CN105891169A - 一种环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法，建立一种环境水样雄激素干扰化合物的前处理方法，并利用重组基因酵母开展检测，以形成完整的环境水样雄激素干扰化合物的快速测试体系。本发明提供的一种环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法，基于重组基因酵母，包括如下步骤：(1)培养重组基因酵母细胞；(2)待测样品与重组基因酵母共孵育；(3)重组基因酵母细胞酶活性测定。本发明方法无需对样品进行复杂的前处理，通过改进了酶活性的反应底物、优化测试体系等，降低了检测方法的检测限，提高测试体系的灵敏度。

Description

一种环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法

技术领域

本发明涉及一种雄激素干扰化合物检测的快速生物测试方法，具体涉及一种基于重组基因酵母的适用于环境水样如地表水、地下水、水源水、污水中雄激素干扰化合物的快速生物测试方法。

背景技术

环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指一些释放到环境中的污染物，它们能够干扰人类和动物激素调节的生理过程，改变内分泌与生殖系统的正常功能，对人类生存和繁衍构成巨大威胁(参见，李剑，饶凯峰，马梅，王子健，核受体超家族及其酵母双杂交检测技术，生态毒理学报,2008,3(6),521-532)。环境激素按其来源可分为天然激素和人工激素两大类；根据其干扰作用类型的不同又可细分为：环境雌激素干扰化合物、环境雄激素干扰化合物、环境甲状腺激素干扰化合物，环境维甲酸激素干扰化合物等。目前已经发现的具有雄激素干扰活性的环境化合物种类繁多，包括氟他胺类、有机氯杀虫剂类、二苯甲烷类、邻苯二甲酸盐类和烷基酚类等(参见，旷毓婵，李英文，谭号，郭学鸣，吴迪，刘智皓.内分泌干扰物对雄激素受体功能的干扰，重庆师范大学学报(自然科学版)，2014，31(2),16-22)。

研究发现，由于工业生产、人类活动等可导致雄激素干扰化合物进入环境水体，在我国的饮用水、地表水、地下水等多种水体中均有检出上述具有雄激素干扰活性的化合物。虽然该类雄激素干扰化合物在环境水体中检出的浓度水平较低，但已对水生生物和人类健康构成威胁。例如，研究证实低浓度的雄激素干扰化合物暴露可改变鱼体血清中的雄激素和雌激素水平，抑制鱼体正常的繁殖能力。由此可见，开展环境水体中雄激素干扰化合物的监测，对于保障水质安全，保护人类健康，维护水生态系统平衡具有重要的意义。

由于环境水样具有被测浓度低、组分复杂、干扰物质多、易受环境影响而变化等特点，通常都要经过复杂的前处理后才能进行分析测定。因此，现阶段环境水样中环境雄激素干扰化合物的检测都包含样品前处理和分析测定两个主要步骤。环境水样雄激素干扰化合物检测时通常采用的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、微波萃取等(参见，王晓峰，环境水样前处理技术的探讨，黑龙江环境通报，2011，35(3)，49-51)。上述前处理方法需要消耗大量有机溶剂，危害环境，且操作时间较长；更重要的是，前处理方法在富集、浓缩的过程中也可能造成样品中雄激素干扰化合物的损失，因此测试结果不能反映环境水样雄激素干扰化合物的真实水平。现阶段的分析测定主要包括化学分析和生物测试方法；化学分析需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员素质有相当严格的要求，而生物测试方法具有稳定、经济、高效的特点，能够弥补化学分析方法的不足。快速测试方法由于摒弃了复杂的样品前处理，去除了富集、净化等步骤，提高了目标化合物的回收率，但是也影响到方法的检测限。如中国发明专利ZL200710308509.2中公开的一种环境中雌激素干扰化合物的生物测试方法。由于没有对待测样品的富集步骤，快速测试方法的检测限通常高于含有前处理的生物测试方法；以及使用有机溶剂提取待测样品，容易造成待测样品的二次污染。

发明内容

本发明提供一种环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法，建立一种环境水样雄激素干扰化合物的前处理方法，并利用重组基因酵母开展检测，以形成完整的环境水样雄激素干扰化合物的快速测试体系。无需对样品进行复杂的前处理，通过改进了酶活性的反应底物、优化测试体系等，降低了检测方法的检测限，提高测试体系的灵敏度。

本发明提供一种环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法，所述测试方法基于重组基因酵母，包括如下步骤：

(1)培养重组基因酵母细胞；

(2)待测样品与重组基因酵母共孵育；

(3)重组基因酵母细胞酶活性测定；

优选地，在所述步骤(1)中，测定酵母细胞密度，重组基因酵母细胞菌液十倍稀释后600nm处的吸光度值OD₆₀₀在0.35-0.40之间；

优选地，所述步骤(2)中待测样品与重组基因酵母共孵育振荡培养2-4h；

优选地，所述步骤(3)包括在孵育好的重组基因酵母细胞中加入4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷(MUG)进行反应生成荧光产物，测其荧光值，当重组基因酵母细胞的测试体积为20-100μL时，加入的MUG的测试浓度为10^-4-10^-5mol/L；

优选地，在所述步骤(2)之前对待测样品进行过滤，去除待测样品中的悬浮颗粒物；

优选地，在所述步骤(2)中加入溶液A，所述溶液A包括：0.2g/L腺嘌呤半硫酸盐，0.2g/L盐酸精氨酸，0.2g/L一水合盐酸组氨酸，0.3g/L异亮氨酸，0.3g/L盐酸赖氨酸，0.2g/L甲硫氨酸，0.5g/L苯丙氨酸，2g/L苏氨酸，0.3g/L酪氨酸，0.2g/L尿嘧啶，1.5g/L缬氨酸，67g/L无氨基酸酵母氮源；

优选地，所述步骤(2)中重组基因酵母细胞、待测样品、溶液A的体积比为2～3：9：1；

优选地，所述步骤(2)中还加入葡萄糖，其终浓度为15～20g/L；

优选地，所述方法中还包括包括：在所述步骤(3)中检测反应终止后上清液的荧光值，绘制标准曲线，计算待测样品中类雄激素化合物的含量；

优选地，在所述步骤(2)中还加入二氢睾酮(DHT)，所述DHT的终浓度为2.5×10^-7mol/L，检测所述步骤(3)反应终止后上清液的荧光值，绘制标准曲线，计算待测样品中抗雄激素化合物的含量。

本发明的目的在于克服已有技术在检测环境水样中雄激素干扰化合物时需要复杂的样品前处理流程，此过程不仅操作时间长、费用高、使用有机溶剂容易造成二次污染，而且前处理过程极容易丢失目标化合物或引入新的干扰化合物，产生假阴性或是假阳性的结果，构建基于重组基因酵母的，无需复杂前处理的环境水样雄激素干扰化合物检测方法。该检测方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少，能够反映环境水样(包括污水、地表水、水源水等)中雄激素受体的诱导/抑制效应，并且通过标准曲线计算得到样品中雄激素干扰化合物的毒性当量浓度值，表征水样中雄激素干扰化合物的浓度水平。

本发明提供的基于重组基因酵母环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法的有益之处在于：1)摒弃了传统方法检测环境水样雄激素干扰化合物时需要复杂的样品前处理技术，如固相萃取、液液萃取、微波萃取等，不仅需要消耗大量有机溶剂，危害环境，且操作时间较长；新方法缩短了近70％的操作时间，减少了近90％的有机溶剂消耗。2)提高了方法的回收率，减少假阳性/阴性结果的发生；通常情况下，前处理在富集、浓缩的过程中极容易造成样品中雄激素干扰化合物的损失，或由于实验操作引入新的污染物，产生假阳性/阴性结果，因此测试结果不能反映环境水样雄激素干扰化合物的真实水平。3)便于开展环境水样的野外快速检测；传统的分析测试方法无论是化学分析还是生物测试，由于需要结合复杂的样品前处理流程，很难直接开展环境水样雄激素干扰化合物的野外检测，新方法提供了一种野外快速检测的新思路；4)利用该方法快速检测环境水样雄激素干扰化合物时，操作简便，省时省力，所需样品量少，成本低廉；且具有稳定、经济、高效的优点；5)选用MUG作为反应底物，替代了常规的反应底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，反应产物也由荧光产物替代了原有的显色产物，提高了方法的灵敏度，降低了测试体系的检测限，新方法报道的DHT的EC₅₀值为1.4×10^-9mol/L，而Sohoni等(1998)报道为>10^-8mol/L。6)本发明采用重组基因酵母，除能直接检测环境水样中的雄激素干扰化合物外，还能够同时反映雄激素干扰化合物可能对人体产生的影响，预警化合物对人体内分泌系统可能存在的风险。

附图说明

图1为本发明不同暴露时间二氢睾酮(DHT)对重组基因酵母酶活性的诱导结果示意图；

图2为本发明二氢睾酮(DHT)对重组基因酵母酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线示意图；

图3为本发明氟他胺对重组基因酵母酶活性抑制的剂量-效应关系示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案作进一步描述。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业渠道获得；本发明实施例中使用重组基因酵母由中国科学院生态环境研究中心提供，该重组基因酵母细胞的培养方法依据中国发明专利ZL200710308509.2中公开的培养方法。

本发明方法中所述溶液A包含：0.2g/L腺嘌呤半硫酸盐，0.2g/L盐酸精氨酸，0.2g/L一水合盐酸组氨酸，0.3g/L异亮氨酸，0.3g/L盐酸赖氨酸，0.2g/L甲硫氨酸，0.5g/L苯丙氨酸，2g/L苏氨酸，0.3g/L酪氨酸，0.2g/L尿嘧啶，1.5g/L缬氨酸，67g/L无氨基酸酵母氮源。

本发明方法中所述MUG反应液包括：21.51g/L Na₂HPO₄·12H₂O，6.22g/L NaH₂PO₄·2H₂O，0.75g/L KCl，0.25g/L MgSO₄·7H₂O，0.00338g/L的MUG。此外，MUG溶解液也可以用DMSO来溶解。

本发明提供一种基于重组基因酵母用于检测环境水样类雄激素干扰化合物的前处理及重组基因酵母共孵育方法。其中，所述重组基因酵母为包含雄激素受体基因片段，并正确表达雄激素受体的重组基因酵母。所述类雄激素干扰化合物选自天然雄激素化合物、有机氯杀虫剂类、二苯甲烷类、邻苯二甲酸盐类和烷基酚类中的一种或几种。

具体步骤如下：

1.1培养重组基因酵母细胞：将重组基因酵母细胞接种到营养缺陷型SD/-Trp/-Leu培养基中，培养12-36h，测定酵母细胞密度，要求十倍稀释后600nm处酵母菌液的吸光度值OD₆₀₀在0.35-0.40之间；

1.2环境水样采集及过滤：用洗净的玻璃瓶采集环境水样1-5L，低温4℃保存；采用0.7μm玻璃纤维滤膜过滤水样，去除水体中的悬浮颗粒物；

1.3水样与重组基因酵母共孵育：准确量取酵母细胞1-1.5mL，离心，室温下1000g离心5min，弃去上清液，将重组基因酵母细胞添加到含4.5mL环境水样的三角瓶中，加入0.5mL溶液A和100mg葡萄糖；三角瓶经半透膜封口后置于150rpm，30℃全温振荡培养箱中暴露培养，测定OD₆₀₀的值；

其中，步骤1.3之前先测定暴露培养的时间，如图1所示，检测不同暴露时间2.5×10^-7mol/LDHT对重组基因酵母酶活性的诱导，其中横坐标是不同暴露时间，纵坐标是百分诱导酶活性值P；分别测定出暴露培养0h-24h后的酶活性值，优选暴露培养时间为2-4h。

本发明提供一种基于重组基因酵母用于检测环境水样抗雄激素干扰化合物的前处理及酵母共孵育方法。其中，所述重组基因酵母为包含雄激素受体基因片段，并正确表达雄激素受体的重组基因酵母。所述抗雄激素干扰化合物选自氟他胺类、有机氯杀虫剂类、二苯甲烷类、邻苯二甲酸盐类和烷基酚类中的一种或几种。

包括如下步骤：

2.1培养重组基因酵母细胞：将酵母细胞接种到营养缺陷型SD/-Trp/-Leu培养基中，培养12-36h，测定酵母细胞密度，要求十倍稀释后600nm处酵母菌液的吸光度值OD₆₀₀在0.35-0.40之间；

2.2环境水样采集及过滤：用洗净的玻璃瓶采集环境水样1-5L，低温4℃保存；采用0.7μm玻璃纤维滤膜过滤水样，去除水体中的悬浮颗粒物；

2.3水样与重组基因酵母共孵育：准确量取重组基因酵母细胞1-1.5mL，离心，室温下1000g离心5min，弃去上清液，将重组基因酵母细胞添加到含4.5mL环境水样的三角瓶中，加入0.5mL溶液A和100mg葡萄糖以及添加25μL 5×10^-5mol/L二氢睾酮(DHT)；三角瓶经半透膜封口后置于150rpm，30℃全温振荡培养箱中暴露培养2-4h后，测定OD₆₀₀的值；

如图2所示，为二氢睾酮(DHT)对重组基因酵母酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线，其中横坐标是DHT浓度，纵坐标是百分诱导酶活性值P；DHT的暴露浓度为2.5×10^-11～2.5×10^-6mol/L，优选DHT的最大效应浓度2.5×10^-7mol/L为环境水样抗雄激素干扰化合物检测的投加浓度；即体系中DHT的终浓度为2.5×10^-7mol/L，测试体系中添加25μL浓度为5×10^-5mol/L的DHT。

本发明还提供一种重组基因酵母酶活性检测方法，包括：孵育后的酵母细胞加入含4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷(MUG)的反应液进行反应，反应生成荧光产物，终止反应后检测上清液的荧光值来计算类/抗雄激素化合物的浓度。

具体步骤如下：

3.1荧光标记：取20-100μL孵育的重组基因酵母细胞,加入120μL测试缓冲液(每100ml基础缓冲液中加入3.33ml浓度为0.1％的SDS溶液和270μLβ-巯基乙醇)和20μL氯仿，在30℃的恒温摇床上1300rpm预培养10min；再加入40μL 10^-5mol/L MUG启动酶反应，30℃，800rpm，0.5-1小时后，加入100μL Na₂CO₃(1mol/L)溶液终止反应，终止反应10min中后取出40ul至酶标板中用酶标仪测定其荧光值；

如下表1所示，检测不同测试体积的重组基因酵母与系列MUG测试浓度反应后菌液荧光强度值，优选重组基因酵母细胞的测试体积为20-100μL，对应MUG的测试浓度为10^-4-10^-5mol/L；反应产物也由荧光产物替代了传统ONPG显色产物，提高了方法的灵敏度，降低了测试体系的检测限，见表1检测率；

表1 不同MUG反应浓度不同菌液体积检测到的荧光强度值，其中DHT的暴露浓度选择为2.5×10^-7mol/L。

注：当检出率<100％时，不表征荧光强度值，标记为“-”

3.2绘制诱导标准曲线：首先将上述重组基因酵母细胞分别与已知系列浓度DHT共培养，加入MUG反应液进行反应，终止反应后检测上清液的荧光值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数，绘制系列DHT浓度相对重组基因酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量－效应关系标准曲线。

具体步骤为：

将DHT溶解到去离子水中，制备一系列的DHT标准浓度反应液(浓度范围2.5×10^-11～2.5×10^-6mol/L),取4.5mLDHT标准浓度反应液，加入离心后的重组基因酵母细胞，0.5mL溶液A和100mg葡萄糖，置于150rpm，30℃全温振荡培养箱中暴露培养2-4h后，将孵育液接种至96孔板中(200μL/孔)测定OD₆₀₀的值；取20-100μL孵育液至96孔板,加入120μL测试缓冲液和20μL氯仿，30℃的恒温摇床1300rpm预培养10min；加入40μL MUG启动酶反应，30℃，800rpm，0.5-1小时后，加入100μLNa₂CO₃(1mol/L)溶液终止反应，酶标仪测定荧光值，其中MUG的激发波长为360nm，吸收波长为450nm；并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制DHT对重组基因酵母细胞β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量－效应关系标准曲线。

β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(A_S－A_B)/(t·V·D·OD_S)，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；OD_S为测试样品在600nm处的吸光度值；A_S为测试样品的荧光值；A_B为空白对照的荧光值。百分诱导酶活性P的计算公式如下：P＝u/u_max×100％，式中，u为β-半乳糖苷酶活性，u_max为最大β-半乳糖苷酶活性，本文为2.5×10^-7mol/LDHT(DHT终浓度为2.5×10^-7mol/L)诱导的酶活性。

如图2所示，系列DHT浓度相对重组基因酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量－效应关系，当DHT浓度为2.5×10^-7mol/L时，酶活性值最高。

3.3绘制抑制标准曲线：首先将上述重组基因酵母细胞分别与已知系列浓度氟他胺以及2.5×10^-7mol/L DHT共培养，加入MUG反应液进行反应，终止反应后检测上清液的荧光值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数，绘制系列氟他胺浓度相对酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性抑制的剂量－效应关系图。

具体步骤如下：

将氟他胺溶解到去离子水中，制备一系列的标准浓度反应液(浓度范围1×10^-11～1×10^-5mol/L),取4.5mL氟他胺标准浓度反应液，加入25μL5×10^-5mol/LDHT(DHT终浓度为2.5×10^-7mol/L)，加入离心后的重组基因酵母细胞，0.5mL溶液A和100mg葡萄糖，置于150rpm，30℃全温振荡培养箱中暴露培养2-4h后，将孵育液接种至96孔板中(200μL/孔)测定OD₆₀₀的值；取20-100μL孵育液至96孔板,加入120μL测试缓冲液和20μL氯仿，30℃的恒温摇床1300rpm预培养10min；加入40μL MUG启动酶反应，30℃，800rpm，0.5-1小时后，加入100μL Na₂CO₃(1mol/L)溶液终止反应，取40μL至酶标板中用酶标仪测定荧光值,并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制氟他胺对重组基因酵母细胞β-半乳糖苷酶活性抑制的剂量－效应关系图。

百分抑制酶活性I的计算公式如下：I＝(1-P)×100％，式中，P为百分诱导酶活性。

如图3所示，氟他胺对重组基因酵母酶活性抑制的剂量-效应关系，横坐标是氟他胺浓度，纵坐标是百分抑制酶活性值I，氟他胺浓度由1×10^-11～1×10^-5mol/L升高，百分抑制酶活性值随着从0-40％升高。

实施例1

利用基于重组基因酵母的环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法测定二氢睾酮(DHT)的效应来绘制标准曲线。

重组基因酵母细胞培养：将制备的重组基因酵母细胞接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基中，30℃空气浴摇床中培养12-36h，检测十倍稀释菌液在600nm处的吸光度值(以培养基为空白)为0.35-0.40。

绘制标准曲线：将DHT溶解到去离子水中，制备一系列的DHT标准浓度反应液(浓度范围2.5×10^-11～2.5×10^-6mol/L)。准确量取重组基因酵母细胞1-1.5mL，室温，1000g离心5min，弃去上清液，将重组基因酵母细胞添加到含4.5mLDHT标准浓度反应液中，加入0.5mL溶液A和100mg葡萄糖。三角瓶经半透膜封口后置于150rpm，30℃全温振荡培养箱中暴露培养2-4h后，将孵育液接种至96孔板中，加热量为200μL/孔，测定OD₆₀₀的值。取20-100μL孵育液至96孔板,加入120μL测试缓冲液和20μL氯仿，30℃的恒温摇床1300rpm预培养10min；加入40μL MUG启动酶反应，30℃，800rpm，0.5-1小时后，加入100μL Na₂CO₃(1mol/L)溶液终止反应，酶标仪测定荧光值(MUG的激发波长为360nm，吸收波长为450nm)。并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制DHT对重组基因酵母细胞β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量－效应关系标准曲线，如图2。

β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(A_S－A_B)/(t·V·D·OD_S)，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；OD_S为测试样品在600nm处的吸光度值；A_S为测试样品的荧光值；A_B为空白对照的荧光值。百分诱导酶活性P的计算公式如下：P＝u/u_max×100％，式中，u为β-半乳糖苷酶活性，u_max为最大β-半乳糖苷酶活性，本文为2.5×10^-7mol/LDHT(DHT终浓度为2.5×10^-7mol/L)诱导的酶活性。

由图2可知，DHT对重组基因酵母细胞β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量－效应关系标准曲线的EC₅₀值为1.4×10^-9mol/L，在2.5×10^-10～2.5×10^-7mol/L范围内存在线性关系；优于国际报道的DHT在重组酵母系统中EC₅₀大于10^-8mol/L的结果，说明本发明建立的快速测试方法适用于环境水样中类雄激素干扰化合物的检测，且与报道的其它方法相比，本方法具有较高的灵敏度，初步表明该快速测试方法可以作为环境水样雄激素干扰化合物的定量检测方法。

实施例2

利用基于重组基因酵母的环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法测定氟他胺的效应来绘制标准曲线。

酵母细胞培养：将制备的重组基因酵母细胞接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基中，30℃空气浴摇床中培养12-36h，检测十倍稀释菌液在600nm处的吸光度值(以培养基为空白)为0.35-0.40。

绘制标准曲线：将氟他胺和2.5×10^-7mol/L DHT溶解到去离子水中，制备一系列的氟他胺标准浓度反应液(浓度范围2.5×10^-11～2.5×10^-6mol/L)。准确量取重组基因酵母细胞1-1.5mL，离心(室温，1000g离心5min)，弃去上清液，将重组基因酵母细胞添加到含4.5mLDHT标准浓度反应液中，加入0.5mL溶液A和100mg葡萄糖。三角瓶经半透膜封口后置于150rpm，30℃全温振荡培养箱中暴露培养2-4h后，将孵育液接种至96孔板中(200μL/孔)测定OD₆₀₀的值。取20-100μL孵育液至96孔板,加入120μL测试缓冲液和20μL氯仿，30℃的恒温摇床1300rpm预培养10min；加入40μL MUG启动酶反应，30℃，800rpm，0.5-1小时后，加入100μL Na₂CO₃(1mol/L)溶液终止反应，酶标仪测定荧光值(MUG的激发波长为360nm，吸收波长为450nm)。并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制氟他胺对重组基因酵母细胞β-半乳糖苷酶活性抑制的剂量－效应关系标准曲线，如图2。

β-半乳糖苷酶活性的计算公式如下：u＝(A_S－A_B)/(t·V·D·OD_S)，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；OD_S为测试样品在600nm处的吸光度值；A_S为测试样品的荧光值；A_B为空白对照的荧光值。百分诱导酶活性P的计算公式如下：P＝u/u_max×100％，式中，u为β-半乳糖苷酶活性，u_max为最大β-半乳糖苷酶活性，本文为2.5×10^-7mol/LDHT诱导的酶活性。

由图3可知，氟他胺对重组基因酵母细胞β-半乳糖苷酶活性抑制的剂量－效应关系标准曲线的RIC₂₀值(百分抑制酶活性为20％时对应氟他胺的浓度)为1.4×10^-9mol·L^-1，在2.5×10^-10～2.5×10^-7mol·L^-1范围内存在线性关系；与国际报道的E₂在重组酵母系统中EC₅₀大于10^-8mol·L^-1之间的结果相符，说明本发明建立的快速测试方法适用于环境水样中抗雄激素干扰化合物的检测，且与报道的其它方法相比，本方法具有较高的灵敏度，初步表明该快速测试方法可以作为环境水样雄激素干扰化合物的定量检测方法。

实施例3：利用快速测试方法检测实际环境水样中的雄激素干扰化合物。

采集某市饮用水源地水样作为测试样品。采用快速测试方法对开展水样中雄激素干扰化合物的检测。利用实施例1和2中所述的快速测试方法检测环境水样中的雄激素干扰化合物，测定结果与文献报道的相关结果进行了比较，见下表2。

表2 快速测试方法检测环境水样雄激素干扰化合物的测试结果

表2为快速测试方法检测环境水样雄激素干扰化合物的测试结果与文献报道相关结果的比较。从表2可以看出，基于重组基因酵母的快速测试方法，在水体中未检测出类雄激素干扰化合物，与文献报道一致；抗雄激素干扰化合物的浓度为1.69×10^-5g/L，与国际上基于样品前处理(通常为固相萃取方法)的水样检测结果之间有很好的可比性。表2的结果表示可以用本发明提出的方法，检测环境水中雄激素干扰化合物的浓度水平，判断其潜在生态毒性的大小。

在以上的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是以上描述仅是本发明的较佳实施例而已，本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，因此本发明不受上面公开的具体实施的限制。同时任何熟悉本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种环境水样雄激素干扰化合物快速测试方法，其特征在于，所述测试方法基于重组基因酵母，包括如下步骤：

(1)培养重组基因酵母细胞；

(2)待测样品与重组基因酵母共孵育；

(3)重组基因酵母细胞酶活性测定。

2.根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(1)中，测定酵母细胞密度，重组基因酵母细胞菌液十倍稀释后600nm处的吸光度值OD₆₀₀在0.35-0.40之间。

3.根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(2)中待测样品与重组基因酵母共孵育振荡培养2-4h。

4.根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入溶液A，所述溶液A包括：0.2g/L腺嘌呤半硫酸盐，0.2g/L盐酸精氨酸，0.2g/L一水合盐酸组氨酸，0.3g/L异亮氨酸，0.3g/L盐酸赖氨酸，0.2g/L甲硫氨酸，0.5g/L苯丙氨酸，2g/L苏氨酸，0.3g/L酪氨酸，0.2g/L尿嘧啶，1.5g/L缬氨酸，67g/L无氨基酸酵母氮源。

5.根据权利要求4所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(2)中还加入葡萄糖，其终浓度为15～20g/L。

6.根据权利要求4所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(2)中重组基因酵母细胞、待测样品、溶液A的体积比为2～3：9：1。

7.根据权利要求1所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(2)之前对待测样品进行过滤，去除待测样品中的悬浮颗粒物。

8.根据权利要求1-7任一所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(3)包括在孵育好的重组基因酵母细胞中加入4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷(MUG)进行反应生成荧光产物，测其荧光值，当重组基因酵母细胞的测试体积为20-100μL时，加入的MUG的测试浓度为10^-4-10^-5mol/L。

9.根据权利要求8所述的快速测试方法，其特征在于，该方法中包括如下步骤：所述步骤(3)中检测反应终止后上清液的荧光值，绘制标准曲线，计算待测样品中类雄激素化合物的含量。

10.根据权利要求8所述的快速测试方法，其特征在于，所述步骤(2)中还加入二氢睾酮(DHT)，所述DHT的终浓度为2.5×10^-7mol/L，检测所述步骤(3)反应终止后上清液的荧光值，绘制标准曲线，计算待测样品中抗雄激素化合物的含量。