JP3130309B2 - シクロデキストリン誘導体及びそれを用いた発色方法 - Google Patents
シクロデキストリン誘導体及びそれを用いた発色方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は塩基性官能基で修飾されたシクロデキストリ
ンに関するもので、合成基質を用いた測定法等に応用さ
れ、臨床化学検査等の分野において効果的に用いられ
る。更に本発明はニトロフェノール類を中性ないし酸性
条件下で発色させるための試薬及び方法に関するもので
ある。
ンに関するもので、合成基質を用いた測定法等に応用さ
れ、臨床化学検査等の分野において効果的に用いられ
る。更に本発明はニトロフェノール類を中性ないし酸性
条件下で発色させるための試薬及び方法に関するもので
ある。
［従来の技術及びその問題点］ ニトロフェノール類の１種である４−ニトロフェノー
ル（パラニトロフェノールともいう）は４−ニトロフェ
ノール基をもつ各種合成基質が特定の酵素作用により分
解されるときに生成する物質で、この物質の増加を経時
的に定量することにより当該酵素の活性を容易に測定す
ることができる。例えば、フォスファターゼの活性を測
定するためには４−ニトロフェノールリン酸を基質とし
て遊離して生じる４−ニトロフェノールを定量する。フ
ォスフォジエステラーゼの活性測定にはビス（４−ニト
ロフェニル）リン酸を基質として同様に測定する。β−
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼの活性測定では、合成基質として４−
ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
が利用される。その他、各種のグリコシダーゼ（グリコ
シド結合の加水分解を触媒する酵素）、グルクロニダー
ゼ、スルファターゼ、ホスホリパーゼＣ、トリプシンや
キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ、Ｄ−グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼなどに対
し、４−ニトロフェニル基をもつ合成基質が開発され、
臨床検査をはじめとするさまざまな分野で実用に供され
ている。
ル（パラニトロフェノールともいう）は４−ニトロフェ
ノール基をもつ各種合成基質が特定の酵素作用により分
解されるときに生成する物質で、この物質の増加を経時
的に定量することにより当該酵素の活性を容易に測定す
ることができる。例えば、フォスファターゼの活性を測
定するためには４−ニトロフェノールリン酸を基質とし
て遊離して生じる４−ニトロフェノールを定量する。フ
ォスフォジエステラーゼの活性測定にはビス（４−ニト
ロフェニル）リン酸を基質として同様に測定する。β−
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼの活性測定では、合成基質として４−
ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
が利用される。その他、各種のグリコシダーゼ（グリコ
シド結合の加水分解を触媒する酵素）、グルクロニダー
ゼ、スルファターゼ、ホスホリパーゼＣ、トリプシンや
キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ、Ｄ−グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼなどに対
し、４−ニトロフェニル基をもつ合成基質が開発され、
臨床検査をはじめとするさまざまな分野で実用に供され
ている。
以上の例で示した各種酵素の活性測定が可能となる原
理は、例えば４−ニトロフェニル基をもつ合成基質の場
合は、その合成基質と遊離して生じる４−ニトロフェノ
ールの間で吸光スペクトルに差があるという事実に基礎
をおいている。すなわち、４−ニトロフェニル基をもつ
合成基質は広いpH領域において紫外部（波長300〜320n
m）に強い吸光ピークをもち可視部（波長400nm以上）に
はほとんど吸光を示さないが、４−ニトロフェノールは
アルカリ性pH領域において電離し、400nm付近を中心と
する強い吸光ピークをもつ４−ニトロフェノレート・ア
ニオンを生じる。したがって、測定しようとする酵素の
活性をアルカリ性pH領域で測定できれば、酵素反応の進
行にともなう可視部の発色を400nmの吸光度増加として
連続モニターでき、正確なレートアッセイが可能とな
る。しかし、測定しようとする酵素の最適pHが中性ない
し顕著には弱酸性の領域にあれば、４−ニトロフェノー
ルはその解離が不完全か、ほとんど解離せず、吸光スペ
クトルは４−ニトロフェニル基をもつ合成基質の吸光ス
ペクトルとほとんどオーバーラップしてしまい、発色が
微弱で、反応を経時的に連続モニターすることが著しく
不都合となる。そこで、現行の測定法では、酵素反応を
スタートさせてから一定時間後に、アルカリを添加して
反応を停止させると同時に生成した４−ニトロフェノー
ルを発色させ、その400nm付近の吸光度を測定するとい
う方法が多く採用されている。すなわち、現行測定法で
は酵素活性測定法としてより正確で簡便な形式といわれ
る理想的なレートアッセイが困難なだけでなく、アルカ
リ添加という余分な操作を必要とする。中性ないし弱酸
性の領域に最適pHをもつ酵素には、例えば酸性ホスファ
ターゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼなど臨床化学的に重要な酵素が含まれて
いる。これら諸酵素の反応を経時的に連続モニターする
ための有用な手段を得ることができれば、測定操作を簡
素化し、測定時間を短縮できるだけでなく、測定精度を
も高め、各種疾患の早期発見や診断に正確な情報を提供
できる。
理は、例えば４−ニトロフェニル基をもつ合成基質の場
合は、その合成基質と遊離して生じる４−ニトロフェノ
ールの間で吸光スペクトルに差があるという事実に基礎
をおいている。すなわち、４−ニトロフェニル基をもつ
合成基質は広いpH領域において紫外部（波長300〜320n
m）に強い吸光ピークをもち可視部（波長400nm以上）に
はほとんど吸光を示さないが、４−ニトロフェノールは
アルカリ性pH領域において電離し、400nm付近を中心と
する強い吸光ピークをもつ４−ニトロフェノレート・ア
ニオンを生じる。したがって、測定しようとする酵素の
活性をアルカリ性pH領域で測定できれば、酵素反応の進
行にともなう可視部の発色を400nmの吸光度増加として
連続モニターでき、正確なレートアッセイが可能とな
る。しかし、測定しようとする酵素の最適pHが中性ない
し顕著には弱酸性の領域にあれば、４−ニトロフェノー
ルはその解離が不完全か、ほとんど解離せず、吸光スペ
クトルは４−ニトロフェニル基をもつ合成基質の吸光ス
ペクトルとほとんどオーバーラップしてしまい、発色が
微弱で、反応を経時的に連続モニターすることが著しく
不都合となる。そこで、現行の測定法では、酵素反応を
スタートさせてから一定時間後に、アルカリを添加して
反応を停止させると同時に生成した４−ニトロフェノー
ルを発色させ、その400nm付近の吸光度を測定するとい
う方法が多く採用されている。すなわち、現行測定法で
は酵素活性測定法としてより正確で簡便な形式といわれ
る理想的なレートアッセイが困難なだけでなく、アルカ
リ添加という余分な操作を必要とする。中性ないし弱酸
性の領域に最適pHをもつ酵素には、例えば酸性ホスファ
ターゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼなど臨床化学的に重要な酵素が含まれて
いる。これら諸酵素の反応を経時的に連続モニターする
ための有用な手段を得ることができれば、測定操作を簡
素化し、測定時間を短縮できるだけでなく、測定精度を
も高め、各種疾患の早期発見や診断に正確な情報を提供
できる。
従って、４−ニトロフェノール及びその他のニトロフ
ェノール類の中性ないし弱酸性のpH領域での効果的な発
色促進作用を有す試薬の開発は、臨床化学検査分野にお
ける実用面に重要な課題となっている。
ェノール類の中性ないし弱酸性のpH領域での効果的な発
色促進作用を有す試薬の開発は、臨床化学検査分野にお
ける実用面に重要な課題となっている。
［問題点を解決するための手段］ そこで、以前本発明者らは、塩基性官能基を共有結合
させた新規シクロデキストリン誘導体を用いて、アグリ
コンである各種ニトロフェノール誘導体を包接し、中性
ないし弱酸性条件下における発色効果を向上させる技術
を開示した。（特開昭63−243101号公報） 該技術は実用的には充分な効果を得られるものである
が、本発明者らは、それに満足することなく更に検討を
加えた。
させた新規シクロデキストリン誘導体を用いて、アグリ
コンである各種ニトロフェノール誘導体を包接し、中性
ないし弱酸性条件下における発色効果を向上させる技術
を開示した。（特開昭63−243101号公報） 該技術は実用的には充分な効果を得られるものである
が、本発明者らは、それに満足することなく更に検討を
加えた。
該技術はα−又はβ−シクロデキストリンに、例え
ば、ジエチルアミノエチル基，ジメチルアミノメチル
基，ジメチルアミノプロピル基，アミノエチル基等を結
合させたものである。明細書にも記述している通り、そ
の導入個数はシクロデキストリン１分子に対し、１個な
いし２個が共有結合されていることが確認でき、例えば
ジエチルアミノエチル修飾化シクロデキストリン（以下
DE−CDともいう）を含む溶液中、４−ニトロフェノール
のpH5.0,400nmにおける吸光度は、４−ニトロフェノー
ルの紫外部吸光度の30％以上に達し、必要充分な感度を
得たのである。
ば、ジエチルアミノエチル基，ジメチルアミノメチル
基，ジメチルアミノプロピル基，アミノエチル基等を結
合させたものである。明細書にも記述している通り、そ
の導入個数はシクロデキストリン１分子に対し、１個な
いし２個が共有結合されていることが確認でき、例えば
ジエチルアミノエチル修飾化シクロデキストリン（以下
DE−CDともいう）を含む溶液中、４−ニトロフェノール
のpH5.0,400nmにおける吸光度は、４−ニトロフェノー
ルの紫外部吸光度の30％以上に達し、必要充分な感度を
得たのである。
上記特許に記されているように塩基性官能基を共有結
合させたシクロデキストリン誘導体は、未修飾のシクロ
デキストリンに比し、多くの長所を持っていることが明
白になった。しかしながら、これらのシクロデキストリ
ン誘導体をもってしても、測定pHが更に酸性にずれた場
合、又はpKaの酸性側から中性側にシフトしているニト
ロフェノール誘導体に対しては、充分にニトロフェノー
ル類を解離させることが出来ず、可視部における飛躍的
な吸光度上昇が望まれるところであった。そこで、本発
明者らは該技術をおし進め、シクロデキストリン１分子
に対し平均３分子以上の塩基性官能基を結合させる方法
を見い出し、これら３分子以上の塩基性官能基が共有結
合したシクロデキストリンの共存が従来のシクロデキス
トリン又は１ないし２分子の塩基性官能基結合シクロデ
キストリンの共存に比べ、中性ないしは酸性領域におい
て４−ニトロフェノールを始めとする各種ニトロフェノ
ール誘導体のpKaを極めて大きく酸性側にずらし、その
結果として更に極大吸収スペクトルを長波長側にシフト
させ相乗的に顕著な発色効果をもたらすことを見い出し
本発明を完成した。β−シクロデキストリン１分子に平
均３分子以上の塩基性官能基を結合させるための合成法
に関しては、本発明の為に塩基性官能基としてまずジエ
チルアミノエチル基を選び、以下の原理によりそのシク
ロデキストリン結合体を完成した。
合させたシクロデキストリン誘導体は、未修飾のシクロ
デキストリンに比し、多くの長所を持っていることが明
白になった。しかしながら、これらのシクロデキストリ
ン誘導体をもってしても、測定pHが更に酸性にずれた場
合、又はpKaの酸性側から中性側にシフトしているニト
ロフェノール誘導体に対しては、充分にニトロフェノー
ル類を解離させることが出来ず、可視部における飛躍的
な吸光度上昇が望まれるところであった。そこで、本発
明者らは該技術をおし進め、シクロデキストリン１分子
に対し平均３分子以上の塩基性官能基を結合させる方法
を見い出し、これら３分子以上の塩基性官能基が共有結
合したシクロデキストリンの共存が従来のシクロデキス
トリン又は１ないし２分子の塩基性官能基結合シクロデ
キストリンの共存に比べ、中性ないしは酸性領域におい
て４−ニトロフェノールを始めとする各種ニトロフェノ
ール誘導体のpKaを極めて大きく酸性側にずらし、その
結果として更に極大吸収スペクトルを長波長側にシフト
させ相乗的に顕著な発色効果をもたらすことを見い出し
本発明を完成した。β−シクロデキストリン１分子に平
均３分子以上の塩基性官能基を結合させるための合成法
に関しては、本発明の為に塩基性官能基としてまずジエ
チルアミノエチル基を選び、以下の原理によりそのシク
ロデキストリン結合体を完成した。
本反応において１分子のβ−シクロデキストリンに導
入されるジエチルアミノエチル基の分子数はシクロデキ
ストリンとジエチルアミノエチル基のモル比，反応温
度，反応時間，反応pHにより大きく左右されることがわ
かった。すなわち、１分子のβ−シクロデキストリンに
平均３分子以上のジエチルアミノエチル基を結合させる
為には、モル比でβ−シクロデキストリンに対しジエチ
ルアミノエチルクロリドが望ましくは５以上，反応温度
は20〜70℃，反応時間として30分〜10時間，反応pHはア
ルカリ性に保つことが必要で、特にpH10以上が望ましい
反応条件であることがわかった。
入されるジエチルアミノエチル基の分子数はシクロデキ
ストリンとジエチルアミノエチル基のモル比，反応温
度，反応時間，反応pHにより大きく左右されることがわ
かった。すなわち、１分子のβ−シクロデキストリンに
平均３分子以上のジエチルアミノエチル基を結合させる
為には、モル比でβ−シクロデキストリンに対しジエチ
ルアミノエチルクロリドが望ましくは５以上，反応温度
は20〜70℃，反応時間として30分〜10時間，反応pHはア
ルカリ性に保つことが必要で、特にpH10以上が望ましい
反応条件であることがわかった。
同様にして、α−，γ−シクロデキストリンのポリDE
AE結合体が得られる。また、ジエチルアミノエチル基以
外にジメチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、
アミノエチル基等の結合体も得ることができる。このよ
うに３分子以上の塩基性官能基で修飾されたシクロデキ
ストリン、例えばポリジエチルアミノエチル化α−シク
ロデキストリン（以下ポリDE−αCDと略す。）、ポリジ
エチルアミノエチル化β−ジクロデキストリン（以下ポ
リDE−βCDと略す。）およびポリジエチルアミノエチル
化γ−シクロデキストリン（以下ポリDE−γCDと略
す。）は意外にも、通常のシクロデキストリンに比べは
るかに水によく溶け実用に供し易いものであった。現
在、特に安価で一般に用いられているβ−シクロデキス
トリンは比較的に水に難溶性でこの性質が臨床化学検査
などにおける実用上の範囲を決めているものである。す
なわち、難溶性の目的物質をシクロデキストリンの包接
により溶解せしめる時シクロデキストリン自身の溶解性
によりその溶解度が限定されてしまうのである。具体的
には特定酵素の活性を測定するためによく使用される合
成基質の溶解の場合などである。加水分解酵素の多くの
場合は難溶性のニトロフェノール誘導体が発色剤として
酵素反応の経過観察のために結合されている。例えば、
前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ測定
のための合成基質である、４−ニトロフェニル（あるい
は２−クルロ−４−ニトロフェニル）−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニドの場合、β−シクロデキストリ
ンの助けで必要量の溶解が試みられるが、シクロデキス
トリン自身の溶解性の悪さのためその目的を充分に果た
し得ない。それに比し、本発明によるポリDE−CD類はた
やすく水に溶解させることができ、その包接能により上
記基質等を充分に必要量溶かし得るのでこの面において
も本発明に実用的価値を付加するものである。
AE結合体が得られる。また、ジエチルアミノエチル基以
外にジメチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、
アミノエチル基等の結合体も得ることができる。このよ
うに３分子以上の塩基性官能基で修飾されたシクロデキ
ストリン、例えばポリジエチルアミノエチル化α−シク
ロデキストリン（以下ポリDE−αCDと略す。）、ポリジ
エチルアミノエチル化β−ジクロデキストリン（以下ポ
リDE−βCDと略す。）およびポリジエチルアミノエチル
化γ−シクロデキストリン（以下ポリDE−γCDと略
す。）は意外にも、通常のシクロデキストリンに比べは
るかに水によく溶け実用に供し易いものであった。現
在、特に安価で一般に用いられているβ−シクロデキス
トリンは比較的に水に難溶性でこの性質が臨床化学検査
などにおける実用上の範囲を決めているものである。す
なわち、難溶性の目的物質をシクロデキストリンの包接
により溶解せしめる時シクロデキストリン自身の溶解性
によりその溶解度が限定されてしまうのである。具体的
には特定酵素の活性を測定するためによく使用される合
成基質の溶解の場合などである。加水分解酵素の多くの
場合は難溶性のニトロフェノール誘導体が発色剤として
酵素反応の経過観察のために結合されている。例えば、
前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ測定
のための合成基質である、４−ニトロフェニル（あるい
は２−クルロ−４−ニトロフェニル）−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニドの場合、β−シクロデキストリ
ンの助けで必要量の溶解が試みられるが、シクロデキス
トリン自身の溶解性の悪さのためその目的を充分に果た
し得ない。それに比し、本発明によるポリDE−CD類はた
やすく水に溶解させることができ、その包接能により上
記基質等を充分に必要量溶かし得るのでこの面において
も本発明に実用的価値を付加するものである。
更に本発明の本質である中性ないしは弱酸性条件下で
のニトロフェノール誘導体に対する発色効果を種々の誘
導体を用いて調べた。４−ニトロフェノール、２−クロ
ロ−４−ニトロフェノール、５−ニトロサリチル酸、５
−ニトロサリチル酸メチル、2,4−ジニトロフェノー
ル、3,4−ジニトロフェノール等についてである。驚く
べきことにこれらの中で最も中性ないしは特に弱酸性下
で電離が微弱な、すなわちpH5.0付近においては、400nm
付近での電離性の可視部発色ピークが認められない４−
ニトロフェノールでさえポリDE−CD類の１％以下の通常
濃度の存在下でその400nm付近に大きな新しい電離性の
発色ピークを出現させ、ポリDE−CD類の作用とその効果
が顕著であることが示された。通常のシクロデキストリ
ンではこれ程の効果は認められない。また、DEの導入が
１ないし２分子の場合と比較しても効果は絶大なるもの
である。またポリDE−CD類は水への溶解性が更に良いた
め使用量を増やして効果的な増強ができる。また他のニ
トロフェノールについても１％以下の通常濃度でDE−
α、DE−βと比較して顕著な可視部発色効果が示され
た。特に２−クロロ−４−ニトロフェノールは中性ない
し酸性下で４−ニトロフェノールに比べ、比較的発色が
なされ易いものとして、最近それを結合させた特定酵素
のための合成基質が供されているが、例えばpH5.0以下
で酵素反応を行う前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼ等については、酵素反応の結果そのpHで生
成する２−クロロ−４−ニトロフェノールの400nm付近
における電離発色は、未修飾のCDの場合は全く不充分
で、またその基質としての溶解度を充分に維持できない
ため、その生成量を連続モニターできるほどの感度と精
度をもたない。またDE−CDを用いても改善の余地は残さ
れている。しかるに、ここへのポリDE−CD類の添加は生
成する２−クロロ−４−ニトロフェノールの吸収スペク
トルを完全電離に近いかたちに出現せしめ発色させるの
で、理想的な状態での当酵素の連続モニター測定が行え
る。
のニトロフェノール誘導体に対する発色効果を種々の誘
導体を用いて調べた。４−ニトロフェノール、２−クロ
ロ−４−ニトロフェノール、５−ニトロサリチル酸、５
−ニトロサリチル酸メチル、2,4−ジニトロフェノー
ル、3,4−ジニトロフェノール等についてである。驚く
べきことにこれらの中で最も中性ないしは特に弱酸性下
で電離が微弱な、すなわちpH5.0付近においては、400nm
付近での電離性の可視部発色ピークが認められない４−
ニトロフェノールでさえポリDE−CD類の１％以下の通常
濃度の存在下でその400nm付近に大きな新しい電離性の
発色ピークを出現させ、ポリDE−CD類の作用とその効果
が顕著であることが示された。通常のシクロデキストリ
ンではこれ程の効果は認められない。また、DEの導入が
１ないし２分子の場合と比較しても効果は絶大なるもの
である。またポリDE−CD類は水への溶解性が更に良いた
め使用量を増やして効果的な増強ができる。また他のニ
トロフェノールについても１％以下の通常濃度でDE−
α、DE−βと比較して顕著な可視部発色効果が示され
た。特に２−クロロ−４−ニトロフェノールは中性ない
し酸性下で４−ニトロフェノールに比べ、比較的発色が
なされ易いものとして、最近それを結合させた特定酵素
のための合成基質が供されているが、例えばpH5.0以下
で酵素反応を行う前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼ等については、酵素反応の結果そのpHで生
成する２−クロロ−４−ニトロフェノールの400nm付近
における電離発色は、未修飾のCDの場合は全く不充分
で、またその基質としての溶解度を充分に維持できない
ため、その生成量を連続モニターできるほどの感度と精
度をもたない。またDE−CDを用いても改善の余地は残さ
れている。しかるに、ここへのポリDE−CD類の添加は生
成する２−クロロ−４−ニトロフェノールの吸収スペク
トルを完全電離に近いかたちに出現せしめ発色させるの
で、理想的な状態での当酵素の連続モニター測定が行え
る。
前記の通りポリDE−αCD、ポリDE−βCD及びポリDE−
γCDは充分水に溶け易く、当合成基質の必要量を反応液
に溶解できることと合わせ実用的に著しい効果を供す
る。
γCDは充分水に溶け易く、当合成基質の必要量を反応液
に溶解できることと合わせ実用的に著しい効果を供す
る。
以上の効果は、同様に、中性付近で反応を行うα−ア
ミラーゼのための合成基質である、４−ニトロフェノー
ル−マルトヘプタオシド、あるいは２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−マルトペンタオシド等を用いて生成する
ニトロフェニル誘導体を400nm付近で連続モニターする
α−アミラーゼの測定の場合、あるいは、よりpHの低い
領域で酵素反応を行わせる酸性ホスファターゼ、グルコ
シダーゼ、グルコロニダーゼ、エステラーゼ、アリルス
ルファターゼ等の測定においても、通常のシクロデキス
トリンに比し、はるかに効果的に使用される。
ミラーゼのための合成基質である、４−ニトロフェノー
ル−マルトヘプタオシド、あるいは２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−マルトペンタオシド等を用いて生成する
ニトロフェニル誘導体を400nm付近で連続モニターする
α−アミラーゼの測定の場合、あるいは、よりpHの低い
領域で酵素反応を行わせる酸性ホスファターゼ、グルコ
シダーゼ、グルコロニダーゼ、エステラーゼ、アリルス
ルファターゼ等の測定においても、通常のシクロデキス
トリンに比し、はるかに効果的に使用される。
以上ポリDE−αCD、ポリDE−βCD及びポリDE−γCDに
ついての本発明の効果を述べたが、他の塩基性官能基を
修飾したシクロデキストリン及び他の酵素反応のための
ニトロフェノール誘導体を結合した他の合成基質を使用
する場合においても、本発明の本質は同様である。更に
ニトロフェノール誘導体の１つである3,4−ジニトロフ
ェニル基を用いた合成基質による種々酵素の測定法にお
いては、本発明のポリDE−CDとの組合せにより、両者の
利点が相まって従来にない高精度な酵素活性測定を供す
ることができる。
ついての本発明の効果を述べたが、他の塩基性官能基を
修飾したシクロデキストリン及び他の酵素反応のための
ニトロフェノール誘導体を結合した他の合成基質を使用
する場合においても、本発明の本質は同様である。更に
ニトロフェノール誘導体の１つである3,4−ジニトロフ
ェニル基を用いた合成基質による種々酵素の測定法にお
いては、本発明のポリDE−CDとの組合せにより、両者の
利点が相まって従来にない高精度な酵素活性測定を供す
ることができる。
以下、実施例により本発明の作用、効果をさらに詳し
く説明する。
く説明する。
実施例−１ ポリDE−CD類の合成方法 1.ポリDE−αCDの合成方法 α−シクロデキストリン2.4gを4mlの蒸留水に懸濁さ
せ、攪拌しながら水酸化ナトリウム1.5gを含む4mlの水
溶液を滴下する。次にジエチルアミノエチルクロリド塩
酸塩1.4gを含む2mlの水溶液を滴下し、30℃で３時間反
応させる。その後反応液を直径1.5cm、高さ50cmのクロ
マト管にセファデックスＧ−25を充填したものを用いて
カラムクロマトグラフィにより分子量別に分別し、1.5g
のDE−αCDを得た。このDE−αCDはジエチルアミノエチ
ル基が１ないし２個結合していることが中和滴定、元素
分析、プロトン核磁気共鳴の分析により判明した。次
に、このDE−αCD2を4mlの蒸留水に懸濁させ、攪拌しな
がら水酸化ナトリウム1.2gを含む4mlの水溶液を加え
る。更にジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩2.0gを含
む2mlの水溶液を滴下し、50℃で５時間、反応溶液のpH
が11を下回らないように水酸化ナトリウム溶液を随時添
加しながら反応させる。その後反応液を前述のセファデ
ックスＧ−25のカラムクロマトグラフィにより分子量別
に分別し、1.2gのポリDE−αCDを得た。このポリDE−α
CDはジエチルアミノエチル基が３ないし４個結合してい
ることが中和滴定、元素分析の分析により判明した。同
様の操作を繰り返すことにより、ジエチルアミノエチル
基の導入個数を増やすことができる。
せ、攪拌しながら水酸化ナトリウム1.5gを含む4mlの水
溶液を滴下する。次にジエチルアミノエチルクロリド塩
酸塩1.4gを含む2mlの水溶液を滴下し、30℃で３時間反
応させる。その後反応液を直径1.5cm、高さ50cmのクロ
マト管にセファデックスＧ−25を充填したものを用いて
カラムクロマトグラフィにより分子量別に分別し、1.5g
のDE−αCDを得た。このDE−αCDはジエチルアミノエチ
ル基が１ないし２個結合していることが中和滴定、元素
分析、プロトン核磁気共鳴の分析により判明した。次
に、このDE−αCD2を4mlの蒸留水に懸濁させ、攪拌しな
がら水酸化ナトリウム1.2gを含む4mlの水溶液を加え
る。更にジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩2.0gを含
む2mlの水溶液を滴下し、50℃で５時間、反応溶液のpH
が11を下回らないように水酸化ナトリウム溶液を随時添
加しながら反応させる。その後反応液を前述のセファデ
ックスＧ−25のカラムクロマトグラフィにより分子量別
に分別し、1.2gのポリDE−αCDを得た。このポリDE−α
CDはジエチルアミノエチル基が３ないし４個結合してい
ることが中和滴定、元素分析の分析により判明した。同
様の操作を繰り返すことにより、ジエチルアミノエチル
基の導入個数を増やすことができる。
2.ポリDE−βCDの合成方法 前述の合成法１において、α−シクロデキストリンに
かえ、β−シクロデキストリンを使用し同様の操作によ
り、ポリDE−βCDを合成した。
かえ、β−シクロデキストリンを使用し同様の操作によ
り、ポリDE−βCDを合成した。
3.ポリDE−γCDの合成方法 前述の合成法１において、α−シクロデキストリンに
かえ、γ−シクロデキストリンを使用し同様の操作によ
り、ポリDE−γCDを合成した。
かえ、γ−シクロデキストリンを使用し同様の操作によ
り、ポリDE−γCDを合成した。
実施例−２ 各ポリDE−CD類の４−ニトロフェノールに
対する可視部発色効果 pH5.0の20mM酢酸緩衝液中における４−ニトロフェノ
ールの400nmにおける吸光度を、シクロデキストリン無
添加、１％DE−CD添加、実施例１で合成した各ポリDE−
CDを１％添加のそれぞれを比較検討した結果を表１に示
す。
対する可視部発色効果 pH5.0の20mM酢酸緩衝液中における４−ニトロフェノ
ールの400nmにおける吸光度を、シクロデキストリン無
添加、１％DE−CD添加、実施例１で合成した各ポリDE−
CDを１％添加のそれぞれを比較検討した結果を表１に示
す。
同様にして４−ニトロフェノール以外の２−クロロ−
４−ニトロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、５
−ニトロサリチル酸、５−ニトロサリチル酸メチルにつ
いて吸光度の増加が認められた。
４−ニトロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、５
−ニトロサリチル酸、５−ニトロサリチル酸メチルにつ
いて吸光度の増加が認められた。
実施例−３ DE導入数によるpKへの効果 実施例１の２で合成したジエチルアミノエチル基の結
合個数の異なるDE−βCD及びポリDE−βCDのそれぞれの
濃度が１％となる25mMコハク酸緩衝液を調製した。そし
てこの各緩衝液中での3,4−ジニトロフェノールのpKを
測定した結果を表２に示す。
合個数の異なるDE−βCD及びポリDE−βCDのそれぞれの
濃度が１％となる25mMコハク酸緩衝液を調製した。そし
てこの各緩衝液中での3,4−ジニトロフェノールのpKを
測定した結果を表２に示す。
実施例−４ 酵素反応への応用 以下の操作により、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼ活性を測定した。
ミニダーゼ活性を測定した。
（１）試薬の調製 ・3,4−ジニトロフェニル−Ｎ− アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド:1.2mM ・コハク酸緩衝液（pH5.0） :25mM ・各ポリDE−βCD :1％ （２）操作法及び結果 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ液（シグ
マ社製ヒト胎盤の酵素で、活性値を50U/に調製）100
μｌに、37℃で５分間加温した試薬3mlを加え反応さ
せ、試薬ブランクを対照に５分間当たりの400nmにおけ
る吸光度変化を測定した。その結果を表３に示す。
マ社製ヒト胎盤の酵素で、活性値を50U/に調製）100
μｌに、37℃で５分間加温した試薬3mlを加え反応さ
せ、試薬ブランクを対照に５分間当たりの400nmにおけ
る吸光度変化を測定した。その結果を表３に示す。
［発明の効果］ 以上から明らかな如く、本発明によれば塩基性官能基
を少なくとも３分子以上結合したシクロデキストリン誘
導体は、ニトロフェノール誘導体の可視部における発色
を著しく増強する効果を有し、ニトロフェノール誘導体
を結合した合成基質を用いる各種の酵素活性測定方法に
応用するとき、特にレート分析の精度を格段に向上させ
るという効果を有する。
を少なくとも３分子以上結合したシクロデキストリン誘
導体は、ニトロフェノール誘導体の可視部における発色
を著しく増強する効果を有し、ニトロフェノール誘導体
を結合した合成基質を用いる各種の酵素活性測定方法に
応用するとき、特にレート分析の精度を格段に向上させ
るという効果を有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 弘實 謙二 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08B 37/16 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】下記式の構造を有する塩基性官能基を少な
くとも３分子共有結合させたシクロデキストリン誘導体
を用いて、ニトロフェノール誘導体を包接することを特
徴とする発色方法。 （式中R1、R2はそれぞれ炭素数１〜３個の低級アルキル
基もしくは水素であって、ｎは１〜３の整数を表す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02218145A JP3130309B2 (ja) | 1990-08-21 | 1990-08-21 | シクロデキストリン誘導体及びそれを用いた発色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02218145A JP3130309B2 (ja) | 1990-08-21 | 1990-08-21 | シクロデキストリン誘導体及びそれを用いた発色方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04100801A JPH04100801A (ja) | 1992-04-02 |
| JP3130309B2 true JP3130309B2 (ja) | 2001-01-31 |
Family
ID=16715351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02218145A Expired - Lifetime JP3130309B2 (ja) | 1990-08-21 | 1990-08-21 | シクロデキストリン誘導体及びそれを用いた発色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3130309B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3009561U (ja) * | 1994-09-28 | 1995-04-04 | 日本高周波鋼業株式会社 | 研削盤用小径軸付き砥石ホルダー |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4401618A1 (de) * | 1994-01-20 | 1995-07-27 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von aminofunktionellen Cyclodextrin Derivaten |
-
1990
- 1990-08-21 JP JP02218145A patent/JP3130309B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3009561U (ja) * | 1994-09-28 | 1995-04-04 | 日本高周波鋼業株式会社 | 研削盤用小径軸付き砥石ホルダー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04100801A (ja) | 1992-04-02 |
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