CN106460019A

CN106460019A - 生产尼龙的方法

Info

Publication number: CN106460019A
Application number: CN201580031154.XA
Authority: CN
Inventors: T·哈斯; E-M·埃克尔; S·贝克
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-05-05
Also published as: CA2948209A1; JP2017516470A; EP2944697A1; EP3143151B1; CN106460019B; EP3143151A1; WO2015173059A1; US20170260553A1; AR100382A1; SG11201609173YA; US10329590B2

Abstract

提供了从合成气生产氨基己酸和/或氨基己酸酯的方法，所述方法包括：A.使合成气与至少一种能够实施Wood‑Ljungdahl途径和乙醇‑羧酸盐发酵的细菌相接触以产生己酸；和B.使所述己酸与经基因工程改造的细胞相接触以产生氨基己酸和/或氨基己酸酯，其中所述经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的烷烃单加氧酶、醇脱氢酶和ω‑氨基转移酶的活性。

Description

生产尼龙的方法

发明简述

本发明涉及从合成气开始以生物技术方式生产聚酰胺，特别是尼龙，所述合成气被转化为己酸和然后化学地转化为己酸甲酯，所述己酸甲酯然后与将己酸甲酯转化为氨基己酸和/或其酯的细胞相接触。

发明背景

聚酰胺是合成聚合物，其中重复单元(单体)具有酰胺基团作为特征性特征。名称“聚酰胺”通常用于指定合成的、商业上可用的热塑性塑料，并因此使该类物质区别于化学上相关的蛋白质。几乎所有重要的聚酰胺都衍生自伯胺，即官能团-CO-NH-出现在其重复单元中。仲胺的聚酰胺(-CO-NR-，R＝有机残基)也存在。氨基羧酸、内酰胺和/或二胺和二羧酸特别地可应用作为用于聚酰胺的单体。

当酰胺键之间的重复单元基本上是脂肪族的时，它们形成被称为尼龙的聚酰胺聚合物。已知尼龙通过二胺和二酸之间的缩合反应来制备。尼龙由于其特点而是最广泛使用的聚合物之一。特别地，尼龙是高度有弹性的和耐用的。因此，尼龙纤维被用在许多应用中，包括衣服面料、包装纸、地毯、乐器弦线、管道、绳索、机械部件等。

一些通常可得的尼龙聚合物包括但不限于尼龙6,6、尼龙6、尼龙11、尼龙12、尼龙4,6、尼龙6,12、尼龙6,10等。其中尼龙6,6和尼龙6是更通常使用的聚合物。尼龙可以通过逐步增长聚合或链增长聚合来制备。从二胺和二酸或从氨基酸制备尼龙是逐步增长聚合，而从内酰胺制备尼龙通常涉及链增长聚合。由于后一种方法以单体开始，因而单体快速形成高分子量聚合物，这使得聚合过程更有效。该方法还减少了中间的二聚体、三聚体和其他寡聚体的形成。因此，该方法比逐步增长聚合更受欢迎。

己内酰胺是在使用链增长聚合来生产尼龙6中的原料。己内酰胺的生产通常是通过使环己酮与羟胺的硫酸氢盐或盐酸盐反应从而导致形成环己酮肟来进行的。然后，这通过贝克曼重排而转化成己内酰胺，其中常常使用浓硫酸作为催化剂。原材料环己酮通常通过用空气中的氧对环己烷进行催化氧化来产生，而环己烷则通过苯的氢化来获得。

用目前可得的生产尼龙的方法存在着几个缺点。在通过肟的贝克曼重排来产生内酰胺之中的一个缺点尤其是，作为副产物形成了大量的盐，例如硫酸钠，其需要进行处置。采用不同方法的在现有技术中所描述的用于产生内酰胺的其他方法包括EP0748797，其描述了从二腈产生内酰胺的方法，其中将二腈氢化为氨基腈并将氨基腈通过环化水解转化为内酰胺。使用分子筛例如酸性沸石、硅酸盐和非沸石分子筛，金属磷酸盐，和金属氧化物或混合金属氧化物，作为用于环化水解的催化剂。然而，该方法除了其他缺点外尤其具有这样的缺点，即通过环化水解来转化氨基腈的选择性是相当低的，并因此也形成大量的副产物。

进一步地，尼龙的传统制造使用基于石油的中间体。例如，使用环己烷来制备己二酸和己内酰胺。丁二烯和天然气是用于制备六亚甲基二胺的重要原材料。尼龙12也依赖于丁二烯原料。因此，在大多数的在现有技术中所描述的产生内酰胺的方法之中，使用烃类例如苯或丁二烯，并且这些是通过裂化对环境有害的汽油或石油来获得的。另外，由于关于这些起始材料的成本将会与石油价格相联系，因而随着预期未来石油价格会增长，尼龙价格也可能相关于石油价格的增长而增长。

因此，所希望的是找到除了纯粹基于石油的原材料之外的其他更可持续的原材料作为用于尼龙生产的起始材料，所述原材料还对环境引起更少的损害。

发明描述

提供了从合成气生产氨基己酸和/或氨基己酸酯的方法，所述方法包括：

A.使合成气与至少一种产乙酸细菌和/或氢氧化细菌相接触以产生己酸；和

B.使所述己酸与经基因工程改造的细胞相接触以产生氨基己酸和/或氨基己酸酯，其中所述经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的至少一种从由烷烃单加氧酶、醇脱氢酶和ω-氨基转移酶组成的组中选择的酶的活性。

特别地，根据本发明的任一方面，提供了从合成气生产氨基己酸和/或氨基己酸酯的方法，所述方法包括：

A.使合成气与至少一种能够实施Wood-Ljungdahl途径和/或乙醇-羧酸盐发酵的细菌相接触以产生己酸；和

B.使所述己酸与经基因工程改造的细胞相接触以产生氨基己酸和/或氨基己酸酯，其中所述经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的烷烃单加氧酶、醇脱氢酶和ω-氨基转移酶的活性。

通常，首先加工一部分从气化过程获得的合成气以便优化产物产率并避免焦油的形成。在合成气中的不希望的焦油和CO的裂化可以通过使用石灰和/或白云石来进行。这些过程详细描述在例如Reed,1981中。

可以在至少一种产乙酸细菌和/或氢氧化细菌存在下将合成气转化为己酸。特别地，可以使用本领域中已知的任何方法。可以通过至少一种原核生物来从合成气产生己酸。特别地，所述原核生物可以选自由下列各项组成的组：埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(Escherichia coli)；梭菌属(Clostridium)，例如扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自养产乙烷梭菌(Clostridium autoethanogenum)、食羧梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；棒杆菌属(Corynebacterium)，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；贪铜菌属(Cupriavidus)，例如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；假单胞菌属(Pseudomonas)，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)；代尔夫特菌属(Delftia)，例如食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)；芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)；乳杆菌属(Lactobacillus)，例如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；或乳球菌属(Lactococcus)，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

在另一个实例中，可以通过至少一种真核生物来从合成气产生己酸。在本发明的方法中所使用的真核生物可以选自：曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)；糖酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；耶氏酵母属(Yarrowia)，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；伊萨酵母属(Issatchenkia)，例如东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)；德巴利酵母属(Debaryomyces)，例如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；阿克苏酵母属(Arxula)，例如食腺嘌呤阿克苏酵母(Arxulaadenoinivorans)；或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

更特别地，可以通过在Steinbusch,2011；Zhang,2013；Van Eerten-Jansen,M.C.A.A,2013；Ding H.等人,2010；Barker H.A.,1949；Stadtman E.R.,1950；BornsteinB.T.等人,1948等中所公开的任何方法来从合成气产生己酸。更加特别地，可以在至少克氏梭菌存在下从合成气产生己酸。

在本文中所使用的术语“产乙酸细菌”是指这样的微生物，其能够实施Wood-Ljungdahl途径并因此能够将CO、CO₂和/或氢转化为乙酸或其盐。这些微生物包括以其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途径但由于基因工程改造而获得了该性状的微生物。此类微生物包括但不限于大肠杆菌细胞。这些微生物也可以被称为一氧化碳营养细菌。目前，本领域中已知21种不同属的产乙酸细菌(Drake等人,2006)，并且这些还可以包括一些梭菌(Drake&Kusel,2005)。这些细菌能够使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源，以氢作为能源(Wood,1991)。进一步地，还可以使用醇、醛、羧酸以及许多己糖作为碳源(Drake等人,2004)。导致乙酸或其盐形成的还原途径被称为乙酰-CoA或Wood-Ljungdahl途径。特别地，所述产乙酸细菌可以选自由下列各项组成的组：潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、长醋丝菌(Acetonema longum)(DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacteriumcarbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum)(DSM 4132)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)第446号物种(Morinaga等人,1990,J.Biotechnol.,第14卷,第187-194页)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)(DSM 1030)、巴克斯碱棒菌(Alkalibaculum bacchi)(DSM22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(DSM 4304)、产生布劳特氏菌(Blautiaproducta)(DSM 2950，以前称为产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)，以前称为产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus))、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)(DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)(DSM 1496)、自养产乙烷梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、食羧梭菌(Clostridium carboxidivorans)(DSM 15243)、考斯凯特梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC编号PTA-10522)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)(ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)(DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)(DSM 1288)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)(DSM 13528)、扬氏梭菌C-01(ATCC55988)、扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)、扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei)(DSM 6539)、食甲氧基苯甲酸梭菌(Clostridiummethoxybenzovorans)(DSM 12182)、拉格斯代尔梭菌(Clostridium ragsdalei)(DSM15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)(DSM 757)、梭菌属(Clostridium)物种ATCC 29797(Schmidt等人,1986,Chem.Eng.Commun.,第45卷,第61-73页)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(DSM 6115)、热苯甲酸脱硫肠状菌热互养共栖亚种(Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp.thermosyntrophicum)(DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)(DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)C2A(DSM 2834)、穆尔氏菌属(Moorella)物种HUC22-1(Sakai等人,2004,Biotechnol.Let.,第29卷,第1607-1612页)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)(DSM 521，以前称为热醋梭菌(Clostridium thermoaceticum))、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)(DSM 1974)、普氏醋菌(Oxobacter pfennigii)(DSM322)、食空气鼠孢菌(Sporomusa aerivorans)(DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusaovata)(DSM 2662)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)(DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)(DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida)(DSM4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030，以前称为凯伍产醋菌(Acetogenium kivui))。

更特别地，可以使用食羧梭菌的菌株ATCC BAA-624。更加特别地，可以使用例如在U.S.2007/0275447和U.S.2008/0057554中所述描述的食羧梭菌的标注为“P7”和“P11”的细菌菌株。

另一种特别合适的细菌可以是扬氏梭菌。特别地，可以在合成气至己酸的转化中使用从由下列各项组成的组中选择的菌株：扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌COL和扬氏梭菌O-52。这些菌株例如描述在WO 98/00558、WO 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988和ATCC 55989中。

产乙酸细菌可以与氢氧化细菌相联合地进行使用。在一个实例中，可以使用产乙酸细菌和氢氧化细菌两者用于从合成气产生己酸。在另一个实例中，可以仅使用产乙酸细菌用于代谢合成气以从合成气产生己酸。在另外一个实例中，可以在该反应中仅使用氢氧化细菌。

所述氢氧化细菌可以选自由下列各项组成的组：无色杆菌属(Achromobacter)、酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、产碱菌属(Alcaligenes)、鱼腥蓝细菌属(Anabena)、产液菌属(Aquifex)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、贪铜菌属、德克斯氏菌属(Derxia)、螺杆菌属(Helicobacter)、草螺菌属(Herbaspirillum)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、氢棒菌属(Hydrogenobaculum)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、氢嗜热菌属(Hydrogenothermus)、氢弧菌属(Hydrogenovibrio)、艾德昂菌属物种(Ideonella sp.)O1、克尔皮德氏菌(Kyrpidia)、生金球菌属(Metallosphaera)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、分枝杆菌属(Myobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、寡养菌属(Oligotropha)、副球菌属(Paracoccus)、暗单胞菌属(Pelomonas)、极单胞菌属(Polaromonas)、假单胞菌属、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、链霉菌属(Streptomyces)、荚硫菌属(Thiocapsa)、密螺旋体属(Treponema)、贪噬菌属(Variovorax)、黄色杆菌属(Xanthobacter)和沃特斯氏菌属(Wautersia)。

在从合成气产生己酸之中，可以使用细菌组合。可以与一种或多种氢氧化细菌相组合地存在多于一种产乙酸细菌。在另一个实例中，可以仅存在多于一种类型的产乙酸细菌。在另外一个实例中，可以仅存在多于一种氢氧化细菌。也称为羊油酸的己酸具有通式C₅H₁₁COOH。

根据本发明的任一方面的方法可以进一步包括使步骤A的己酸酯化以产生C₁-C₄己酸酯的步骤，并且使所述C₁-C₄己酸酯与步骤B的经基因工程改造的细胞相接触。特别地，所述酯化方法涉及使步骤A的己酸与至少一种C₁-C₄醇相接触以产生C₁-C₄己酸酯。

在另一个实例中，从合成气产生己酸可以涉及与能够通过使用乙醇-羧酸盐发酵来产生己酸的细菌氢氧化细菌相联合地使用产乙酸细菌。在一个实例中，可以使用产乙酸细菌和氢氧化细菌两者用于从合成气产生己酸。例如，可以与克氏梭菌同时地使用扬氏梭菌。在另一个实例中，可以仅使用产乙酸细菌用于代谢合成气以从合成气产生己酸。在该实例中，所述产乙酸细菌可以能够实施乙醇-羧酸盐发酵途径和Wood-Ljungdahl途径这两者。在一个实例中，所述产乙酸细菌可以是可以能够实施Wood-Ljungdahl途径和乙醇-羧酸盐发酵途径这两者的食羧梭菌。

所述乙醇-羧酸盐发酵途径至少详细地描述在Seedorf,H.等人,2008中。所述生物可以选自由下列各项组成的组：克氏梭菌、食羧梭菌等。这些微生物包括以其野生型形式不具有乙醇-羧酸盐发酵途径但由于基因工程改造而获得了该性状的微生物。特别地，所述微生物可以是克氏梭菌。

在一个实例中，根据本发明的任一方面的实施步骤A的细胞可以是经基因工程改造的微生物。所述经基因工程改造的细胞或微生物可以在遗传上不同于野生型细胞或微生物。在根据本发明的任一方面的经基因工程改造的微生物和野生型微生物之间的遗传差异可以在于：在经基因工程改造的微生物中存在可能在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等。在一个实例中，根据本发明的任一方面的经基因工程改造的微生物可以包含使得所述微生物能够产生己酸的酶。与本发明的经基因工程改造的微生物相关的野生型微生物可以不具有使得经基因工程改造的微生物能够产生己酸的酶的活性或者不具有可检测的使得经基因工程改造的微生物能够产生己酸的酶的活性。在本文中所使用的术语“经基因工程改造的微生物”可以与术语“经基因工程改造的细胞”互换使用。根据本发明的任一方面的基因工程改造在所述微生物的细胞上进行。

在一个实例中，所述微生物可以是表达至少一种选自E₁至E₁₀的酶的野生型生物，其中E₁是醇脱氢酶(adh)，E₂是乙醛脱氢酶(ald)，E₃是乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)，E₄是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)，E₅是3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)，E₆是丁酰-CoA脱氢酶(bcd)，E₇是电子传递黄素蛋白亚基(etf)，E₈是辅酶A转移酶(cat)，E₉是乙酸激酶(ack)，和E₁₀是磷酸转乙酰酶(pta)。特别地，根据本发明的任一方面的野生型微生物可以至少表达E₂、E₃和E₄。更加特别地，根据本发明的任一方面的野生型微生物可以至少表达E₄。

在另一个实例中，根据本发明的任一方面的微生物可以是这样的经基因工程改造的生物，其具有相对于野生型微生物而言增加的至少一种选自E₁至E₁₀的酶的表达，其中E₁是醇脱氢酶(adh)，E₂是乙醛脱氢酶(ald)，E₃是乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)，E₄是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)，E₅是3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)，E₆是丁酰-CoA脱氢酶(bcd)，E₇是电子传递黄素蛋白亚基(etf)，E₈是辅酶A转移酶(cat)，E₉是乙酸激酶(ack)，和E₁₀是磷酸转乙酰酶(pta)。特别地，根据本发明的任一方面的经基因工程改造的微生物可以至少表达酶E₂、E₃和E₄。更加特别地，根据本发明的任一方面的经基因工程改造的微生物可以至少表达E₄。酶E₁至E₁₀可以分离自克氏梭菌。

根据本发明的任一方面，E₁可以是乙醇脱氢酶。特别地，E₁可以选自由下列各项组成的组：醇脱氢酶1、醇脱氢酶2、醇脱氢酶3、醇脱氢酶B及其组合。更特别地，E₁可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_1075、CKL_1077、CKL_1078、CKL_1067、CKL_2967、CKL_2978、CKL_3000、CKL_3425和CKL_2065。更加特别地，E₁可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_1075、CKL_1077、CKL_1078和CKL_1067。

根据本发明的任一方面，E₂可以是乙醛脱氢酶。特别地，E₂可以选自由下列各项组成的组：乙醛脱氢酶1、醇脱氢酶2及其组合。特别地，E₂可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_1074、CKL_1076等。更特别地，E₂可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_1074和CKL_1076。

根据本发明的任一方面，E₃可以选自由下列各项组成的组：乙酰乙酰-CoA硫解酶A1、乙酰乙酰-CoA硫解酶A2、乙酰乙酰-CoA硫解酶A3及其组合。特别地，E₃可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_3696、CKL_3697、CKL_3698等。更特别地，E₃可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_3696、CKL_3697和CKL_3698。

根据本发明的任一方面，E₄可以是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶1、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶2等。特别地，E₄可以包含与多肽CKL_0458、CKL_2795等的至少50％的序列同一性。更特别地，E₄可以包括与多肽CKL_0458或CKL_2795具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽。

根据本发明的任一方面，E₅可以是3-羟基丁酰-CoA脱水酶1、3-羟基丁酰-CoA脱水酶2及其组合。特别地，E₅可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_0454、CKL_2527等。更特别地，E₅可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_0454和CKL_2527。

根据本发明的任一方面，E₆可以选自由下列各项组成的组：丁酰-CoA脱氢酶1、丁酰-CoA脱氢酶2等。特别地，E₆可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_0455、CKL_0633等。更特别地，E₆可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_0455和CKL_0633。

根据本发明的任一方面，E₇可以选自由下列各项组成的组：电子传递黄素蛋白α亚基1、电子传递黄素蛋白α亚基2、电子传递黄素蛋白β亚基1和电子传递黄素蛋白β亚基2。特别地，E₇可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_3516、CKL_3517、CKL_0456、CKL_0457等。更特别地，E₇可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_3516、CKL_3517、CKL_0456和CKL_0457。

根据本发明的任一方面，E₈可以是辅酶转移酶(cat)。特别地，E₈可以选自由下列各项组成的组：丁酰-CoA:乙酸CoA转移酶、琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶、4-羟基丁酰-CoA:辅酶A转移酶等。更特别地，E₈可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_3595、CKL_3016、CKL_3018等。更特别地，E₈可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_3595、CKL_3016和CKL_3018。

根据本发明的任一方面，E₉可以是乙酸激酶A(ack A)。特别地，E₉可以包含与CKL_1391等的多肽序列的至少50％的序列同一性。更特别地，E₉可以包括与CKL_1391的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽。

根据本发明的任一方面，E₁₀可以是磷酸转乙酰酶(pta)。特别地，E₁₀可以包含与CKL_1390等的多肽序列的至少50％的序列同一性。更特别地，E₁₀可以包括与CKL_1390的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽。

在一个实例中，野生型的或经基因工程改造的微生物表达E₁-E₁₀。特别地，根据本发明的任一方面的微生物可以具有相对于野生型微生物而言增加的E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀或其组合的表达。在一个实例中，所述经基因工程改造的微生物具有相对于野生型微生物而言增加的E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈、E₉和E₁₀的表达。更特别地，酶E₁-E₁₀中的任何酶的组合可以存在于所述生物中以使得能够产生至少一种羧酸。在一个实例中，根据本发明的任一方面所使用的经基因工程改造的生物可以包含酶E₁-E₁₀中的任何酶的组合，其使得所述生物能够同时产生至少一种或两种或三种类型的羧酸。例如，所述微生物可以能够同时产生己酸、丁酸和/或乙酸。类似地，所述微生物可以经基因工程改造以表达酶E₁-E₁₀的组合，其使得所述生物能够产生单一类型的羧酸或各种各样的羧酸。在所有上面的情况下，所述微生物可以是以其野生型形式的或者是经基因工程改造的。

在一个实例中，根据本发明的任一方面的经基因工程改造的微生物具有相对于野生型微生物而言增加的氢化酶成熟蛋白和/或电子传递复合物蛋白的表达。特别地，所述氢化酶成熟蛋白(hyd)可以选自由下列各项组成的组：hydE、hydF或hydG。特别地，所述hyd可以包含与从由下列各项组成的组中选择的多肽的至少50％的序列同一性：CKL_0605、CKL_2330、CKL_3829等。更特别地，根据本发明的任一方面所使用的hyd可以包括与从由下列各项组成的组中选择的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽：CKL_0605、CKL_2330和CKL_3829。

在整个本申请中，除非有相反的说明，任何数据库代码均是指从NCBI数据库(更特别地，在2014年6月12日在线的版本)可得的序列，并且如果这样的序列为核苷酸序列，包括通过翻译该核苷酸序列而获得的多肽序列。

根据本发明的任一方面的方法可以进一步包括使步骤A的己酸酯化以产生C₁-C₄己酸酯的步骤，并且使所述C₁-C₄己酸酯与步骤B的经基因工程改造的细胞相接触。

在一个实例中，所述酯化方法可以是化学过程。本领域中已知的任何化学反应可以用于将己酸转化为C₁-C₄醇己酸酯。更特别地，所述方法涉及使己酸与醇反应。可以使己酸与至少一种短链碳醇相接触以产生己酸酯。特别地，所述短链碳醇可以是C₁-C₄醇。所述短链醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇和/或丁醇。特别地，所述醇可以选自由甲醇、乙醇、异丙醇和/或丁醇组成的组，以分别产生己酸甲酯、己酸乙酯、己酸丙酯或己酸丁酯。该反应可以在至少一种催化剂存在下发生。所述催化剂通常为酸性催化剂例如磺酸，碱例如碱金属氢氧化物或碱金属的醇盐，金属氧化物，或者金属烷基化物。特别地，己酸可以被代谢，从而形成C₁-C₄醇己酸酯。特别地，所述催化剂可以是ZrOCl₂·8H₂O。

在一个实例中，己酸与甲醇在ZrOCl₂·8H₂O存在下进行反应，从而产生己酸甲酯。

根据本发明的任一方面的方法可以包括在使己酸与至少一种C₁-C₄醇相接触之前首先对从合成气产生的己酸进行提取的步骤。可以使用本领域中已知用于提取己酸的任何方法。特别地，己酸提取方法的一个例子提供在Byoung,S.J等人,2013的第2.3节之中。另一个例子可以是在Kieun C.等人,2013中的“Extraction Model”这一节之下所公开的方法。

在另一个实例中，所述酯化方法可以是生物化学过程，其中至少一种酶可以参与催化该酯化过程。用于酯化的酶可以选自由下列各项组成的组：硫酯酶、酰基-CoA合成酶、酯合酶和脂肪酶。这些酶中的至少一种可以在本发明的方法的步骤A的细菌中表达。在一个实例中，所述产乙酸细菌和/或氢氧化细菌可以过表达能够酯化己酸的酯化酶。在另一个实例中，在本发明的方法的步骤A之后可以包括另外的表达酯化酶的细胞以将己酸酯化为己酸酯。

可以将来自本发明的方法的步骤A的己酸直接转化为氨基己酸和/或氨基己酸酯。在另一个实例中，可以首先将来自本发明的方法的步骤A的己酸通过化学方法或生物化学方法酯化为己酸酯。然后，使该己酸酯与本发明的方法的步骤B的经基因工程改造的细胞相接触。在一个实例中，顺次地或同时地以组合方式进行化学过程和生物化学过程这两者，以酯化己酸。

然后，可以使所述C₁-C₄醇己酸酯与经基因工程改造的细胞相接触以产生氨基己酸和/或氨基己酸酯，其中所述经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的至少一种从由烷烃单加氧酶、醇脱氢酶和ω-氨基转移酶组成的组中选择的酶的活性。

根据本发明的任一方面的细胞相对于其野生型而言已经进行了基因工程改造，从而相比于其野生型而言，它能够从C₁-C₄醇己酸酯开始产生更多的氨基己酸和/或氨基己酸酯。这样的细胞可以用于通过发酵从C₁-C₄醇己酸酯产生氨基己酸和/或来自氨基己酸的氨基己酸酯。

短语“相比于其野生型而言，它能够从己酸甲酯开始产生更多的氨基己酸和/或氨基己酸酯”也应用于这样的情况：即所述经基因工程改造的细胞的野生型不能够形成任何氨基己酸和/或氨基己酸酯用以开始。还包括至少不产生可检测量的这些化合物的野生型细胞，并且仅在对野生型进行基因工程改造以产生在本发明的任何方法中所使用的细胞之后才形成可检测量的这些化合物。

在本文中与细胞相联合地使用的短语“野生型”可以表示具有以如在野外天然地看到的那样的形式的基因组组成的细胞。该术语可以可应用于整个细胞以及独个基因。因此，术语“野生型”不包括这样的细胞或这样的基因，其中基因序列已经至少部分地被人通过使用重组方法进行了改变。

特别地，所述经基因工程改造的细胞可以已经进行了基因工程改造，从而在限定的时间间隔内，例如在2小时内，特别地在8小时内，和更特别地在24小时内，它所形成的氨基己酸和/或氨基己酸酯是野生型细胞的至少两倍，特别地至少10倍，更特别地至少100、1000或10000倍。产物形成的增加可以例如通过下述方式来测定：将根据本发明的方法所使用的细胞和野生型细胞各自分开地在合适的营养培养基中在相同的条件(相同的细胞密度，相同的营养培养基，相同的培养条件)下培养经过指定的时间间隔，和然后测定在所述营养培养基中的靶产物(氨基己酸和/或氨基己酸酯)的量。

根据本发明的方法所使用的细胞可以是原核细胞或真核细胞。它们可以是哺乳动物细胞(例如，人细胞或非人细胞)，植物细胞，或者微生物例如酵母、真菌或细菌。特别地，所述微生物可以是细菌。更特别地，所述微生物可以是酵母。

合适的细菌、酵母或真菌可以是已经作为细菌、酵母或真菌菌株保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，缩写为DSMZ),Brunswick,Germany中的那些细菌、酵母或真菌。可以在本发明的方法中使用的合适的细菌可以属于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm处所列出的类别。可以在本发明的方法中使用的合适的酵母可以属于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm处所列出的类别。可以在本发明的方法中使用的合适的真菌可以属于在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm处所列出的类别。

特别地，可以进行基因工程改造和在本发明的方法中使用的细胞可以选自棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、糖酵母属、埃希氏菌属、发酵单胞菌属(Zymomonas)、耶氏酵母属、甲基杆菌属(Methylobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)和梭菌属。更特别地，可以在本发明的方法中使用的细胞可以选自由下列各项组成的组：大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和恶臭假单胞菌。更加特别地，可以在本发明的方法中使用的细胞可以是大肠杆菌。大肠杆菌可以是本领域中已知的任何菌株。特别地，所述菌株可以是JM101。

特别地，相比于其野生型而言，可以在根据本发明的方法的经基因工程改造的细胞中发现增加的下列酶中的至少一种酶的活性：

i)烷烃单加氧酶，其催化羧酸或羧酸酯转化为相应的ω-羟基羧酸和/或ω-羟基羧酸酯；

ii)醇脱氢酶，其催化ω-羟基羧酸和/或ω-羟基羧酸酯转化为相应的ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯；和/或

iii)ω-氨基转移酶，其催化ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯转化为相应的ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸酯。

在本文中所使用的短语“增加的酶的活性”是指增加的细胞内活性。基本上，酶活性的增加可以通过下列方式来实现：增加编码所述酶的基因序列的拷贝数，使用强启动子，或者采用编码具有增加的活性的相应的酶的基因或等位基因，和任选地将这些措施相组合。例如，用包含所希望的基因、该基因的等位基因或其部分的载体和使所述基因的表达成为可能的载体，通过转化、转导、接合或这些方法的组合来产生在根据本发明的方法中所使用的经基因工程改造的细胞。特别地，异源表达通过将所述基因或等位基因整合到细胞的染色体中或整合到染色体外复制型载体中来实现。

根据本发明的任一方面的细胞按照本领域中已知的任何方法来进行遗传转化。特别地，所述细胞可以按照在WO/2009/077461中所公开的方法来产生。

在本文中所使用的短语“经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的酶的活性”是指各自酶的活性的增加程度为至少2倍，特别地至少10倍，更特别地至少100倍，更加特别地至少1000倍，和更加特别地至少10000倍。

根据本发明的任一方面，所述细胞可以具有仅烷烃单加氧酶、醇脱氢酶或ω-氨基转移酶的活性的增加，或者其组合的活性的增加。特别地，活性的增加可以在烷烃单加氧酶和醇脱氢酶，或者烷烃单加氧酶和ω-氨基转移酶，或者醇脱氢酶和ω-氨基转移酶中。特别地，所述细胞可以具有烷烃单加氧酶、醇脱氢酶或ω-氨基转移酶的活性的增加。

所述烷烃单加氧酶可以由来自恶臭假单胞菌GPO1的AlkBGT基因编码。AlkBGT基因序列的分离例如描述在van Beilen等人，2002中。进一步地，细胞色素P450单加氧酶，特别地来自假丝酵母属，例如来自热带假丝酵母(Candida tropicalis)，或来自植物，例如来自鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)的细胞色素P450单加氧酶也可以用作烷烃单加氧酶。合适的来自热带假丝酵母的细胞色素P450单加氧酶的基因序列例如公开在WO00/20566中，而合适的来自鹰嘴豆的细胞色素P450单加氧酶的基因序列例如给出在Barz等人,2000中。AlkB基因的其他同源物也给出在van Beilen等人,2003中。关于二甲苯单加氧酶的合适的基因例如为xylM或xylA基因，并且包含这两个基因的质粒具有GENBANK登录号M37480。特别地，编码烷烃单加氧酶的基因序列可以来自食油假单胞菌，并且可以包含或可以是SEQ ID NO.1的序列(表1)。

所述醇脱氢酶可以由来自恶臭假单胞菌GPO1、博尔库姆食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)和反硝化玫瑰杆菌(Roseobacter denitrificans)的AlkJ基因(EC 1.1.99-2)编码。特别地，AlkJ基因可以由食油假单胞菌编码。关于由AlkJ基因所编码的醇脱氢酶的基因序列可以例如在KEGG基因数据库中找到。特别地，编码AlkJ基因的基因序列可以包含或可以是SEQ ID NO:2(表1)。

所述ω-氨基转移酶可以选自在US-A-2007/0092957中通过序列编号248、250、252和254进行表征的ω-氨基转移酶。

在另一个实例中，所述ω-氨基转移酶可以分离自植物。所述来自植物的ω-氨基转移酶可以选自由下列各项组成的组：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、燕麦(Avenasativa)、甜菜(Beta vulgaris)、大豆(Glycine max)、大麦(Hordeum vulgare)、日本百脉根(Lotus japonicus)、番茄(Solanum lycopersicum)、木薯(Manihot esculenta)、稻(Oryza sativa)、普通小麦(Traeticum aestivum)、玉蜀黍(Zea mays)、菠菜(Spinaciaoleracea)、点纹疆南星(Arum maculatum)、多年生山靛(Mercurialis perennis)和异株荨麻(Urtica dioica)。

特别地，可以在用于本发明的方法的重组细胞中使用来自紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)DSM30191的ω-氨基转移酶CV2025。更特别地，所述ω-氨基转移酶为来自紫色色杆菌DSM30191的ω-氨基转移酶(Kaulmann等人,2007)，其由根据SEQID NO:3的基因序列(表1)编码。

表1.用于对根据本发明的任一方面的细胞进行基因工程改造的基因的核苷酸序列

由与根据SEQ ID NO:1、2和3的序列具有90％、95％、99％和特别地100％同一性的核酸所编码的酶在本发明的方法中是合适的。相对于SEQ ID NO:1-3而言的“核苷酸同一性”通过使用已知的方法来测定。通常，考虑到特殊的要求，使用特殊的具有算法的计算机程序。可以用于测定同一性的方法首先产生在待比较的序列之间的最大一致。用于测定同一性的计算机程序包括但不限于GCG软件包，其包括GAP(Deveroy,J.等人,1984)，以及BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.等人,1990)。BLAST程序可以从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))和从其他来源(BLASTManual,Altschul S.等人,1990)获得。

众所周知的Smith-Waterman算法也可以用于测定核苷酸同一性。

用于核苷酸比较的参数可以包括下列：

-Needleman和Wunsch算法，1970，

-比较矩阵

匹配＝+10

错配＝0

缺口罚分＝50

缺口长度罚分＝3。

GAP程序也适合于用上面给出的参数进行使用。这些参数通常是在核苷酸序列比较中的缺省参数。

此外，来自β-Ala:丙酮酸氨基转移酶亚群的酶是合适的。这些包括但不限于例如来自下列菌株的氨基转移酶：恶臭假单胞菌W619(gi:119860707，gi:119855857，gi:119856278)、恶臭假单胞菌KT2440(gi:24984391)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01(gi 15595330，gi:15600506，gi 15595418，gi 9951072)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)(gi:3319731)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)MA4680(gi:29831094，gi:29829154)和紫色色杆菌ATCC12472(gi34102747)。在整个本申请中，除非有相反的说明，任何数据库代码均是指从NCBI数据库(更特别地，在2014年2月20日在线的版本)可得的序列，并且如果这样的序列为核苷酸序列，包括通过翻译该核苷酸序列而获得的多肽序列。

根据本发明的任一方面的方法可以进一步包括将氨基己酸酯转化为氨基己酸的步骤。特别地，ω-氨基己酸酯转化为相应的ω-氨基己酸。根据本发明的方法的重组细胞可以具有增加的催化ω-氨基己酸酯转化为相应的ω-氨基己酸的酶的活性，所述酶可以是酯酶，其可以由细胞分泌。由细胞分泌酯酶具有这样的优点，即酯键仅在细胞外进行切割。由于ω-氨基己酸酯的膜通透性相比于ω-氨基己酸而言是更好的，因此ω-氨基己酸酯离开细胞并且进入在细胞周围的营养培养基中。那么在细胞外发现的酯酶将会在代谢催化ω-氨基己酸酯至ω-氨基己酸的转化中是更有效的。

特别地，所使用的酯酶可以是脂肪酶。在一个实例中，合适的脂肪酶可以是来自荧光假单胞菌HU380的脂肪酶LipA(ACC代码Q76D26，Kojima和Shimizu,2003)。为了确保将酯酶分泌到细胞外，可以以技术人员已知的方式给酯酶提供相应的信号序列，其建立分泌。如果例如在大肠杆菌中过表达来自荧光假单胞菌HU380的脂肪酶LipA，那么可以有利地给它提供来自EstA的信号序列，所述EstA是在铜绿假单胞菌的细胞表面上天然出现的酯酶(Becker等人,2005)。其他合适的酶为来自南极假丝酵母(C.antarctica)、米黑毛霉(M.miehei)和洋葱假单胞菌(P.cepacia)的脂肪酶(Vaysse等人,2002)。

备选地，分泌出的ω-氨基己酸酯也可以常规地进行切割，以获得ω-氨基己酸，这例如通过用氢氧化物(例如氢氧化钠)的水溶液来进行ω-氨基己酸酯的皂化即水解。

在一个实例中，可以将ω-氨基己酸转化为内酰胺。内酰胺是环状酰胺，其可以成为关于形成聚酰胺的基础。特别地，内酰胺的开环聚合可以导致形成尼龙。更特别地，可以使6-己内酰胺进行聚合以形成尼龙-6。

在ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺的产生之中，进行下列的工艺步骤：

I)使根据本发明的任一方面的重组细胞与包含C₁-C₄己酸酯的培养基或者与邻近包含C₁-C₄己酸酯的有机相的培养基在使得所述细胞能够从C₁-C₄己酸酯形成ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺的条件下相接触；和/或

II)分离所得的ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺。

可以使根据本发明的方法进行使用的经基因工程改造的细胞与营养培养基相接触，并因此连续地或不连续地(在分批过程中或者在补料分批过程中或者在重复的补料分批过程中)进行培养，以为了产生ω-氨基己酸或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺。半连续过程也是可想到的，如在GB1009370A中所描述的。已知的培养方法描述在Chmiel 的教科书,1991中或描述在Storhas的教科书,1994中。

待使用的培养基必须是对于特定菌株的要求来说合适的。用于各种微生物的培养基的描述给出在“Manual of Methods for General Bacteriology”中。

可以将有机含氮化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)用作氮源。氮源可以分开地或作为混合物进行使用。

在一个实例中，根据本发明的任一方面，至少在形成ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺的阶段期间，在步骤I)中所使用的培养基包含氨基基团供体，例如氨或铵离子或甚至氨基酸(尽管特别地，丙氨酸或天冬氨酸)，其在由氨基转移酶催化的ω-氧代己酸和/或ω-氧代己酸酯至相应的ω-氨基己酸和/或ω-氨基己酸酯的转化中作为胺供体起作用。

可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠的盐作为磷的来源。另外，所述培养基可以包含生长所需要的金属盐，例如硫酸镁和/或硫酸铁。除了上面提及的物质外，还可以使用必需生长物质，例如氨基酸和/或维生素。还可以向所述培养基添加合适的前体。可以将上面的物质以单一制备物的形式添加至培养物，或者它们可以在培养期间以合适的方式进行提供。

可以以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨气、氨水和/或酸性化合物例如磷酸或硫酸，以用于控制培养物的pH。可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯，以控制泡沫形成。质粒稳定性可以通过在培养基中使用合适的抗生素来维持。有氧条件可以通过使用氧气或含氧气体混合物例如空气来维持，可以将它们供给到培养基中。培养物的温度可以在20℃至45℃或者25℃至40℃的范围内。

在一个实例中，在根据本发明的用于产生ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺的方法中，在补充有氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素的无机盐培养基中使用衍生自大肠杆菌的重组细胞(按照Riesenberg等人,1990)。

在一个实例中，在根据本发明的方法中，首先培养细胞，以为了在不包含C₁-C₄己酸酯的营养培养基中进行生物质产生。仅在已经获得了一定的生物质之后才将C₁-C₄己酸酯添加至营养培养基和/或使细胞与包含C₁-C₄己酸酯的新的营养培养基相接触。在这方面，在形成ω-氨基羧酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺期间存在的C₁-C₄己酸酯的量可以在1至200g/l的范围内，尤其是在20至200g/l的范围内。

根据本发明的一个实例，根据本发明的方法在包含水相和有机相的两相系统中进行。在步骤I)中由重组细胞来进行的ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺的形成在水相中发生。所得的ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺在有机相中积累。以该方式，可能的是，原位提取出所得的ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺。

作为有机相，可能的是，使用中等链长的烷烃和具有大于4的logP值(很少的泡沫形成)的那些烷烃，或者在物理上相似的芳香族化合物或芳香酯。

在根据本发明的方法的步骤II)中，任选地分离所得的ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺，并且对于该分离，其可以在两段纯化过程中发生，所述两段纯化过程包括：

a)提取步骤，其中从培养基中提取出ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺，和

b)精细纯化步骤，其中通过蒸馏过程或选择性结晶来进一步纯化在步骤a)中所获得的提取物，从而获得纯度为至少99.8％的ω-氨基己酸相、ω-氨基己酸酯相和/或内酰胺相。

特别地，步骤a)中的提取可以被设计为所谓的“原位”提取，其中同时地进行根据本发明的用于产生ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺的方法的步骤I)和II)。

步骤II)中的精细纯化可以例如通过蒸馏或结晶来进行。

在一个实例中，可以通过使用本领域中已知的在化学上类似的程序来将氨基己酸酯转化为氨基己酸。

其他酶可以催化ω-氨基羧酸转化为相应的内酰胺，并且在此如果该酶由细胞分泌，那么这也可以是有利的。以该方式，可能的是，将由细胞直接形成的ω-氨基羧酸或仅在ω-氨基羧酸酯的细胞外切割后才形成的ω-氨基羧酸转化为相应的内酰胺，因此任选地有助于靶产物的纯化。

在另一个实例中，直接催化氨基己酸以形成尼龙。尼龙是通常用于描述脂肪族聚酰胺的术语。常见的脂肪族聚酰胺例如尼龙6、尼龙6,6和尼龙6,10展示出高的机械强度、韧性和化学耐性，并且可以进行牵拉以形成高强度纤维。所述尼龙可以选自由下列各项组成的组：尼龙-6,6、尼龙-6、尼龙-6,9、尼龙-6,10和尼龙-6,12。特别地，所述尼龙可以是尼龙-6,6、尼龙-6、尼龙-6,9、尼龙-6,10或尼龙-6,12。更加特别地，所述尼龙可以是尼龙-6。在一个实例中，可以在反应中形成多于一种类型的尼龙。

可以通过使用本领域中已知的任何方法，从氨基己酸和/或氨基己酸酯产生尼龙。在一个实例中，可以从衍生自ω-氨基己酸的内酰胺生产尼龙。

从内酰胺产生聚酰胺可以通过众所周知的方法来进行，所述方法例如描述在DE1495198、DE2558480、EP0129196中，或者还描述在“Polymerization Processes”,1977中。

在另一个实例中，尼龙6可以通过ω-氨基己酸和/或衍生自其的内酰胺的缩聚而直接产生。

特别地，所述尼龙可以以直至至少10重量％、至少25重量％、至少50重量％或至少75重量％的程度基于ω-氨基己酸、ω-氨基己酸酯和/或衍生自ω-氨基己酸的内酰胺。

根据本发明的另一个方面，提供了通过本发明的方法而获得的氨基己酸和/或氨基己酸酯。还提供了衍生自根据本发明的方法而产生的氨基己酸的内酰胺。

根据本发明的一个方面，提供了用于生产基于氨基己酸和/或氨基己酸酯的尼龙的方法，该方法包括：

-通过根据本发明的任一方面的方法来产生氨基己酸和/或氨基己酸酯；和

-使所述氨基己酸和/或氨基己酸酯进行聚合，从而获得尼龙。

根据另外一个方面，提供了通过根据本发明的任一方面的方法而获得的尼龙。

附图简述

图1显示了用于烷烃单加氧酶(AlkBGT)的表达载体pBT10(Schrewe等人,2011)(A)和用于醇脱氢酶AlkJ的表达载体PJ10(B)。

图2是显示了用大肠杆菌JM101(pBT10)来进行的己酸至己酸甲酯的全细胞反应(羟基化)的图，这通过测量己酸甲酯、6-羟基己酸甲酯(6-羟基己酸甲基酯)和氧代己酸甲酯(6-氧代己酸甲基酯)的总浓度。生物质浓度：0.68±0.02g_CDW L^-1，在包含1％(w/v)葡萄糖的KPi-缓冲液(pH 7.4)中。每个数据从两次生物学重复中以一式两份进行测量。

图3是显示了在全细胞反应中比活性的测量结果的图，其中步骤1是用大肠杆菌JM101(pBT10)来进行的己酸至己酸甲酯的羟基化的测量结果，和步骤2是醇氧化步骤的测量结果。生物质浓度：0.68±0.02g_CDW L^-1，在包含1％(w/v)葡萄糖的KPi-缓冲液(pH 7.4)中。每个数据从两次生物学重复中以一式两份进行测量。

图4是显示了用大肠杆菌JM101(pBT10)来进行的6-羟基己酸甲酯至氧代己酸甲酯的全细胞反应的图，这通过测量6-羟基己酸甲酯(6-羟基己酸甲基酯)和氧代己酸甲酯(6-氧代己酸甲基酯)的总浓度。生物质浓度：0.86g_CDW L^-1，在包含1％(w/v)葡萄糖的KPi-缓冲液(pH 7.4)中。每个数据从两次生物学重复中以一式两份进行测量。

图5是显示了在醇氧化步骤的全细胞反应中比活性的测量结果(6-羟基己酸甲酯(6-羟基己酸甲基酯)和氧代己酸甲酯(6-氧代己酸甲基酯))的图。生物质浓度：0.86g_CDW L^-1，在包含1％(w/v)葡萄糖的KPi-缓冲液(pH 7.4)中。每个数据从两次生物学重复中以一式两份进行测量。

图6是显示了用大肠杆菌JM101(pJ10)来进行的6-羟基己酸甲酯至氧代己酸甲酯的全细胞反应的图，这通过测量6-羟基己酸甲酯(6-羟基己酸甲基酯)和氧代己酸甲酯(6-氧代己酸甲基酯)的总浓度。生物质浓度：0.91g_CDW L^-1，在包含1％(w/v)葡萄糖的KPi-缓冲液(pH 7.4)中。每个数据从两次生物学重复中以一式两份进行测量。

图7是显示了在用大肠杆菌JM101(pJ10)来进行的6-羟基己酸甲酯至氧代己酸甲酯的羟基化的全细胞反应中比活性的测量结果的图。生物质浓度：0.91g_CDW L^-1，在包含1％(w/v)葡萄糖的KPi-缓冲液(pH 7.4)中。每个数据从两次生物学重复中以一式两份进行测量。

图8显示了起始质粒pGEc47，其用作用于扩增alkBGTS的模板。

图9显示了所使用的引物以及所得的PCR产物alkBFG和alkT。

实施例

上面描述了优选的实施方案，其如本领域技术人员将会理解的，可以经历在设计、构建或操作方面的改变或修饰，而不背离权利要求书的范围。例如，这些改变旨在由权利要求书的范围所涵盖。

实施例1

从合成气生产乙醇和乙酸或其盐

对于合成气(66％H₂，33％CO₂)至乙醇和乙酸或其盐的生物转化，使用扬氏梭菌这种细菌。所有培养步骤在可以用丁基橡胶塞子气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于扬氏梭菌的细胞培养，使5mL冷冻培养物在50ml的ATCC1754培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0，20g/L MES，1g/L酵母提取物，0.8g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.1g/L KCl，0.1g/L KH₂PO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L CaCl₂·2H₂O，20mg/L氨三乙酸，10mg/LMnSO₄·H₂O，8mg/L(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O，2mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.2mg/LCuCl₂·2H₂O，0.2mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.2mg/L NiCl₂·6H₂O，0.2mg/L Na₂SeO₄，0.2mg/LNa₂WO₄·2H₂O，20g/L d-生物素，20μg/L叶酸，100μg/L盐酸吡哆醇，50g/L盐酸硫胺素·H₂O，50g/L核黄素，50g/L烟酸，50g/L泛酸钙，1g/L维生素B12，50g/L对氨基苯甲酸盐，50μg/L硫辛酸，大约67.5mg/L NaOH，400mg/L盐酸L-半胱氨酸，400mg/L Na₂S·9H₂O，5g/L果糖)中厌氧地进行生长。从该培养物中，取10ml并接种在100ml的ATCC1754培养基中以开始形成生长培养物。将该生长培养物在35℃下温育3天。

对于生产阶段，从生长培养物中收获细胞，并将其用生产培养基进行洗涤。随后，在耐火的无菌玻璃瓶(体积250ml)中将细胞粒状沉淀重悬浮在75ml的生产培养基(DM4培养基：pH 5.8，15mg/l FeCl₂·4H₂O，2g/l(NH₄)H₂PO₄，0.2g/l NaCl，0.15g/l KCl，0.5mg/l刃天青，3mg/l H₃BO₃，2mg/l CoCl₂·6H₂O，1mg/l ZnSO₄·7H₂O，300μg/l Na₂MoO₄·2H₂O，300μg/lMnSO₄·H₂O，200μg/l NiCl₂·6H₂O，100μg/L CuCl₂·2H₂O，100μg/l Na₂SeO₃，106μg/l d-生物素，5μg/l叶酸，2.5μg/l盐酸吡哆醇，266μg/l盐酸硫胺素，12.5μg/l核黄素，12.5μg/l烟酸，413μg/l泛酸钙，12.5μg/l维生素B₁₂，12.5μg/l对氨基苯甲酸盐，15.0μg/l硫辛酸，0.5g/l MgCl₂·7H₂O，0.2g/l CaCl₂·2H₂O)中，并且开始扬氏梭菌的生产阶段。将生产培养物与合成气(66％H₂，33％CO₂，1.8巴)一起用丁基橡胶塞子盖住并静置113.75小时，并且在35℃下进行温育和在100rpm下进行摇动。在培养期间，气相每天发生变化，并且每天取样以测定光密度和所产生的不同的分析物(通过NMR)。结果显示，所产生的乙酸盐的量从0.02g/l增加至1.2g/l，和所产生的乙醇的量从0.01g/l增加至0.1g/l。无法检测到己酸和丁酸。

实施例2

从合成气生产丁酸和己酸

对于合成气至丁酸和己酸的生物转化，在生产阶段中使用扬氏梭菌和克氏梭菌的共培养物。扬氏梭菌将来自环境大气的H₂和CO₂转化为乙酸或其盐和乙醇。这些产物被克氏梭菌从水相中吸收并转化为丁酸和己酸。

所有培养步骤在可以用丁基橡胶塞子气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于扬氏梭菌的细胞培养，使10mL冷冻培养物在100ml的ATCC1754培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0，20g/L MES，1g/L酵母提取物，0.8g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.1g/LKCl，0.1g/L KH₂PO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L CaCl₂·2H₂O，20mg/L氨三乙酸，10mg/LMnSO₄·H₂O，8mg/L(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O，2mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.2mg/LCuCl₂·2H₂O，0.2mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.2mg/L NiCl₂·6H₂O，0.2mg/L Na₂SeO₄，0.2mg/LNa₂WO₄·2H₂O，20g/L d-生物素，20μg/L叶酸，100μg/L盐酸吡哆醇，50g/L盐酸硫胺素·H₂O，50g/L核黄素，50g/L烟酸，50g/L泛酸钙，1g/L维生素B12，50g/L对氨基苯甲酸盐，50μg/L硫辛酸，大约67.5mg/L NaOH，400mg/L盐酸L-半胱氨酸，400mg/L Na₂S·9H₂O，5g/L果糖)中厌氧地进行生长。将该生长培养物在35℃下温育2天。

对于克氏梭菌的细胞培养，使10mL的克氏梭菌的连续培养物在100mL的DMSZ52培养基(DSMZ52培养基：pH＝6.98，10g/L CH₃COOK，0.31g/L K₂HPO₄，0.23g/L KH₂PO₄，0.25g/lNH₄Cl，0.20 g/l MgSO₄·7H₂O，1g/L酵母提取物，0.50mg/L刃天青，10μl/l HCl(25％，7.7M)，1.5mg/L FeCl₂·4H₂O，70g/L ZnCl₂·7H₂O，100g/L MnCl₂·4H₂O，6g/L H₃BO₃，190μg/L COCl₂·6H₂O，2g/L CuCl₂·6H₂O，24g/L NiCl₂·6H₂O，36g/L Na₂MO₄·2H₂O，0.5mg/LNaOH，3g/L Na₂SeO₃·5H₂O，4μg/L Na₂WO₄·2H₂O，100g/L维生素B12，80g/L对氨基苯甲酸，20g/L D(+)生物素，200μg/L烟酸，100g/L D-泛酸钙，300μg/L盐酸吡哆醇，200μl/l盐酸硫胺素·2H₂O，20mL/L乙醇，2.5g/L NaHCO₃，0.25g/L盐酸半胱氨酸·H₂O，0.25g/L Na₂S·9H₂O)中进行生长。将该生长培养物在35℃下温育2天。

对于生产阶段，分开地从所述两种生长培养物中收获细胞，并将其用生产培养基进行洗涤。随后，在耐火的无菌玻璃瓶(体积250ml)中将每个细胞粒状沉淀重悬浮在35ml的生产培养基(PETC改良培养基：pH 6.0，10g/l MES，2.4g/l NaCl，3g/l NH₄Cl，0.3g/l KCl，0.3g/l KH₂PO₄，0.6g/l MgSO₄·7H₂O，0.12g/l CaCl₂·2H₂O，20mg/l氨三乙酸，10mg/lMnSO₄·H₂O，8mg/l(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O，2mg/l CoCl₂·6H₂O，2mg/l ZnSO₄·7H₂O，0.2mg/lCuCl₂·2H₂O，0.2mg/l Na₂MoO₄·2H₂O，0.2mg/l NiCl₂·6H₂O，0.2mg/l Na₂SeO₄，0.2mg/lNa₂WO₄·2H₂O，2g/l d-生物素，2g/l叶酸，10g/l盐酸吡哆醇，5g/l盐酸硫胺素·H₂O，5g/l核黄素，5g/l盐酸，5g/l泛酸钙，5μg/L维生素B12，5g/l对氨基苯甲酸盐，5μg/l硫辛酸，10g/lMESNA，大约67.5mg/l NaOH，300mg/l盐酸半胱氨酸·H₂O，300mg/l Na₂S·9H₂O)中，并且开始扬氏梭菌和克氏梭菌的共生产。将生产培养物与合成气(66％H₂，33％完全经¹³C标记的CO₂，1.8巴)一起用丁基橡胶塞子盖住并静置191小时，并且在35℃下进行温育和在100rpm下进行摇动。在培养期间，气相每天发生变化，并且每天取样以测定光密度和所产生的不同的分析物(通过NMR)。

通过使用来自该混合生产的经无菌过滤的上清液的半定量¹H-NMR光谱学来测定产物的量。将样品按照磷酸盐缓冲液进行稀释(在规定的D₂O中)并用水抑制进行测量。在具有或不具有¹³C偶合抑制的情况下进行测量。作为内部定量标准物，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(TSP)。

结果显示，所产生的乙酸盐的量从0.05g/l增加至1.7g/l(所产生的总乙酸盐的93mol％是经¹³C标记的)和所产生的乙醇的量从0.05g/l增加至0.12g/l(所产生的总乙醇的92mol％是经¹³C标记的)。另外，己酸的浓度从0.02g/l增加至0.13g/l(所产生的总己酸的63mol％是经¹³C标记的)和丁酸从0.01g/l增加至0.07g/l(所产生的总丁酸的63mol％是经¹³C标记的)。这证实了，大百分比的所产生的己酸和丁酸衍生自合成气的碳源。

实施例3

从乙醇和乙酸或其盐生产己酸和丁酸

对于乙醇和乙酸或其盐至己酸和丁酸的生物转化，使用克氏梭菌这种细菌。所有培养步骤在可以用丁基橡胶塞子气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

将在5ml的DMSZ52培养基(DSMZ52培养基：pH＝6.98，10g/L CH₃COOK，0.31g/LK₂HPO₄，0.23g/L KH₂PO₄，0.25g/l NH₄Cl，0.20g/l MgSO₄·7H₂O，1g/L酵母提取物，0.50mg/L刃天青，10μl/l HCl(25％，7.7M)，1.5mg/L FeCl₂·4H₂O，70μg/L ZnCl₂·7H₂O，100μg/LMnCl₂·4H₂O，6μg/L H₃BO₃，190μg/L COCl₂·6H₂O，2μg/L CuCl₂·6H₂O，24μg/L NiCl₂·6H₂O，36μg/L Na₂MO₄·2H₂O，0.5mg/L NaOH，3μg/L Na₂SeO₃·5H₂O，4μg/L Na₂WO₄·2H₂O，100g/L维生素B12，80g/L对氨基苯甲酸，20g/L D(+)生物素，200μg/L烟酸，100μg/L D-泛酸钙，300μg/L盐酸吡哆醇，200μl/L盐酸硫胺素·2H₂O，20mL/L乙醇，2.5g/L NaHCO₃，0.25g/L盐酸半胱氨酸·H₂O，0.25g/L Na₂S·9H₂O)中的梭菌冷冻培养物置于250ml的瓶中，并且添加50ml的DSMZ52培养基。将该生长培养物在35℃下温育3天。然后，将100ml的DSMZ52培养基用10ml的该培养物进行接种以产生预备培养物。将该预备培养物在35℃下温育3天。对于主要培养物的产生，在500ml的瓶中将200ml的DSMZ52培养基用5％的来自预备培养物的细胞进行接种。将培养物用丁基橡胶塞子盖住并在35℃下温育98小时。在培养时间段的开始和结束时，进行取样。将这些样品就光密度和不同的分析物(通过NMR)进行测试。存在～0.01至最大0.35-0.37的OD₆₀₀的生长。结果显示，乙酸盐的量从4.9g/l降低至2.4g/l，和乙醇的量从12.5g/l降低至9.2g/l。另外，己酸的浓度从0.1g/l增加至6.85g/l，和丁酸的浓度从0.1g/l增加至2.9g/l。

实施例4

使用食羧梭菌从合成气形成己酸

从DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心)获得野生型菌株食羧梭菌(登录号DSM 15243)并自养地进行培养，以从合成气形成己酸。所有培养步骤在可以用丁基橡胶塞子气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

使用复合培养基来使细胞进行生长。所述复合培养基的构成如下：3g/l NH₄Cl，0.3g/l KCl，0.6g/l MgSO₄·7H₂O，2.4g/l NaCl，0.3g/l KH₂PO₄，120mg/l CaCl₂·2H₂O，10g/l MES，1g/l酵母提取物，0.4g/l L-盐酸半胱氨酸，20mg/l氨三乙酸，10mg/l MnSO₄·H₂O，8mg/l(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O，2mg/l CoCl₂·6H₂O，2mg/l ZnSO₄·7H₂O，0.2mg/l CuCl₂·2H₂O，0.2mg/l Na₂MoO₄·2H₂O，0.2mg/l NiCl₂·6H₂O，0.2mg/l Na₂SeO₄，0.2mg/l Na₂WO₄·2H₂O，20μg/l d-生物素，20μg/l叶酸，100μg/l盐酸吡哆醇，50μg/l盐酸硫胺素·H₂O，50μg/l核黄素，50μg/l烟酸，50μg/l泛酸钙，50μg/l维生素B₁₂，50μg/l对氨基苯甲酸盐，50μg/l硫辛酸，100μg/l MESNA，pH 6.0。

在装有500ml复合培养基和食羧梭菌菌株的1L的隔膜瓶中进行自养培养。在37℃下以100次/分钟的摇动频率在敞开的水浴摇床(Innova 3100,New BrunswickScientific)中进行温育。被捕获在培养基中的气体通过孔径为10微米的喷射器来移除，所述喷射器被安装在反应器的中央。在没有pH控制的情况下进行培养。通过所述喷射器，以3l/小时(0.1vvm)的通气速率在大气压下用组成为67％H₂和33％CO₂的预混合气体混合物对反应器进行清洗。

反应器用5ml的接种在甘油(10％)中的食羧梭菌的冷冻培养物来开始，所述食羧梭菌在上面提及的复合培养基中在O₂不存在下在具有果糖的情况下是异养的。将培养物在35℃下温育46小时。

当获得样品时，取5ml的每种样品用于测定OD₆₀₀、pH和产物谱。产物浓度的测定通过半定量¹H-NMR光谱学来进行。作为内部定量标准物，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)。

结果显示了0.01至0.18的OD₆₀₀的增加，以及从5.75至5.51的pH的降低。另外，乙酸盐浓度从7mg/l降低至0.8g/l，乙醇浓度从0g/l增加至0.16g/l，和丁酸盐浓度从0增加至0.19g/l。另外，在该时间段期间形成了63mg/l的己酸。

实施例5

大肠杆菌JM101(pBT10)，其作为用于氧化己酸甲酯和/或羟基己酸甲酯的全细胞催化剂

按照Schrewe等人,2011和WO2009077461A1来产生携带质粒pBT10(图1A)的重组大肠杆菌菌株JM101细胞，所述质粒pBT10表达来自恶臭假单胞菌的烷烃羟化酶(AlkB)、玉红氧还蛋白(AlkG)和玉红氧还蛋白还原酶(AlkT)这三个基因。

概括而言，实施下列步骤：

alkBGT表达载体的构建

从pCOM系统(Smits等人,2001)开始来产生构建体pBT10(图1A，SEQ ID NO:1)，其包含对于氧化成醛来说必需的来自恶臭假单胞菌的烷烃羟化酶(AlkB)、玉红氧还蛋白(AlkG)和玉红氧还蛋白还原酶(AlkT)这三个组分。对于这三个基因的表达，将alkBFG基因序列置于alkB-启动子的控制之下，和将alkT基因置于alkS-启动子的控制之下(SEQ IDNO:9)。

克隆策略

为了简化alkB和alkG的克隆，将位于它们之间的基因alkF与alkB和alkG一起进行扩增和克隆。AlkF对于待被催化的反应来说是没有意义的。

片段alkBFG的PCR扩增产物＝2524bp(参见SEQ ID NO:2(alkB)和SEQ ID NO:3(alkG))，其具有位于alkB上游的NdeI切割位点和位于alkG下游的SalI切割位点。引物的序列提供在下面的表2中。

片段alkT的PCR扩增产物(2958bp)(SEQ ID NO:4(alkT))。

表2.用于扩增alkBFG和alkT的引物

SEQ ID NO	序列	描述
			5	AAGGGAATTCCATATGCTTGAGAAACACAGAGTTC	alkBFG正向
6	AAAATTCGCGTCGACAAGCGCTGAATGGGTATCGG	alkBFG反向
			7	TGAGACAGTGGCTGTTAGAG	alkT正向
8	TAATAACCGCTCGAGAACGCTTACCGCCAACACAG	alkT反向

通过PCR来扩增片段alkBFG和alkT。使用质粒pGEc47(图8)(Eggink等人(1987))作为模板。

借助于已经被线性化并提供以平端并且与各自的平端PCR产物相连接的亚克隆载体HCKan(Lucigen Corporation)来进行克隆(图9)。

接下来，用限制酶NdeI和SalI将alkBFG片段从所述亚克隆载体中切出，和用限制酶PacI和XhoI将alkT片段从所述亚克隆载体中切出。将所述片段在琼脂糖凝胶(1％)中进行分开，从凝胶中切出，并使用凝胶提取试剂盒进行分离。

将所述片段相继地连接到载体pCOM10(Smits,T.H.M.等人,2001)中。在第一步中，将alkBFG通过切割位点NdeI和SalI插入到pCOM10中，和然后在第二步中，将alkT通过切割位点PacI和XhoI进行克隆。

将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。将携带质粒的克隆在包含卡那霉素的LB培养基上进行选择。通过限制性分析和测序来检查所分离出的质粒。将它称为pBT10(图1A)。对于生物转化，通过在42℃下热休克2分钟来将质粒pBT10转化到经化学方法成为感受态的菌株大肠杆菌JM101中。

所有的细胞测定法通过使用下列条件来进行：

使大肠杆菌菌株JM101细胞在30℃下在M9培养基(组成：6.8g/l Na₂PO₄·2H₂O，2.4g/l KH₂PO₄，0.4g/l NaCl，1.6g/l NH₄Cl，0.5g/l MgSO₄·7H₂O，1ml的由36.5g/l的强度为37％的盐酸、1.91g/l MnCl₂·4H₂O、1.87g/l ZnSO₄·7H₂O、0.84g/l Na-EDTA·2H₂O、0.3g/l H₃BO₃、0.25g/l Na₂MoO₄·2H₂O、4.7g/l CaCl₂·2H₂O、17.3g/l FeSO₄·7H₂O、0.15g/l CuCl₂·2H₂O组成的痕量元素溶液US3)中进行生长。当OD₄₅₀＝0.2时，进行接种。让细胞进行生长，并且当OD₄₅₀达到0.5时，用0.025％(v/v)二环丙基酮(DCPK)(烷烃羟化酶活性的强有力的义务诱导物)来进行基因表达的诱导。将细胞进一步温育4小时。然后，通过离心收获细胞，将细胞粒状沉淀重悬浮在包含1％(w/v)葡萄糖的50mM磷酸钾缓冲液(KPi，pH 7.4)中，并将其置于生物反应器中。用40μl的10％(v/v)高氯酸来终止生长，所述高氯酸允许质子化为所得的酸，并因此使得用醚来对反应混合物进行提取变得可行。

然后，将反应混合物通过乙醚进行提取，并且通过气相色谱法进行底物和产物浓度的随后定量。使重组细胞中的每一个在静息细胞测定法中分开地与己酸甲酯相接触，并且在较长的时间段内进行取样。

静息大肠杆菌JM101(pBT10)有效地催化了己酸甲酯至羟基己酸甲酯的转化，如在图2和3中所显示的。仅在小的程度上发生了由AlkBGT催化的羟基己酸甲酯至氧代己酸甲酯的氧化。

如可以在下面的表3中看到的，对于羟基化反应(第一步骤)的最大比活性显示为大约90U g_CDW，和对于醇氧化步骤(第二步骤)的最大比活性显示为6U g_CDW。

当使用羟基己酸甲酯作为用于大肠杆菌JM101(pBT10)的底物时，存在缓慢且低效的由AlkBGT催化的羟基己酸甲酯至氧代己酸甲酯的醇氧化。当使用羟基己酸甲酯作为用于大肠杆菌JM101(pBT10)的底物时，观察到相似的行为，如在图4和5中所显示的。测量到25Ug_CDW的最高的羟基己酸甲酯氧化率，并且氧代己酸甲酯积累在15分钟后停止，虽然仍然存在重大量的底物。这显示，AlkBGT在羟基己酸甲酯至氧代己酸甲酯的醇氧化中不是有效的。

实施例6

大肠杆菌JM101(pJ10)，其作为用于氧化羟基己酸甲酯的全细胞催化剂

使用来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系统alkBGT用于己酸或己酸甲酯的羟基化。至醛的第二步骤由醇脱氢酶alkJ来催化。

产生携带质粒pJ10的第二重组大肠杆菌菌株JM101细胞，所述质粒pJ10表达编码来自恶臭假单胞菌的醇脱氢酶AlkJ的基因(图1B)。

更有效的羟基己酸甲酯氧化通过将醇脱氢酶AlkJ引入到大肠杆菌JM101中来实现。在静息细胞测定法中检验携带AlkJ的大肠杆菌JM101(pJ10)的氧化能力。使用羟基己酸甲酯作为底物，并且将结果显示在图6和7中。如在下面的表3中所显示的，羟基己酸甲酯氧化的测量结果为大于200U g_CDW。这些结果显示，AlkJ催化醇的氧化，并且在催化该反应方面比AlkBGT更有效。因此，AlkJ是在开发用于经由6-氧代氨基己酸甲基酯来产生6-氨基己酸甲基酯的全细胞催化剂中的重要组分。

表3.在用静息大肠杆菌JM101(pBT10)和大肠杆菌JM101(pJ10)来产生己酸甲酯和6-羟基己酸甲酯中的最大比活性的测量结果。

生物质浓度：0.68-0.91g_CDW L^-1，

在包含1％(w/v)葡萄糖的KPi-缓冲液(pH 7.4)中

对于有效的醇至醛的氧化，AlkJ的存在看起来是必需的。

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序列表

<110> Evonik Industries AG

<120> 生产尼龙的方法

<130> 2013P00369WO

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> 食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）

<220>

<221> misc_feature

<223> 烷烃单加氧酶

<400> 1

cttgagaaac acagagttct ggattccgct ccagagtacg tagataaaaa gaaatatctc 60

tggatactat caactttgtg gccggctact ccgatgatcg gaatctggct tgcaaatgaa 120

actggttggg ggatttttta tgggctggta ttgctcgtat ggtacggcgc acttccattg 180

cttgatgcga tgtttggtga ggactttaat aatccgcctg aagaagtggt gccgaaacta 240

gagaaggagc ggtactatcg agttttgaca tatctaacag ttcctatgca ttacgctgca 300

ttaattgtgt cagcatggtg ggtcggaact cagccaatgt cttggcttga aattggtgcg 360

cttgccttgt cactgggtat cgtgaacgga ctagcgctca atacaggaca cgaactcggt 420

cacaagaagg agacttttga tcgttggatg gccaaaattg tgttggctgt cgtagggtac 480

ggtcacttct ttattgagca taataagggt catcaccgtg atgtcgctac accgatggat 540

cctgcaacat cccggatggg agaaagcatt tataagtttt caatccgtga gatcccagga 600

gcatttattc gtgcttgggg gcttgaggaa caacgccttt cgcgccgtgg ccaaagcgtt 660

tggagtttcg ataatgaaat cctccaacca atgatcatca cagttattct ttacgccgtt 720

ctccttgcct tgtttggacc taagatgctg gtgttcctgc cgattcaaat ggctttcggt 780

tggtggcagc tgaccagtgc gaactatatt gaacattacg gcttgctccg tcaaaaaatg 840

gaggacggtc gatatgagca tcaaaagccg caccattctt ggaatagtaa tcacatcgtc 900

tctaatctag tgctgttcca ccttcagcgg cactcggatc accacgcgca tccaacacgt 960

tcttatcagt cacttcggga ttttcccggc ctgccggctc ttccgacggg ttaccctggt 1020

gcatttttga tggcgatgat tcctcagtgg tttagatcag ttatggatcc caaggtagta 1080

gattgggctg gtggtgacct taataagatc caaattgatg attcgatgcg agaaacctat 1140

ttgaaaaaat ttggcactag tagtgctggt catagttcga gtacctctgc ggtagcatcg 1200

tag 1203

<210> 2

<211> 1656

<212> DNA

<213> 食油假单胞菌

<220>

<221> misc_feature

<223> AlkJ基因

<400> 2

atgtacgact atataatcgt tggtgctgga tctgcaggat gtgtgcttgc taatcgtctt 60

tcggccgacc cctctaaaag agtttgttta cttgaagctg ggccgcgaga tacgaatccg 120

ctaattcata tgccgttagg tattgctttg ctttcaaata gtaaaaagtt gaattgggct 180

tttcaaactg cgccacagca aaatctcaac ggccggagcc ttttctggcc acgaggaaaa 240

acgttaggtg gttcaagctc aatcaacgca atggtctata tccgagggca tgaagacgat 300

taccacgcat gggagcaggc ggccggccgc tactggggtt ggtaccgggc tcttgagttg 360

ttcaaaaggc ttgaatgcaa ccagcgattc gataagtccg agcaccatgg ggttgacgga 420

gaattagctg ttagtgattt aaaatatatc aatccgctta gcaaagcatt cgtgcaagcc 480

ggcatggagg ccaatattaa tttcaacgga gatttcaacg gcgagtacca ggacggcgta 540

gggttctatc aagtaaccca aaaaaatgga caacgctgga gctcggcgcg tgcattcttg 600

cacggtgtac tttccagacc aaatctagac atcattactg atgcgcatgc atcaaaaatt 660

ctttttgaag accgtaaggc ggttggtgtt tcttatataa agaaaaatat gcaccatcaa 720

gtcaagacaa cgagtggtgg tgaagtactt cttagtcttg gcgcagtcgg cacgcctcac 780

cttctaatgc tttctggtgt tggggctgca gccgagctta aggaacatgg tgtttctcta 840

gtccatgatc ttcctgaggt ggggaaaaat cttcaagatc atttggacat cacattgatg 900

tgcgcagcaa attcgagaga gccgataggt gttgctcttt ctttcatccc tcgtggtgtc 960

tcgggtttgt tttcatatgt gtttaagcgc gaggggtttc tcactagtaa cgtggcagag 1020

tcgggtggtt ttgtaaaaag ttctcctgat cgtgatcggc ccaatttgca gtttcatttc 1080

cttccaactt atcttaaaga tcacggtcga aaaatagcgg gtggttatgg ttatacgcta 1140

catatatgtg atcttttgcc taagagccga ggcagaattg gcctaaaaag cgccaatcca 1200

ttacagccgc ctttaattga cccgaactat cttagcgatc atgaagatat taaaaccatg 1260

attgcgggta ttaagatagg gcgcgctatt ttgcaggccc catcgatggc gaagcatttt 1320

aagcatgaag tagtaccggg ccaggctgtt aaaactgatg atgaaataat cgaagatatt 1380

cgtaggcgag ctgagactat ataccatccg gtaggtactt gtaggatggg taaagatcca 1440

gcgtcagttg ttgatccgtg cctgaagatc cgtgggttgg caaatattag agtcgttgat 1500

gcgtcaatta tgccgcactt ggtcgcgggt aacacaaacg ctccaactat tatgattgca 1560

gaaaatgcgg cagaaataat tatgcggaat cttgatgtgg aagcattaga ggctagcgct 1620

gagtttgctc gcgagggtgc agagctagag ttggca 1656

<210> 3

<211> 1380

<212> DNA

<213> 紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）

<220>

<221> misc_feature

<223> omega-氨基转移酶

<400> 3

atgcagaaac agcgtaccac ctctcagtgg cgtgaactcg atgcggcgca tcatctccat 60

ccgtttaccg ataccgcgag cctcaatcag gcgggtgcgc gtgtgatgac ccgtggcgaa 120

ggcgtgtatc tctgggatag cgaaggcaac aaaattattg atggcatggc gggcctctgg 180

tgcgtgaacg tgggctatgg ccgtaaagat tttgcggaag cggcgcgtcg tcagatggaa 240

gaactcccgt tttataacac cttctttaaa accacccatc cggcggtggt ggaactcagc 300

agcctcctcg ccgaagttac cccggcaggt tttgatcgtg tgttttatac caacagcggc 360

agcgaaagcg tggataccat gattcgtatg gtgcgtcgtt attgggatgt gcagggcaaa 420

ccggaaaaaa aaaccctcat tggccgttgg aacggctatc acggcagcac cattggcggt 480

gcgagcctcg gcggcatgaa atatatgcat gaacagggcg atctcccgat tccgggcatg 540

gcgcatattg aacagccgtg gtggtataaa catggcaaag atatgacccc ggatgaattt 600

ggcgtggttg cggcgcgttg gctcgaagaa aaaattctcg aaatcggcgc ggataaagtg 660

gcggcgtttg tgggcgaacc gattcagggt gcgggcggtg tgattgttcc gccggcaacc 720

tattggccgg aaattgaacg tatttgccgc aaatatgatg tgctcctcgt tgcggatgaa 780

gtgatttgcg gctttggccg taccggcgaa tggtttggcc atcagcattt tggctttcag 840

ccggacctct ttaccgcggc gaaaggcctc agcagcggct atctcccgat tggcgcggtg 900

tttgtgggca aacgtgttgc ggaaggtctc attgcgggcg gtgattttaa ccatggcttt 960

acctatagcg gccatccggt gtgtgcggcg gtggcgcatg cgaatgttgc ggcgctccgt 1020

gatgaaggca ttgtgcagcg tgtgaaagat gatattggcc cgtatatgca gaaacgttgg 1080

cgtgaaacct ttagccgttt tgaacatgtg gatgatgtgc gtggcgtggg catggtgcag 1140

gcgtttaccc tcgtgaaaaa caaagcgaaa cgtgaactct ttccggattt tggcgaaatt 1200

ggcaccctct gccgcgatat tttttttcgc aacaacctca ttatgcgtgc gtgcggcgat 1260

cacattgtgt ctgcaccgcc gctcgttatg acccgtgcgg aagtggatga aatgctcgcc 1320

gtggcggaac gttgcctcga agaatttgaa cagaccctca aagcgcgtgg cctcgcctaa 1380

<210> 4

<211> 1158

<212> DNA

<213> 假单胞菌属物种（Pseudomonas sp.）

<220>

<221> misc_feature

<223> 片段alkT的PCR扩增产物

<400> 4

atggcaatcg ttgttgttgg cgctggtaca gctggagtaa atgctgcgtt ctggcttcgt 60

caatatggtt ataaagggga aattaggatt tttagcaggg agtctgtggc gccttatcag 120

cggcctcctc tatccaaggc ttttctgaca agtgagattg cagaatccgc agtgccatta 180

aagccagaag gtttttatac gaataacaat attaccattt cgttaaatac accgattgta 240

tcaatcgacg tggggcgtaa gatagtttct tctaaagatg gaaaagaata cgcgtatgaa 300

aaattgattc ttgcaacacc tgctagcgca cgtaggttaa cctgcgaggg gtctgaactg 360

tctggggtct gctatttacg cagtatggaa gacgccaaaa atttacgtag gaaacttgtg 420

gagagtgcgt ctgttgttgt gttgggcggc ggagtaatcg ggcttgaagt cgcctcagct 480

gcggtgggct tagggaagag ggtcacagtg atagaagcca ccccgcgtgt aatggcgcgc 540

gtggttacgc cggcagcagc aaacttagtc agagcccgcc tggaggctga aggaattgag 600

ttcaagctga atgcgaaatt aacgtctata aagggcagga atggccatgt tgaacaatgc 660

gtacttgaaa gtggagaaga aattcaggcg gatctgattg tagttggaat cggtgctatc 720

ccagagctag agctggcaac tgaggcggcc cttgaagtga gtaatggtgt tgtggtcgat 780

gatcagatgt gtacatcgga tacaagtata tatgcaatcg gcgactgcgc aatggctaga 840

aatccttttt ggggaacgat ggtacgttta gagacaattc ataatgcggt tacacacgct 900

caaattgtcg caagtagcat ctgtggcaca tcaacaccag caccaacccc accacggttc 960

tggtctgatc ttaaagggat ggcgctgcaa ggacttggtg ctctaaagga ctacgataaa 1020

ctcgttgttg caattaataa cgaaactctt gaactagaag tccttgcgta caagcaggag 1080

cgactgattg caactgagac aataaatttg cctaaacgtc aaggtgcgct tgcagggagt 1140

ataaaattac ctgattag 1158

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<220>

<221> misc_feature

<223> alkBFG正向

<400> 5

aagggaattc catatgcttg agaaacacag agttc 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<220>

<221> misc_feature

<223> alkBFG反向

<400> 6

aaaattcgcg tcgacaagcg ctgaatgggt atcgg 35

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<220>

<221> misc_feature

<223> alkT正向

<400> 7

tgagacagtg gctgttagag 20

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<220>

<221> misc_feature

<223> alkT反向

<400> 8

taataaccgc tcgagaacgc ttaccgccaa cacag 35

<210> 9

<211> 519

<212> DNA

<213> 假单胞菌属物种

<220>

<221> misc_feature

<223> alk基因簇

<400> 9

atggctagct ataaatgccc ggattgtaat tatgtttatg atgagagtgc gggtaatgtg 60

catgaggggt tttctccagg tacgccttgg caccttattc ctgaggattg gtgctgcccc 120

gattgcgccg ttcgagacaa gcttgacttc atgttaattg agagcggcgt aggtgaaaag 180

ggcgtcacct caacccatac ttcgccaaat ttatccgagg ttagtggcac aagtttaact 240

gctgaagcag tggttgcgcc gacaagctta gagaaattgc ctagtgccga cgttaaaggc 300

caagatctat ataaaactca acctccaagg tctgatgccc aaggcgggaa agcatacttg 360

aagtggatat gtattacttg tggccatata tatgatgagg cgttgggcga tgaggccgag 420

ggttttactc caggtactcg ctttgaggat attcctgatg actggtgctg tccggattgc 480

ggggctacga aagaagacta tgtgctctac gaggaaaag 519

Claims

1.提供了从合成气生产氨基己酸和/或氨基己酸酯的方法，所述方法包括：

A.使合成气与至少一种能够实施Wood-Ljungdahl途径和乙醇-羧酸盐发酵的细菌相接触以产生己酸；和

2.根据权利要求1的方法，其进一步包括使步骤A的己酸酯化以产生C₁-C₄己酸酯的步骤，并且使所述C₁-C₄己酸酯与步骤B的经基因工程改造的细胞相接触。

3.根据权利要求2的方法，其中所述酯化步骤涉及使步骤A的己酸与至少一种C₁-C₄醇相接触以产生C₁-C₄己酸酯。

4.根据权利要求2或3之一的方法，其中所述酯化步骤由至少一种酯化细菌来催化。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤B中在所述经基因工程改造的细胞中

-所述烷烃单加氧酶由来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的AlkBGT基因编码；

-所述醇脱氢酶由来自恶臭假单胞菌的AlkJ基因编码；和/或

-所述ω-氨基转移酶为来自紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)DSM30191的ω-氨基转移酶CV2025。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法进一步包括将氨基己酸酯转化为氨基己酸的步骤。

7.根据权利要求6的方法，其中所述的氨基己酸酯至氨基己酸的转化由来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶LipA(Q76D26)来催化。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤B的细胞选自由下列各项组成的组：经基因工程改造的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、经基因工程改造的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞和经基因工程改造的恶臭假单胞菌细胞。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤A中的所述能够实施Wood-Ljungdahl途径的细菌为从由下列各项组成的组中选择的产乙酸细菌：潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)(ATCC35199)、长醋丝菌(Acetonema longum)(DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacteriummalicum)(DSM 4132)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)第446号物种、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)(DSM1030)、巴克斯碱棒菌(Alkalibaculum bacchi)(DSM 22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(DSM 4304)、产生布劳特氏菌(Blautia producta)(DSM2950)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)(DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)(DSM 1496)、自养产乙烷梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、食羧梭菌(Clostridium carboxidivorans)(DSM15243)、考斯凯特梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC编号PTA-10522)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)(ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)(DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)(DSM 1288)、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)(DSM 13528)、扬氏梭菌C-01(ATCC 55988)、扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)、扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei)(DSM 6539)、食甲氧基苯甲酸梭菌(Clostridium methoxybenzovorans)(DSM 12182)、拉格斯代尔梭菌(Clostridium ragsdalei)(DSM 15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)(DSM757)、梭菌属(Clostridium)物种ATCC 29797、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculumkuznetsovii)(DSM 6115)、热苯甲酸脱硫肠状菌热互养共栖亚种(Desulfotomaculumthermobenzoicum subsp.thermosyntrophicum)(DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)(DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A(DSM2834)、穆尔氏菌属(Moorella)物种HUC22-1、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)(DSM 521)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)(DSM 1974)、普氏醋菌(Oxobacter pfennigii)(DSM 322)、食空气鼠孢菌(Sporomusa aerivorans)(DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)(DSM 2662)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusasilvacetica)(DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)(DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida)(DSM 4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)(DSM2030)。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述能够实施乙醇-羧酸盐发酵的细菌选自由下列各项组成的组：克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和食羧梭菌。

11.根据权利要求3至10中任一项的方法，其中所述C₁-C₄醇为甲醇。

12.根据权利要求3至11中任一项的方法，其中将从合成气产生的己酸在与C₁-C₄醇相接触以产生C₁-C₄己酸酯之前首先进行提取。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞在包含氨基酸的培养基中，所述氨基酸发挥用于步骤B的胺供体的作用。

14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中催化所述氨基己酸以形成尼龙。

15.根据权利要求14的方法，其中所述尼龙选自由下列各项组成的组：尼龙-6,6、尼龙-6、尼龙-6,9、尼龙-6,10和尼龙-6,12。