CN104293842A - 一种利用醋糟废弃物发酵生产油脂的方法 - Google Patents

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朱道辰
谢长校
陈焱
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Abstract

醋糟是生产食醋过程中的副产物，醋糟中含有粗蛋白，粗纤维，粗灰分及丰富的微量元素，醋糟的掩埋或丢弃在浪费资源的同时也给环境带来严重危害。浑浊红球菌（ Rhodococcus opacus PD630）拥有强大的碳源转化能力，能够将各种碳源转化成甘油三酯，以脂滴的形式储存起来，是目前被公认的发展生物能源最具潜力的候选菌种之一。经过发明者的长期研究，发现浑浊红球菌可以充分利用醋糟中的营养物，代谢产生脂肪酸。同时发明者积极优化发酵工艺，能够高效率地解决醋糟废弃物的处理问题。

Description

一种利用醋糟废弃物发酵生产油脂的方法
技术领域
本发明涉及一种醋糟废弃物的处理方法，尤其是关于浑浊红球菌(Rhodococcus opacus PD630)利用醋糟废弃物发酵，生产油脂的一种方法。
背景技术
醋糟是生产食醋过程中的副产物，我国食醋产量大，醋糟资源相当丰富。醋糟中含有粗蛋白，粗纤维，粗灰分及丰富的微量元素。之前我国一直将其掩埋处理，不仅是严重的浪费而且酸水渗漏还导致环境污染。近几年对醋糟的利用开始有了些研究，主要用作动物饲料，植物和食用真菌培养基质，燃料等。但是这些方法在对醋糟干燥时能耗大，动物对醋糟的中粗纤维的利用率不高，培养基质使用后仍留有不少残渣需要处理。
浑浊红球菌（Rhodococcus opacus PD630）拥有强大的碳源转化能力,能够将各种碳源转化成甘油三酯，以脂滴的形式储存起来，其含油量可高达菌体干重的87%,是目前被公认的发展生物能源最具潜力的候选菌种之一。而醋糟中含有丰富的碳水化合物，粗蛋白、丰富的微量元素及无机氮源，经过发明者的长期研究，发现浑浊红球菌可以充分利用这些营养物，代谢产生脂肪酸。同时发明者积极优化发酵工艺，能够高效率地解决醋糟废弃物的处理问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用醋糟废弃物发酵生产油脂的方法。在浑浊红球菌（Rhodococcus opacus PD630）的发酵培养基中配入适量的醋糟，在发酵过程中实时监测其浓度，及时补料，同时也要控制好其他条件参数。通过匀浆使得红球菌细胞破碎释放胞内油脂，然后将浑浊红球菌发酵积累的油脂通过极性有机溶剂（如氯仿、己烷）萃取出来。本发明采用的培养基通过加入四氢嘧啶来保护在酸性条件下的浑浊红球菌，维持其生长和代谢。发明人通过长期研究，优化出成熟高效的发酵条件。
具体实施方式
实施例1（实验室）
本实施例采用的发酵培养基，成分如下：
表1（营养平衡型）
名称 用量 名称 用量
(NH4)2SO4 1.4g 微量元素混合液 1.0ml
MgSO4·7H2O 1.0g Stock A溶液 1.0ml
CaCl2·2H2O 0.02g 醋糟 10g
尿素 1g 1.0M磷酸缓冲液 35.2ml
ddH2O 963ml 葡萄糖 2g
四氢嘧啶 1g    
本实施例采用的微量元素混合液成分：1L混合液中含有 FeSO4·7H2O, 0.5g; ZnSO4·7H2O, 0.4g ；MnSO4·H2O, 0.02g; H3B03, 0.015g; NiC12·6H2O, 0.01g, EDTA, 0.25g; CoCl2·6H2O, 0.05g;  CuCl2·2H2O, 0.005g。
本实施例中采用的Stock A溶液成分：1L溶液中含有NaMoO4·2H2O, 2.0g和 FeNa·EDTA, 5.0g。
本实施例采用的1.0M磷酸缓冲液配制方法如下：1L溶液中含113g K2HPO4和 47g KH2PO4。
按上述配方配制好培养基，并灭菌处理。将浑浊红球菌接种于该培养基在28℃，200rpm条件下摇瓶培养120h,起始PH控制为7.2±0.02。
实施例2（实施例2）
本实施例的发酵培养基各成分如下：
表2（氮源限制型）
名称 用量 名称 用量
(NH4)2SO4 1.4g 微量元素混合液 1.0ml
MgSO4·7H2O 1.0g Stock A溶液 1.0ml
CaCl2·2H2O 0.02g 醋糟 15g
尿素 0.1g 1.0M磷酸缓冲液 35.2ml
ddH2O 963ml 葡萄糖 2g
四氢嘧啶 2g    
本实施例采用的微量元素混合液成分：1L混合液中含有 FeSO4·7H2O, 0.5g; ZnSO4·7H2O, 0.4g ；MnSO4·H2O, 0.02g; H3B03, 0.015g; NiC12·6H2O, 0.01g, EDTA, 0.25g; CoCl2·6 H2O, 0.05g;  CuCl2·2H2O, 0.005g。
本实施例中采用的Stock A溶液成分：1L溶液中含有NaMoO4·2H2O, 2.0g和 FeNa·EDTA, 5.0g。
本实施例采用的1.0M磷酸缓冲液配制方法如下：1L溶液中含113g K2HPO4和 47g KH2PO4。
按上述配方配制好培养基，并灭菌处理。将浑浊红球菌接种于该培养基在28℃，200rpm条件下摇瓶培养120h,起始PH控制为7.2±0.02。
实施例3（工业氮源限制）
本实施例采用的发酵培养基配方如下：
表3
名称 用量 名称 用量
(NH4)2SO4 700g 微量元素混合液 500ml
MgSO4·7H2O 500g Stock A溶液 500ml
CaCl2·2H2O 10.0g 醋糟粉末 15kg
四氢嘧啶 100g 1.0M磷酸缓冲液 1760ml
ddH2O 482L 葡萄糖 1.5kg
尿素 20g    
本实施例采用的微量元素混合液成分：1L混合液中含有 FeSO4·7H2O, 0.5g; ZnSO4·7H2O, 0.4g ；MnSO4·H2O, 0.02g; H3BO3, 0.015g; NiCl2·6H2O, 0.01g, EDTA, 0.25g; CoCl2·6H2O, 0.05g;  CuCl2·2H2O, 0.005g。
本实施例中采用的Stock A溶液成分：1L溶液中含有NaMoO4·2H2O, 2.0g和 FeNa·EDTA, 5.0g。
本实施例采用的1.0M磷酸缓冲液配制方法如下：1L溶液中含113g K2HPO4 和 47g KH2PO4。
按上述配方配制好培养基，并灭菌处理。将浑浊红球菌接种于该培养基在28℃，200rpm条件下摇瓶培养120h,起始PH控制为7.2±0.02。
实施例4：测定浑浊红球菌细胞油产率
A.测定红球菌细胞干重
上述实施例1、2和3发酵结束后，分别取每个发酵罐取 1ml发酵液，在10000rpm下离心10min，用水洗涤生物质沉淀两次，并在40℃下恒温干燥24h，通过重量分析确定生物质。
B.从浑浊红球菌细胞中提取油（Folch油的提取方法）
将上述实施例发酵产生的红球菌生物质与20体积的氯仿：甲醇（2:1）混合液一起匀浆。分散后，室温下在轨道振荡器上过夜搅拌整个混合液，离心并回收液相。用0.2体积的水洗涤溶剂。漩涡混合几秒后，2000rpm下离心分开两相。虹吸去除上相，氮气流氛围下在旋转蒸发器中蒸发含有脂质的下相，回收油脂，称重。
C.计算细胞油产率
通过用红球菌细胞产油脂的量与浑浊红球菌细胞干重的比值来表示细胞的油脂产率。
表4红球菌PD630细胞油产率
  细胞干重 产油量 细胞产油率
实施例1 42.2g/L 7.7g/L 18.2%
实施例2 24.2g/L 16.7g/L 69.01%
实施例3 28.1g/L 21.5g/L 76.5%
由表4可以看出，营养平衡的发酵培养基，虽然能够使菌体快速生长繁殖，但是却不能促进浑浊红球菌的细胞内油脂积累，氮源限制培养基能够大大提高红球菌的油脂积累效率。
实施例5：红球菌胞内积累油脂成分及含量分析
向实施例4中提取出来的3份油脂样品加入1ml正己烷，4000rpm离心5min ，上清转移至气相瓶。气相色谱分析用岛津GC-2010，色谱柱为DB-Wax(30m×0.32mm，0.25μm)，氢离子火焰检测器，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃。分流方式为进样1μl,分流比为10:1，载气为氮气。
  程序升温设置：
  120℃ Hold 3min
  以5℃/min,升温至190℃
  以4℃/min,升温至220℃
  Hold 20min
分析结果见表5
表5
由表5 的成分分析可以看出，浑浊红球菌积累的油脂，脂肪酸种类主要集中于C14-C18的中链脂肪酸，其中C16：0(棕榈油酸)和C18：1(油酸）含量最高。红球菌利用醋糟产生的油脂中含有功能脂肪酸，红球菌产油的这一特征可以作为功能脂肪酸生产的一大潜力方向。

Claims (7)

1.一种利用醋糟废弃物发酵生产油脂的方法。
2.根据权利要求1所述，发酵生产油脂的生产菌种为红球菌属。
3.根据权利要求2所述产油菌种包括Rhodococcus opacus PD630、Rhodococcus jostii RHA1等红球菌属的多个种。
4.根据权利要求1、2或3所述，产油红球菌产油利用的碳源为醋糟废弃物。
5.根据权利要求4所述，醋糟添加方式为直接配入培养基和补料添加，添加量为8%-10%。
6.根据权利要求4或5所述，在红球菌发酵培养基中加入四氢嘧啶，所加四氢嘧啶浓度为0.02%-1%。
7.红球菌细胞产油的提取方式为氯仿-甲醇（2:1）萃取。
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