KR20180027496A - 속 클로스트리듐 베이제링키의 돌연변이 균주 - Google Patents

속 클로스트리듐 베이제링키의 돌연변이 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 돌연변이 박테리아, CNCM I-4985, CNCM I-4986, CNCM I-4987 및 CNCM I-4988, 및 2015 년 11 월 26 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 기탁된 CNCM I-5027, CNCM I-5028 및CNCM I-5029 에 관한 것으로서, 이들은 이소프로판올 및 부탄올 생성을 위한 당의 발효에 사용될 수 있다.

Description

속 클로스트리듐 베이제링키의 돌연변이 균주 {MUTANT STRAINS OF THE GENUS CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII}
본 발명은 랜덤 돌연변이유발에 의해 개선된 속 클로스트리듐 베이제링키 (Clostridium beijerinckii) 의 박테리아뿐 아니라 이들 박테리아를 이용하는 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합물의 제조 방법에 관한 것이다.
2 내지 6 개의 탄소 원자로 구성된 많은 소위 "플랫폼 (platform)" 화학 분자는 주로 화석 자원에서 생성된다. 이들 기본 분자는 중간체 화합물의 제조에 사용되며, 그 용도는 연료 제형 또는 나아가 향수 산업에서, 중합체의 합성, 약학 분자의 합성과 같이 다양하다.
그러나, 특정 환경적인 이유로, 그러나 무엇보다도 석유 자원의 불가피한 쇠퇴를 다루기 위해, 재생가능한 원료로부터 이들 "플랫폼" 분자의 제조를 허용하는 대체 공정이 개발되고 있다.
프로필렌 (또는 프로펜) 은 석유화학에서 두 번째로 많이 사용되는 분자이다. 이것은 주로 석유로부터 유래되며, 특히 스팀 크래킹에 의해, 촉매 크래킹에 의해 또는 프로판의 탈수소화에 의해 수득된다.
석유 이외의 프로필렌을 생산할 수 있는 가능한 방법들 중 하나는 IBE (이소프로판올, 부탄올, 에탄올) 발효로서 공지된 발효인, 바이오매스로부터 추출된 당의 생물학적 발효에 의해 수득된 이소프로판올의 탈수를 실시하는 것이다.
"솔벤토제닉 (solventogenic) 발효" 로서 불리우는 발효는 클로스트리듐 속의 미생물에 의해 수행된다. 클로스트리디아 (Clostridia) 는 내생포자를 형성할 수 있는 그람-양성 바실러스로, 퍼미큐티스 (Firmicutes) 문에 속한다. 이들 박테리아는 엄밀히 말하면 혐기성이며 편재되어 있다; 이들은 동물의 장, 토양 등에서 발견될 수 있다. 이들은 상이한 당들을 분해할 수 있고, 각종 기질로부터 용매를 생성할 수 있다. 이 "솔벤토제닉" 발효가 완료되면, 최종 생성물은 발효가 ABE 타입 (아세톤, 부탄올 및 에탄올의 생산) 또는 IBE 타입 (이소프로판올, 부탄올 및 에탄올의 생성) 인지에 따라 달라질 수 있다.
가장 많이 연구된 "ABE" 균주는 1924 년에 코네티컷의 토양으로부터 단리된 클로스트리듐 아세토부틸리큠 (Clostridium acetobutylicum) ATCC 824 (Weyer & Rettger, 1927, J. Bacteriol. 14, 399-424) 이다. 또 다른 많이 연구되어진 균주로는 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ 6423 (NRRL B593) 이 있는데, 그 이유는 이것이 NADH-의존적 1차/2차 알코올 데히드로게나아제의 게놈 (adh) 내 존재로 인해 아세톤을 이소프로판올로 환원시켜 이소프로판올/부탄올/에탄올 용매의 혼합물을 생성할 수 있기 때문이다 (Ismaiel et al., 1993, J. Bacteriol., 175(16), 5097-105).
클로스트리듐 균주에 의한 용매 생성 산업 공정의 개발과 관련하여 주된 제약으로서 최종 용매의 타이터 (titre) 가 있는데, 이 문제는 첫 번째 산업 단위가 건설된 이래로 언급되어 온 문제이다 (Jones, D.T., Woods, D.T., 1986, Microbiological. Reviews. 50(4), 484-524). 저 용매 타이터의 주된 원인은 최종 생성물 및 특히 부탄올의 독성이다. 배양 배지에서 10-12 g/L 초과의 부탄올 농도는 클로스트리듐 균주의 성장을 제한하는 것으로 공지되어 있다 (Zheng et al., 2009, J. Ind. Microb. & Biotechnol. 36:1127-1138).
현재까지 대부분의 수행된 과학적 연구는 클로스트리듐 균주에 의한 부탄올의 합성을 개선하는 것을 목표로한다. 이를 위해, 돌연변이유발에 기초한 접근법 및 더 높은 부탄올 함량에 저항할 수 있는 클로스트리듐 균주의 선택 (selection) 을 포함해, 부탄올에 대한 내성을 개선시키기 위해 몇 가지 접근법이 적용되어 왔다 (US 4,757,010). 랜덤 돌연변이유발의 기술은, 균주의 유전자 풀을 개질하여 환경 선택 압력을 가함으로써 이들을 특정한 특성을 향하여 진화시킬 수 있게 한다. 이 기술은 자연 선택의 현상을 최적화하고 가속화한다.
사용할 수 있는 또 다른 기술은, 재생 과정을 모방하나 큰 규모로 모방함으로써 다수 유기체의 전체 게놈의 DNA 를 조합 및 재조합할 수 있게 하는 "게놈 셔플링 (genome shuffling)" 의 기술이다. 재조합 현상은 예를 들어 돌연변이유발 처리 및 선택적 배지에서의 플레이팅 후 선택되어진 균주의 원형질체의 융합에 의해 행해진다. 두 기술의 조합이 대사산물의 생성이 개선되고, 기질의 동화 (assimilation) 가 더 양호하며, 형성된 생성물에 대한 내성이 더 큰 균주를 수득하는 것을 도울 수 있다.
현재, 이소프로판올 및 부탄올의 혼합물의 개선된 농도를 수득 가능하게 하는, 적절한 발효 조건 하에서 배양된 새로운 박테리아 균주에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명의 개요
본 발명은 하기에 대한 것이다:
* 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-4985 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
* 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-4986 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
* 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-4987 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
* 2015 년 11 월 26 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-5027 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
* 2015 년 11 월 26 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-5028 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
* 2015 년 11 월 26 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-5029 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
돌연변이 박테리아 CMCM I-4985, CNCM I-4986, CNCM I-4987 는, 균주 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 로부터, 이것을 돌연변이유발제, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 로 처리하고, 유의미한 양의 이소프로판올, 또는 메틸 브로모부티레이트 또는 에틸 브로모부티레이트를 함유하는 배지에서 선택하여, 이소프로판올 및 부탄올의 혼합물을 제조하는데 잠재적으로 유용한 돌연변이체를 선택한 후에 수득되었다. 모체 균주 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 와 비교하면, 선택된 박테리아는 당 발효 후 용매인 이소프로판올 및 부탄올의 최종 타이터 측면에서 이점을 나타냈다.
본 발명은 또한 2015 년 5 월 27 일에 수탁 번호 CNCM I-4988 로 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 돌연변이 박테리아에 관한 것이다. 균주 CNCM I-4988 은 균주 CNCM I-4986 및 CNCM I-4987 로 수행된 게놈 셔플링 단계 후 상당한 농도의 이소프로판올을 그 환경에서 용인하는 돌연변이체의 능력을 기반으로 선택하는 단계로부터 유래된다.
발효에 이용된 균주 CNCM I-4988 는 균주 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 에 비해 농도가 개선된 용매 이소프로판올과 부탄올의 혼합물을 생성하는 능력이 있다.
본 발명은 또한 박테리아 CNCM I-4985, CNCM I-4986, CNCM I-4987 및 CNCM I-4988 로부터 선택된 박테리아를 이용해 당을 함유하는 배양 배지에서 25 내지 37℃ 의 온도에서 실행된 혐기성 발효에 의한 이소프로판올과 부탄올의 혼합물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 또한 박테리아 CNCM I-5027, CNCM I-5028 및 CNCM I-5029 로부터 선택된 박테리아를 이용할 수 있다. 박테리아 CNCM I-5027, CNCM I-5028 및 CNCM I-5029 은 돌연변이유발제 NTG 를 이용하여 돌연변이화된 균주로 게놈 셔플링함으로써 수득하였다.
배양 배지는 바람직하게 글루코오스를 당으로서 함유한다.
구현예에 따르면, 배양 배지는 가수분해된 전분-함유 기질을 함유한다.
본 발명에 따르면, 배양 배지는 카르복실산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 아세트산 및/또는 부티르산을 함유한다.
IBE 를 자연 생산하는 균주인 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 의 성능을 개선하기 위해, 본 발명자들은 돌연변이유발제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 로 상기 균주를 처리하여 그 유전적 내용을 개질하였다.
사용된 돌연변이유발 기술은 돌연변이유발제를 액체 배지 중 박테리아 균주와 접촉시킨 다음, 상이한 고체 배양 배지, 예를 들어 페트리 접시에 돌연변이원에 의한 처리에서 비롯된 균주를 플레이팅하는 것으로 이루어진다. 배양 배지는 천연 균주 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 에 대해 독성인 어느 정도의 이소프로판올 또는 메틸 브로모부티레이트 또는 에틸 브로모부티레이트를 포함한다.
균주의 선택은 이소프로판올에 저항성이 있는 돌연변이체가 IBE 발효 테스트 동안 이소프로판올의 축적을 용인하는 가정 하에서 이것을 찾는 원리에 기초한다.
선택 생성물로서 메틸 브로모부티레이트 또는 에틸 브로모부티레이트의 용도는 개선된 부티르알데히드 및 부탄올 데히드로게나아제 활성을 보이고, 2-브로모부티레이트에 대한 저항성에 대해 선택된 클로스트리듐 아세토부틸리큠 ATCC824 의 돌연변이체를 기술하는 문헌 [Clark, S. W., Bennett, G. N., & Rudolph, F. B. ((1989). Isolation and Characterization of Mutants of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Deficient in Acetoacetyl-Coenzyme A:Acetate/Butyrate:Coenzyme A-Transferase (EC 2.8.3.9) and in Other Solvent Pathway Enzymes. Appl. Environ. Microbiol., 55(4), 970-6)] 을 기반으로 한다. 본 발명자들은 개질된 부티르알데히드 활성을 갖는 균주가 ABE 발효에 수반되는 대사 반응이 IBE 발효의 대사 반응과 유사한 정도로 개선된 방식으로 이소프로판올을 생성할 수 있다고 추정한다.
배양 단계 후 회수된 돌연변이된 균주는 그리하여 그들 게놈에 있어서 개질되어져, 독성 생성물에 대한 저항성을 얻고, 용매 (보다 특히 이소프로판올 및 부탄올) 의 생성을 위한 잠재적으로 더 나은 발효 능력을 얻는다.
이어서, 저항성 균주는 그들의 이소프로판올 및 부탄올 생성에 대한 실질 능력을 측정하기 위해, 글루코오스 또는 가수분해된 전분-함유 기질을 함유하는 성장 배지에서 배양되었다. 이들 발효 단계가 완료되면, 부다페스트 조약에 따라 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 2015 년 5 월 27 일에 기탁하였고, 각각 레퍼런스 CNCM I-4985, CNCM I-4986 및 CNCM I-4987 를 갖는 3 종의 클로스트리듐 베이제링키 돌연변이 균주를 선택하는 것이 가능했다.
본 발명에 따라, 부다페스트 조약에 따라 Institut Pasteur 에 또한 기탁된 돌연변이 균주 CNCM I-4988 를, 돌연변이 균주의 게놈 셔플링으로써 수득하였다.
셔플링 단계를 개시하기 위해, 클로스트리듐 베이제링키 돌연변이들 사이에서 융합을 유도한다. 상이한 집단들 (populations) 간 이러한 유전적 교환은 그리하여 성 번식의 특징인 재조합을 모방한다. 셔플링 후 수득한 딸 세포는 그의 발효 프로파일에서의 변화를 검색함으로써 다시 선택된다. "셔플링" 공정은 용매, 특히 이소프로판올 및 부탄올을 생성하는 능력, 및 상당한 농도의 이소프로판올을 그 환경에서 용인하는 능력에 의해 개선되어진 최종 균주가 수득될 때까지 여러 세대 (또는 셔플링 라운드) 에 걸쳐 반복될 수 있다.
따라서, 돌연변이 균주 CNCM I-4988 는, 돌연변이 균주 CNCM I-4986 및 CNCM I-4987 로 수행한 셔플링 라운드 및 이소프로판올에 대한 개선된 내성 (40 g/L 초과의 이소프로판올) 에 대한 균주의 선택 후에 수득되었다.
본 발명의 주제를 형성하는 균주를 수득하기 위해 사용된 돌연변이유발 방법을 이하에 상세히 기술한다.
출발 균주 (또한 용어 "야생형" 으로 지칭) 는 Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 에 기탁된 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 이다.
이 균주를 GAPES 로 불리우는 배지 (그 조성은 표 1 에 기재함) 에서 사전배양하였다. 사전 배양 단계를, 24 시간에 걸쳐 35-37℃ 의 온도에서 실시하였다.
Figure pct00001
표 1: GAPES 배지의 조성
이때, 상기 사전 배양물은 CGM (Clostridium Growth Medium; 클로스트리듐 성장 배지) 배지 (그 조성은 표 2 에 제공함) 에서 배양을 개시하는데 사용된다.
Figure pct00002
표 2: CGM 배지의 조성
일단 배양되면, 야생형 균주 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 를, 액체 CGM 배지에서 그의 돌연변이원 특성에 대해 공지되어 있는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG ; Sigma-Aldrich) 과 접촉시켜, 상이한 돌연변이 조건에 적용시켰다.
제 1 테스트 시리즈에서, 지수 성장 상 (phase) 에서, 즉 3 내지 4 시간 동안 배양된 후 회수된 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 의 야생형 균주를, 시험관 내 35-37℃ 의 온도에서, 농도 50 ㎍/mL 의 NTG 를 수득하도록 CGM 배지에 첨가된 NTG 와 접촉시켰다. NTG 와의 접촉은 1 시간 동안 계속된다.
세포를, 칼륨 포스페이트의 버퍼 용액 (pH = 6.6) 으로 2 회 세정한 후, 다시 새 CGM 배지에서 취하여, 1 내지 3 시간의 재생 단계를 35℃ 에서 수행하였다. 선택 조작을 위해, 돌연변이된 세포를 재생 단계 후 선택 접시에서 플레이팅한다. 선택 배지는 선택제로서 에틸 브로모부티레이트를 0.5 mL/L 의 농도로 함유하는 CGM 배지이다. 인큐베이션을, 24-48 시간에 걸쳐 35-37℃ 의 온도에서 선택 배지에서 실시하였다. 24 내지 48 시간 동안 배양한 후, 선택제에 대한 저항성을 보이는 돌연변이를 선택하였다.
이어서, 그에 따라 선택된 상이한 돌연변이들의 성능을, 혐기성 조건 하 바이알에서, 2 개의 상이한 발효 배지, 즉 표 1 에 기재된 GAPES 배지, 및 글루코오스를 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ) 로 대체한 GAPES 배지 (상기 배지에서 70 g/L 글루코오스 당량의 농도에 상응함) 를 이용하여 테스트하였다.
교반 하에서 48 시간에 걸쳐 37℃ 의 온도에서 혐기성 발효를 실시한다.
제 2 의 테스트 시리즈에서, 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 의 야생형 균주를 CGM 배지에서 배양하고, 지수 상에서, 즉 3 내지 4 시간 동안 배양한 후 수집한 다음, 75 ㎍/mL 의 NTG 와 접촉시킨다. 이어서, 돌연변이를 상기 언급된 바와 동일한 조건 하지만, 선택제로서 이소프로판올을 40 g/L 의 농도로 이용하여 선택하였다.
이어서, 이소프로판올에 대한 저항성을 획득한 그렇게 선택된 돌연변이를, 70 g/L 의 글루코오스 당량을 제공하기 위해 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ) 가 글루코오스 대신에 첨가된 GAPES 배지 및 표 1 에 기재된 배지에서, 바이알에서 혐기성 조건 하 발효로 테스트하였다. 혐기성 발효를 교반 하 37℃ 의 온도에서 48 시간에 걸쳐 실시한다.
제 3 의 테스트 시리즈에서, 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ-6423 의 야생형 균주를 CGM 배지에서 배양하고, 지수 상, 즉 3 내지 4 시간 동안 배양 후 수집한 다음, 50 ㎍/mL 의 NTG 와 접촉시킨다. 돌연변이를, 또한 40 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 의 배양 용액을 이용하여 선택한다.
이어서, 이소프로판올에 저항성인 돌연변이를, 바이알에서 혐기성 조건 하 발효로, 70 g/L 의 글루코오스 당량을 제공하는 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ) 를 글루코오스 대신 함유하는 GAPES 배지 및 표 1 에 기재된 배지에서 테스트한다. 혐기성 발효를 48 시간에 걸쳐 37℃ 의 온도에서 교반 하 실시한다.
이하 표 3 에, GAPES 배지로 혐기성 발효 48 시간 후 생성된 용매의 분석 결과를 요약한다.
용매를 CP-PoraBOND Q 컬럼 및 FID (Flame Ionization Detector; 불꽃 이온화 검출기) 를 이용해 기체 크로마토그래피 (Varian®장치) 로써 검정한다. 프로판-1-올을, 내부 표준으로서 이용한다.
크로마토그래피 매개변수는 하기와 같다:
- 컬럼: 길이 25 미터; 내부 직경 (ID): 0.32 mm; 외부 직경 (ED): 0.45 mm; 필름 두께: 5 ㎕
- 인젝터의 온도: 90℃ 에서 250℃, 150℃/min
- 캐리어 기체 (carrier gas) 의 유속: 1.6 mL/min (6.8 psi)
- 컬럼 온도: 50℃ 에서 250℃, 50℃/min
- FID 검출기 온도: 80℃
- 주입 부피: 1 ㎕
Figure pct00003
표 3: NTG 를 이용하여 랜덤 돌연변이유발로써 수득된 돌연변이 균주로부터 GAPES 배지에서 발효 후 용매의 농도
부다페스트 조약에 따라 기탁된 돌연변이 균주를 별표로 표 3 에 표시하였다.
균주 9* 는 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 기탁된 균주 CNCM I-4985 에 해당한다.
균주 6* 는 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 기탁된 균주 CNCM I-4986 에 해당한다.
균주 7* 는 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 기탁된 균주 CNCM I-4987 에 해당한다.
표 4 는 클로스트리듐 베이제링키의 돌연변이 균주 CNCM I-4985, CNCM I-4986 및 CNCM I-4987 를 이용해, 70 g/L 의 글루코오스 당량으로, 글루코오스가 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ) 으로 대체된 GAPES 배지에서 발효로써 생성된 용매의 농도를 제시한다.
48 시간 동안 혐기성 발효 후, 글루코오스 함량을, Aminex®HPX-87P 컬럼 (Biorad, 길이 300 mm 및 직경 7.8 mm) 으로의 HPLC (Varian®) 으로써 80℃ 에서 측정하였다. 사용된 용리액은 유속 0.4 mL/min 의 물이다. 검출기는 굴절계 (Varian® 350 RI) 이다. 주입된 샘플 부피는 35 ㎕ 이다.
용매를, 상기 기재된 바와 같은 기체 크로마토그래피로써 분석한다.
Figure pct00004
표 4: 글루코오스를 대체하여 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ) (70 g/L 글루코오스 당량) 을 함유하는 GAPES 배지에서 발효 후 용매의 농도
균주 CNCM I-4985, CNCM I-4986 및 CNCM I-4987 으로 수행된 발효는, 야생형 균주 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ 6423 에 의해 생성된 것보다 이소프로판올 및 부탄올의 농도가 더 높은 발효 포도액 (fermentation must) 을 생성한다는 것에 주목한다.
NTG 로의 랜덤 돌연변이유발 및 40 g/L 의 이소프로판올에 대한 또는 0.5 mL/L 의 에틸 브로모부티레이트에 대한 그들의 저항성에 대한 선택의 단계 후 수득된 돌연변이 균주를 [Gao, X., Zhao, H., Zhang, G., He, K. & Jin, Y. (2012). Genome shuffling of Clostridium acetobutylicum CICC 8012 for improved production of acetone-butanol-ethanol (ABE). Curr. Microbiol., 65(2), 128-32] 에 기재된 프로토콜에 따라 게놈 셔플링 단계에 사용했다.
돌연변이 균주를 먼저 지수 상으로 CGM 배지에 개별적으로 도입하고, 3 내지 4 시간 동안 배양한 후 수집했다. 이어서, 배양물을 4000 G 에서 10 분 동안 원심분리하고, 0.5 M 의 수크로오스, 20 mM 의 나트륨 말레에이트 모노히드레이트 및 20 mM 의 MgCl2 을 함유하는 pH 6.5 의 나트륨 말레에이트 모노히드레이트 No.1 (SMM 1) 의 용액으로 2 회 세정하였다.
수집된 세포를 1 시간 동안 35℃ 에서 다음의 조성을 갖는 나트륨 말레에이트 모노히드레이트 No.2 의 용액과 접촉시킨다: 0.5 M 의 수크로오스, 20 mM 의 나트륨 말레에이트 모노히드레이트, 20 mM 의 MgCl2, 1 g/L 의 시스테인, 1 g/L 의 글루타티온 (15 mg/mL 의 리소자임이 첨가됨). 처리가 완료되면, 세포를 수집하고, 나트륨 말레에이트 모노히드레이트 No.1 의 용액으로 세정하고, 4000 G 에서 5 분 동안 원심분리한다.
상이한 집단들을 이어서 10 mL 의 나트륨 말레에이트 모노히드레이트 No.3 의 용액 (0.5 M 의 수크로오스, 20 mM 의 나트륨 말레에이트 모노히드레이트, 20 mM 의 MgCl2, 1 g/L 의 시스테인, 1 g/L 의 글루타티온, 50 mM CaCl2) 에서 혼합하고, 여기에는 30% w/v (100 mL 당 30 g) 의 PEG 4000 이 첨가되어 있으며, 이는 20 분간 35-37℃ 의 온도에서 인큐베이션되어 원형질체 사이에서 융합이 유도된다. 융합된 세포를 CGM 배지에서 현탁하고, 40 시간에 걸쳐 CGM 아가 상에서 재생시킨다.
NTG 로 처리된 돌연변이 균주로부터 원형질체 융합에 의한 몇몇의 교차 (crossing) 를 수행했다. 이어서, 유전적으로 셔플링된 균주를 CGM 배지에서 이소프로판올에 대한 증가된 내성에 대해 선택하였다 (45 에서 50 g/L 의 이소프로판올).
표 5 는 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 기탁된 균주 CNCM I-4988 및 야생형 균주 클로스트리듐 베이제링키 DSMZ 6423 로 수득된, 48 시간 동안 발효 후의 발효 포도액의 용매 농도를 비교한다. 글루코오스를 대체하여 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ; 70 g/L 글루코오스 당량) 을 함유한 GAPES 배지에서 발효를 수행하였다. 균주 CNCM I-4988 는 균주 CNCM I-4986 및 CNCM I-4987 으로 게놈 셔플링의 단일 라운드로부터 기원한다.
Figure pct00005
표 5: 글루코오스를 대체하는 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ; 70 g/L 글루코오스 당량) 을 함유하는 GAPES 배지에서 발효 후 용매의 농도
균주 CNCM I-4988 은 동일한 이소프로판올 생성 수준을 유지하면서 야생형 균주보다 많은 부탄올을 생성한다는 점에 유의해야 한다.
상이한 돌연변이 균주를 또한 2 회의 게놈 셔플링 라운드 후 수득한 다음, 그 후에 글루코오스를 대체해 가수분해된 전분-함유 기질 (70 g/L 글루코오스 당량) 이 첨가된 GAPES 배지에서 혐기성 발효로 테스트하였다.
균주 CNCM I-5027 를 이하에 기술한 바와 같이 단리하였다.
게놈 셔플링 단계를, 균주 CNCM I-4985 및 75 ㎍/mL 의 NTG 용액으로 돌연변이유발에서 비롯한 균주로 수행한 다음, 40 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 배지에 대한 그 저항성에 대해 선택하였다. 셔플링 라운드 후, 돌연변이된 세포를 40 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 선택 배지를 이용하여 선택했다. 선택 배지에서의 인큐베이션을 24 시간에 걸치고 35-37℃ 의 온도에서 수행한다. 24 시간 동안 배양 후, 저항성을 보이는 돌연변이를 선택하고, 다시 24 시간 동안 35-37℃ 의 온도에서, 50 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 배지에서 인큐베이션에 적용하였다. 균주 CNCM I-5027 는 상기 제 2 선택 단계 결과이다.
균주 CNCM I-5028 에 관하여, 이것은 균주 CNCM I-4985, 및 40 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 선택 배지에서 선택된 NTG (75 ㎍/mL) 로의 돌연변이유발 이전 단계에 적용된 바 있는 2 개의 다른 균주들로 수행된 게놈 셔플링 단계의 결과이다. 상기와 같이, 균주 CNCM I-5028 는 40 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 선택 배지, 이어서 50 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 선택 배지를 이용하는 2 개의 선택 단계로부터 기원한다.
균주 CNCM I-5029 는, 상기 기재된 프로토콜에 적용되었으나, NTG (75 ㎛/mL) 로의 돌연변이유발로부터 기원하고, 40 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 선택 배지에서 그의 저항성에 대해 선택된 2 개의 균주를 이용하여 게놈 셔플링 단계를 수행하여 단리되었다. 이전에서와 같이, 균주 CNCM I-5029 의 단리는, 40 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 배지 다음 50 g/L 의 이소프로판올을 함유하는 CGM 배지를 이용하는 두 단계로 수행되었다.
표 6 은 균주 CNCM I-5027, CNCM I-5028 및 CNCM I-5029 로 수득된, 48 시간 동안 37℃ 에서 발효 후의 발효 포도액의 용매 농도를 제공한다. 발효는, 표 1 에 제공된 조성을 갖는 GAPES 배지에서 수행되었다.
Figure pct00006
표 6: 글루코오스를 대체하는 가수분해된 전분-함유 기질 (GRITZ; 70 g/L 글루코오스 당량) 을 함유하는 GAPES 배지에서 37℃ 에서 발효 후 용매의 농도
균주 CNCM I-5027, CNCM I-5028 및 CNCM I-5029 은 기준 균주 DSM 6423 보다 더 많은 이소프로판올을 생성할 수 있다는 점이 관찰된다. 나아가, CNCM I-5028 및 CNCM I-5029 는 균주 DSMZ 6423 에 비해 더 많은 부탄올을 생성 가능하게 한다.
CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM) CNCMI-4985 20150527 CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM) CNCMI-4986 20150527 CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM) CNCMI-4987 20150527 CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM) CNCMI-4988 20150527 CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM) CNCMI-5027 20151126 CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM) CNCMI-5028 20151126 CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM) CNCMI-5029 20151126

Claims (12)

  1. 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-4985 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키 (Clostridium beijerinckii) 의 박테리아.
  2. 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-4986 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
  3. 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-4987 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
  4. 2015 년 5 월 27 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-4988 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
  5. 2015 년 11 월 26 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-5027 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
  6. 2015 년 11 월 26 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-5028 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
  7. 2015 년 11 월 26 일에 Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) 에 수탁 번호 CNCM I-5029 로 기탁된 속 클로스트리듐 베이제링키의 박테리아.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아를 이용하는, 당을 함유하는 배양 배지에서 25 내지 37℃ 의 온도에서의 혐기성 발효에 의한, 이소프로판올과 부탄올의 혼합물의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 배양 배지의 당이 글루코오스인 제조 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 배양 배지가 가수분해된 전분-함유 기질을 함유하는 제조 방법.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 카르복실산을 함유하는 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 카르복실산 배지가 아세트산 또는 부티르산인 제조 방법.
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