JPH0819162B2 - シクロデキストリン誘導体を用いる発色方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は塩基性官能基で修飾されたシクロデキストリ
ンに関するもので、合成基質を用いた測定法等に応用さ
れ、臨床化学検査等の分野において効果的に用いられ
る。更に本発明はニトロフェノール類を中性ないし弱酸
性条件下で発色させるための試薬及び方法に関するもの
である。

［従来の技術］ ニトロフェノール類の１種である４−ニトロフェノー
ル（パラニトロフェノールともいう）は４−ニトロフェ
ノール基をもつ各種合成基質が特定の酵素作用により分
解されるときに生成する物質で、この物質の増加を経時
的に定量することにより当該酵素の活性を容易に測定す
ることができる。例えば、フォスファターゼの活性を測
定するためには４−ニトロフェノールリン酸を基質とし
て遊離して生じる４−ニトロフェノールを定量する。フ
ォスフォジエステラーゼの活性測定にはビス（４−ニト
ロフェニル）リン酸を基質として同様に測定する。β−
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼの活性測定では、合成基質として４−
ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
が利用される。その他、各種のグルコシダーゼ（グルコ
シド結合の加水分解を触媒する酵素）、ホスホリパーゼ
Ｃ、トリプシンやキモトリプシンなどのセリンプロテア
ーゼ、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼなどに対し、４−ニトロフェニル基をもつ合成基
質が開発され、臨床検査をはじめとするさまざまな分野
で実用に供されている。

［発明が解決しようとする問題点］ 以上の例で示した各種酵素の活性測定が可能となる原
理は、例えば４−ニトロフェニル基をもつ合成基質の場
合は、その合成基質と遊離して生じる４−ニトロフェノ
ールの間で吸光スペクトルに差があるという事実に基礎
をおいている。すなわち、４−ニトロフェニル基をもつ
合成基質は広いpH領域において紫外部（波長300〜320n
m）に強い吸光ピークをもち可視部（波長400nm以上）に
はほとんど吸光を示さないが、４−ニトロフェノールは
アルカリ性pH領域において電離し、400nm付近を中心と
する強い吸光ピークをもつ４−ニトロフェノレート・ア
ニオンを生じる。したがって、測定しようとする酵素の
活性をアルカリ性pH領域で測定できれば、酵素反応の進
行にともなう可視部の発色を400nmの吸光度増加として
連続モニターでき、正確なレートアッセイが可能とな
る。しかし、測定しようとする酵素の最適pHが中性ない
し顕著には弱酸性の領域にあれば、４−ニトロフェノー
ルの吸光スペクトルは４−ニトロフェニル基をもつ合成
基質の吸光スペクトルとほとんどオーバーラップしてし
まい、発色が微弱で、反応を経時的に連続モニターする
ことが著しく不都合となる。そこで、現行の測定法で
は、酵素反応をスタートさせてから一定時間後に、アル
カリを添加して反応を停止させると同時に生成した４−
ニトロフェノールを発色させ、その400nm付近の吸光度
を測定するという方法が多く採用されている。すなわ
ち、現行測定法では酵素活性測定法としてより正確で簡
便な形式といわれる理想的なレートアッセイが困難なだ
けでなく、アルカリ添加という余分な操作を必要とす
る。

中性ないし弱酸性の領域に最適pHをもつ酵素には、例
えば酸性フォスファターゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼなど臨床化学的に重要な酵素が含まれてい
る。これら諸酵素の反応を経時的に連続モニターするた
めの有用な手段を得ることができれば、測定操作を簡素
化し、測定時間を短縮できるだけでなく、測定精度をも
高め、各種疾患の早期発見や診断に正確な情報を提供で
きる。

従って、４−ニトロフェノール及びその他のニトロフ
ェノール類の中性ないし弱酸性のpH領域での効果的な発
色促進作用を有す試薬の開発は、臨床化学検査分野にお
ける実用面に重要な課題となっている。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、塩基性官能基を共有結合させたシクロデキ
ストリン誘導体を用いて、ニトロフェノール誘導体を包
接して発色させることを特徴とする発色方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

４−ニトロフェノールをはじめとする芳香族化合物
は、疎水的性質をもつフェニル基がシクロデキストリン
に取り込まれて包接化合物を形成することが知られてい
る。これにより芳香環のイオン状態に微妙な変化が起き
れば電離の促進が期待される。そこで、４−ニトロフェ
ノール等にα−シクロデキストリンまたはβ−シクロデ
キストリンを添加すると電離が進行し、400nm付近の吸
光度の増大がみられるが、その効果は中性から特に弱酸
性領域ではなお満足できるものではなくそれ自体の溶解
性の低さも合わせ、実用化には多くの問題を含んでい
る。

本発明者等は、鋭意検討の結果、シクロデキストリン
に塩基性官能基を共有結合させることにより、フェノー
ル性水酸基の電離の促進が起こらないかどうか、またそ
れにより４−ニトロフェノール類の発色促進が起こらな
いかどうかを試みてそこで塩基性基を融合させたシクロ
デキストリン誘導体を合成し、中性ないし微酸性pH領域
で、４−ニトロフェノールおよびその他のニトロフェノ
ール類の吸光スペクトルに対する効果を調べたところ、
顕著な発色効果をもつことが判明し本発明を達成した。

本発明を更に詳述すると本発明のために、塩基性官能
基としてまずジエチルアミノエチル基を選び、下記の原
理により、そのシクロデキストリン結合体を合成した。

同様にしてα−シクロデキストリンのジエチルアミノ
エチル結合体が得られる。またジエチルアミノエチル基
以外にジメチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピ
ル、アミノエチル基等の結合体も得ることができる。こ
のように塩基性官能基で修飾されたシクロデキストリ
ン、例えばジエチルアミノエチル化α−シクロデキスト
リン（以下DEαと略す。）およびジエチルアミノエチル
化β−シクロデキストリン（以下DEβと略す。）は意外
にも、通常のシクロデキストリンに比らべはるかに水に
よく溶け実用に供し易いものであった。現在、特に安価
で一般に用いられているβ−シクロデキストリンは比較
的に水に難溶性でこの性質が臨床化学検査等における実
用上の範囲を決めているものである。

すなわち、難溶性の目的物質をβ−シクロデキストリ
ンの包接により溶解せしめる時シクロデキストリン自身
の溶解性によりその溶解度が限定されてしまうのであ
る。具体的には特定酵素の活性を測定するためによく使
用される合成基質の溶解の場合などである。加水分解酵
素の場合は多く難溶性のニトロフェノール誘導体が発色
剤として酵素反応の経過観察のために結合されている。
例えば前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダー
ゼ測定のための合成基質である、４−ニトロフエニル
（あるいは２−クロロ−４−ニトロフェニル）−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニドの場合、β−シクロデ
キストリンの助けで必要量の溶解が試みられるが、シク
ロデキストリン自身の溶解性の悪さのためその目的を充
分に果たし得ない。それに比し、本発明によるDEα,DE
β等はたやすく水に溶解させることができ、その包括能
により上記基質等を充分に必要量溶かし得るのでこの面
においても本発明に実用的価値を付加するものである。

更に本発明の本質である中性ないしは弱酸性条件下で
のニトロフェノール誘導体に対する発色効果を種々の誘
導体を用いて調べた。４−ニトロフェノール、２−クロ
ロ−４−ニトロフェノール、５−ニトロサリチル酸、５
−ニトロサルチル酸メチル、2,4−ジニトロフェノール
などについてである。驚くべきことにこれらの中で最も
中性ないしは特に弱酸性下で電離が微弱な、すなわちpH
5.0付近においては、400nm付近での電離性の可視部発色
ピークが認められない４−ニトロフェノールでさえ、DE
αあるいはDEβの１％以下の通常濃度の存在下でその40
0nm付近に大きな新しい電離性の発色ピークを出現さ
せ、DEα、DEβの作用とその効果が顕著であることが示
された。通常のシクロデキストリンではこれ程の効果は
認められない。またDEα,DEβでは水への溶解性がよい
ため使用量を増やして効果的な増強できる。また他のニ
トロフェノールについても１％以下の通常濃度で、数倍
に及ぶ可視部発色効果が示された。

特に２−クロロ−４−ニトロフェノールは中性ないし
弱酸性下で４−ニトロフェノールに比べ、比較的発色が
なされ易いものとして、最近それを結合させた特定酵素
のための合成基質が供されているが、例えばpH5.0以下
で酵素反応を行う前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼ等については、酵素反応の結果そのpHで生
成する２−クロロ−４−ニトロフェノールの400nm付近
における電離発色は、なお、全く不充分で、その生成量
を連続モニターできるほどの感度と精度をもたない。し
かるに、ここへのDEα、あるいはDEβの添加は生成する
２−クロロ−４−ニトロフェノールの吸収スペクトルを
ほぼ完全電離に近いかたちに出現せしめ発色させるの
で、ほぼ理想的な状態での当酵素の連続モニター測定が
行える。

前記のとおり、DEα、DEβないしは充分水に溶け易
く、当合成基質の必要量を反応液に溶解できることと合
わせ実用面に著しい効果を供するものである。

以上の効果は、同様に、中性付近で反応を行うα−ア
ミラーゼのための合成基質である、４−ニトロフェニル
−マルトヘプタオシド、あるいは２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−マルトペンタオシド等を用いて生成するニ
トロフェニル誘導体を400nm付近で連続モニターするα
−アミラーゼの測定の場合、あるいは、よりpHの低い領
域で酵素反応を行わせる酸性フォスファターゼ測定のた
めのニトロフェノール誘導体を結合させた合成基質を使
用する場合などにおいても、通常のシクロデキストリン
に比し、はるかに効果的に使用される。

以上DEα、DEβについて本発明の効果を述べたが他の
塩基性官能基を修飾したシクロデキストリン及び他の酵
素反応のためニトロフェノール誘導体を結合した他の合
成基質を使用する場合においても本発明の本質は、同様
である。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ （発色試薬の合成法） 1.2−（N,N−ジアルキルアミノエチル）−α−シクロデ
キストリン（以下、DEαと略記）： α−シクロデキストリン2.4gを4mlの蒸留水に懸濁さ
せ、攪拌しながら水酸化ナトリウム1.5gを含む4mlの水
溶液を滴下していくと透明な液が得られる。さらに攪拌
を続けながら、ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩1.
4gを含む2mlの水溶液を滴下し、30〜40℃で数時間攪拌
を続けると反応は完全に終結する。この反応混合液よ
り、セファデクスG-25カラムクロマトグラフィーにより
低分子物質を除去することにより1.6gのDEαが得られ
る。得られたDEαはジエチルアミノエチル基を１個ない
し２個共有結合していることが中和滴定およびプロトン
核磁気共鳴より判明した。

2.2−（N,N−ジアルキルアミノエチル）−β−シクロデ
キストリン（以下、DEβと略記）： 上記合成１においてα−シクロデキストリンのかわりに
β−シクロデキストリンを用いることにより、ほぼ同収
率でDEβを合成することができる。

実施例２ DEαの４−ニトロフェノールに対する可視部発色効果
と酵素反応への応用。

第１図はpH5.0における４−ニトロフェノールの吸光
スペクトルと、発色試薬としてDEαを濃度１％に添加し
た場合の吸光スペクトルを比較したものである。この図
より明らかなように４−ニトロフェノールは400nm付近
においてほとんど吸光度をもたないが、DEαを含む溶液
中で顕著な発色促進効果が示され400nmにおける吸光度
は、４−ニトロフェノールの紫外部吸光度の30％以上に
達し、十分に測定可能となる。一方、４−ニトロフェノ
ール合成基質の１つである４−ニトロフェノールＮ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニドの吸光スペクトルは、
pH5.0における４−ニトロフェノールのスペクトルより
わずかに低波長にシフトしている以外はほとんど同じ
で、これにDEαを濃度１％に添加しても、吸光ピークの
微少な長波長シフトが観察されるだけで400nm付近にお
ける吸光度は全く影響を受けない。したがって、DEαを
含むこの反応液中で４−ニトロフェニールＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを作用させ生成する４−
ニトロフェノールを410nmの吸光度変化量として連続モ
ニターすることにより当酵素活性を測定することができ
る。なお、DEα共存下で可視部吸光度の極大を与える波
長は410nmである。また、使用する分光光度計が360nmに
おける吸光度を測定する性能をも有していれば、同波長
における吸光度変化をモニターすることによりpH5.0に
おける測定感度を更に、約25％増大させることも可能で
ある。DEαの４−ニトロフェノールに対する可視部吸光
度増大効果はpH4.0においてもいくらか観察され、中性
ないし微アルカリ性までの広いpH領域においてその効果
を保持している。

実施例３ DEβの４−ニトロフェノールに対する可視部発色効果 実施例１におけるDEαのかわりにDEβを用いることに
より、DEαの約60％の発色効果を得ることができる。

実施例４ DEα、DEβの２−クロロ−４−ニトロフェノールに対
する可視部発色効果と酵素反応への応用 ２−クロロ−４−ニトロフェノールは、pH5.0におい
て10％以上も電離しているので、400nm付近にも吸収を
示す。0.1μ−酢酸緩衝液中それぞれ0.8％以上の濃度で
DEα、DEβを加えた時、２−クロロ−４−ニトロフェノ
ールの吸収スペクトルはほぼ安全電離に近いかたちを示
し、400nmの吸光度はDEαで3.8倍、DEβで3.4倍であっ
た。

一方、合成基質のひとつである２−クロロ−４−ニト
ロフェニール−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
はpH5.0において400nm付近にほとんど吸収を示さない。
DEαあるいはDEβにおいても微妙な長波長シフトが観察
されるだけで400nm付近の処理にはほとんど影響がな
い。従って、この基質溶液にＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼを作用させ、生産する２−クロロ−４
−ニトロフェノールを410nmでの吸光度の変化量として
連続モニターすることができた。

実施例５ DEαおよびDEβの他のニトロフェノール類に対する可
視部発色効果 実施例２〜４の方法でpH5.0において、いろいろなニ
トロフェノール類に対し、DEα及びDEβが可視部吸光度
を増加させる効果をもつかどうかについて調べた結果を
示す。なお、用いたDEαおよびDEβの濃度は0.8％とし
た。

（ｉ）2,4−ジニトロフェノールはpH5.0で約90％電離し
ているから、そのままでも400nmにおいて強い吸光を示
している。しかし、この吸光は、紫外部にある強い吸光
の肩を形成するにすぎない。ここにDEαを添加すると、
400nmに独立した吸光ピークを形成し、その吸光度は35
％増大した。

（ii）５−ニトロサリチル酸はpH5.0で400nmの吸光度は
紫外部吸光極大値の2.5％にすぎない。これにDEαまた
はDEβを添加すると、その吸光度を３ないし４倍に増大
させることができる。

（iii）５−ニトロサリチル酸メチルのpH5.0における40
0nmの吸光度は紫外部吸光極大値の3.6％である。これに
DEβを添加すると400nmを中心に新しい吸光ピークが出
現し、吸光度は6.4倍に増大する、DEαはDEβより弱い
が類似の効果をもつ。

（iv）５−ニトロサリチル酸エチルに対しても、DEβお
よびDEαはメチルエステルに対するのと類似の効果を示
す。しかし、その効果はメチルエステルの場合の方が顕
著である。

［発明の効果］ 以上から明らかな如く、本発明によれば塩基性官能基
を結合したシクロデキストリンは、ニトロフェノール誘
導体の可視部における発色を著しく助長する効果を有
し、また、更には、それ自身通常のシクロデキストリン
より水に易溶のためニトロフェノール誘導体を結合した
合成基質を用いる各種の酵素活性測定法に応用する時、
従来にない実用面での有用性を持つ。

【図面の簡単な説明】

第１図は４−ニトロフェノールの吸光スペクトルのDEα
による影響を示すグラフ図である。 イ……pH5.0 20mμ酢酸緩衝液中 ロ……DEα１％を含むpH5.0 20mμ酢酸緩衝液中

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 弘實 謙二 (56)参考文献 特開 昭60−152502（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】塩基性官能基を共有結合させたシクロデキ
   ストリン誘導体を用いて、ニトロフェノール誘導体を包
   接して発色させることを特徴とする発色方法。
2. 【請求項２】ニトロフェノール誘導体を生成する反応系
   に、上記シクロデキストリン誘導体を共存させ発色を行
   わせるところの特許請求の範囲第１項記載の発色方法。