JPH0420297A - 酵素活性測定用基質とこれを用いる酵素活性測定方法及び測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、酵素活性測定用基質とこれを用いる酵素活
性測定方法及び測定用試薬に関する。

更に詳しくは分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ
基を有する酵素（Ｎ−アセチル−βＤ−グルコサミニダ
ーゼ、Ｎ−アセチル−βＤ−へキソサミニダーゼ、アル
カリ性もしくは酸性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、またはβ−Ｄ−グルクロニダーゼ）反応の基
質、この基質から酵素反応によって生成する３、４ジニ
トロフェノールの呈色（吸光度）を測定する酵素活性の
測定方法、及びこの基質を含有する酵素測定用試薬に関
するものである。

〈従来の技術と発明が解決しようとする問題点〉臨床検
査において、尿細管障害、糖尿病性腎障害等の各種腎疾
患の早期診断に欠かせないＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼまたはＮアセチル−β−Ｄ−へキソサミ
ニダーゼ（以下、ＮＡＧアーゼと略称する）活性を測定
するには、従来、基質として分子の末端にｐ−ニトロフ
ェノキシ基を有する（ｐ−ニトロフェノールをアグリコ
ンとする）ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニドを基質とし、本酵素の作用で遊離する
ｐ−二トロフェノール（アグリコン）を高ｐ　Ｈ領域で
比色定量する方法が採られている（Ｍｅｔ、ｈｏｄｓ　
ｉ−ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ　、　２８巻、ｐ。

７７２−７７６）。また、基質としてｍ−クレゾールス
ルポンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニドを基質とし用いる方法が開示されている（特開昭
５８−９９４号公報参照）。

しかし、ＮＡＧアーゼ酵素作用の至適ｐＨは酸性側領域
の５付近であるのに対し、ｐ−ニトロフェノールはアル
カリ側のｐ、　Ｈ８以上のアルカリ側領域でなければ十
分な発色を示さない。そのため酵素ＮＡＧアーゼの活性
を測定するには、いずれの基質の場合も酵素と基質を混
合して反応を開始し、一定時間後に反応液にアルカリ溶
液を添加して反応を停止させ、分光光度計にかけるとい
う操作を行わなければならず、好適な条件でモニターす
る速度分析（いわゆるレートアッセイ）を行えないとい
う欠点がある。

そこで、レートアッセイを行うためにＮＡＧアーゼが適
切に作用する酸性側のｐ　Ｈ５付近で発色する、Ｐ−ニ
トロフェノールに変わる化合物（アグリコン）の結合し
たＮ−アセチル−βＤ−グルコザミニド基質を開発しよ
うという試みがなされてきた。

すなわち、この目的で現在までに次のニトロ化合物をア
グリコンとする基質が提案されている（特開昭６１−１
．７７９９９　）。

（ａ）２．４−ジニトロフェノール（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５５巻、　ｐ、　、　１１８６１−１１
８６９　、１９８０）（ｂ）２−クロロ−４−ニトロフ
ェノール（特開昭６１．−１１２０９２号） （ｃ）２．５−ジニトロフェノール （ｄ）２６−ジクロロ−４−ニトロフェノール（ｅ）２
．６−ジプロモー４−二トロフェノール（ｆ）２，３．
６−１−ジクロロ−４ニトロフエノール （ｇ）２，３，５．６−テトラブロモ−４−ニトロフェ
ノール （ｈ）２，３，５．６−テトラクロロ−４−ニトロフェ
ノール （ｉ）７−スルフオー２．４−ジニトロ−１−ナフトー
ル（特開昭６ｌ−１７７９９９）上記化合物は、いずれ
の場合もフェノール性水酸基の隣接する位置にバルキー
な電子吸引性置換基を持ち、酸性度を強め、低いｐ、　
Ｈでも電離して発色する性質を持つことから、これらを
分子末端に（アグリコンとして）結合した基質は、前記
Ｐ−二トロフェノールの有する欠点を補うことが期待さ
れたものである。

しかしながら、これら酸性アグリコンとＮ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミンを縮合して合成した基質は、全て
著しく水に難溶であるか、低いｐＨで満足できる電離発
色を示さないか、そのもの自体が不安定か、または２位
のバルキーな置換体のため酵素反応に障害を与えるとい
う問題を有する。例えば、２−り四ロー４−ニトロフェ
ニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド基質は水に
難溶のため十分な基質を溶解でず、従ってそれが試薬の
調製法や測定精度にも著しく影響し実用上満足のいく測
定法となっていない。

また、２，４−ジニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド基質は合成が困難で、各種の反応条
件を検討して、最善と思われる合成法によっても収率は
高々５％に過ぎない。この原因はこの物質の不安定性に
起因するもので、最終段階の再結晶においても加水分解
を防ぐために細心の注意を払う必要がある（前出、Ｊ、
　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５５巻、ｐ、１１８６１−１１８６９゜
１９８０）。

以上のように、現在までに試みられた、Ｐ−ニトロフェ
ノールに変わる種々のニトロフェノール化合物では、こ
のＮＡＧアーゼの基質に関する問題を解決することは出
来なかった。

更に、これらの事情が当てはまる生体内酵素等とその基
質を第１表（巻末）に−括してあげる。

そこで発明者等は、前記Ｐ−ニトロフェノールに変わる
二ｌ・ロフェノール化合物を更に検討した。すなわち、
ベンゼン環の電子状態や立体特異的反応性等を検討した
ところ、必要な酸性度を保有し、またフェノール性水酸
基の隣接位にバルキーな置換基を持たない誘導体という
観点から、３．４−ジニトロフェノールが、適している
ことを知り、この３，４−ジニトロフェノールを分子末
端に結合した基質を種々合成して本発明を完成した。

〈問題点を解決するための手段〉 本願発明は、ＮＡＧアーゼ、ホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等のレー
トアッセイのための基質として十分に水に溶けやすく安
定で、しかも酸性ｐ　Ｈ領域でも優れた発色性及び定量
性を示す基質、この基質から生成する３、４−ジニトロ
フェノールの呈色（吸光度）を測定する酵素活性の測定
方法、並びにこの基質を含有する酵素測定用試薬を提供
することを目的とする。

本願発明は下記の（１）〜（７）に記載する請求項によ
り構成されている。

（１）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
することを特徴とする下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、
または（Ｄ）に記載する酵素活性測定用基質。

（Ａ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコザミニダーゼ、も
しくはＮ−アセチル−β−Ｄヘキソサミニダーゼ （Ｂ）アルカリ性または酸性ホスファターゼ（Ｃ）β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ （Ｄ）β−Ｄ−グルクロニダーゼ （２）分子の末端に３．４−ジニトロフェノキシ基を有
する基質から生成する３、４−ジニトロフェノールの呈
色（吸光度）を測定することを特徴とする下記の（Ａ）
、（Ｂ）、（Ｃ）、またＬ）：（Ｄ）に記載する酵素活
性測定方法。

（Ａ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコザミニダーゼ、も
しくはＮ−アセチル−β−Ｄ−へキソザミニダーゼ （Ｂ）アルカリ性または酸性ホスファターゼ（Ｃ）β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ （Ｊ））β−Ｄ−グルクロニダーゼ （３）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
する基質が、３，４−ジニトロフェニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニドもしくは３４−ジニトロフェ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−へキソサミニド（Ｎ−ア
セチル−βＤ−グルコザミニダーゼもしくはＮ−アセチ
ルβ−Ｄ−ヘギソサミニダーゼ活性測定用）、３゜４−
ジニトロフェニルリン酸またはその塩（アルカリ性また
は酸性ホスファターゼ活性測定用）、３．４−ジニトロ
フェニル−β−Ｄ−グルクロニド（β−Ｄ−グルクロニ
ダーゼ活性測定用）、または３４−ジニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド（β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性
測定用）である特許請求の範囲第（２）項記載の酵素活
性測定方法。

（４）測定系にシクロデキストリンを共存させる特許請
求の範囲第（２）項及び第（３）項記載の酵素活性測定
力法。

（５）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
する、下記の（Ａ）、（Ｂ）（Ｃ）、または（Ｄ）に記
載する酵素活性測定用基質を含有することを特徴とする
酵素活性測定用試薬。

（△）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコザミニダーゼ、も
しくはＮ−アセチル−β−Ｄヘキソザミニダーゼ （１３）アルカリ性または酸性ホスファターゼ（Ｃ）β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ （Ｄ）β−Ｄ−グルクロニダーゼ （６）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
する基質が、３，４−ジニトロフェニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコザミニドもしくは３，４−ジニトロフ
ェニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−へキソザミニド（Ｎ−ア
セチル−βＤ−グルコサミニダーゼもしくはＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−’＼キソザミニダーゼ活性測定用）、３４
−ジニトロフェニルリン酸またはその塩（アルカリ性ま
たは酸性ホスファターゼ活性測定用）、３．４−ジニト
ロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（β−Ｄ−グルクロ
ニダーゼ活性測定用）、または３．４−ジニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
活性測定用）である特許請求の範囲第（５）項記載の酵
素活性測定用試薬。

（７）酵素活性測定用基質と共にシクロデキストリンを
含有する特許請求の範囲第（５）項及び第（６）項記載
の酵素活性測定用試薬。

本願発明に使用する３、４−ジニトロフェノール自身は
既知化合物であるが、この化合物を分子末端に有する（
結合した）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコザミニド等が
合成されたという記録はなく、性質も知られていない。

ましてこれらが生体内酵素ＮＡＧアーゼ、ホスファター
ゼ等の活性測定用の基質、及びβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ等の標識酵素活性測定用の基質として利用されたとい
う記録も皆無である。

本願発明に使用する３、４−ジニトロフェノールは、基
質分子の末端に結合したとき溶解度が大きく、溶解補助
剤なしで酵素基質として使用できる。すなわち、３，４
−ジニトロフェノールを、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニドの基質末端に結合したときは１２ｍＭという
実用性の極めて高い濃度の水溶液が調製でき、しかもそ
の溶液は低温で極めて安定に保存出来る。これに対し、
例えば２−クロロ−４−二トロフェノールは、ｐＫ＝＝
５．５の酸性度を持つが、これより合成した２−り四ロ
ー４−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニドは難溶性で測定キットに導入するためにはシクロ
デキストリン、クラウンエーテル等の溶解補助剤を添加
してもなお十分な溶解性は得られず、従って測定用試薬
としての性能も十分ではない。

〈作用〉 この発明は、生体内酵素反応の基質として、従来の分子
の末端にｐ−ニトロフェノキシ基等を有する（ｐ−ニト
ロフェノール等をアグリコンとする）基質に代えて、３
，４−ジニトロフェノール基を導入することにより、■
酵素の作用ｐＨ（中性もしくは酸性側）水溶液における
基質の溶解性、安定性（保存性）を格段に向上させ、■
酵素の作用ｐＨと酵素反応の測定指標物質（３，４−ジ
ニトロフェノール）の呈色（吸光度測定）ｐＨを−致さ
せるか、または近づけて、正確かつ精度のよいレート分
析を可能としたものである。

〈実施例１〉 ［ｒＮＡＧアーゼの基質、３，４−ジニトロフェニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドの合成１ １１ｏ１１ｅｍａｎ（Ｒｅｃｕｉｌ　ｄｅｓ　Ｔｒａｖ
ｅａｕｘ　Ｃｈｉｍｉｑｕｅｓ　ｄｅｓＰａｙｓ−Ｂａ
ｓ、　２１巻、Ｐ　　４３２−４４７］、　９０２　）
の方法に従い、ｍ−ニトロフェノール２０ｇより出発し
、濃硝酸によるニトロ化、副反応生成物との分離を経て
、純３，４−ジニトロフエノール７ｇを合成した。融点
は１３４℃で、上記文献の値と一致した。

合成した３、４−ジニトロフェノール１ｇよりカリウム
３，４−ジニトロフェノラートの粉末を調製し、これを
乾燥アセトン中、２−アセタミド−２−デオキシ−３，
４，，６，−１−り一〇−アセチルーα−１−クロロ−
Ｄ−グルコサミニド２ｇと約３時間還流する。アセトン
を留去、縮合生成物をクロロホルムに溶解し、希アルカ
リで未反応物質３，４−ジニトロフェノラートを除去し
た後、縮合生成物約１．５ｇが得られた。これをエタノ
ールから再結晶して精製した。最後に縮合生成物をメタ
ノールに溶解し、少量のナトリウムメチラートを触媒と
して脱アセチル化することにより、はぼ定量的に３，４
−ジニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニドが得られた。これを熱エタノールより再結晶して
精製した。

３．４−ジニトロフェニル−Ｎ−アセデルβ−Ｄ−グル
コザミニド（以下、３．４−ＤＮＧともいう）は基質と
して使用するとき充分な水溶性を有し、ＮＡＧアーゼ活
性測定に充分な１２ｍＭの濃度の水溶液を容易に調製す
ることが出来る。また、この水溶液は水冷下で安定、室
温では一夜放置して１％程度の分解が起こるのみである
。酵素反応条件（ｐＨ５，３７°Ｃ）での１時間の分解
率は１．５％に過ぎない。スペクトルは紫外線２９０ｎ
ｍに強い吸収を持つが、可視部４００ｎｍにはほとんど
吸光を示さず光学的に顕著に区別される。

〈実施例２〉 「３，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、
３，４−ジニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、及
び３，４−ジニトロフェニルリン酸の合成と酵素反応」 実施例１と同様の手法により、合成された３゜４−ジニ
トロフェノールと、２，３，４．６−チトラーＯ−アセ
チルーα−１−クロロ−Ｄ−ガラク）・シト、及び２，
３．４−トリー〇−アセチルーα−１−クロロ−Ｄ−グ
ルクロニド−６−メチルエステルを用いて、縮合生成物
をそれぞれ１、．３ｇ、及び０．７ｇを得、エタノール
から再結晶後、実施例１と同じ方法で脱アセチル化し、
再びエーテルより再結晶して精製した。

また同様に、３，４ジニトロフエノールをピリジン中に
てｐｏｃβ３．Ｈ３ＰＯ４各２ｇと反応させ、縮合生成
物１．５ｇを得、ナトリウム塩として、再結晶により精
製した。

これらはいずれも、少なくとも１０ｍＭの溶解］　８ 性も有し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄグルクロ
ニダーゼ、及びフォスファターゼ活性測定用基質として
、ガラクトシグーゼ（Ｅ、ｃｏｌｉ由来）は２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐ、Ｈ６，５）中、グルクロニダーゼ及び
酸性フォスファターゼは５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，
０）及び４０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５，１）中で尿
及び血清を検体として、それぞれの酵素活性が測定され
た。

〈実施例３〉 「ＮへＧアーゼ活性の測定ｊ ０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５）１．５ｒｒ＋ｊ２と
１．２ｍＭの３．４−ＤＮＧを含む反応混合液（反応時
、酵素液を加えて体積が３ｍｆｆになるように調製）を
３７℃に平衡化して分光光度計にセットした後、ＮＡＧ
アーゼ液（シグマ社製ヒト胎盤の酵素で、標準測定法、
　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２８巻、
ｐ、７７２−７７６、による活性値を０．５０Ｕ／９，
１００Ｕ／β、２００Ｕ＃２及び３００　Ｕ／ｊｌｌ）
５種類に調製）１００ｔＬｊ２を添加、直ちに波長４０
０ｎｍの吸光度の経時変化をモニターした結果を第１図
に示す（図中の直線に付された数値の単位はＵ　／　、
ｆ２である。）。コントロールを補正した反応速度と酵
素量には正比例の関係が見られ、レートアッセイが正確
に行なわれたことが示される。酵素無添加時（コントロ
ール）における吸光度の経時変化は再現性が高（、ｊ回
コントロールをとるだけで以後の測定を進めることが出
来る。

〈実施例４〉 Ｉｒ３．４−ＤＮＧを含有する試薬を用いるＮＡＧアー
ゼ活性の測定方法」 （１）試薬の調製 ３．４−ＤＮＧ　　　　　　　　　１．２ｍＭクエン酸
緩衝液（ｐＨ５，０）　　Ｏ，］、Ｍ（２）操作法 検体１５０μ℃に、３７°Ｃで５分間加温した試薬３ｍ
ｆ２を加え反応させ、試薬ブランクを対照に単位時間あ
たりの４００ｎｍにおける吸光度変化を測定した。

（３）結果 標準品を用いたときの検量線は、２００　Ｕ／ｆ２まで
直線性を示し、２−クロル−４ニトロフェニル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄグルコサミニド基質法との相関性も良好
であった。

生体液中のＮＡＧアーゼ活性測定値は第２表（巻末）の
通りである。

〈実施例５〉 「酸性フォスファターゼ活性測定法」 （１）試薬の調製 ３．４ジニトロフエニルリン酸　　１０ｍＭクエン酸緩
衝液（ｐＨ５，１）　　　４０ｍＭ（２）操作法 検体２０μ℃に、３７℃で５分間加温した試薬２００μ
℃を加えて反応させ、試薬ブランクを対照に単位時間あ
たりの４００ｎｍにおける吸光度変化を測定した。

（３）結果 標準品を用いたときの検量線は、２００　Ｕ／ｆｌまで
直線性を示し、ｐ−ニトロフェニルリン酸基質法との相
関性も良好であった。

生体液中の酸性フォスファターゼ活性測定値は第３表（
巻末）の通りである。

〈実施例６〉 ｒ測定精度の比較（オートアナライザー用試薬として調
製）ｊ （ａ）３．４−ＤＮＧ法（本願の方法）（１）使用試薬 試薬１：クエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）０．１試薬２　
：　３，４−ＤＮＧ　　６ｍＭを含む０．　１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ５，０） （１丁）操作法 検体２ｏｕｇと、試薬１　０．４ｍｆｆを３７°Ｃで５
分間加温した後、試薬２０．１ｍｆｆを加えて反応させ
、４．　ＯＯｎ　ｍにおける吸光度変化を測定した。

（ｂ　）−２−クロル−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセ
デルグルコサミニド法 メイアッセイＮＡＧ−Ｒ■（三光純薬販売）を説明書に
従い使用した。

（ＩＩＩ　）結果（ＣＶ値として比較）は次の通りであ
った。

二りＬ　　　方法 ２Ｕ／β　　１０．８％　　８３．４％５１Ｕ／、ｅ　
　　　３．７％　　　４．９％以上の測定結果によれば
、尿中ＮＡＧアーゼの正常値付近（数Ｕ　／　ｍ℃）で
の測定精度に大きな差が表れ、基質溶解性の優れた本願
発明の方法の利点が示されいる。

〈実施例７〉 「各種シクロデキストリン（ＣＤ）による増感効果Ｊ α−５β−１γ−ＣＤ類について、これらの最終濃度が
２．４ｍＭとなるようにＯ，１Ｍクエン酸緩衝液を調製
し、４００ｎｍにおける３、４ＤＮＰの増感効果を調べ
た。

その結果は次の通りであった。

増感効率％ 無添加 α−ＣＤ類 β−ＣＤ類 γ−ＣＤ類 １０３〜１０４ １１１〜１４６ 増感効率の高かったβ−ＣＤ類を用いて、実施例３に基
づいてＮＡＧアーゼを測定したところ、同様な良好な結
果を得た。

特に水溶性が高く、増感効果の高いＤ　Ｅ　Ａ、　Ｅ　
−β−ＣＤについては、最終濃度２４．　ｍ　Ｍにて、
２倍以上の感度の上昇が示された。

以上の実施例における測定試薬組成は、−数的なもので
あり、当業者であれば種々の応用が可能である。

例えば、検体の濁りを防ぐための各種界面活性剤の添加
、また防腐剤、安定化剤の添加、更には発色感度を高め
、相対的に試薬ブランク値を低減させ、また３、４−ジ
ニトロフェノールのｐＫａ値を酸性側に移行させ、実行
Ｓ／Ｎ比を増大させる等の目的でシクロデキストリンま
たはその各種誘導体の添加等を適宜行なうことができる
。

本願発明は、ｐＨ１温度に影響されにく（優れた溶解性
を示す３，４−ジニトロフェノールをアグリコンとして
有する基質と、それらを用いて測定することで、各種の
酵素活性を精度よく測定することを主旨とするもので、
前記した応用も包含するものである。

〈発明の効果〉 この発明に係る生体内酵素反応の基質とこれを用いる酵
素活性測定方法及び測定用試薬は、以上のように構成し
たから、Ｎ−アセチル−β−Ｄグルコサミニダーゼ、Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−へキソサミニダーゼ、アルカリ性
もしくは酸性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、またはβ−Ｄ−グルクロニダーゼ等のレート分析の
精度を格段に向」ニさせるという効果を有する。

【図面の簡単な説明】

図面は、酵素量（ＮＡＧアーゼ） 相関関係を示す図である。 第１表 と吸光度との 第２表 ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β ミニド基質法をいう。 Ｄゲルコサ 第３表 ■ＰＮＰ−リン酸法とは、 ニトロフェニルリ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
   することを特徴とする下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、
   または（Ｄ）に記載する酵素活性測定用基質。 （Ａ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、も
   しくはＮ−アセチル−β−Ｄ− ヘキソサミニダーゼ （Ｂ）アルカリ性または酸性ホスファターゼ（Ｃ）β−
   Ｄ−ガラクトシダーゼ （Ｄ）β−Ｄ−グルクロニダーゼ
2. （２）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
   する基質から生成する３，４−ジニトロフェノールの呈
   色（吸光度）を測定することを特徴とする下記の（Ａ）
   、（Ｂ）、（Ｃ）、または（Ｄ）に記載する酵素活性測
   定方法。 （Ａ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、も
   しくはＮ−アセチル−β−Ｄ− ヘキソサミニダーゼ （Ｂ）アルカリ性または酸性ホスファターゼ（Ｃ）β−
   Ｄ−ガラクトシダーゼ （Ｄ）β−Ｄ−グルクロニダーゼ
3. （３）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
   する基質が、３，４−ジニトロフェニル−Ｎ−アセチル
   −β−Ｄ−グルコサミニドもしくは３，４−ジニトロフ
   ェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニド（Ｎ−
   アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼもしくはＮ−ア
   セチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測定用）、３
   ，４−ジニトロフェニルリン酸またはその塩（アルカリ
   性または酸性ホスファターゼ活性測定用）、３，４−ジ
   ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（β−Ｄ−グル
   クロニダーゼ活性測定用）、または３，４−ジニトロフ
   ェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（β−Ｄ−ガラクトシダ
   ーゼ活性測定用）である特許請求の範囲第（２）項記載
   の酵素活性測定方法。
4. （４）測定系にシクロデキストリンを共存させる特許請
   求の範囲第（２）項及び第（３）項記載の酵素活性測定
   方法。
5. （５）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
   する、下記の（Ａ）、（Ｂ）、 （Ｃ）、または（Ｄ）に記載する酵素活性測定用基質を
   含有することを特徴とする酵素活性測定用試薬。 （Ａ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、も
   しくはＮ−アセチル−β−Ｄ− ヘキソサミニダーゼ （Ｂ）アルカリ性または酸性ホスファターゼ（Ｃ）β−
   Ｄ−ガラクトシダーゼ （Ｄ）β−Ｄ−グルクロニダーゼ
6. （６）分子の末端に３，４−ジニトロフェノキシ基を有
   する基質が、３，４−ジニトロフェニル−Ｎ−アセチル
   −β−Ｄ−グルコサミニドもしくは３，４−ジニトロフ
   ェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニド（Ｎ−
   アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼもしくはＮ−ア
   セチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測定用）、３
   ，４−ジニトロフェニルリン酸またはその塩（アルカリ
   性または酸性ホスファターゼ活性測定用）、３，４−ジ
   ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（β−Ｄ−グル
   クロニダーゼ活性測定用）、または３，４−ジニトロフ
   ェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（β−Ｄ−ガラクトシダ
   ーゼ活性測定用）である特許請求の範囲第（５）項記載
   の酵素活性測定用試薬。
7. （７）酵素活性測定用基質と共にシクロデキストリンを
   含有する特許請求の範囲第（５）項及び第（６）項記載
   の酵素活性測定用試薬。