时，1 L产油培养基的组成及含量为：8～10 g Na2HPO4·12H2O，1～2 g KH2PO4，0.1～0.3 g MgSO4·7H2O，1.0～1.5 mg FeNH4-citrate（16.5~18.5% Fe，购于Sigma公司），15～25 mg CaCl2，1.5～2.5 ml霍格兰溶液（购买于Sigma公司，产品编号H2395），0.4～0.6 g NaHCO3和0.1～0.5g NH4Cl，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1:7～10。
当发酵菌株为浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069时，1 L产油培养基的组成及含量为：0.3～0.5 g KH2PO4，1.3～2.0 g K2HPO4，0.1～0.3 g MgSO4·7H2O，0.01～0.02 g FeCl3，0.4～0.6 mg MnSO4·H2O，0.5～1.5 mg CuSO4·5H2O，0.5～1.5 mg ZnSO4·7H2O, 0.3～0.6 mg CaCl2,
0.1～0.3 mg KCl，0.4～0.6 mg H3BO3和0.1～0.5 g NH4NO3，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1:7～10。
发酵温度优选为25～37℃，振荡转速优选为150～250 rpm。
所述酯交换反应的步骤为，将菌体加入含有氯仿、碳原子数小于2的醇的酸性溶液中，于90～100℃条件下反应，得到反应后的溶液，在反应后的溶液中分离出微生物油脂。
所述分离方法为，反应后的溶液中加入水，分层后，对有机相进行真空干燥。
所述菌体、氯仿、碳原子数小于2的醇的配比为10 mg :1～5 ml:0.85～4.5 ml。
本发明的有益效果是，本发明制备得到的微生物油脂经过气象色谱-质谱联用仪分析，其油脂的脂肪酸碳链长度为12～20，其中棕榈酸（C16）和硬脂酸（C18）是主要的脂肪酸。
本发明首次提出利用生物质热解轻油作为产油微生物碳源的方法，其优点在于：通过回收利用热解轻油，可以优化热解生产工艺，减少排放后造成的环境污染，同时为生物油脂生产提供更广泛的原料来源，有助于促进生物柴油推广基于油脂生产中原料成本所造成的瓶颈问题的解决。本发明所制得的脂肪酸以C16和C18为主，与一般植物油类似，可推广应用于其他领域，如食品添加剂的原料。同时这种方法工艺简单，运行成本低，改进空间大，可大量用于工业化生产。
本发明的浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 44193和浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069，购买于德国微生物菌种保藏中心，网址为www.dsmz.de。
附图说明
图1是实施例1中浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.44193的细菌生长及微生物油脂积累随时间的变化情况示意图。
图2是实施例2中浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069的细菌生长及微生物油脂积累随时间的变化情况示意图。
具体实施方式
实施例
1
一种回收轻油生产微生物油脂的方法，包括以下步骤：
（1）原料基质制备：将轻油收集，通过0.45 μm的膜进行过滤，去除杂质，加入去离子水，所述轻油与去离子水的体积比为1:7.5，同时添加盐类方案为：1 L 产油培养基中含有9.00 g Na2HPO4·12H2O，1.50 g KH2PO4，0.20 g MgSO4·7H2O，1.2 mg FeNH4-citrate（16.5~18.5% Fe，购于Sigma公司），20 mg CaCl2，2 ml霍格兰溶液（购买于Sigma公司，产品编号H2395）和 0.50 g NaHCO3，0.5 g NH4Cl。制备好的原料基质调节pH为4，并通过0.22 μm的膜进行无菌处理，得到产油培养基。
（2）浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 44193菌体的获得：将固体培养基上的浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 44193接入已经过无菌处理的种子培养基中进行活化，所述浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO. 44193购买于德国微生物菌种保藏中心，网址为www.dsmz.de。所述种子培养基配方为，1 L水中添加30 g大豆胰化蛋白胨（Trypticase Soy Broth），调节pH值为7.3。36 h后接入驯化培养基进行驯化，1 L驯化培养基的组成及含量为：9.00 g Na2HPO4·12H2O，1.50 g KH2PO4，0.20 g MgSO4·7H2O，1.2 mg FeNH4-citrate（16.5~18.5% Fe，购于Sigma公司），20 mg CaCl2，2 ml霍格兰溶液（购买于Sigma公司，产品编号H2395）和 0.50 g NaHCO3，1 g NH4Cl，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1:7.5。24 h后收集驯化培养后的菌体。将驯化培养后的菌体接入200 ml所述产油培养基中，通风、振荡培养，促进细菌油脂的积累，反应条件为发酵温度为30℃，振荡转速为150 rpm，得到菌体。
（3）收集10 mg菌体，加入1 ml氯仿，0.85 ml甲醇，0.15 ml浓硫酸，100℃下反应140 min，冷却后加入1ml去离子水，分层后收集有机相，对有机相进行真空干燥。通过气象色谱-质谱联用仪的分析。发酵阶段细菌生长和微生物油脂积累情况如图1所示，细菌生长用细菌菌体悬浮液在600 nm紫外光下的吸收（OD600）表示，微生物油脂含量为油脂质量占细菌菌体干重的百分数。其中细菌油脂的最大含量出现在16h，为24.35%（油脂质量占细菌干重的百分数）。
实施例
2
一种回收轻油生产微生物油脂的方法，包括以下步骤：
（1）原料基质制备：将轻油收集，通过0.45 μm的膜进行过滤，去除杂质，加入去离子水，所述轻油与去离子水的体积比为1:10，同时添加盐类方案为：1 L 产油培养基中含有0.40 g KH2PO4，1.60 g K2HPO4，0.20 g MgSO4·7H2O，0.015 g FeCl3，0.50 mg MnSO4·H2O，1.0 mg CuSO4·5H2O，1.0 mg ZnSO4·7H2O，0.5 mg CaCl2，0.1 mg KCl，0.5 mg H3BO3，0.5 g NH4NO3。制备好的原料基质调节pH为4，并通过过0.22 μm的膜进行无菌处理。
（2）浑浊红球菌DSM 1069菌体的获得：将固体培养基上的浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069接入已经过无菌处理的种子培养基中进行活化处理，36 h后接入驯化培养基进行驯化，所述浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）DSM NO.1069购买于德国微生物菌种保藏中心，网址为www.dsmz.de。所述种子培养基配方为，1 L水中添加4 g葡萄糖，4 g酵母抽提物，10 g麦芽提取物，调节pH为7.2。1 L驯化培养基的组分和含量为：0.40 g KH2PO4，1.60 g K2HPO4，0.20 g MgSO4·7H2O，0.015 g FeCl3，0.50 mg MnSO4·H2O，1.0 mg CuSO4·5H2O，1.0 mg ZnSO4·7H2O，0.5 mg CaCl2，0.1 mg KCl，0.5 mg H3BO3，1 g NH4NO3，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1:10，24 h后收集驯化培养后的菌体。将驯化培养后的菌体接入200ml所述产油培养基中，通风、振荡培养，促进细菌油脂的积累，反应条件为发酵温度为26℃，振荡转速为250 rpm，得到菌体。
（3）收集10 mg菌体，加入5ml氯仿，4.5 ml甲醇，0.15 ml浓硫酸，100℃下反应140 min，冷却后加入1 ml去离子水，分层后收集有机相，对有机相进行真空干燥。通过气象色谱-质谱联用仪的分析。发酵阶段细菌生长和微生物油脂积累情况如图2所示。细菌生长用细菌菌体悬浮液在600 nm紫外光下的吸收（OD600）表示，油脂含量为油脂质量占细菌菌体干重的百分数。其中细菌油脂的最大含量出现在40 h，为19.06%（油脂质量占细菌干重的百分数）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种回收轻油生产微生物油脂的方法，其特征是，以轻油为原料，添加水将轻油稀释，添加盐分，调节pH值为4～8.5，灭菌，制得产油培养基，以浑浊红球菌(Rhodococcus opacus)DSM NO.44193或浑浊红球菌(Rhodococcus
opacus)DSM NO.1069为发酵菌株，将发酵菌株驯化培养，得到驯化培养后的菌株，将驯化培养后的菌株添加入产油培养基中，通风、振荡培养，发酵12～45h后收集菌体，通过酯交换反应得到微生物油脂；
当发酵菌株为浑浊红球菌(Rhodococcus
opacus)DSM NO.44193时，1L驯化培养基的组成及含量为：8～10g Na2HPO4·12H2O，1～2g KH2PO4，0.1～0.3g MgSO4·7H2O，1.0～1.5mg FeNH4-citrate，15～25mg CaCl2，1.5～2.5ml霍格兰溶液，0.4～0.6g NaHCO3和1～5gNH4Cl，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1∶7～10；
当发酵菌株为浑浊红球菌(Rhodococcus
opacus)DSM NO.1069时，1L驯化培养基的组成及含量为：0.3～0.5g KH2PO4，1.3～2.0g K2HPO4，0.1～0.3g MgSO4·7H2O，0.01～0.02gFeCl3，0.4～0.6mg MnSO4·H2O，0.5～1.5mg CuSO4·5H2O，0.5～1.5mg ZnSO4·7H2O,0.3～0.6mg CaCl2,0.1～0.3mg KCl，0.4～0.6mg H3BO3和1～5g NH4NO3，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1∶7～10；
所述酯交换反应的步骤为，将菌体加入含有氯仿、碳原子数小于2的醇的酸性溶液中，于90～100℃条件下反应，得到反应后的溶液，在反应后的溶液中分离出微生物油脂；
所述菌体、氯仿、碳原子数小于2的醇、酸的配比为10mg∶1～5ml∶0.85～4.5ml：0.15ml。
2.如权利要求1所述的回收轻油生产微生物油脂的方法，其特征是，所述轻油为木质纤维素生物质热解后液体产品中的水溶液部分，并通过小于0.5μm的滤膜过滤去除杂质。
3.如权利要求1所述的回收轻油生产微生物油脂的方法，其特征是，稀释比例为轻油与水的体积比为1∶7～10。
4.如权利要求1、2或3所述的回收轻油生产微生物油脂的方法，其特征是，所述发酵菌株的驯化培养方法为，将所述发酵菌株添加入种子培养基活化培养，得到活化菌株种子液，然后将活化菌株种子液添加至驯化培养基中，活化菌株种子液的添加体积为驯化培养基体积的1％～5％，18～30h之后收集菌体，得到驯化培养后的菌株。
5.如权利要求1、2或3所述的回收轻油生产微生物油脂的方法，其特征是，
当发酵菌株为浑浊红球菌(Rhodococcus
opacus)DSM NO.44193时，1L产油培养基的组成及含量为：8～10g Na2HPO4·12H2O，1～2g KH2PO4，0.1～0.3g MgSO4·7H2O，1.0～1.5mg FeNH4-citrate，15～25mg CaCl2，1.5～2.5ml霍格兰溶液，0.4～0.6g NaHCO3和0.1～0.5g NH4Cl，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1∶7～10；
当发酵菌株为浑浊红球菌(Rhodococcus
opacus)DSM NO.1069时，1L产油培养基中含有的盐分的组成及含量为：0.3～0.5g KH2PO4，1.3～2.0g K2HPO4，0.1～0.3gMgSO4·7H2O，0.01～0.02g FeCl3，0.4～0.6mg MnSO4·H2O，0.5～1.5mgCuSO4·5H2O，0.5～1.5mg ZnSO4·7H2O，0.3～0.6mg CaCl2，0.1～0.3mg KCl，0.4～0.6mg H3BO3和0.1～0.5g NH4NO3，其余为轻油和水，所述轻油与水的体积比为1∶7～10。
6.如权利要求1、2或3所述的回收轻油生产微生物油脂的方法，其特征是，发酵温度为25～37℃，振荡转速为150～250rpm。
7.如权利要求1、2或3所述的回收轻油生产微生物油脂的方法，其特征是，所述分离方法为，反应后的溶液中加入水，分层后，对有机相进行真空干燥。
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