CN112458134B - 一种利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的培养基 - Google Patents

一种利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的培养基，本发明确认了利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的种子、发酵罐培养基的碳源、氮源最佳配伍比例，同时使用了甜菜碱，调节菌体渗透压，有利于提高菌种活力，促进菌丝生长和代谢，替代蛋白胨，降低生产成本，同时，乳酸钙水解生成乳酸，能抑制噬菌体产生，保证生产稳定，同现有技术相比，发酵效价提高8.9%以上，生产成本下降11.2%以上。

Description

一种利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的培 养基
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的培养基。
背景技术
氨基葡萄糖是天然的氨基单糖,为人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的物质，其分子式C6H13O5N，结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
氨基葡萄糖系葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物，俗称氨基糖，易溶于水及亲水性溶剂。通常以N-乙酰基衍生物（如甲壳素）或以N-硫酸酯和N-乙酰-3-O-乳酸醚（胞壁酸）形式存在于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中。
氨基葡萄糖具有免疫调节、治疗骨关节炎、抗氧化、抗衰老以及防腐抗菌等作用，被广泛应用在医疗、食品、化妆品、农业上。
在医疗上，氨基葡萄糖能减缓关节和软骨部位病变，缓解关节疼痛，有利于再生软骨组织；也可以用于治疗胃溃疡；若在服用氨基葡萄糖的同时服用抗生素，可以促进血液对抗生素的吸收，增加疗效并降低一些副反应；另外，氨基葡萄糖在预防颈椎病、参与肝肾解毒、抗癌等方面也有显著疗效。
在食品上，氨基葡萄糖对人体无毒，并且有抗衰老、刺激婴儿肠道内双歧杆菌的生长、调节内分泌等作用，因此可以作为食品配料使用。如日本、美国的一些生产商在蛋糕、面包、饮料等产品中添加氨基葡萄糖。
在化妆品、农业上，可以添加到高档化妆品、植物生长调节剂、饲料添加剂中。
目前，氨基葡萄糖主要采用生物提取法和微生物发酵法生产，其中
生物提取法系从虾蟹壳中提取甲壳素或壳聚糖,再经盐酸水解而成氨基葡萄糖盐酸盐，该工艺需要虾蟹壳资源，产品有鱼腥味，对过敏反应的患者不适用，而且产品中重金属含量容易超标，影响市场推广。
微生物发酵法一般采用转基因工程技术，将氨基葡萄糖合酶和氨基葡萄糖乙酰化酶的基因在大肠杆菌中共表达，获得转基因工程菌，其中氨基葡萄糖合酶和氨基葡萄糖乙酰化酶是氨基葡萄糖代谢途径中两个关键酶，分别催化葡萄糖转化为氨基葡萄糖、氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。伴随发酵技术水平提高，产量提升空间较大，微生物发酵法具有工业化大生产的潜力，成为行业发展方向。
目前，国内采用转基因工程菌大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖工艺，存在的主要问题有以下几点：
1 发酵原材料成本高。一般发酵法生产氨基葡萄糖的发酵培养基中，氮源物质需加入蛋白胨，这类原材料价格较高，导致生产成本增加。
2 大肠杆菌转基因菌，免疫力较差，易染噬菌体，为抑制染菌，梁芳《氨基葡萄糖的发酵中试放大和提取工艺研究》（江南大学研究生论文，2013）在氨基葡萄糖的发酵培养基中加入抗生素，如硫酸卡那霉素，但培养基中加入抗生素对大肠杆菌转基因菌自身活性造成抑制，影响氨基葡萄糖发酵水平提高。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种既能有效避免染菌，同时又可提高发酵水平，降低生产成本的利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的培养基。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种利用大肠杆菌转基因工程菌发酵法生产氨基葡萄糖的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中
所述种子培养基组成为：蛋白胨10～12g/L、酵母粉5～7g/、氯化钠10～12g/L；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖 110～130g/L、甘油6～10g/L、玉米浆4～7g/L、酵母粉16～18g/L、甜菜碱 5.5～6.0g/L、KH2PO4 4.4～4.7g/L、K2HPO4 12～15g/L、NaCL4.0～4.5g/L、乳酸钙 8～12g/L。
所述种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮90～110mg/100ml、总糖3.0～3.5g/100ml、pH6.5～7.5。
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮60～140mg/100ml、总糖3.2～4.0g/100ml、pH6.8～7.5。
本发明的技术优势体现在：
1本发明确认了利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的种子、发酵罐培养基的碳源、氮源最佳配伍比例，发酵培养基中加入甜菜碱，可调节菌体渗透压，有利于提高菌种活力，促进菌丝生长和代谢，提高种子液质量，提高发酵生产水平。
2本发明发酵培养基中使用了甜菜碱替代蛋白胨可降低生产成本，培养基中使用乳酸钙，乳酸钙水解生成乳酸，能抑制噬菌体产生，保证生产稳定，同现有技术相比，发酵效价提高8.9%以上，生产成本下降11.2%以上。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例中是以大肠杆菌转基因工程菌为生产菌种。
下述实施例的菌种选用种子液的质量要求为：培养时间10小时左右移种，移种比例为6%左右。
种子培养工艺：在火焰保护下，将已经培养好的大肠杆菌转基因工程菌母瓶培养液接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温37±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min。
发酵培养工艺：将培养好的种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度：37±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵补料工艺：发酵8hr后开始补料，发酵截止前12hr左右，停止补料。采用流加补料方式，补料量1500～2600L/h（30立方发酵罐），补料液为已消毒、温度30～35℃的12～15%（g/g)液化葡萄糖液。
发酵过程监测并控制：糖浓度1.0～3.0g/100ml，氨基氮30～110mg/100ml。
发酵效价（N-乙酰氨基葡萄糖）≥70g/L，发酵周期控制在65～75h。
实施例1
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基组成：蛋白胨20kg、酵母粉10kg、氯化钠20kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮94mg/100ml、总糖3.2g/100ml、pH6.9。
种子培养：在火焰保护下，将已经培养好的大肠杆菌转基因工程菌母瓶培养液接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.05MPa；罐温37±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，培养时间10h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积30m3。
发酵培养基组成：葡萄糖3300kg、甘油180kg、玉米浆150kg、酵母粉510kg、甜菜碱171kg、KH2PO4138kg、K2HPO4 360kg、NaCL132kg、乳酸钙330kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮82mg/100ml、总糖3.6g/100ml、pH7.1。
发酵培养：将培养好的种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，培养温度37±0.5℃；空气流量1800m3/h；搅拌转速150r/min。发酵罐移种8hr开始流加补料，补料速度1500L/h，补料液12%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵50hr停止补料，期间pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵效价（N-乙酰氨基葡萄糖）82g/L，发酵周期65h。
实施例2
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基组成：蛋白胨24kg、酵母粉12kg、氯化钠22kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮99mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.3。
种子培养：在火焰保护下，将已经培养好的大肠杆菌转基因工程菌母瓶培养液接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03MPa；罐温37±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，培养时间11h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积30m3。
发酵培养基组成：葡萄糖3450kg、甘油210kg、玉米浆165kg、酵母粉540kg、甜菜碱171kg、KH2PO4135kg、K2HPO4 390kg、NaCL126kg、乳酸钙360kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮82mg/100ml、总糖3.6g/100ml、pH7.1。
发酵培养：将培养好的种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，培养温度37±0.5℃；空气流量1600m3/h；搅拌转速140r/min。发酵罐移种10hr开始流加补料，补料速度1800L/h，补料液13%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵59hr停止补料，期间pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束,发酵效价（N-乙酰氨基葡萄糖）78g/L，发酵周期71h。
实施例3
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基组成：蛋白胨24kg、酵母粉14kg、氯化钠24kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮106mg/100ml、总糖3.5g/100ml、pH7.4。
种子培养：在火焰保护下，将已经培养好的大肠杆菌转基因工程菌母瓶培养液接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.04MPa；罐温37±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，培养时间12h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积30m3。
发酵培养基组成：葡萄糖3600kg、甘油240kg、玉米浆120kg、酵母粉480kg甜菜碱165kg、KH2PO4132kg 、K2HPO4 420kg、NaCL129kg、乳酸钙300kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮110mg/100ml、总糖3.7g/100ml、pH7.4。
发酵培养：将培养好的种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37±0.5℃；空气流量1700m3/h.搅拌转速150r/min；发酵罐移种8hr开始流加补料，补料速度2200L/h，补料液14%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵60hr停止补料，期间pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束,发酵效价（N-乙酰氨基葡萄糖）82g/L，发酵周期72h。
实施例4
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基组成：蛋白胨22kg、酵母粉12kg、氯化钠22kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮98mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.3。
种子培养：在火焰保护下，将已经培养好的大肠杆菌转基因工程菌母瓶培养液接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.05MPa；罐温37±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，培养时间11h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积30m3。
发酵培养基组成：葡萄糖3750kg、甘油270kg、玉米浆210kg、酵母粉510kg、甜菜碱174kg、KH2PO4141kg、K2HPO4 405kg、NaCL120kg、乳酸钙240kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮122mg/100ml、总糖3.8g/100ml、pH7.4。
发酵培养：将培养好的种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37±0.5℃；空气流量1800m3/h；搅拌转速160r/min。发酵罐移种8hr开始流加补料，补料速度2400L/h，补料液15%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵55hr停止补料，期间pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵效价（N-乙酰氨基葡萄糖）80g/L，发酵周期68h。
实施例5
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基组成：蛋白胨20kg、酵母粉12kg、氯化钠24kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量为：氨基氮95mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.4。
种子培养：在火焰保护下，将已经培养好的大肠杆菌转基因工程菌母瓶培养液接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温37±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，培养时间11h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积30m3。
发酵培养基组成：葡萄糖3900kg、甘油300kg、玉米浆150kg、酵母粉510kg、甜菜碱180kg、KH2PO4138kg、K2HPO4 450kg、NaCL135kg、乳酸钙270kg。在121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮118mg/100ml、总糖3.9g/100ml、pH6.9。
发酵培养：将培养好的种子培养液接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37±0.5℃；空气流量1600m3/h；搅拌转速150r/min。发酵罐移种9hr开始流加补料，补料速度2600L/h，补料液15%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵60hr停止补料，期间pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵效价（N-乙酰氨基葡萄糖）81g/L，发酵周期73h。
对比案例1
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：蛋白胨20kg、酵母粉10kg、氯化钠20kg。
首先，将种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量为：氨基氮75mg/100ml、总糖3.2g/100ml、pH7.6。然后在火焰保护下，将已经培养好的大肠杆菌转基因工程菌母瓶菌丝接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，培养时间10h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积30m3。
葡萄糖3000kg、甘油120kg、蛋白胨360kg、酵母粉720kg、玉米浆120kg、(NH4)2SO4165kg、KH2PO4 69kg、K2HPO4 377kg、乳糖300kg、硫酸卡那霉素1.5kg。发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮118mg/100ml、总糖3.9g/100ml、pH6.9。
发酵过程中，温度37±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；发酵罐移种31hr开始流加补料，补料速度2400～2600L/h，补料液15%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵55hr停止补料。pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵效价（N-乙酰氨基葡萄糖）74g/L，发酵周期68h。

Claims (1)

1.一种利用大肠杆菌转基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中
所述种子培养基组成为：蛋白胨10～12g/L、酵母粉5～7g/L、氯化钠10～12g/L；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖110～130g/L、甘油6～10g/L、玉米浆4～7g/L、酵母粉16～18g/L、甜菜碱5.5～6.0g/L、KH2PO4 4.4～4.7g/L、K2HPO4 12～15g/L、NaCL4.0～4.5g/L、乳酸钙8～12g/L；
所述种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮90～110mg/100ml、总糖3.0～3.5g/100ml、pH6.5～7.5；
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮60～140mg/100ml、总糖3.2～4.0g/100ml、pH6.8～7.5。
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