CN101813676B - 一种污泥中痕量雌激素含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种污泥中痕量雌激素的检测技术，特别是涉及污泥样品中痕量雌酮和17β-雌二醇含量的检测方法。本方法将采集好的污泥样品进行冷冻干燥，添加NaN₃并采用丙酮振荡萃取后，进行快速溶剂萃取，合并上述萃取液，采用固相萃取柱浓缩富集其中的雌激素，采用乙酸乙酯将雌激素从固相萃取柱上洗脱下来，利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度。该方法环境友好、易于操作、且回收率较高，能够快速分析污泥样品中痕量雌酮和17β-雌二醇的含量。

Description

一种污泥中痕量雌激素含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种污泥中痕量雌激素的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对污泥样品中痕量雌酮和17β-雌二醇含量的检测方法。

背景技术

由人与动物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，E1)和17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)，会随着粪尿排放进入污水处理系统中。同时，畜禽粪便中的雌激素会通过堆肥施用或地表径流进入水体底泥中。雌激素的排放是不可避免的，近十年来雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。有关鱼类生殖异常现象的研究结果表明，污水处理厂受纳水体中所含ng/L浓度水平的雌激素是导致鱼类雌性化生殖异常现象的主要原因物质。欧美等国对多家污水处理厂雌激素浓度及去除效率的调查结果显示，在污水处理厂出水及受纳水体中残留着ng/L浓度水平的雌激素，表明污水处理厂不能有效去除进水中的雌激素。

污水处理厂剩余污泥经脱水后通常采用填埋处理，污泥中吸附的雌激素可随地表径流等过程进入土壤环境，甚至污染地下水，具有潜在的生态风险。因此测定污泥中雌激素的含量，对污水处理系统中雌激素的控制和生态风险评价，具有重要意义。

污泥中雌激素的含量与污水处理工艺、污泥性质及有机质含量等因素有关。由于污泥样品基体复杂，样品前处理技术在雌激素检测中起着重要的作用，如何高效地从污泥样品中提取雌激素成为了痕量雌激素的分析瓶颈。在对污泥中雌激素的提取方面，单独采用快速溶剂萃取法或超声波萃取法等虽然具有分析时间短、有毒溶剂使用量少、萃取效率高等优点，但仍然存在回收率低、重现性差等缺点。近年来，雌激素的仪器检测技术有了很大的提高，如气相色谱-质谱联用(GC/MS)、气相色谱-串联质谱联用(GC/MS/MS)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)、液相色谱-串联质谱联用(LC/MS/MS)等，具有较高的灵敏度和精确度。因此，建立回收率高、重现性好、精确度及精密度高的污泥中痕量雌酮和17β-雌二醇分析方法，成为研究的关键。

发明内容

本发明的目的是针对污泥样品基体复杂，雌激素痕量存在，前处理技术难度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确、快速的分析技术，实现对污泥样品中痕量雌酮和17β-雌二醇的定量测定。

本发明的技术方案如下：

一种污泥中痕量雌激素含量的检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)污泥样品预处理

取1g经冷冻干燥后污泥样品，加入0.5mL1.5×10^-3mol/L的NaN₃溶液，搅拌均匀后风干；向上述干燥后的污泥样品中加入10mL丙酮振荡30min后，在2000rpm下离心30min，收集上清液，重复两次；离心后的污泥样品风干后，采用快速溶剂萃取仪进行萃取，萃取剂为丙酮，其溶剂量为120-140mL，萃取液与上述两次振荡离心后的上清液合并混匀得到提取液；快速溶剂萃取条件为：温度60℃，压力1500pis，静态提取2次，各8min；Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；取50mL提取液加入1000mL蒸馏水后混匀，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min；萃取结束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2×3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min；洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后冷藏待测。

(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度

色谱柱：Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm；

梯度洗脱：采用甲醇和pH＝10的氨水为流动相，甲醇的比例在0-1.2min内由15％升到70％，1.2-2.0min内升到90％，2.0-3.0min内升到98％，3.0-6.1min维持在98％，6.1-6.2min内降至15％，6.2-10min内维持在15％，以上百分比均为体积百分比；

(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

(4)样品的测定

采集待测污泥样品，按步骤(1)对污泥样品进行预处理，再按步骤(2)进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤(3)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测污泥样品中雌激素的含量。

本发明所述的方法还包括：采用同样的污泥样品，采用浸泡加标方式按0.5ng/g的添加量加入标准溶液，进行上述预处理并测定雌酮和17β-雌二醇含量，进行回收率计算；

本发明所述污泥中痕量雌激素含量的检测方法，其中：所述雌激素为雌酮和17β-雌二醇。

本发明的有益效果是添加NaN₃抑制了微生物的降解作用，回收率较好；采用快速溶剂萃取进行提取，操作简单，萃取速度快，安全可靠；采用固相萃取进行富集，有机溶剂用量少，富集倍数高，操作简单；采用液相色谱-串联质谱联用进行检测，检测限低，具有较高的灵敏度和精确度。本发明提供一种检测限低、重现性好、灵敏度高、回收率较好、操作简单易行的分析方法，能够快速分析污泥中痕量雌酮和17β-雌二醇的含量。

附图说明

图1为200ng/L标准品溶液的色谱图，出峰顺序为E1：5.69min；E2：5.63min；

图2为剩余污泥样品的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

(1)活性污泥样品预处理

将活性污泥样品进行冷冻干燥处理之后，取1g经冷冻干燥后污泥样品，加入0.5mL NaN₃溶液(1.5×10^-3mol/L)，搅拌均匀后风干。向上述干燥后的污泥样品中加入10mL丙酮振荡30min后，在2000rpm下离心30min，收集上清液，重复两次。离心后的污泥样品风干后，利用快速溶剂萃取仪进行萃取，萃取剂为丙酮，其溶剂量为120-140mL。萃取液与上述两次振荡离心后的上清液合并混匀得到提取液。快速溶剂萃取条件为：温度60℃，压力1500pis，静态提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min。取50mL提取液加入1000mL蒸馏水后混匀，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min。萃取结束后真空抽干5min，以去除水分，利用2×3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min。洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后，待测。

(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度

液相色谱-串联质谱联用选择的条件：3200Qtrap^TM型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国AppliedBiosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，美国Agilent公司。

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。采用甲醇和pH＝10的氨水为流动相，流动相梯度条件详见表1。

表1流动相梯度条件

液相色谱-串联质谱联用对雌酮和17β-雌二醇的最低检测限为200ng/L。

(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量2种雌激素，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行分析，分别以雌激素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到2条标准曲线，用于测定样品中分析物的量。图1为200ng/L标准品溶液的色谱图。

(4)样品及回收率的测定

采集待测活性污泥样品，按步骤(1)对污泥样品进行预处理，再按步骤(2)进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测污泥样品中雌酮和17β-雌二醇的含量。

采用同样的污泥样品进行冷冻干燥，取1g冷冻干燥后的污泥样品，采用浸泡加标方式按0.5ng/g的添加量加入标准溶液，进行预处理并测定雌酮和17β-雌二醇含量，并按照下式进行回收率计算：

$R=\frac{C-C_0}{0.5}\×100\%---\left(1\right)$

R-回收率，％；

C-添加标准溶液污泥样品的雌激素含量，ng/g；

C₀-未添加标准溶液污泥样品的雌激素含量，ng/g。

本方法的回收率与最低检测限，如表2所示。

表2本方法的回收率和最低检测限

以下为利用本发明检测污水处理厂剩余污泥中痕量雌酮和17β-雌二醇的实施例：

采集北京污水处理厂剩余污泥样品，迅速装入密封袋中带回实验室进行处理分析。污泥样品先进行冷冻干燥处理。取1g经冷冻干燥后污泥样品，加入0.5mLNaN₃溶液(1.5×10^-3mol/L)，搅拌均匀后风干。向上述干燥后的污泥样品中加入10mL丙酮振荡30min后，在2000rpm下离心30min，收集上清液，重复两次。离心后的污泥样品风干后，进行快速溶剂萃取，萃取剂为丙酮，其溶剂量为120-140mL。萃取液与上述两次振荡离心后的上清液合并混匀得到提取液。快速溶剂萃取条件为：温度60℃，压力1500pis，静态提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min。取50mL提取液加入1000mL蒸馏水后混匀，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min。萃取结束后真空抽干5min，以去除水分，利用2×3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min。洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后，待测。

利用液相色谱-串联质谱联用测定上述待测样品的雌激素浓度。液相色谱-串联质谱联用选择的条件：3200Qtrap^TM型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国Applied Biosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，美国Agilent公司。色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。采用甲醇和pH＝10的氨水为流动相，流动相梯度条件详见表1。计算结果得到，该污水处理厂剩余污泥中雌酮和17β-雌二醇的含量分别为0.43～1.01ng/g和未检出～0.67ng/g。图2为剩余污泥样品的色谱图。

Claims (3)

1.一种污泥中痕量雌激素含量的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）污泥样品预处理

取1g经冷冻干燥后污泥样品，加入0.5mL 1.5×10^-3mol/L 的NaN₃溶液，搅拌均匀后风干；向上述干燥后的污泥样品中加入10mL丙酮振荡30min后，在2000rpm下离心30min，收集上清液，重复两次；离心后的污泥样品风干后，采用快速溶剂萃取仪进行萃取，萃取剂为丙酮，其溶剂量为120-140mL，萃取液与上述两次振荡离心后的上清液合并混匀得到提取液；所采用的快速溶剂萃取条件为：温度60℃，压力10342.5kPa，静态提取2次，各8min；Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；取50mL上述提取液加入1000mL蒸馏水后混匀，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min；萃取结束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2×3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min，洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200μL乙腈/水等体积比混合液，漩涡混合，冷藏待测。

（2）利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度

色谱柱： Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm；

梯度洗脱：采用甲醇和pH=10的氨水为流动相，甲醇的比例在0-1.2min内由15%升到70%，1.2-2.0min内升到90%，2.0-3.0min内升到98%，3.0-6.1min维持在98%，6.1-6.2min内降至15%，6.2-10min内维持在15%，以上百分比均为体积百分比；

（3）标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

（4）样品的测定

采集待测污泥样品，按步骤（1）对污泥样品进行预处理，再按步骤（2）进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤（3）得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测污泥样品中雌激素的含量。

2.根据权利要求1所述污泥中痕量雌激素含量的检测方法，其特征在于，还包括采用浸泡加标方式测定回收率的步骤，添加量为0.5ng/g。

3.根据权利要求1所述污泥中痕量雌激素含量的检测方法，其中：所述雌激素为雌酮和17β-雌二醇。

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